La eficacia diagnóstica del plasma miR-362-3p combinado con ecografía Doppler en el diagnóstico del cáncer de mama

Resumen

La tasa de diagnóstico de cáncer de mama es relativamente baja. El método de la tabla cuádruple se utilizó para analizar el valor diagnóstico de miR-362-3p combinado con ecografía Doppler para el cáncer de mama. La combinación de la ecografía Doppler y el miR-362-3p mejoró eficazmente la eficacia diagnóstica, proporcionando un método prometedor para el diagnóstico del cáncer de mama.

Resumen

El cáncer de mama es el segundo tumor maligno más común en el mundo, amenazando gravemente la vida de las mujeres y suponiendo una enorme carga económica. Este estudio pretende explorar el valor del miR-362-3p combinado con la ecografía Doppler en el diagnóstico del cáncer de mama. En total se incluyeron 182 pacientes con cáncer de mama y 147 pacientes con enfermedad benigna mamaria en este estudio. Los niveles plasmáticos de miR-362-3p de los pacientes se midieron utilizando la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa por fluorescencia en tiempo real (RT-qPCR). La prueba de chi cuadrado se utilizó para analizar las diferencias en los parámetros de la ecografía Doppler entre los dos grupos de pacientes. La curva característica del operador receptor (ROC) se utilizó para evaluar la efectividad diagnóstica de miR-362-3p, el Índice de Resistencia (RI) y el Índice de Pulsatilidad (PI). La eficiencia diagnóstica de la ecografía Doppler combinada con miR-362-3p plasmático en el cáncer de mama se analizó mediante el método de la tabla cuádrupla. Los niveles de miR-362-3p disminuyeron notablemente en pacientes con cáncer de mama. Hubo diferencias significativas en los parámetros de la ecografía bidimensional. miR-362-3p, RI y PI tienen valor diagnóstico para el cáncer de mama. El valor diagnóstico combinado de los tres factores fue mayor. La ecografía combinada con miR-362-3p mejoró significativamente la sensibilidad, la precisión y el valor predictivo negativo en el diagnóstico del cáncer de mama. La ecografía Doppler combinada con miR-362-3p podría mejorar la eficiencia diagnóstica del cáncer de mama, lo que podría proporcionar una herramienta diagnóstica auxiliar no invasiva y potencial para el cáncer de mama.

Introducción

Según las estadísticas de la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer, la tasa de incidencia del cáncer de mama superó la del cáncer de pulmón en 2020^. El cáncer de mama es un tumor maligno que ocurre con frecuencia y es una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer en mujeres a nivel^mundial. Un diagnóstico oportuno del cáncer de mama es beneficioso para el pronóstico de las pacientes. La biopsia de tejido es el estándar de oro para diagnosticar el cáncer de mama. Sin embargo, este es un tipo de diagnóstico invasivo y no se aplica a pacientes con cáncer de mama en fase^{temprana 2}.

La ecografía Doppler es una técnica de imagen comúnmente utilizada para el cribado del cáncer de mama y el diagnóstico^{auxiliar 3}. La ecografía Doppler puede evaluar con precisión el tamaño de los nódulos, las señales de flujo sanguíneo y el estado de la metástasis^{ganglio linfático 4}. La ecografía Doppler mamaria, debido a sus ventajas como la ausencia de radiación ionizante, la seguridad y la no invasividad, así como la capacidad de realizar exámenes repetibles, se ha convertido en una de las técnicas de imagen más utilizadas en el cribado y diagnóstico del cáncer^{de mama 5}. Sin embargo, la ecografía Doppler tiende a verse afectada por el fondo tisular al detectar cánceres de mama de baja densidad o de bajo volumen, lo que resulta en una disminución significativa de la sensibilidad diagnóstica y dificulta satisfacer las necesidades clínicas para un diagnóstico^{precoz 6}. Por ello, es necesario desarrollar biomarcadores plasmáticos que puedan superar las limitaciones de la tecnología de ultrasonido Doppler. Si la combinación de ambos métodos puede aumentar la sensibilidad del diagnóstico para el cáncer de mama, tendrá un valor clínico significativo y una importancia práctica.

