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Ensayo de protección con amikacina para cuantificación y visualización de la invasión celular de Escherichia coli

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DOI:

10.3791/71108

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3 de julio de 2026

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1Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 3Howard Hughes Medical Institute, University of Texas Southwestern Medical Center, 4Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center

En este artículo

Resumen

La resistencia a los antibióticos entre cepas invasivas de Escherichia coli por adherentes plantea desafíos para evaluar la invasión bacteriana utilizando el ensayo tradicional de protección contra gentamicina. Se describe un método mejorado para evaluar cuantitativamente la invasión bacteriana enumerando unidades formadoras de colonias y cualitativamente mediante visualización de células infectadas mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia.

Resumen

La invasión de células epiteliales es un fenotipo clave para muchos patógenos entéricos, incluyendo Salmonella, Shigella y Vibrio. Un patógeno invasivo emergente es Escherichia coli (AIEC), que está implicado en la patogénesis de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). Las cepas AIEC carecen de factores de virulencia comúnmente asociados con otros patógenos invasores, lo que dificulta la identificación genética. Como resultado, las cepas AIEC se clasifican fenotípicamente en función de su capacidad para invadir células epiteliales mediante un ensayo estándar de campo de protección contra gentamicina. Sin embargo, dado que las cepas AIEC suelen aislarse de pacientes con EII que reciben diversos antibióticos como parte de su régimen de tratamiento, el aumento de aislados resistentes a gentamicina ha hecho que este ensayo sea menos fiable para la clasificación AIEC. Para evitar este problema, se desarrolló un ensayo alternativo de protección basado en amikacina para cuantificar y visualizar la invasión celular AIEC. Este ensayo utiliza amikacina, un aminoglucósido semisintético de amplio espectro que ataca eficazmente cepas resistentes a otros aminoglucósidos, mientras permanece extracelular a las células hospedadoras eucariotas. Así, las bacterias extracelulares mueren durante la infección mientras que las intracelulares quedan "protegidas". Esto constituye la base de un ensayo cuantitativo para comparar la invasividad de cepas, medida como el porcentaje de la puntuación de invasión utilizando unidades formadoras de colonias (UFC) recuperadas tras la infección. Este ensayo también puede utilizarse como medida cualitativa de la invasión mediante la inmunotinción de células epiteliales infectadas y la visualización de estas células mediante microscopía confocal. Este método sirve como herramienta diagnóstica para detectar AIEC a pacientes con EII, que también puede aplicarse a otros patógenos multirresistentes para evaluar la invasión celular, un indicador de virulencia y patogenicidad.

Introducción

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que incluye la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa, es una enfermedad inflamatoria gastrointestinal crónica que afecta a millones de personas entodo el mundo. A pesar del aumento de la incidencia global de EII, su etiología precisa sigue siendo incierta, debido a la compleja interacción de factores genéticos, ambientales, microbianos einmunológicos 2,3. Una característica distintiva de la EII es la alteración de la composición microbiana intestinal, que a menudo está impulsada por factores ambientales, como una dieta alta en azúcares y grasas común en paísesindustrializados 4,5. La microbiota de los pacientes con EII se caracteriza frecuentemente por una reducción de la diversidad microbiana, el enriquecimiento de Gammaproteobacterias patógenas y el agotamiento de los Firmicutesprotectores 6,7. En pacientes con MC, Escherichia coli (E. coli) está enriquecida en la microbiota intestinal, se asocia e invade la mucosa intestinal, y se correlaciona positivamente con enfermedad activa y grave8,9. Este patótipo emergente de E. coli asociado con la EC se denomina Escherichia coli invasiva adherente (AIEC).

AIEC son patógenos oportunistas gramnegativos que colonizan la mucosa ileal de pacientes con CD con una mayor propensión que los controlessanos 10. Las cepas AIEC aisladas de pacientes con CD son genéticamente diversas, abarcando a menudo todos los filogrupos de E. coli que incluyen tanto E. coli comensales como patógenos E. coli 11. A diferencia de patógenos como Shigella y Salmonella, que dependen del uso de sistemas de secreción tipo III para facilitar la invasión de las células huésped, el AIEC carece de estos sistemas de virulenciaconservados 12. Por lo tanto, nuestra comprensión de la virulencia AIEC se basa en gran medida en su fenotipo in vitro, que se caracteriza por su capacidad para adherirse e invadir células epiteliales y sobrevivir dentro de los macrófagos10.

La invasión de células epiteliales por la AIEC está mediada por múltiples factores de virulencia, incluyendo el pilus tipo 1 y las fimbrias polares largas. FimH, situada en la punta del pilus tipo 1, media la adhesión a los residuos de manosa en el receptor del huésped fuertemente glicosilado CEACAM613. Esta unión promueve la entrada de AIEC en enterocitos y apoya su replicaciónintracelular 14. AIEC también se adhiere a las células microfold (M), células epiteliales especializadas situadas sobre las zonas de Peyer mediante interacciones entre sus fimbrias polares largas y la glicoproteína de la proteína de superficie de células M 215,16. Esta adhesión permite a la AIEC translocar entre células M, alcanzar macrófagos subyacentes y desencadenar la expresión de citocinas proinflamatorias como el TNF-α, que no solo promueven la inflamación sino que también favorecen la replicación bacteriana dentro de losmacrófagos 17,18. Se hipotetiza que estos mecanismos patógenos perpetúan la inflamación crónica en el huésped, como se observa en la enfermedad de la muerte.

Los AIEC se definen por su fenotipo in vitro , lo que hace que el ensayo de protección contra la gentamicina sea indispensable para la clasificación de cepas y el descubrimiento de factores devirulencia 8. Este enfoque puede complicarse por aislados resistentes a gentamicina, lo que puede resultar en su clasificación errónea comoinvasora 11. Para evitar este problema, se probaron antibióticos alternativos que eliminan eficazmente aislados resistentes a gentamicina sin penetrar las membranas de las células huésped. Mediante este enfoque, se identificó la amikacina como un sustituto adecuado de la gentamicina, ofreciendo eficacia y compatibilidad comparables con ensayos estándar de invasión, así como una citotoxicidad mínima, como se evidenció por la tinción con azul de tripán en estudios previos y posteriormente validada aquí mediante un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (Figura suplementaria 1)11. La amikacina es un aminoglucósido semisintético derivado de la kanamicina que inhibe el crecimiento bacteriano al interrumpir la síntesis deproteínas 19. La amikacina es especialmente eficaz contra bacterias gramnegativas multirresistentes, incluyendo Pseudomonas, Acinetobacter y Escherichia species19. Cabe destacar que las modificaciones estructurales en la columna vertebral de la kanamicina hacen que la amikacina sea menos susceptible a las enzimas bacterianas inactivadoras deaminoglucósidos 19. Como resultado, la amikacina representa una alternativa robusta a la gentamicina para atacar bacterias multirresistentes a fármacos en ensayos de invasión. Los siguientes protocolos describen cómo evaluar el fenotipo de invasión de E. coli utilizando tanto la cepa de referencia NRG857c como aislados clínicos con el ensayo de protección contra la amikacina.

