Desarrollo de un protocolo de reconstitución de vesículas COPII sin células para investigar la clasificación STING en un sistema basado en células HEK-293

Resumen

Este protocolo describe un sistema optimizado sin células para reconstituir la incorporación de STING en vesículas COPII, permitiendo un análisis bioquímico controlado de la clasificación de carga durante la exportación de RE.

Resumen

La vía cGAS–STING es un componente central de la inmunidad innata. Al activarse, la proteína STING residente en el retículo endoplásmico (RE) se empaqueta en las vesículas COPII y se transporta al aparato de Golgi para iniciar la señalización posterior. A pesar de la importancia de este proceso, los mecanismos moleculares que rigen la clasificación STING en vesículas COPII siguen siendo incompletamente comprendidos. Aquí se presenta un flujo de trabajo optimizado para la reconstrucción in vitro de las vesículas COPII para facilitar el análisis controlado de la selección de carga. Se describe un método escalable para preparar citosol de alta concentración (30–40 mg/mL) a partir de células en suspensión HEK-293F, combinado con un procedimiento sencillo para generar células HEK-293T semipermeables como fuente de membrana definida. En comparación con los sistemas tradicionales basados en células adherentes, este enfoque mejora la escalabilidad, reduce costes y mejora la reproducibilidad. Utilizando STING como modelo de carga, la gemación de vesículas COPII y la incorporación de la carga se validan mediante análisis Western blot, con una eficiencia basal de empaquetado de aproximadamente el 20% bajo condiciones definidas. Este sistema permite la manipulación controlada de parámetros bioquímicos, incluida la estimulación de nucleótidos, para evaluar sus efectos en la incorporación de cargas. Este protocolo proporciona una plataforma robusta y adaptable para investigar la clasificación de carga mediada por COPII y puede ampliarse para estudiar proteínas transmembrana adicionales y factores regulatorios implicados en la exportación de RE.

Introducción

La vía de señalización cGAS-STING actúa como un mecanismo fundamental del sistema inmunitario innato, detectando ADN citosólico de doble cadena (dsDNA) para iniciar una respuesta antiviral. Al detectar dsDNA, la enzima cGAS produce el dinucleótido cíclico cGAMP, que actúa como un segundo mensajero que se une al STING ^1,2. De forma crucial, STING reside como un dímero inactivo en el retículo endoplásmico (RE) bajo condiciones de estado^{estacionario 3}. Su activación requiere una translocación rápida y altamente regulada del RE al aparato de Golgi. Es en el Golgi donde STING recluta y activa las quinasas aguas abajo TBK1 e IRF3, lo que conduce a la producción de interferones tipo I y citocinas^{proinflamatorias 4}.

El transporte de STING está mediado por vesículas recubiertas de COPII, los vehículos universales para la exportación de proteínas del^{ER 5}. El ensamblaje del abrigo COPII —compuesto por el pequeño complejo GTPasa Sar1, el complejo interior Sec23/24 y el complejo exterior Sec13/31— es responsable tanto de deformar la membrana ER en vesículas como de reclutar selectivamente la carga ^6,7. Sec22b se clasifica en vesículas COPII mediante un epítopo estructural reconocido por el complejo Sec23/24 de COPII⁸. Otras cargas incluyen la familia p24 y el marcador ERGIC-53, ambos dependientes de un motivo φC dihidrofóbico C-terminal para^{clasificar el 9}. En cambio, ciertas proteínas ancladas en RE, como la ribóforina I (RPN1), permanecen confinadas al RE y actúan como marcadores de estructuras intactas del RE, ya que no se transportan a través de las vesículas^{COPII 10}. En consecuencia, en experimentos de reconstitución de vesículas COPII libres de células, Sec22b y p24 suelen considerarse cargas de COPII, mientras que la ribóforina sirve como marcador para monitorizar la contaminación por RE en preparaciones de vesículas. Aunque la maquinaria general del transporte de COPII está bien caracterizada, las señales moleculares específicas que desencadenan la secuestración selectiva de STING activada en estas vesículas siguen siendo esquivas. Comprender estos mecanismos de selección es fundamental, ya que la desregulación del transporte STING está relacionada con diversas enfermedades autoinmunes y autoinflamatorias, como la vasculopatía asociada a STING con inicio en la infancia (SAVI) y el síndrome^{COPA 11}. Sin embargo, estudiar estos eventos transitorios y altamente dinámicos en células intactas sigue siendo técnicamente un reto.