Los microARN (miARN) son una clase de moléculas de ARN no codificantes con una longitud de aproximadamente 20 a 24 nucleótidos ^7,8. Una de las características de los miARN es un alto grado de conservación durante el proceso evolutivo. Los miARN tienen una amplia distribución tisular, que no solo se expresa específicamente en diversas células del tejido humano, sino que también pueden existir de forma estable en múltiples fluidos corporales como la sangre y la^{saliva 9}. Estas características de distribución proporcionan ventajas para el desarrollo de marcadores diagnósticos no invasivos. Funcionalmente, los miARN degradan el ARNm uniéndose complementariamente a las 3' Regiones No Traducidas (UTR)^10,11, participando en una serie de procesos patológicos y fisiológicos clave como las respuestas inflamatorias celulares, el estrés oxidativo, la apoptosis y la proliferación y^{diferenciación 12}. Un gran número de estudios ha confirmado que los cambios anormales en los perfiles de expresión de miARN están estrechamente relacionados con la aparición y desarrollo del cáncer de mama^13,14. La desregulación de la expresión de miARN puede promover la transformación maligna de las células epiteliales mamarias al regular las redes de expresión de oncogenes o genes supresores de tumores. miR-362-3p es un factor típico que inhibe la progresión tumoral. Varios informes encontraron que miR-362-3p inhibía la progresión del cáncer de mama 15,16,17. Assiri et al. informaron que la baja expresión de miR-362-3p estuvo estrechamente asociada con un mal pronóstico y una supervivencia global más corta en pacientes con cáncer^{de mama 15}. Mecánicamente, miR-362-3p ejerció un efecto antitumoral en el cáncer de mama al dirigirse a la helicasa DEAD-box 5 (DDX5) para promover la proliferación, invasión y migración de células^{cancerosas 16}. Además, el equipo liderado por Kang también encontró que miR-362-3p estaba significativamente regulado a la baja en los tejidos del cáncer de mama, y que la regulación dirigida de la expresión de miR-362-3p podría servir como una estrategia terapéutica novedosa para el manejo del cáncer^{de mama 17}. Sin embargo, no se ha informado sobre si el miR-362-3p puede servir como marcador diagnóstico temprano para el cáncer de mama.

Este estudio midió el nivel de expresión de miR-362-3p en el plasma y analizó simultáneamente los parámetros clave de imagen de la ecografía Doppler en pacientes con cáncer de mama. El estudio exploró en profundidad el valor combinado de aplicación de los niveles plasmáticos de expresión de miR-362-3p y los parámetros de imagen de la ecografía Doppler, y demostró claramente la eficacia de este enfoque diagnóstico combinado en el cribado del cáncer de mama y en el diagnóstico diferencial entre enfermedades benignas y malignas de mama.

Protocolo

Este estudio se realizó conforme a los principios de la Declaración de Helsinki. La aprobación fue concedida por el Comité de Ética del Hospital Afiliado de la Universidad Médica Secundaria de Shandong, Escuela de Medicina Clínica, Universidad Médica Secundaria de Shandong (número de aprobación: wyfy-2023-ky-124). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos implicados en el estudio. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Sujetos experimentales

El cálculo del tamaño de la muestra se realizó utilizando el software G*Power 3.1 basado en una prueba t de muestra independiente. Se establecieron un tamaño de efecto medio (d de Cohen = 0,5, ampliamente utilizado en estudios observacionales clínicos), una prueba de dos colas, α = 0,05, y una potencia (1 − β) = 0,95. El cálculo indicó que se requerían al menos 105 participantes por grupo. Finalmente, se incluyeron 182 pacientes con cáncer de mama y 147 pacientes con lesiones mamarias benignas, y el tamaño real de la muestra de ambos grupos superó con creces el mínimo requerido, asegurando suficiente capacidad estadística para respaldar las conclusiones del estudio y controlar el riesgo de error tipo II dentro de un rango aceptable. Todos los participantes fueron inscritos de forma estricta y consecutiva según criterios unificados de inclusión y exclusión.