Protocolo

NOTA: Este protocolo describe un método para evaluar la capacidad de invasión de cepas AIEC en células epiteliales de Caco-2. La concentración de amikacina utilizada en este protocolo (240 μg/mL) corresponde al 10× de la concentración inhibitoria mínima (CMI), determinada mediante tiras reactivas de CMI de amikacina en un panel de 32 aislados clínicos representativos de AIEC de 13 pacientes con enfermedad inflamatoriaintestinal 11. Los investigadores deben determinar la CIM para sus propios aislados AIEC antes de realizar el ensayo (véase Tabla de Materiales), ya que la susceptibilidad a los antibióticos puede variar entre aislados. La Sección 1 detalla el ensayo de protección contra la amikacina para la cuantificación del porcentaje de invasión, y la Sección 2 describe el ensayo de protección contra la amikacina para microscopía confocal.

1. Ensayo de protección contra amikacinas para cuantificar el porcentaje de invasión

  1. Recubrimiento de colágeno de placas de 24 pozos
    1. Diluir 35,29 μL de ácido acético glacial estéril (véase Tabla de Materiales) en 30 mL de 1× PBS (véase Tabla de Materiales) en un tubo cónico de 50 mL.
    2. Pipetear 300 μL de colágeno (véase Tabla de Materiales) en el 1× PBS con solución de ácido acético.
    3. Solución de vórtice durante 10 segundos para mezclar bien.
    4. Dispensar 250 μL de la solución de colágeno diluida en cada pozo de una placa estéril tratada con cultivo tisular de 24 pozos.
      NOTA: La solución de colágeno de 30 mL es suficiente para cubrir aproximadamente cinco placas de 24 pozos.
    5. Inclina la placa en todas las direcciones para asegurarte de que la solución ha cubierto uniformemente el fondo de cada pozo.
    6. Incuba las placas a 37 °C durante 2 horas para permitir que el colágeno se adhiera a la superficie plástica.
    7. Una vez completada la incubación, aspira la solución de colágeno de cada pozo.
    8. Pipetear 1 mL de 1× PBS en cada pozo para lavar el colágeno residual y aspirar cada pozo. Repite este paso dos veces más (3 lavados en total).
    9. Placas secas dentro de un armario de seguridad biológica para asegurarse de que toda la humedad visible se haya evaporado.
      NOTA: Las placas pueden usarse inmediatamente para la siembra de células o almacenarse a temperatura ambiente. Al guardar las placas, sella el perímetro exterior con parafilm estéril o colócalas dentro de una bolsa ziplock estéril.