Para abordar estos desafíos, se desarrolló un sistema optimizado de reconstitución sin células para analizar los requisitos moleculares de la clasificación de carga mediada por COPII. Aunque los ensayos de gemación in vitro han sido durante mucho tiempo un pilar de la biología^{celular 12}, su adopción generalizada suele estar limitada por el alto coste y la complejidad de preparar componentes de alta calidad. En este estudio se introduce un flujo de trabajo optimizado que utiliza células en suspensión HEK-293F como fuente económica de citosol activo y células HEK-293T semipermeabilizadas como donante robusto de membrana. El flujo de trabajo general del sistema de reconstitución de vesículas COPII sin células se ilustra en la Figura 1. En este sistema, el Sec22b se utilizó como control positivo para confirmar la incorporación de la carga en las vesículas, mientras que el RPN1 se utilizó como control negativo para monitorizar y descartar contaminación por membrana de RE. Utilizando STING como carga de prueba de concepto, este estudio demostró que el sistema modela eficazmente aspectos bioquímicos esenciales de la clasificación STING. Esta plataforma proporcionó una herramienta versátil y escalable para identificar factores citosólicos y señales de membrana que rigen la clasificación STING, con aplicaciones potenciales para estudiar una amplia variedad de otras vías de transporte vesiculares.

Protocolo

Las líneas celulares HEK-293F (RRID: CVCL_6642) y HEK-293T (RRID: CVCL_0063) se obtuvieron del Centro de Recursos Celulares del Peking Union Medical College. Ambas líneas celulares fueron autenticadas mediante perfilado de repetición tándem corta (STR) y se confirmó que estaban libres de contaminación por micoplasmas. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

No participaron en este estudio participantes humanos ni animales vertebrados. Por lo tanto, no se requería aprobación ética. Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo conforme a las directrices institucionales de bioseguridad.

1. Preparación del citosol de células HEK-293F

1. Células semilla HEK-293F a una densidad de 1 × 10⁶ células/mL en un medio de cultivo de mamíferos definido de 100 mL, suplementado con 1% de penicilina–estreptomicina. Cultiva las células en un matraz cónico de 500 mL.
2. Incubar el cultivo en suspensión a 37 °C con un 5% de CO₂ en una incubadora agitada durante 60 horas.
3. Extrae las células mediante centrifugación a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C. Determina el número total de celdas usando un contador automático.
4. Lava el pellet celular con 50 mL de solución salina fosfatada tamponada (PBS) bien fría. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
5. Suspende el pellet celular en un volumen igual de tampón de B88 helado (20 mM HEPES, pH 7,3; 250 mM sorbitol; 150 mM acetato de potasio; 5 mM acetato de magnesio).
6. Lisa las celdas sobre hielo pasando la suspensión por una jeringuilla de 5 mL equipada con una aguja calibre 22 para más de 100 movimientos.
7. Examina la lisis celular mediante microscopía óptica. Retirar los restos celulares mediante centrifugación a 20.000 × g durante 10 minutos a 4 °C.
8. Transfiere el sobrenadante a tubos ultracentrífugas. Centrifugar a 100.000 × g durante 1 hora a 4 °C.
   PRECAUCIÓN: Asegúrate de que los tubos de las ultracentrífugas estén correctamente equilibrados para evitar daños en el equipo y riesgos para la seguridad.
9. Recoge el sobrenadante aclarado. Concentra la muestra utilizando un dispositivo de ultrafiltración de corte de peso molecular (MWCO) de 3 kDa a 4.000 × g a 4 °C.
10. Mide la concentración de proteínas utilizando un ensayo de ácido bicinconínico (BCA). Ajusta la concentración a 30–40 mg/mL.
    PRECAUCIÓN: Manipula nitrógeno líquido con el equipo de protección adecuado para evitar lesiones criogénicas.
11. Alicuota del citosol. Congelar rápidamente las alicotas en nitrógeno líquido y almacenarlas a −80 °C (Figura 2A)
    PRECAUCIÓN: Evita más de dos ciclos de congelación-deshielo. Guarda las alicuotas a −80 °C durante hasta 6 meses.