De 2023 a 2024, todos los pacientes estuvieron matriculados en el Hospital Afiliado de la Universidad Médica Secundaria de Shandong, Escuela de Medicina Clínica, Universidad Médica Secundaria de Shandong. Lesiones benignas: Las lesiones no malignas fueron confirmadas por la patología. Cáncer de mama: tumores malignos fueron confirmados por patología. Se recogieron muestras de sangre venosa de todos los participantes tras ayuno nocturno. Las muestras venosas de sangre se anticoagularon y centrifugaron para separar el plasma, cumpliendo estrictamente con los procedimientos estándar, y luego se transfirieron a −80 °C para almacenamiento a largo plazo, que posteriormente se utilizó para la extracción de miARN. Todas las muestras de plasma estaban estrictamente limitadas a no más de dos ciclos de congelación-descongelación antes de la extracción de ARN para evitar la degradación del miARN. Todos los pacientes estaban completamente informados sobre el protocolo del estudio y proporcionaron voluntariamente su consentimiento informado por escrito antes de la inscripción.

Criterios de inclusión para pacientes con cáncer de mama: (1) Pacientes con cáncer primario de mama confirmado patológicamente. (2) No hay tratamiento quirúrgico antes de la inscripción. (3) No recibió tratamiento de radioterapia ni quimioterapia antes de la recogida de la muestra.

Criterios de inclusión para pacientes con enfermedad mamaria benigna: (1) Lesiones mamarias benignas confirmadas patológicamente. (2) Sin ningún otro tumor maligno sistémico ni lesiones precancerosas. (3) No embarazada y no lactante. (4) No hay infección aguda grave ni enfermedad inflamatoria crónica.

Criterios de exclusión para pacientes con cáncer de mama y lesiones mamarias benignas: (1) Infección mamaria grave o enfermedad crítica aguda. (2) Disfunción grave del hígado o riñón, o enfermedad autoinmune. (3) Pacientes que recibieron terapia hormonal en un plazo de 6 meses.

2. Ecografía Doppler

Las mamas bilaterales de la paciente fueron examinadas minuciosamente en cuatro cuadrantes mediante ecografía Doppler. Se utilizó una ecografía bidimensional para registrar las características de la lesión, incluyendo límites, forma, eco interno, ondas posteriores del eco y relación de aspecto de la lesión. Se aplicó imagen de flujo Doppler en color para evaluar los parámetros del flujo sanguíneo de la lesión, incluyendo el índice de resistencia (RI), el índice de pulsatilidad (PI) y la velocidad máxima del flujo sanguíneo (V_max). Las señales de flujo sanguíneo se clasificaron según un sistema de clasificación previamente^{reportado 18}: Grado 0: Sin señal de flujo sanguíneo; Grado I: señal de flujo sanguíneo mínimo; Grado II: La longitud de la señal de flujo sanguíneo supera la mitad del diámetro de la lesión; Grado III: señal de flujo sanguíneo abundante.

3. Definición positiva para el diagnóstico por ecografía de cáncer de mama

Estos incluían (1) Límites ambiguos; (2) Forma irregular; (3) Eco interno desigual; (4) Eco trasero debilitado; (5) Relación de aspecto >1; (6) RI > 0,70; (7) PI > 1,50; (8) Caudal sanguíneo máximo (Vmax)> 18,00 cm/s; (9) Señal de flujo sanguíneo ≥ grado II. Cualquier lesión que cumpla cualquiera de los criterios sospechosos anteriores se clasifica como positiva en ecografía, mientras que aquellas que no presentan características sospechosas se clasifican como negativas para ecografía.