  1. Preparación de soluciones de acción amikacina
    1. Pesa 240 mg de disulfato de amikacina (véase Tabla de Materiales) y transfiere a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Pipetear 1 mL de agua estéril y solubilizar la amikacina mediante vórtice, produciendo una concentración final de 240 mg/mL (1000× stock).
    3. Haz 20 μL de alicotas de la solución de amikacina y guárdalas a -20 °C.
      NOTA: La amikacina se mantiene estable a -20 °C durante 6–12 meses. Prepara alicotas de un solo uso para minimizar ciclos repetidos de congelación y deshielo.
  2. Preparación de las células Caco-2
    1. Descongelación de celdas Caco-2 a partir de stock congelado
      1. Preparar un medio de crecimiento completo suplementando el Medio Águila Modificado de Dulbecco (DMEM, véase Tabla de Materiales) con suero bovino fetal al 10% (FBS, véase Tabla de Materiales) y solución antibiótico-antimicótica al 1% (véase Tabla de Materiales).
      2. Precalentar el medio en un baño María a 37 °C durante 30 minutos.
      3. Coloca el vial congelado de las células Caco-2 en un baño maria a 37 °C e incuba durante 1–2 minutos hasta que las células estén completamente descongeladas.
      4. Retira el vial del baño maria y rocía el exterior del frasco con etanol al 70%.
      5. Dentro de un armario de seguridad biológica, pipetear las células en un tubo cónico de 15 mL que contiene 9 mL de medio de crecimiento completo.
      6. Centrifuga las celdas a 500 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
      7. Aspira el sobrenadante y vuelve a suspender la cápsula en 5 mL de medio de crecimiento completo.
      8. Transfiere las células a un matraz decultivo tisular de 75 cm (T75) que contiene 10 mL de medio de crecimiento completo y caliente.
      9. Haz girar la placa 3 veces para asegurarte de que las células estén distribuidas uniformemente por la parte inferior de la placa.
      10. Incuba las células a 37 °C con un 5% de CO2 hasta que las células alcancen una confluencia del ~90% (6–7 días).
        NOTA: La confluencia se estima mediante una aproximación de visualización de las células usando un microscopio óptico. Cambia el medio cada 3 días mientras las células se recuperan.
    2. Siembra de células Caco-2
      1. Medio de crecimiento completo precalentado y 0,25% (p/v) de tripsina-EDTA (véase Tabla de Materiales) en un baño maría a 37 °C.
      2. Una vez que las células Caco-2 alcanzan el ~90% de confluencia, aspira medios de cultivo celular y añade 2 mL de tripsina-EDTA. Inclina el matraz para que la solución de tripsina cubra toda la superficie inferior del matraz y así asegurar que se inactiven todas las trazas de FBS.
      3. Aspira la solución de tripsina-EDTA y añade 3 mL de tripsina-EDTA. Incuba las células a 37 °C con 5% deCO2 durante 5–15 minutos. Visualiza las células usando un microscopio óptico en varios momentos durante el periodo de incubación para observar el redondeo celular, indicando que las células se han desprendido.
        NOTA: Evita golpear el lateral del matraz para facilitar el desprendimiento celular, ya que esto puede causar que las células se agrupen.
      4. Pipetear 6 mL de medio de crecimiento completo para desactivar la solución de tripsina-EDTA y mezclar pipeteando suavemente arriba y abajo para resuspender las células.
      5. Pipete las celdas en un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 500 × g durante 5 minutos para hacer las pilas en pellet.
      6. Aspirar medios y resuspender las células en 3 mL de medio de crecimiento completo.
      7. Transfiere 10 μL de las celdas Caco-2 suspendidas a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Añade 10 μL de tinte azul Trypan (véase Tabla de Materiales) al tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y mezcla pipeteando arriba y abajo varias veces.
      8. Pipetear 10 μL de la mezcla azul Caco-2/Trippan a una lámina de la celda (véase Tabla de Materiales). Enumerar el número de células vivas para calcular la viabilidad celular.
        NOTA: Al enumerar el número de celdas Caco-2 presentes, solo considera el número de células vivas, no el número total de celdas para la siembra.
      9. Semillas de células Caco-2 en una placa de 24 pozos o en un matraz T75.
      10. Para una placa de 24 pozos, sigue los pasos siguientes:
        1. Semillas de células Caco-2 a una concentración de 1 x 105 celdas/mL usando la siguiente ecuación:
          [(1 × 105 celdas) (Número de pozos que se siembran + 2)] / [Concentración de celdas viables (celdas/mL)] = celdas (mL)
        2. Retirar el volumen de celdas calculado arriba de las celdas Caco-2 suspendidas en el paso 3.2.6 en un tubo cónico de 15 mL. Calcula el volumen de medio de crecimiento completo que se va a añadir a las células usando la siguiente ecuación:
          (Número de pozos que se siembran + 2 pozos) - celdas (mL) = medio (mL)
          NOTA: Los "pozos +2" en el cálculo son para tener en cuenta el error de pipeteo.
        3. Pipetear el volumen del medio calculado arriba en el cónico de 15 mL que contiene las celdas Caco-2 y mezclar pipeteando varias veces arriba y abajo.
        4. Pipetear 1 mL de células Caco-2 en medio de crecimiento completo (concentración final 1 x 105 células/mL) en cada pozo de la placa de 24 pozos recubierta de colágeno.
        5. Incubar la placa a 37 °C con un 5% de CO2 hasta que las células alcancen un ~90% de confluencia (3–4 días).
      11. Para un matraz T75, sigue los pasos a continuación:
        1. Transfiere 7,5 x 10 5 celdasviables a un matraz T75 usando la siguiente ecuación:
          [(7,5 × 105 celdas)] / [concentración viable de recuento celular (células/mL)] = células (mL)
          NOTA: El número de células viables para añadir al matraz T75 se determinó en base a las directrices del ATCC para el cultivo de células Caco-2.
        2. Retira el volumen de celdas calculado arriba y transfiere a un matraz T75. Calcula el volumen de medio de crecimiento completo que se va a añadir a las células usando la siguiente ecuación:
          15 mL - volumen de celdas añadidas al matraz = medio (mL)
        3. Pipetear el volumen de medios calculado arriba al matraz T75.
        4. Haz girar la placa suavemente varias veces para dispersar uniformemente las células por el fondo del frasco. Incubar a 37 °C con un 5% deCO2 hasta que las células alcancen una confluencia del ~90% (3–4 días).
  3. Ensayo de Protección Amikacin
    NOTA: Asegúrese de que todo el medio de cultivo celular esté precalentado a 37 °C antes del inicio del experimento.
    1. Preparación de bacterias
      1. Usando un palo de madera estéril o una punta de pipeta estéril, raspa suavemente bacterias de un stock de glicerol bacteriano congelado almacenado a -80 °C y traza en una placa de agar de LB para obtener colonias individuales. Incuba la placa a 37 °C durante la noche.