2. Preparación de células HEK-293T semipermeabilizadas

1. Placas de células HEK-293T que expresan STING humano de longitud completa a una densidad de 3 × 10⁶ células por plato de 15 cm en 15 mL de DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% penicilina-estreptomicina. Incubar a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 48 horas.
2. Cosechar las células con aproximadamente un 60% de confluencia.
3. Aspira el medio y lava las células dos veces con 10 mL de PBS bien frío.
4. Añadir 2 mL de tripsina–EDTA al 0,25%. Incuba a temperatura ambiente durante 2–3 minutos para desprender las células.
5. Añadir 200 μL de inhibidor de tripsina de soja (1 mg/mL) para detener la tripsinización. Resuspender las células en 10 mL de tampón KHM helado (20 mM HEPES, pH 7,2; 110 mM acetato de potasio; 2 mM de acetato de magnesio).
6. Pelleta las células centrifugando a 250 × g durante 3 minutos. Descarta el sobrenadante.
   PRECAUCIÓN: La digitonina es tóxica. Maneja la manga en una campana extractora con el equipo de protección personal adecuado.
7. Resuspende las células en un buffer KHM de 6 mL helado. Añadir 6 μL de solución de digitonina (40 mg/mL en DMSO).
8. Mezcla suavemente por inversión. Incuba en hielo durante 5 minutos.
9. Añade 8 mL de tampón KHM para diluir la digitonina. Centrifugar a 250 × g durante 3 minutos para recoger las células permeabilizadas.
10. Suspende el pellet en un tampón HEPES helado de 14 mL (50 mM HEPES, pH 7,3; 90 mM de acetato de potasio). Incuba en hielo durante 10 minutos.
11. Centrifuga a 250 × g durante 3 minutos. Resuspende el pellet en 1 mL de KHM· helado Buffer de Cl (20 mM HEPES, pH 7,3; 110 mM KCl; 2 mM MgCl₂).
12. Centrifugar a 10.000 × g durante 15 segundos. Descarta el sobrenadante.
13. Resuspende el pellet en 50 μL KHM· Amortiguador de Cl. Mide la concentración de proteínas mediante un ensayo BCA y ajusta a 5–7 mg/mL.

3. Experimento de reconstitución de vesículas COPII sin células

1. Prepara todos los reactivos listados en la Tabla de Materiales. Alicota y guarda a −80 °C.
2. Prepara una mezcla de reacción de 50 μL que contenga 110 mM de KCl, 20 mM de HEPES (pH 7,2), 2 mM de MgCl₂, cóctel inhibidor de proteasas (1×), 0,2 mM de GTP y un sistema de regeneración de ATP (40 mM de creatina fosfato, 0,2 mg/mL de creatina fosfocinasa, 1 mM de ATP).
3. Añade cGAMP a una concentración final de 10 μM. Incuba la reacción a temperatura ambiente durante 15 minutos.
4. Añadir 50 μg de células HEK-293T semipermeabilizadas. Mezcla suavemente.
5. Añadir 80 μg de citosol HEK-293F para iniciar la formación de la vesícula. Incuba a 37 °C durante 45 minutos.
6. Coloca la reacción sobre hielo para terminar con la gemación. Centrifugar a 12.000 × g durante 20 minutos a 4 °C.
7. Recoge las vesículas que contienen el sobrenadante. Conserva el pellet que contiene orgánulos.
8. Ultracentrifugar el sobrenadante a 100.000 × g durante 1 hora a 4 °C. Resuspende la cápsula de vesícula en un tampón de carga proteica de 30 μL.
9. Calienta muestras a 95 °C durante 5 minutos. Centrifugar a 20.000 × g durante 5 minutos para eliminar los precipitados.
10. Realizar SDS-PAGE y transferir proteínas a las membranas de PVDF. Prueba con anticuerpos contra Sec22b, STING y RPN1.

