Ensayo basado en inmunofluorescencia para la detección de focos nucleares de RAD51 como marcador de reparación homóloga por recombinación en células cancerosas de ovario

Resumen

Los focos nucleares de RAD51 son un marcador de la actividad de recombinación homóloga (HR). Este manuscrito describe un método sencillo de inmunofluorescencia para detectar estos focos en células cancerosas, permitiendo evaluar la función de la HR y apoyando la investigación preclínica de las respuestas a agentes dañinos del ADN.

Resumen

RAD51 es una proteína central en la vía de recombinación homóloga (HR) y es esencial para la reparación precisa de las rupturas de doble cadena (DSB) del ADN. Tras la formación de DSB, la resección final del ADN genera sustratos de ADN monocatenario que facilitan el reclutamiento y ensamblaje de filamentos de nucleoproteínas RAD51 en los sitios de daño. Este proceso da lugar a la formación de focos nucleares discretos de RAD51, que sirven como una lectura funcional ampliamente aceptada de la actividad de la HR y como marcador sustituto de la competencia en HR. Dado que los defectos en la HR son comunes en varias malignidades, especialmente en cánceres de ovario y mama, la evaluación de la formación de focos de RAD51 ha surgido como un enfoque importante para evaluar la capacidad de reparación del ADN y predecir la respuesta a terapias dañinas del ADN, incluyendo compuestos de platino e inhibidores de la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP), cuya eficacia está fuertemente influida por el estado de reparación de la HR. Este manuscrito describe un protocolo basado en inmunofluorescencia sencillo, fiable y reproducible para la detección y cuantificación de focos nucleares RAD51 en células de cáncer de ovario cultivadas. El método consiste en inducir daño al ADN por radiación ionizante (IR), seguida de fijación, inmunotinción con anticuerpos contra RAD51 y γH2AX, microscopía confocal y análisis cuantitativo manual de focos colocalizados RAD51/γH2AX. El protocolo puede aplicarse en condiciones basales o tras perturbaciones genéticas y farmacológicas para determinar sus efectos sobre la función de la HR. Los resultados representativos demuestran una inducción robusta de focos de RAD51 en células de cáncer de ovario competentes en HR tras daño en el ADN, mientras que la disminución de RAD51 reduce notablemente la formación de focos a pesar de niveles comparables de DSB, confirmando la especificidad del ensayo. En conjunto, este protocolo proporciona un ensayo funcional robusto y reproducible para evaluar la competencia en RRHH, con amplias aplicaciones en la investigación preclínica y potencialmente traslacional del cáncer.

Introducción

Las rupturas de doble cadena del ADN (DSB) están entre las formas más graves de daño en el ADN porque una reparación inexacta puede comprometer la estabilidad del genoma y contribuir al desarrollo tumoral o a la muerte^{celular 1,2,3}. Para contrarrestar estas amenazas, las células emplean varias vías de reparación del ADN, incluyendo la recombinación homóloga (HR), considerada el mecanismo más preciso para reparar los DSB ^2,4,5. A diferencia de las vías de reparación propensas a errores, la HR utiliza una secuencia de ADN homóloga como plantilla para restaurar la información genética en el sitio dañado. En consecuencia, la HR funciona predominantemente durante las fases S y G2 del ciclo celular, cuando las cromátidas hermanas están disponibles para servir como plantillas de^{reparación 2,5}. Cabe destacar que la HR es esencial para la reparación precisa de los DSB que surgen de fuentes endógenas como el estrés de replicación, así como de insultos exógenos como la radiación ionizante (RI) y agentes quimioterapéuticos dañinos del^{ADN 2,5.}