      2. Usando un palo de madera estéril o una punta de pipeta estéril, recoge una sola colonia de la placa de agar e inocúla en 3 mL de caldo. Incuba el cultivo a 37 °C agitando a 200 rpm durante la noche.
      3. Realizar una dilución 1:10 del cultivo nocturno en caldo de 1 mL LB y medir la densidad óptica a 600 nm (OD600) del cultivo usando un espectrofotómetro.
    2. Cálculo de multiplicidad de infección (MOI)
      1. Transfiere 100 μL del cultivo nocturno a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL y centrifuga a 6000 × g durante 10 minutos a 4 °C.
      2. Aspira el sobrenadante con cuidado para no alterar la cápsula celular. Resuspende el pellet en 1 mL de suero y medios libres de antibióticos y antimicóticos.
        NOTA: Esto es una dilución 1:10 del cultivo bacteriano durante la noche. Para el cálculo del MOI, utiliza el valor brutode OD 600 calculado para el cultivo diluido durante la noche en el paso 4.1.3, no el valor OD600 corregido por el factor de dilución.
      3. Calcula el volumen de suspensión bacteriana a añadir desde el paso 4.2.2 para infectar las células Caco-2 con un MOI de 10 usando el siguiente cálculo:
        [1 unidad de OD/2,4 × 109 bacterias] × [10 bacterias/célula] × [1 mL × OD 1:10] × 1 ×105 ×103 = volumen (uL)
        NOTA: Registre cuidadosamente el volumen calculado para cada muestra, ya que este valor se utilizará más adelante para calcular el inóculo CFU/mL. Este volumen de suspensión bacteriana es solo para un pozo dentro de la placa de 24 pozos.
      4. Prepara el medio infectado transfiriendo el volumen calculado de la suspensión bacteriana del paso 4.2.3 a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL. Añade 1 mL de suero y medios libres de antibióticos y antimicóticos. Mezcla suavemente pipeteando arriba y abajo varias veces.
    3. Infección por células Caco-2
      1. Retirar la placa de 24 pozos que contiene las monocapas de células Caco-2 de la incubadora y aspirar el medio completo.
      2. Pipetear 1 mL de suero y medios libres de antibióticos y antimicóticos en cada pozo y aspirar para eliminar rastros de medios que contengan suero. Repite este paso una vez más (2 lavados en total).
        NOTA: Reducir la presión de vacío al aspirar para evitar alterar la monocapa celular.
      3. Pipetear 1 mL del medio infectivo desde el paso 4.2.4 a cada pozo de la placa de 24 pozos que contiene las células Caco-2.
      4. Centrifugar la placa de 24 pozos a 500 × g durante 15 minutos a temperatura ambiente para sincronizar el contacto bacteriano con las células epiteliales.
      5. Incubar la placa de 24 pozos a 37 °C con 5% deCO2 durante 3 horas para permitir la invasión bacteriana.
      6. Durante el periodo de incubación, determina la CFU/mL del cultivo diluido durante la noche a partir del paso 4.2.2 realizando diluciones en serie de 10 veces en PBS estéril de 1× usando una placa de 96 pozos.
        1. Para preparar cada dilución, transfiere 200 μL del cultivo diluido durante la noche desde el paso 4.2.2 hasta el primer pozo de la placa.
        2. Pipetear 20 μL del cultivo a la siguiente fila, que contiene 180 μL de 1× PBS. Mezcla pipeteando arriba y abajo 10 veces. Repite hasta que las diluciones alcancen 10-6 usando una punta nueva de pipeta para la transferencia cada vez.
        3. La placa 10 μL de diluciones puntuales triplica de las 10-2 a 10-6 diluciones sobre placas de agar LB. Deja que las manchas se absorban en el agar bajo la llama.
        4. Incubar las placas durante la noche a 27–30 °C para evitar el crecimiento excesivo de colonias y asegurar que las colonias individuales queden claras y separadas.
          NOTA: El placado puntual en triplicado mejora la precisión de la cuantificación y permite la detección en una variedad de concentraciones bacterianas. La temperatura de incubación más baja ralentiza el crecimiento bacteriano, lo que permite una estimación más precisa de la UFC a partir de muestras de alta concentración.
      7. Preparar un medio que contenga antibióticos añadiendo 240 μg/mL de amikacina a suero precalentado y medios libres de antibióticos y antimicóticos.
      8. Tras completar la infección de 3 h, aspira el medio de las monocapas de células Caco-2. Añade 1 mL de suero y medios libres de antibióticos y antimicóticos a cada pozo. Repite este paso una vez más (2 lavados en total).
      9. Pipetear 1 mL de un medio que contenga amikacina de 240 μg/mL en cada pozo e incubar a 37 °C con 5% deCO2 durante 1 hora para eliminar bacterias extracelulares.
      10. Aspira el medio de cada pozo y añade 1 mL de 1× PBS para eliminar las bacterias adherentes que mueren por la amikacina. Repite este paso una vez más (2 lavados en total).
      11. Pipeta 200 μL de 1% Tritón-X-100 (véase Tabla de Materiales) diluida en 1× PBS en cada pozo. Incubar en un agitador orbitario a 90 rpm durante 10 minutos para lisar las células epiteliales.
      12. Desacoplan las células de la placa de 24 pozos pipeteando aproximadamente 30 veces por pozo.
        NOTA: Dado que recubrir las placas con colágeno mejora la adherencia celular, es importante asegurarse de que la monocapa se haya desprendido de la placa. Esto puede confirmarse visualmente comparando un pozo lisado en relación con uno no lisado y un pozo sin células Caco-2, que se verá claro.
      13. Realizar diluciones en serie de 10 veces de los lisados celulares en una placa de 96 pozos usando 1× PBS.
        NOTA: Realiza las diluciones en serie hasta la dilución 10-3 .
      14. Lámina de 10 μL de diluciones puntuales en triplicado, que van desde las no diluidas hasta las 10-3 diluciones, sobre placas de agar LB. Deja que las manchas se absorban en el agar bajo la llama. Incubar las placas durante la noche a 27–30 °C para evitar el sobrecrecimiento de las colonias y asegurar colonias individuales claras y separadas.
    4. Conteo de colonias y cálculo del porcentaje de invasión
      1. Tras la incubación nocturna, cuenta el número de colonias en cada dilución puntual del cultivo nocturno diluido y del lisado recuperado. Selecciona una dilución en la que cada punto contenga más de 7 colonias aisladas. Utiliza la misma dilución a lo largo de los triplicados para calcular el número medio de colonias bacterianas obtenidas para esa dilución.
        NOTA: Cuenta las diluciones que contienen colonias individuales bien aisladas y evita contar las diluciones que contengan colonias en contacto.
      2. Calcula la CFU/mL del inóculo, la CFU/mL recuperada y el porcentaje de invasión usando las siguientes ecuaciones:
        UFC del inóculo (UFC/mL):
        Inóculo de la UFC = (número medio de colonias) (factor de dilución) (volumen del medio infeccioso (μL) x 100
        UFC recuperado (UFC/mL):
        UFCrecuperada = (número medio de colonias) (factor de dilución) x 100
        Porcentaje de invasión (%):
        Invasión (%) = [(UFC recuperada)/(inóculo de UCC)] × 100