Resultados

Durante la preparación del citosol de células HEK-293F, se evaluaron dos parámetros para evaluar la calidad del citosol. Las células HEK-293F se cultivaron a alta densidad, lo que dio lugar a extractos citosólicos con altas concentraciones de proteínas. Además, se evaluó el grado de alteración celular tras la lisis basada en jeringuilla mediante microscopía óptica, confirmando la eficiencia de la lisis celular bajo las condiciones aplicadas (Figura 2B).

...

Discusión

La reconstitución de reacciones bioquímicas esenciales in vitro ha sentado las bases de los sistemas libres de células, que han sido fundamentales en numerosos descubrimientos pioneros. Entre ellos se incluyen la identificación del cGAS como sensor de ADN^{citosólico 14,15}, la elucidación del papel del citocromo c en la apoptosis y el descubrimiento de la primera desmetilasa de histonas, JHDM1^16,17<...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringuillas estériles de 5 mL	WEGO	V526273	Utilizado para la lisis celular mecánica
Adenosina 5′-trifosfato (ATP)	MCE	HY-B2176	100 mM en agua, pH 7,3, almacenado a − 80 y ºC; C
Adobe Illustrator	Adobe Systems Incorporated	SCR_010279	Utilizado para crear ilustraciones conceptuales y diagramas esquemáticos
Sistema de regeneración ATP (10 veces)	—	—	Mezcla regeneradora de energía que contiene creatina fosfato, creatina quinasa y ATP
Kit de ensayo de proteínas BCA	Thermo Fisher	23227	Ensayo proteico colorimétrico
BioRender	BioRender	SCR_018361	Utilizado para crear ilustraciones conceptuales y diagramas esquemáticos
BSA	Biorigen	BN20815	Reactivo bloqueador
Incubadora agitadora de dióxido de carbono	ZhiChu	ZCZY-CS8	Mantiene la temperatura, CO2 y agitación para el cultivo en suspensión
Incubadora CO2	Thermo Fisher	3110	Mantiene la temperatura y CO2 para el cultivo adherente
Microscopio convencional	Olimpo	CX43	Utilizado para evaluar la lisis y morfología celular
Creatina quinasa	Roche	CKRO	20 mg/mL de fondo en buffer, almacenado en y en menos 80 y ºC; C
Fosfato de creatina	Roche	CRPHO-RO	Componente del sistema de regeneración ATP
Centrífuga de sobremesa	Eppendorf	5810R	Utilizado para centrifugación a baja velocidad
Digitonina	Sigma	D5628	Estojo de 40 mg/mL en DMSO, almacenado a y menos; 20 y grados C
DMEM	Corning	10-013-CMR	Medio de crecimiento para células HEK-293T
D-Sorbitol	Sangon	A100691	Solución de stock de 1 M en agua, almacenada a 4 grados; C
Reactivo de detección ECL	Biorigen	BN16009	Sustrato quimioluminiscente
Tanque de electroforesis	Bio-Rad	1658001	Aparatos para SDS-PAGE
Suero fetal bovino (FBS)	Corning	35-015-CV	Suplemento sérico
Rotor de ángulo fijo (TFT 80.2)	Thermo Fisher	54456	Rotor para ultracentrifugación
Celdas FreeStyle 293-F	Thermo Fisher	R79007	Utilizado para la preparación de citosoles
IgG antiratón de cabra (H+L)	Invitrogen	31430	Anticuerpo secundario conjugado con HRP
IgG anti-conejo de cabras (H+L)	Invitrogen	31460	Anticuerpo secundario conjugado con HRP