RAD51 es un efector central de la vía HR y desempeña un papel fundamental en la búsqueda de homología y la invasión de hebras durante la reparación mediada por HR de DSBs ^2,5. Tras la formación de DSB, los extremos del ADN son sometidos a una resección, un proceso iniciado por el complejo MRE11–RAD50–NBS1 (MRN) y factores asociados que generan sobresalentes de ADN monocatenario de 3′. Estas regiones monocatenarias están inicialmente recubiertas por la proteína de replicación A (RPA), que impide la formación de estructuras secundarias y estabiliza el intermedio de ^{reparación 4,5,6}. La HR se inicia entonces mediante las acciones coordinadas de BRCA1, PALB2 y BRCA2, que facilitan el reclutamiento y carga de RAD51 sobre ADN resecado, desplazando RPA y promoviendo la formación de filamentos nucleoproteicoicos ^4,5,6 que contienen RAD51. Una vez ensamblados, estos filamentos buscan secuencias de ADN homólogas dentro de la cromátida hermana y catalizan el intercambio de cadenas, facilitando así la fiel restauración del ADN^{dañado 4,5,6}. La acumulación de RAD51 en los sitios DSB aparece microscópicamente como focos nucleares puntuados que pueden detectarse mediante la inmunofluorescencia 7,8,9,10. Debido a que la formación de estos focos refleja el compromiso exitoso de la maquinaria de RRHH, el análisis de focos RAD51 se ha convertido en un enfoque funcional ampliamente utilizado para evaluar la capacidad de RR y la competencia en la reparación del ADN en células 7,8,9,10. Es importante destacar que este ensayo mide la capacidad de las células para ejecutar una respuesta de HR tras el daño al ADN, en lugar de depender únicamente de los niveles de expresión de genes o proteínas asociados a HR.

Los defectos en la HR se observan con frecuencia en el cáncer, especialmente en tumores que presentan alteraciones en los parálogos BRCA1, BRCA2, RAD51 u otros genes implicados en la HR, y son especialmente prevalentes en cánceres de ovario^{y mama} 4,11,12,13,14. La deficiencia de HR tiene importantes implicaciones terapéuticas, ya que confiere una mayor sensibilidad a agentes dañinos del ADN, como la terapia con platino, y a los inhibidores de la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) mediante el principio de letalidad^sintética 4,11,12,13,14,15 . Por lo tanto, los ensayos funcionales fiables para evaluar la actividad de RRHH son fundamentales tanto para los estudios mecanicistas como para la investigación traslacional.

Este protocolo describe un ensayo basado en inmunofluorescencia para la detección y cuantificación de focos nucleares de RAD51 tras daño en el ADN en células de cáncer de ovario. El flujo de trabajo consiste en la inducción de DSBs de ADN usando IR, seguida de la detección inmunofluorescente de RAD51 y γH2AX y la cuantificación de focos nucleares co-localizados mediante microscopía confocal. El protocolo se demuestra utilizando células OVCAR-8 con competencia en HR y células ABT^R2 resistentes a inhibidores de PARP adquiridas, y proporciona un enfoque funcional reproducible para evaluar la actividad de la HR tras la formación de DSB. Aunque el análisis de focos RAD51 se utiliza ampliamente como medida funcional de la actividad de la HR, los métodos disponibles suelen centrarse en entornos experimentales específicos y carecen frecuentemente de una guía detallada sobre cómo integrar la inducción controlada de daño al ADN, la confirmación de la formación de DBS en el ADN, los controles de validación de ensayos y la cuantificación estandarizada basada en imágenes. Además, enfoques alternativos para evaluar la función de la HR, incluyendo ensayos genómicos de cicatrices, firmas mutacionales y análisis de expresión génica o proteica, proporcionan medidas indirectas del estado de HR y no evalúan directamente la capacidad celular para reclutar RAD51 en los sitios de daño en el ADN. Los ensayos basados en reporteros, como el DR-GFP, ofrecen mediciones directas de la actividad de la HR, pero requieren ingeniería genética estable y no son fácilmente aplicables a muchos modelos experimentales. Por lo tanto, el flujo de trabajo descrito aquí combina daño al ADN inducido por infrarrojos con la tinción dual de inmunofluorescencia RAD51/γH2AX para verificar simultáneamente la formación de DSB y cuantificar el reclutamiento de RAD51 en cromatina dañada. Este enfoque proporciona un método práctico, biológicamente relevante y ampliamente aplicable para la evaluación funcional directa de la competencia en RRHH en células cancerosas cultivadas, incorporando controles de ensayo, pasos de validación y procedimientos estandarizados de cuantificación de focos.