2. Ensayo de protección con amikacina para microscopía confocal

  1. Preparación de cubiertas estériles recubiertas de poli-L-lisina
    1. En un armario de seguridad biológica, se utilizan pinzas estériles para colocar las cubiertas recubiertas de poli-L-lisina (véase la Tabla de Materiales) sobre una toalla de papel empapada en un 70% de etanol.
    2. Rocía ambas láminas de las cubiertas con un 70% de etanol, usando pinzas estériles para voltear la funda a cada lado.
    3. Deja que las cubiertas se sequen bajo luz UV en el armario de seguridad biológica hasta que estén completamente secas.
  2. Siembra de celdas Caco-2 en una placa de 6 pozos
    1. En un armario de seguridad biológica, coloque 1 cubierta recubierta de poli-L-lisina en cada pozo de una placa de 6 pozos.
    2. Repite los pasos 3.2.1–3.2.8 de la sección "Sembrado de celdas Caco-2".
    3. Semillar las células Caco-2 a una concentración de 1 x 105 células/mL en una placa de 6 pozos usando la siguiente ecuación:
      [(1 × 105 celdas) (Número de pozos que se siembran + 2)] / [Concentración de células viables (células/mL)] × 2 = celdas (mL)
      NOTA: Este valor se multiplica por 2 para tener en cuenta la adición de 2 mL de medio por pozo al usar una placa de 6 pozos.
    4. Retira el volumen de celdas calculado arriba en un tubo cónico de 15 mL. Calcula el volumen de medio de crecimiento completo que se va a añadir a las células usando la siguiente ecuación:
       (Número de pozos que se siembran + 2 pozos) x 2 - celdas (mL) = medio (mL)
    5. Pipetear el volumen del medio calculado arriba en el cónico de 15 mL que contiene las celdas Caco-2 y mezclar pipeteando varias veces arriba y abajo.
    6. Añadir 2 mL de células Caco-2 en medio de crecimiento completo a cada pozo de la placa de 6 pozos (concentración final 1 × 105 células/mL).
    7. Incubar la placa a 37 °C con 5% de CO2 hasta que las células alcancen una confluencia del ~90% (2–3 días).
  3. Ensayo de protección con amikacina
    1. Realizar el ensayo de protección de la amikacina tal y como está escrito en la Sección 1, Pasos 4.1-4.3.10
  4. Tinción por inmunofluorescencia
    1. Fijación y permeabilización de células Caco-2
      1. Fija las celdas añadiendo 1 mL de paraformaldehído al 4% diluido en 1X PBS (véase Tabla de Materiales) a cada pozo. Incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
      2. Aspira cada pozo y añade 1 mL de 1× PBS a las células de lavado. Repite este paso dos veces más (3 lavados en total).
        NOTA: Las células pueden almacenarse durante varios días en 1X PBS a 4 °C.
      3. Añade 1 mL de Triton-X-100 al 0,1% a cada pozo e incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente para permeabilizar las células.
      4. Aspira la solución de Triton-X-100 y añade 1 mL de 1× PBS a cada pozo. Incuba las células con 1× PBS durante 5 minutos. Repite este paso dos veces más (3 lavados en total).
    2. Bloqueo y tinción por anticuerpos
      1. Para evitar la unión inespecífica de anticuerpos, prepare una solución bloqueante usando albúmina sérica bovina al 1% (BSA), 22,52 mg/mL de glicina en 1× PBS + 0,1% Tween20 (véase la Tabla de Materiales).
      2. Añade 1 mL de solución bloqueante a cada pozo e incuba durante 1 hora a temperatura ambiente.
        NOTA: El paso de bloqueo también puede realizarse a 4 °C durante 16 horas.
      3. Aspirar solución bloqueante e incubar células con anticuerpo primario anti-Rabbit E. coli (véase Tabla de Materiales) diluido (dilución recomendada 1:500) en solución bloqueante durante 1 hora a temperatura ambiente.
        NOTA: La incubación con el anticuerpo primario también puede realizarse a 4 °C durante 16 horas.
      4. Aspirar la solución primaria de anticuerpos y añadir 1 mL de 1× PBS + 0,1% Tween20. Incubar las células en 1× PBS + 0,1% Tween20 durante 5 minutos. Repite este paso dos veces más (3 lavados en total).
      5. Incubar células con anticuerpo secundario anti-Rabbit Alexa Fluor 488 (véase Tabla de Materiales) diluido (dilución recomendada 1:1000) en solución bloqueante durante 1 hora a temperatura ambiente. Envuelva la placa en papel de aluminio para proteger al fluoróforo de la luz.
      6. Aspirar la solución secundaria de anticuerpos y añadir 1 mL de 1× PBS + 0,1% Tween20. Incubar las células en 1× PBS + 0,1% Tween20 durante 5 minutos. Repite este paso dos veces más (3 lavados en total).
    3. Contratinción y montaje del abrigo
      1. Para teñir el ADN del huésped y el bacteriano y la actina del huésped, preparar una dilución combinada usando 10 mg/mL de Hoechst (dilución recomendada 1:2000, véase Tabla de Materiales) y Rodamina-faloidina (dilución recomendada 1:1000, véase Tabla de Materiales) en 1× PBS.
      2. Añade 1 mL de solución de tinte a cada pozo y incuba durante 10 minutos.
      3. Retira la solución de colorante y añade 1 mL de 1× PBS a cada pozo. Repite este paso una vez más (2 lavados en total).
      4. Añade 1 mL de 1× PBS y deja las células sumergidas en la solución.
      5. Coloca una gota de medio de montaje (véase Tabla de Materiales) sobre la diapositiva etiquetada.
      6. Levanta cuidadosamente el portafiltro de la placa de 6 pozos usando una aguja doblada y invierte el abrigo de modo que el lado que contiene las celdas mire hacia el portaobjetos que contiene el medio de montaje.
      7. Coloca el cubrebocas sobre el soporte de montaje. Asegúrate de que el soporte de montaje esté distribuido uniformemente por todo el cubrimiento.
      8. Incuba los portaobjetos montados a temperatura ambiente durante la noche en la oscuridad.
      9. Sella los bordes de la funda con esmalte transparente y guarda las guías a 4 °C en una caja de correderas.
      10. Fotografía las muestras montadas usando los canales correspondientes que corresponden a los tintes/fluoróforos usados con un microscopio confocal.

Resultados

Para evaluar la eficacia del tratamiento con amikacina en la eliminación de bacterias extracelulares y visualizar la invasión intracelular, realizamos experimentos de infección utilizando monocapas de células Caco-2. Como se muestra en la Figura 1, el tratamiento con gentamicina o amikacina tras la infección con E. coli NRG857c (control positivo) o E. coli DH5α (control negativo) dio lugar a perfiles de invasión similares. Estos hallazgos indican que la amikacina es tan eficaz como la gentamicina para eliminar bacterias extracelulares y refleja con precisión la carga bacteriana intracelular, apoyando su uso como antibiótico alternativo para ensayos de invasión. Se considera aceptable un rango de recuperación de ~4-10% de NRG857c y <1% de E. coli DH5α para una interpretación precisa de fenotipos de invasión en relación con cepas mutantes u otros aislados clínicos, consistente con observacionesprevias 11. Si las puntuaciones porcentuales de invasión para los controles positivo y negativo están fuera de este rango de recuperación esperado, los resultados deben interpretarse con cautela y el ensayo debe repetirse.

Para demostrar que la amikacina puede atacar eficazmente aislados clínicos de E. coli resistentes a la gentamicina, se realizaron ensayos de protección con gentamicina y amikacina en paralelo, y se examinaron los perfiles de invasión de los aislados. Como se muestra en la Figura 2, el tratamiento de aislados resistentes a gentamicina con gentamicina dio lugar a valores de recuperación muy variables, que oscilaban entre el 21,52% y el 2788,50%. En contraste, el tratamiento con amikacina redujo drásticamente la recuperación en todos los aislados, destacando su eficacia y permitiendo mediciones de invasión más precisas y fiables.