GraphPad Prism	GraphPad Software	SCR_002798	Utilizado para realizar análisis estadísticos (ANOVA unidireccional) y generar el gráfico de barras cuantitativo en la Figura 4D.
Guanosina 5′-trifosfato (GTP)	MCE	HY-113225	10 mM de stock en agua, pH 7,3, almacenado en − 80 y ºC; C
Células HEK-293T que expresan STING humano	—	—	Generados internamente; Utilizado como fuente de membrana
Amortiguador HEPES (1 M, pH 7,3)	Beyotime	C0215	Componente tampón para la preparación de la solución
Sistema de imagen	Bio-Rad	12003153	Utilizado para la detección de señales
Tetrahidrato de acetato de magnesio	Investigación Hampton	HR2-561	Componente de tampón para la preparación de B88
Cloruro de magnesio hexahidrato	Investigación Hampton	HR2-559	Componente búfer
Microcentrífuga	Eppendorf	5420R	Utilizado para centrifugación a velocidad media
Microcentrífuga	Eppendorf	5420	Utilizado para centrifugación rutinaria
Espectrofotómetro NanoDrop	Thermo Fisher	840-317400	Utilizado para la cuantificación de proteínas
Medio OPM-CD Trans293	OPM	P82019	Medio sin suero para la cultura de suspensión HEK-293F
Penicilina– estreptomicina (100 veces)	Servicebio	G4003	Suplemento antibiótico para cultivo celular
Fenilmetil sulfonilfluoruro (PMSF)	Sangon	A610425	Inhibidor de proteasa
Inhibidores de la fosfatasa	Laboratorio	C0104	Prevenir la desfosforilación de proteínas
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Servicebio	G4202	Amortiguador para lavar celdas
Acetato de potasio	Sigma	236497	Solución de stock de 1 M en agua, almacenada a 4 grados; C
Suministro eléctrico	Bio-Rad	1645052	Proporciona voltaje para la electroforesis
Cóctel inhibidor de proteasas, libre de EDTA	Roche	4693132001	Mezcla de inhibidores de proteasas de amplio espectro
Membrana PVDF	Millipore	ISEQ00010	Membrana para Western blot
Anticuerpo RPN1 (mab de conejo)	Abcam	ab197888	Marcador ER
El gel SDS-PAGE (4– 20%)	—	—	Utilizado para la separación de proteínas
Búfer de carga SDS-PAGE (5 veces)	Solarbio	P1040	Amortiguador de preparación de muestras de proteínas
Anticuerpo Sec22b (mab de conejo)	Abcam	ab181076	Marcador de carga COPII
Inhibidor de tripsina de soja (SBTI)	Sigma	T9128	1 mg/mL en PBS, almacenado a − 20 y grados C
Anticuerpo de la picadura (conejo mAB)	CST	13647	Anticuerpo primario
Búfer TBST	Servicebio	G0004	Amortiguador de lavado para inmunoblot
Ciclador térmico	Bio-Rad	186-1096	Utilizado para calefacción e incubación
Baño metálico termostático	DLAB	5062102100	Mantiene la temperatura constante
Celda de transferencia	Bio-Rad	1703930	Utilizado para transferencia de proteínas
Tripsina-EDTA (0,25%)	Servicebio	G4011	Utilizado para el desprendimiento celular
Ultracentrífuga	Thermo Fisher	75000100	Utilizado para centrifugación a alta velocidad
Tubos ultracentrífugas (2 mL)	Thermo Fisher	54460	Tubos compatibles con ultracentrifugación
Tubo de ultrafiltración (4 mL, 10 kDa MWCO)	Millipore	UFC8010	Uso para la concentración de citosoles