Protocolo

Todos los materiales y reactivos utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales, incluyendo información del fabricante, números de catálogo y diluciones de anticuerpos. Una visión general del protocolo se muestra en la Figura 1.

NOTA: Las líneas celulares de cáncer de ovario OVCAR-8 y ABT^R2 se utilizan en este protocolo y han sido descritas^previamente 15,16,17,18,19,20. Las células OVCAR-8 fueron amablemente proporcionadas por el Dr. Larry Karnitz (Mayo Clinic), quien originalmente las recibió del Dr. Dominic Scudiero (Instituto Nacional del Cáncer, NIH). Las células^{ABT R2}fueron amablemente proporcionadas por el Dr. Scott Kaufmann (Mayo Clinic⁾²⁰. ABT^R2 es un derivado resistente a PARPi del BRCA2.- línea celular de cáncer de ovario mutada PEO1 que adquirió resistencia mediante la restauración de la expresión de BRCA2. Debido a que la restauración BRCA2 restableció la carga y la actividad de HR de RAD51, las células^{ABT R}2 sirven como un modelo representativo de competencia en HR. La identidad de la línea celular se verificó en función de la procedencia de la fuente y características establecidas reportadas en la literatura 15,16,17,18,19,20. Se realizaron experimentos utilizando células de bajo paso (pasajes 3–12) mantenidas en cultivo durante no más de 1 mes tras el descongelamiento. Las líneas celulares se analizaban rutinariamente para detectar contaminación por micoplasma cada 6 meses utilizando un kit de detección de micoplasmas, y se confirmó que todos los cultivos utilizados en este estudio estaban libres de micoplasma.

PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico y debe prepararse y manipularse en una campana extractora certificada de productos químicos mientras se lleva el equipo de protección personal adecuado. Las líneas celulares de origen humano deben manejarse conforme a los procedimientos institucionales de bioseguridad utilizando prácticas de contención adecuadas. El Triton X-100, el soporte de montaje y el esmalte de uñas deben manejarse según las recomendaciones de seguridad del fabricante. La IR debe ser administrada únicamente por personal capacitado y de acuerdo con las políticas institucionales de seguridad radiológica. Eliminar residuos químicos, biológicos y asociados a la radiación según los requisitos institucionales y regulatorios locales.