Finalmente, para evaluar el fenotipo intracelular de AIEC durante la invasión, las células Caco-2 fueron infectadas con E. coli NRG857c. La Figura 3 muestra una imagen representativa de una célula Caco-2 infectada con bacterias (verde) teñidas por inmunofluorescencia, actina del huésped (rojo) y ADN (azul) visualizadas mediante contratinción con rodamina-faloidina y Hoechst, respectivamente. A las 4 horas de la infección, se observa que NRG857c se replica en el citoplasma, localizándose cerca del núcleo y dentro de los límites de actina, lo que confirma la naturaleza intracelular de estas bacterias.

figure-results-1
Figura 1: La adición de gentamicina o amikacina a células Caco-2 infectadas con la cepa AIEC NRG857c da lugar a perfiles de invasión comparables. Las monocapas de células Caco-2 fueron infectadas con la cepa AIEC NRG857c y E. coli DH5α con un MOI de 10. Tras 3 horas de infección, las células fueron tratadas durante 1 hora con gentamicina (100 μg/mL) o amikacina (240 μg/mL) para eliminar bacterias extracelulares. Las células se lisaron con Tritón-X-100 al 1%, y los homogeneados se diluyeron en serie y se placaron en agar LB para la enumeración de la UFC. La invasión se expresó como el porcentaje de bacterias recuperadas en relación con el inóculo inicial. Los datos representan tres experimentos independientes (n = 3); Las barras de error indican la desviación estándar de la media. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: La amikacina ataca eficazmente cepas resistentes a la gentamicina de E. coli. Las monocapas de Caco-2 se infectaron con cepas de E. coli aisladas de pacientes con EII con un MOI de 10. Tras 3 horas de infección, las células se trataron durante 1 hora con gentamicina (100 μg/mL) o amikacina (240 μg/mL) para eliminar bacterias extracelulares. Las células se lisaron con Tritón-X-100 al 1%, y los homogeneados se diluyeron en serie y se placaron en agar LB para la enumeración de la UFC. La invasión se expresó como el porcentaje de bacterias recuperadas en relación con el inóculo inicial. Los datos representan tres experimentos independientes (n = 3); Las barras de error indican la desviación estándar de la media. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Visualización de la invasión de células epiteliales por E. coli. Micrografías confocales representativas de células Caco-2 infectaron E. coli NRG857c. Las células Caco-2 se infectaron durante 3 horas, seguidas de una incubación de 1 hora con amikacina (240 μg/mL). La actina del huésped se teñió con rodamina-Falodin (rojo), y el ADN del huésped y el bacteriano se tiñeron con Hoechst (azul). Se detectó E. coli (verde) usando un anticuerpo primario anticonejo E. coli y un anticuerpo secundario anticonejo Alexa Fluor 488 anticonejo. Las imágenes se adquirieron con un objetivo de 63× con un zoom de 3× utilizando un microscopio confocal Leica. Barras de escala = 10 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: Diagrama de flujo del estudio. (A)Las cepas AIEC se cultivaron durante la noche, se lavaron y añadieron a monocapas Caco-2 con un MOI de 10. Tras 3 horas de infección y 1 hora de tratamiento con amikacina, se recuperaron y cuantificaron bacterias intracelulares mediante diluciones en serie de placas en triplicados. (B) Las monocapas infectadas fueron fijadas, teñidas con anticuerpos e imágenes mediante microscopía de fluorescencia. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: El tratamiento con amikacina resulta en una citotoxicidad mínima en las células epiteliales. Las células Caco-2 fueron tratadas con gentamicina (100 μg/mL) o amikacina (240 μg/mL) durante 1 hora. La citotoxicidad se determinó midiendo la lactato deshidrogenasa liberada en el medio de cultivo. Las barras de error indican desviación estándar de la media (n = 3). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El ensayo de protección de la amikacina es un enfoque modificado para evaluar la invasión de E. coli en células epiteliales. Varios pasos son fundamentales para el éxito de este ensayo, incluyendo el recubrimiento de colágeno de las placas, el mantenimiento de la integridad de la monocapa y la eficiencia en la lisis celular. Las células Caco-2 son una línea celular adherente que puede adherirse a plástico tratado con cultivo de tejidos y formarmonocapas 20. Sin embargo, durante la infección, el uso de medios sin suero y los lavados repetidos pueden influir en el desprendimiento celular, lo que lleva a una subrepresentación de la invasiónbacteriana 21. Para solucionar esto, recubrir placas con componentes de la matriz extracelular, como el colágeno tipo IV, puede favorecer la unión celular y la formación de una monocapa estable y confluente durante la infección21. Esto es importante ya que se ha demostrado que la cepa AIEC LF82 interrumpe uniones estrechas durante la invasión, y la formación incompleta de una monocapa puede eludir este paso, lo que lleva a resultadossesgados 22. Por último, la lisis celular eficiente es otro paso clave que afecta a la recuperación bacteriana, ya que la lisis incompleta podría enmascarar la invasividad, confundiendo los resultados delensayo 23. Para evitar esto, es importante resuspender completamente el lisado celular tras la incubación con Triton-X-100.

Además de los desafíos técnicos que podrían contribuir a la variabilidad del ensayo de invasión, se ha demostrado que el porcentaje de inóculo recuperado tras la infección para la cepa AIEC LF82 oscila entre 0,61 y 17,25%8. Esta variabilidad podría estar influida por la ausencia de ciertas señales ambientales, como sales biliares, mucina y otros metabolitos intestinales en este ensayo in vitro que se sabe que contribuyen a la virulenciaAIEC 24,25,26. Específicamente, se ha demostrado que las sales biliares inducen la expresión de fimbrias polares largas, que aumentan la unión y translocación de AIEC a través de las célulasM 27. Otros patógenos gastrointestinales, como Vibrio y Shigella, son conocidos por regular sus sistemas de secreción tipo III en respuesta a la bilis para mediar la invasión celularepitelial 28,29. La subcultivación con sales biliares para inducir la expresión del factor de virulencia es estándar en los protocolos de protección contra gentamicina para otros patógenos, y el cultivo de AIEC con estas señales ambientales puede estabilizar la invasión y producir perfiles másconsistentes 30,31.