4. Reacción en cadena cuantitativa de polimerasa por fluorescencia en tiempo real (RT-qPCR)

Los miARN plasmáticos se extrajeron utilizando un kit especializado de extracción de miARN. Las muestras de ARN extraídas con éxito se utilizaron para sintetizar ADNc utilizando kits especializados de transcripción inversa de miARN. Condiciones de reacción de transcripción inversa para miR-362-3p: El volumen total de esta reacción fue de 20 μL. El procedimiento de reacción PCR fue el siguiente: (1) La mezcla se incubó a 37 °C durante 15 minutos, (2) Se realizó la reacción de transcripción inversa durante 50 minutos a 42 °C, (3) La enzima se inactivó durante 5 minutos a 95 °C. El producto se almacenaba a 4 °C. Las condiciones de reacción qPCR: El volumen total del sistema de reacción fue de 20 μL. Las condiciones de amplificación se realizaron de la siguiente manera: (1) El ADNc fue predesnaturalizado y la ADN polimerasa se activó a 95 °C durante 2 minutos. (2) Las cadenas de ADN se recocen y extienden durante 30 s a 60 °C. Los dos pasos anteriores se realizaron durante un total de 40 ciclos. La expresión relativa del gen se calculó mediante la fórmula 2^-(ΔΔCt). La expresión relativa del miR-362-3p fue calibrada por U6. Para justificar el uso de U6 como control endógeno, se evaluó la estabilidad de U6 utilizando el algoritmo BestKeeper en la cohorte plasmática. El coeficiente de variación (CV) de los valores de U6 Ct en todas las muestras fue inferior al 2%, indicando una alta estabilidad en la expresión. Por ello, U6 fue validado y seleccionado como el gen de referencia para la normalización de la expresión de miR-362-3p en el presente estudio. La secuencia posterior de los cebadores fue proporcionada por el kit. Las secuencias de cebadores fueron las siguientes:

miR-362-3p: GCCGAGAACACACCTATTCA.

U6: CTCGCTTCGGCAGCACATATATA.

5. Curva de Característica de Funcionamiento del Receptor (ROC)

El índice de Youden se utilizó para determinar el valor de corte óptimo para miR-362-3p en el diagnóstico del cáncer de mama, calculando los valores de sensibilidad y especificidad de la curva ROC. El modelo diagnóstico combinado se construyó utilizando regresión logística binaria en SPSS, con miR-362-3p, RI y PI introducidos como variables independientes. El método Enter incluyó variables para generar el valor de probabilidad predicho del diagnóstico combinado para cada sujeto. La fórmula para la probabilidad de predicción (PRE): . Las curvas ROC se representaron basándose en el PRE. La prueba Delong se utilizó para comparar las diferencias en los valores de Área Bajo la Curva (AUC) entre diferentes curvas ROC.

6. Definición de parámetros de resultado

El parámetro principal de resultado fue la eficacia diagnóstica global del modelo combinado de plasma miR-362-3p y ecografía Doppler para el cáncer de mama, con el diagnóstico patológico como estándar de oro. Los parámetros secundarios de resultado incluyeron el rendimiento diagnóstico solo de la ecografía Doppler y el miR-362-3p plasmático solo.

7. Estadísticas de datos

Se analizaron los niveles de expresión de miR-362-3p y las curvas ROC de los dos grupos de pacientes utilizando software estadístico y gráfico. La prueba t se utilizó para comparar las diferencias en las variables continuas entre los dos grupos. La prueba chi-cuadrado y el método de la tabla cuádruple se analizaron utilizando SPSS 26.0. La prueba del chi-cuadrado se utilizó para evaluar las diferencias estadísticas de variables categóricas; la combinación de dos índices (miR-362-3p + ecografía Doppler) se consideró el análisis principal, representando una conclusión diagnóstica cualitativa rutinaria en la práctica clínica; si había características sospechosas derivadas de la clasificación del Sistema de Informes y Datos de Imagen Mamaria (BI-RADS), la lesión se definía como positiva; se utilizó el método de la tabla cuádruple para calcular la especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo y precisión del diagnóstico combinado de la ecografía Doppler y miR-362-3p. Los resultados diagnósticos entre la ecografía Doppler y el miR-362-3p incluyeron verdadero positivo (a), falso positivo (b), falso negativo (c) y verdadero negativo (d). Fórmula de cálculo: Sensibilidad = a / (a + c); Especificidad = d / (d + b); Valor Predictivo Positivo = a / (a + b); Valor predictivo negativo = d / (d + c); Precisión = (a + d) / (a + b + c + d). Los tres métodos diagnósticos (miR-362-3p, ecografía y diagnóstico combinado) se realizaron utilizando la prueba Pearson χ² para las tablas de contingencia R×C. Se consideró estadísticamente significativo un P < 0,05.