1. Cultivo celular y mantenimiento

1. Cultivo de células en medio de crecimiento del Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 suplementado con suero bovino fetal al 8% en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO₂.
   NOTA: Estas condiciones de cultivo son coherentes con las utilizadas en nuestros estudios previos de las células OVCAR-8 y ABT^R215,16,17,18,19. Bajo estas condiciones, ambas líneas celulares presentan un crecimiento robusto y fenotipos reproducibles de respuesta al daño del ADN.
2. Si se desea, realizar perturbaciones (por ejemplo, knockdown/knockout génico), siguiendo condiciones experimentales^{optimizadas 15,17}.
   NOTA: En este protocolo, se proporciona un ejemplo representativo de perturbación génica mediada por siRNA de RAD51 antes del análisis de inmunofluorescencia.
   1. Preparar 5 × 10⁶ células en un medio RPMI-1640 de 180 μL suplementado con suero bovino fetal al 8%.
   2. Añade 20 μL de solución de siRNA de 20 μM (2 μM de siRNA por transfección) y mezcla suavemente.
      NOTA: Utiliza los siguientes siRNAs: siRNA de luciferasa de control no dirigido (siLUC): 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′; RAD51 siRNA (si RAD51.): 5′-GGGAUUUGUGAAGCCAAA-3′. Todos los siRNA fueron adquiridos a Horizon Discovery.
   3. Transfiere la suspensión de la celda a una cubeta de electroporación de 4 mm.
   4. Electroporar las células usando un electroporador BTX ECM 830 con dos pulsos de 10 ms a 280 V.
   5. Transfiere las células a un medio de crecimiento completo e incubar bajo condiciones estándar de cultivo en un plato de 10 cm durante 24 horas.
   6. Repite la electroporación de siRNA usando las mismas condiciones descritas en los pasos 1.2.1–1.2.4.
   7. Incubar las células bajo condiciones estándar de cultivo en un plato de 15 cm durante 48 horas adicionales.
   8. Siembra una porción de las células para el ensayo de inmunofluorescencia como se describe en el Paso 2. Reserva las células restantes para la validación del knockdown de RAD51 mediante inmunobloting.
   9. Validar el knockdown de RAD51 mediante inmunoblot
      1. Células de lisis en tampón de lisis helado que contiene 50 mM de HEPES (pH 7,6), 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% de Triton X-100, 10 mM de NaF, 30 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de Na₃VO₄, 10 mM de β-glicerofosfato y cóctel inhibidor de proteasas (1 comprimido por cada tampón de lisis de 10 mL).
      2. Clarificar los lisados mediante centrifugación a 18.800 × g . durante 5 minutos a 4 °C. Transfiere el sobrenadante a un tubo microcentrífuga fresco y determina la concentración de proteínas utilizando un ensayo proteico adecuado.
      3. Mezcla una cantidad adecuada de lisato proteico con 4× tampón de muestra de Laemmli para lograr una concentración final de 1×.
      4. Añadir β-mercaptoetanol a una concentración final del 20% y calientar las muestras a 95 °C durante 12 minutos antes de la SDS-PAGE.
      5. Separar cantidades iguales de proteína mediante SDS-PAGE y transferir proteínas a una membrana adecuada para el análisis inmunoblot.
      6. Bloquea la membrana con leche al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente y agita.
      7. Lava la membrana tres veces (5 min cada una) con 1× suero suero tinter-buffer con 20 grados preadolescentes (TBST) a temperatura ambiente y agitando.
      8. Incubar la membrana con anticuerpo policlonal de conejo anti-RAD51 (dilución 1:1.000) o anticuerpo anti-ACTIN (dilución 1:1000) a 4 °C durante 16–18 horas con agitación.
      9. Lava la membrana con 1× TBST (5 min cada uno) a temperatura ambiente agitando.
      10. Incubar la membrana con anticuerpo secundario anti-conejo o anti-ratón conjugado con peroxidasa picante (HRP) (dilución 1:10.000) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación.
      11. Lavar la membrana con 1× TBST (5 min cada uno) a temperatura ambiente con agitación, detectar bandas inmunorreaccionantes utilizando un método adecuado de detección de quimioluminiscencia y confirmar la disminución de RAD51 en relación con células transfectadas con el SIRNA de control no dirigido.

2. Siembra de células

1. Cuando las células alcanzan la fase de crecimiento logarítmico (aproximadamente 70–80% de confluencia), aspira el medio de cultivo y lava suavemente las células una vez con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el suero residual.
2. Añadir suficiente solución de tripsina–EDTA al 0,25% para cubrir la monocapa celular (por ejemplo, 1–2 mL por matraz T175) e incubar a 37 °C durante 2–5 minutos, monitorizando el desprendimiento celular bajo el microscopio.
3. Una vez que las células se hayan desprendido, neutraliza inmediatamente la tripsina añadiendo un volumen igual de medio de cultivo completo que contenga FBS.
4. Recoge la suspensión de la celda en un tubo cónico de 15 mL
5. Determinar la viabilidad y concentración celular usando exclusión de azul de tripán y un hemotómetro o contador celular automático antes de la siembra.
6. Prepara una suspensión unicelular en medio de crecimiento completo a una concentración de 4 × 10⁴ células/mL.
7. Semilla 200 μL de la suspensión de la celda en cada pozo de una lámina de cámara de vidrio de 8 pozos para lograr una densidad final de 8.000 celdas por pozo.
8. Incubar las láminas de cámara durante 24 horas a 37 °C con un 5% de CO₂ para permitir la unión celular.
   NOTA: El número de células para sembrar puede variar según el tipo de célula. Prepara una suspensión de celda de exceso suficiente para al menos un pozo adicional para compensar la variabilidad del pipeteo. Siembra cada condición en duplicado o más para asegurar su reproducibilidad. Si se desea una modulación farmacológica de la HR, las células deben tratarse tras la inserción nocturna (12–16 h después de la siembra). La densidad de siembra debe ajustarse según sea necesario para asegurar que las células alcancen la confluencia adecuada en el momento del tratamiento y el análisis posterior, teniendo en cuenta los efectos esperados del agente farmacológico sobre la proliferación o viabilidad celular. Dado que la HR ocurre predominantemente durante las fases S y G2 del ciclo celular, se mantienen los cultivos en crecimiento logarítmico y se evita la sobreconfluencia. Para experimentos que involucran tratamientos que puedan alterar la progresión del ciclo celular, se puede realizar la incorporación de EdU, el análisis del contenido de ADN u otras mediciones del ciclo celular para facilitar la interpretación de los resultados de los focos RAD51. Incluir controles no tratados (–IR) e irradiados (+IR) en cada experimento para establecer la formación de focos basales e inducidos por daño al ADN de RAD51, respectivamente. Al realizar perturbaciones mediadas por siARN, incluye siRNA de control no dirigido (por ejemplo,si LUC) y condiciones específicas de siRNA de objetivo (por ejemplo,si RAD51). Se recomiendan controles sin anticuerpos primarios y sin anticuerpos secundarios durante la optimización de anticuerpos para evaluar la tinción inespecífica y la fluorescencia de fondo.