Otra limitación de este ensayo es que la invasión bacteriana se evalúa en un único punto temporal, lo cual, aunque es estándar en el campo, probablemente simplifica en exceso el procesode invasión 12. La invasión bacteriana es un proceso dinámico que implica adherencia, internalización, replicación intracelular y escape de la célulahuésped 32. Dado que los genes nuevos que contribuyen a la invasión de la AIEC han sido difíciles de identificar, el uso de un solo ensayo temporal podría subestimar el número de genes que contribuyen a esteproceso 12. Por lo tanto, se han utilizado ensayos de invasión temporales para evaluar cómo genes específicos contribuyen a la invasión y para estudiar la replicación de AIEC en células I-407 yHep-2 8,33. Aunque el uso de un ensayo de invasión temporal es valioso para caracterizar la contribución de genes individuales a la invasión, requiere mucho trabajo, especialmente al detectar muchos aislados clínicos. Por esta razón, se utiliza un único punto temporal para evaluar la invasión.

Además, el estilo de vida intracelular de AIEC no ha sido muy bien caracterizado. La mayoría de los estudios utilizan la invasión porcentual como lectura principal para detectar cambios en la UFC de varios mutantes de deleción del factor devirulencia 14,34. La visualización de las células huésped infectadas puede proporcionar perspectivas únicas sobre la biología de AIEC que se pierden al usar solo la enumeración de laUFC 35. Por lo tanto, para evaluar de forma exhaustiva el papel de los diferentes genes en la invasión celular, se debe realizar una microscopía de inmunofluorescencia de las células infectadas junto con la enumeración de UFC. Esto es importante porque puede ayudar a identificar genes que funcionan en la supervivencia y escape endosómico, que atacan el citoesqueleto del huésped o que presentan diferencias en la carga bacteriana por célula, lo cual podría pasarse por alto solo con la recuperación de la UFC. Es importante señalar que el uso del protocolo de tinción por inmunofluorescencia descrito aquí para detectar bacterias intracelulares no distingue entre bacterias verdaderamente internalizadas y aquellas adheridas a la superficie celular. Un enfoque de tinción diferencial, en el que las bacterias extracelulares se marcan con un anticuerpo secundario distinto antes de la permeabilización y las bacterias intracelulares se tiñen tras la permeabilización, abordaría esta limitación y podría implementarse en futuros estudios para distinguir de forma más definitiva estaspoblaciones 36.

La importancia de este método radica principalmente en la capacidad de detectar aislados de E. coli multirresistentes a pacientes con EII que reciben tratamiento antibióticodiverso 11. La gentamicina se utiliza para tratar pacientes con EII de inicio temprano y puede administrarse para tratar otras infeccionesbacterianas 37. La aparición de aislados resistentes a gentamicina impediría el uso del ensayo estándar, haciendo de la amikacina una alternativa másfiable 11. El uso de los protocolos descritos en este artículo permitirá una caracterización más completa de la biología de la infección en AIEC y ayudará a identificar nuevos genes que pueden contribuir a la invasión. Estos métodos son importantes en el contexto de la patogénesis bacteriana y la investigación de interacción huésped-patógeno, ya que permiten el descubrimiento de nuevos factores de virulencia, la caracterización del ciclo de vida intracelular bacteriano y la exploración de las vías del huésped dirigidas durante la infección. Además, son ampliamente aplicables para estudiar otros patógenos invasores utilizando modelos celulares epiteliales in vitro .

Divulgaciones

Los autores no declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Iniciativa para Patógenos Emergentes del Instituto Médico Howard Hughes (K.O., J.N.), la subvención 1-561 (K.O.), la Fundación Once Upon a Time (K.O.), la subvención NIH R35 GM134945 (K.O.), la subvención NIH NIDDK K08-DK-123316 (J.N.), los Burroughs Wellcome Fund Career Awards for Medical Scientists - 1020904 (J.N.) y NIH T32 AI007520 (S.F.).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
75 cm2 Matraz de cultivo de tejidoFisher Scientific FB012937
Amicacina disulfato Research Products International A20540-25.0
Antibiótico-Antimicótico (100x)Gibco15240062
Anticuerpo anti-E.coliAbcamab137967
Placas de micropocillo BioLite - 6 pozosFisher Scientific 12-556-004
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA7906
Colágeno I, cola de rata, 100 mgCorning354236
Diapositiva de cámara de conteo celular CountessInvitrogenC10312
DMEM, alta glucosaGibco11965118
Suero fetal bovinoCorning35-011-CV
Ácido acético glacialSigma-AldrichA6283
Glicina ultrapuraUSBiologicalG8165
Anticuerpo secundario anti-Conejo IgG (H + L) cruzado adsorto, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Hoechst 33342, trihidrocloruro trihidratoInvitrogenH3570
Liofilchem MTS amikacina [AK] 0.016-256 μg/mLFisher Scientific 22-777-704Tiras de prueba MIC de amikacina
Solución de paraformaldehído, 4% en PBSFisher Scientific J19943.K2
PBS, 1xCorning21-040-CV
Portaobjetos de vidrio alemán estéril recubiertos de poli-L-lisina para cultivo celularNeuvitroNC1327375
Montante antidesvanecimiento oro ProLong InvitrogenP36934
Rodamina-FalidinaInvitrogenR415Rojo-naranja 540/565 nm
Placas de cultivo de tejido estériles tratadas en superficieFisher Scientific FB012929Placas de 24 pozos
Triton X-100 (Electroforesis)Fisher Scientific BP151-100
Azúcar de tripánInvitrogenT10282
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenolGibco25200056
Tween-20Fisher Scientific BP337-100