Resultados

El nivel de miR-362-3p disminuyó significativamente en pacientes con cáncer de mama

Se compararon la información clínica de referencia y las características patológicas clínicas de 182 pacientes con cáncer de mama y 147 pacientes con lesiones mamarias benignas. Los datos detallados se resumieron en la Tabla 1. La RT-qPCR se utilizó para medir los niveles plasmáticos de miR-362-3p en dos grupos de pacientes. Los resultados most...

Discusión

El cáncer de mama es uno de los tipos más comunes de tumores malignos, convirtiéndose en un importante problema de salud pública que amenaza la salud humana^. Las altas tasas de incidencia y mortalidad no solo causan graves traumas psicológicos a las familias de los pacientes, sino que también suponen una enorme carga para la sociedad y la economía. La mayoría de las pacientes con cáncer de mama ya han experimentado invasión local...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BD Vacutainer K2EDTA Blood Collection Tube (purple cap)	EE. UU.	367861	Para recolección de sangre venosa y preparación de plasma para el análisis de miRNA.
Sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch	Bio-Rad Laboratories	1855195	Instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia de 96 pozos y 6 canales, utilizando conducción de fibra óptica e imagen CCD fría, con recolección de fluorescencia sincrónica en cada pozo sin demora. El rango dinámico alcanza 10 órdenes de magnitud, y es compatible tanto con qPCR convencional como con análisis de curva de fusión de alta resolución (HRM). El software admite la exportación de formato RDML, es compatible con pruebas de investigación y clínicas, y se usa comúnmente en experimentos como cuantificación de expresión génica, tipificación de SNP y análisis de metilación.
Tubos de PCR Kirgen de 0.1 mL (o tubos de PCR de 8 tiras), estériles	Shanghai, China	KG0811	Utilizado para preparar y realizar reacciones qPCR.
Tubos de microcentrífuga Kirgen de 1.5 mL, estériles	Kirgen Biotech Co., Ltd.	KG2911	Utilizado para el almacenamiento de muestras, preparación de reactivos y centrifugación durante la extracción de miRNA y la transcriptasa inversa.
Kit de aislamiento de miRNA miRcute (columna de giro)	Beijing, China	DP501	Para el aislamiento y purificación de ARN total, incluido el miRNA de muestras de plasma humano, utilizando tecnología basada en columna de giro.
Kit miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA	Beijing, China	KR211	Para la transcripción inversa de miRNA purificado en cDNA de cadena sencilla mediante el método de cola poli(A).
Kit miRcute Plus miRNA qPCR (SYBR Green)	Beijing, China	FP411	Para la detección de PCR en tiempo real cuantitativa de miRNA utilizando química basada en SYBR Green I.
Placa multipozo Roche LightCycler 480 de 96, blanca	Mannheim, Alemania	4729692001	Utilizado para ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real en el instrumento Roche LightCycler 480.
Sonda de matriz lineal Siemens Acuson 14L5 / 14L5 SP	Siemens Healthineers	10041226	Sonda de matriz lineal de alta frecuencia, con un rango de frecuencia de 5–14 MHz, especialmente diseñada para el examen de órganos superficiales como el seno y la tiroides. Cuenta con alta resolución y excelente contraste de tejidos, y admite elastografía y escaneo automático de volumen mamario.
Sistema de ultrasonido Siemens Acuson S2000/S3000/S1000	Siemens Healthineers	/	El sistema de diagnóstico de ultrasonido Doppler color admite funciones de imagen 3D/4D en tiempo real e imágenes de elasticidad, y se usa ampliamente en múltiples departamentos como abdomen, cardiovascular, ginecología y obstetricia y seno.
Termociclador de 96 pozos Veriti	Thermo Fisher Scientific	4375786	Instrumento de PCR de gradiente de 96 canales, admite optimización de temperatura de gradiente; tiene alta precisión de control de temperatura; se usa para síntesis de cDNA y amplificación de PCR convencional.