3. Inducción de daño en el ADN por RI

1. Las células expuestas en las láminas de la cámara a IR con una dosis de 6 Gy²¹ para inducir DSBs de ADN.
2. Inmediatamente devuelve las láminas a una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO₂.
3. Incuba las células durante 6 horas después de la IR.
   NOTA: El IR se entregaba utilizando un irradiador biológico RS-2000 operado a 160 kV y 25,0 mA (posición de estantería 5). Las células se irradiaban a temperatura ambiente con una única dosis de 6 Gy (aproximadamente 4,8 Gy/min) y se devolvían inmediatamente a una incubadora de 37 °C con un 5% de CO₂ para su recuperación. El irradiador se calibraba rutinariamente según las recomendaciones del fabricante, y todos los procedimientos se realizaban conforme a las directrices institucionales de seguridad radiológica. La incubación post-RI de 6 horas se ha establecido^{previamente en 15, 17, 22}. El momento óptimo puede variar según el tipo celular y debe optimizarse para cada línea celular.

4. Fijación y permeabilización

1. Aspira cuidadosamente el medio de cultivo de los pozos sin alterar las células.
2. Fija las células usando paraformaldehído al 3% recién preparado en 1× PBS durante 12 minutos a temperatura ambiente.
3. Aspira suavemente el fijador y lava los pozos tres veces con 500 μL de 1× PBS por pozo.
4. Permeabiliza las células con 0,2% de Triton X-100 en 1× PBS durante 12 minutos a temperatura ambiente.
5. Lava los pozos tres veces con 1× PBS.
   NOTA: Realiza los pasos de fijación, permeabilización y lavado con delicadeza, añadiendo y retirando soluciones a lo largo de la pared de cada pozo para minimizar el desprendimiento celular. Salvo que se indique lo contrario, usa 500 μL de 1× PBS por lavado.

5. Bloqueo

1. Prepara una solución bloqueante disolviendo albúmina sérica bovina (BSA) al 5% (p/v) en 1× PBS.
2. Incuba las células en una solución bloqueante durante 60 minutos a temperatura ambiente para reducir la unión de anticuerpos inespecíficos.

6. Incubación primaria de anticuerpos

1. Retira la solución bloqueante y lava las células tres veces con 1× PBS.
2. Prepara los anticuerpos primarios en las diluciones adecuadas en la solución bloqueante. Se utilizan anticuerpos anti-RAD51 policlonal de conejo (1:1000) y anti-fosfo-histona H2AX (γH2AX) (1:1000) monoclonal de ratón, siendo γH2AX un marcador para los DSB^23,24.
3. Añadir 100 μL de solución primaria diluida de anticuerpos a cada pozo.
4. Incubar las láminas a temperatura ambiente durante 16–18 horas en una cámara humidificada para evitar la evaporación.
   NOTA: Los dos anticuerpos primarios pueden combinarse en la misma solución para una tinción simultánea.