Referencias

  1. Bruner, L. P., White, A. M., Proksell, S. Inflammatory bowel disease. Prim Care. 50 (3), 411-427 (2023).
  2. Richard, N., Savoye, G., Leboutte, M., Amamou, A., Ghosh, S., et al. Crohn's disease: Why the ileum?. World J Gastroenterol. 29 (21), 3222-3240 (2023).
  3. Hracs, L., et al. Global evolution of inflammatory bowel disease across epidemiologic stages. Nature. 642 (8067), 458-466 (2025).
  4. Lewis, J. D., Abreu, M. T. Diet as a trigger or therapy for inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 398-414.e6 (2017).
  5. Khan, S., et al. Dietary simple sugars alter microbial ecology in the gut and promote colitis in mice. Sci Transl Med. 12 (567), (2020).
  6. Ma, X., et al. Gut microbiota in the early stage of Crohn's disease has unique characteristics. Gut Pathog. 14 (1), 46 (2022).
  7. Vester-Andersen, M. K., et al. Increased abundance of proteobacteria in aggressive Crohn's disease seven years after diagnosis. Sci Rep. 9 (1), 13473 (2019).
  8. Boudeau, J., Glasser, A. L., Masseret, E., Joly, B., Darfeuille-Michaud, A. Invasive ability of an Escherichia coli strain isolated from the ileal mucosa of a patient with Crohn's disease. Infect Immun. 67 (9), 4499-4509 (1999).
  9. Darfeuille-Michaud, A., et al. High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn's disease. Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).
  10. Barnich, N., et al. Adherent-invasive Escherichia coli in Crohn's disease: the 25th anniversary. Gut. , (2025).
  11. Kim, J., et al. Genetic and microbial analysis of invasiveness for Escherichia coli strains associated with inflammatory bowel disease. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 19 (4), 101451 (2025).
  12. Camprubi-Font, C., Martinez-Medina, M. Why the discovery of adherent-invasive Escherichia coli molecular markers is so challenging?. World J Biol Chem. 11 (1), 1-13 (2020).
  13. Barnich, N., et al. CEACAM6 acts as a receptor for adherent-invasive E. coli, supporting ileal mucosa colonization in Crohn disease. J Clin Invest. 117 (6), 1566-1574 (2007).
  14. Boudeau, J., Barnich, N., Darfeuille-Michaud, A. Type 1 pili-mediated adherence of Escherichia coli strain LF82 isolated from Crohn's disease is involved in bacterial invasion of intestinal epithelial cells. Mol Microbiol. 39 (5), 1272-1284 (2001).
  15. Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
  16. Chassaing, B., et al. Crohn disease--associated adherent-invasive E. coli bacteria target mouse and human Peyer's patches via long polar fimbriae. J Clin Invest. 121 (3), 966-975 (2011).
  17. Glasser, A. L., Boudeau, J., Barnich, N., Perruchot, M. H., Colombel, J. F., et al. Adherent invasive Escherichia coli strains from patients with Crohn's disease survive and replicate within macrophages without inducing host cell death. Infect Immun. 69 (9), 5529-5537 (2001).
  18. Bringer, M. A., Billard, E., Glasser, A. L., Colombel, J. F., Darfeuille-Michaud, A. Replication of Crohn's disease-associated AIEC within macrophages is dependent on TNF-alpha secretion. Lab Invest. 92 (3), 411-419 (2012).
  19. Ristuccia, A. M., Cunha, B. A. An overview of amikacin. Ther Drug Monit. 7 (1), 12-25 (1985).
  20. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
  21. Vllasaliu, D., Falcone, F. H., Stolnik, S., Garnett, M. Basement membrane influences intestinal epithelial cell growth and presents a barrier to the movement of macromolecules. Exp Cell Res. 323 (1), 218-231 (2014).
  22. Wine, E., Ossa, J. C., Gray-Owen, S. D., Sherman, P. M. Adherent-invasive Escherichia coli, strain LF82 disrupts apical junctional complexes in polarized epithelia. BMC Microbiol. 9, 180 (2009).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
  24. Delmas, J., et al. Metabolic adaptation of adherent-invasive Escherichia coli to exposure to bile salts. Sci Rep. 9 (1), 2175 (2019).
  25. Zhang, S., et al. Mucosal metabolites fuel the growth and virulence of E. coli linked to Crohn's disease. JCI Insight. 7 (10), (2022).
  26. Viennois, E., et al. Dietary emulsifiers directly impact adherent-invasive E. coli gene expression to drive chronic intestinal inflammation. Cell Rep. 33 (1), 108229 (2020).
  27. Chassaing, B., Etienne-Mesmin, L., Bonnet, R., Darfeuille-Michaud, A. Bile salts induce long polar fimbriae expression favouring Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli interaction with Peyer's patches. Environ Microbiol. 15 (2), 355-371 (2013).
  28. Gotoh, K., et al. Bile acid-induced virulence gene expression of Vibrio parahaemolyticus reveals a novel therapeutic potential for bile acid sequestrants. PLoS One. 5 (10), e13365 (2010).
  29. Bajunaid, W., et al. The T3SS of Shigella: Expression, structure, function, and role in vacuole escape. Microorganisms. 8 (12), (2020).
  30. Poore, K., Lenneman, B. R., Faherty, C. S. Epithelial cell infection analyses with Shigella. J Vis Exp. (204), e66426 (2024).
  31. Chimalapati, S., Lafrance, A. E., Chen, L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus: Basic techniques for growth, genetic manipulation, and analysis of virulence factors. Curr Protoc Microbiol. 59 (1), e131 (2020).
  32. Rodrigues, E., Marzook, N. B., Pallett, M. A., Sateriale, A. Convergent mechanisms of epithelial cell structure manipulation by intestinal pathogens. PLoS Pathog. 21 (7), e1013367 (2025).
  33. Jaishankar, J., et al. A critical role for Vibrio parahaemolyticus LPS to mediate evasion of host immune response during infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (33), e2426547122 (2025).
  34. Cieza, R. J., Hu, J., Ross, B. N., Sbrana, E., Torres, A. G. The IbeA invasin of adherent-invasive Escherichia coli mediates interaction with intestinal epithelia and macrophages. Infect Immun. 83 (5), 1904-1918 (2015).
  35. Liu, H., Semino-Mora, C., Dubois, A. Mechanism of H. pylori intracellular entry: an in vitro study. Front Cell Infect Microbiol. 2, 13 (2012).
  36. Heesemann, J., Laufs, R. Double immunofluorescence microscopic technique for accurate differentiation of extracellularly and intracellularly located bacteria in cell culture. J Clin Microbiol. 22 (2), 168-175 (1985).
  37. Lev-Tzion, R., Ledder, O., Shteyer, E., Tan, M. L. N., Uhlig, H. H., et al. Oral vancomycin and gentamicin for treatment of very early onset inflammatory bowel disease. Digestion. 95 (4), 310-313 (2017).

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