7. Incubación secundaria de anticuerpos

1. Prepara anticuerpos secundarios en las diluciones adecuadas en la solución bloqueadora. Se utiliza Alexa Fluor 488 con anti-conejo conjugado para la cabra IgG (1:350) para detectar RAD51, y Alexa Fluor 594 conjugado para la cabra anti-ratón IgG (1:350) se emplea para detectar γH2AX.
2. Aspira la solución primaria de anticuerpos y lava las células tres veces con 1× PBS.
3. Añadir 100 μL de solución secundaria diluida de anticuerpos a cada pozo.
4. Incuba las láminas durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad.
   NOTA: Los dos anticuerpos secundarios pueden combinarse para una detección simultánea. A partir de esta sección, realiza todos los pasos en un espacio protegido de luz para minimizar el fotoblanqueamiento.

8. Contratinción y montaje nuclear

1. Preparar la solución de Hoechst 33342 a una dilución 1:1.000 en 1× PBS para teñir los núcleos.
2. Aspira la solución secundaria de anticuerpos y lava las células una vez con 1× PBS.
3. Incubar células con solución diluida de Hoechst 33342 durante 90 segundos a temperatura ambiente.
4. Aspira la solución Hoechst 33342 y lava las células tres veces con 1× PBS.
5. Retira el PBS de 1× y desconecta la cámara superior de las láminas de vidrio, y añade unos 25 μL de antifade mountant a cada pozo.
6. Coloca llaves de cristal sobre las celdas montadas, asegurando un contacto uniforme con el soporte de montaje.
7. Elimina las burbujas de aire con cuidado y sella los bordes con esmalte de uñas.
   NOTA: La contratinción nuclear proporciona una referencia para los núcleos, facilitando la localización y cuantificación precisa de los focos nucleares RAD51 y γH2AX.

9. Imagen y cuantificación de focos RAD51 en los DSB

1. La imagen se presenta inmediatamente o se guarda a 4 °C en una caja de diapositivas en la oscuridad hasta el análisis.
   NOTA: Para minimizar la posible degradación de la señal y el fotoblanqueo, adquiere las imágenes lo antes posible, preferiblemente dentro de una semana desde el montaje.
2. Adquirir imágenes usando un microscopio confocal con líneas láser y conjuntos de filtros apropiados: Hoechst 33342 (405 nm) para núcleos, Alexa Fluor 488 (488 nm) para RAD51 y Alexa Fluor 594 (561/594 nm) para γH2AX.
3. Realizar imágenes confocales utilizando un objetivo de alta ampliación adecuado para resolver estructuras subcelulares.
4. Cuantificar manualmente los focos RAD51 contando focos nucleares discretos que co-localizan con γH2AX; excluye focos no co-localizados con γH2AX.
   NOTA: Validar el rendimiento de los anticuerpos antes del análisis cuantitativo confirmando focos nucleares de RAD51 y γH2AX inducidos por infrarrojos en células de control y la reducción de la señal de RAD51 tras el tratamiento con SIRNA de RAD51. Cuantificar solo focos nucleares discretos de RAD51 que co-localicen con γH2AX en núcleos con morfología intacta y patrones de tinción claros; excluyen tinciones difusas o no nucleares, señales RAD51 no colocalizadas, células superpuestas o multinucleadas, células mitóticas y células apoptóticas. Mantener configuraciones de imagen idénticas en cada experimento y aplicar criterios manuales de puntuación consistentes en todas las condiciones. Analizar ~50 núcleos por condición desde múltiples campos de visión para cada réplica biológica y realizar al menos tres réplicas biológicas independientes. Informa el número de focos co-localizados de RAD51/γH2AX por núcleo utilizando un análisis estadístico adecuado.

10. Análisis estadístico

1. Cuantificar focos co-localizados RAD51/γH2AX a partir de aproximadamente 50 núcleos por condición.
2. Presentar datos como media ± SD de al menos tres réplicas biológicas independientes.
3. Realizar comparaciones estadísticas utilizando una prueba estadística adecuada (por ejemplo, una prueba t de Student bi-colada no emparejada para comparaciones entre dos grupos o una ANOVA unidireccional para comparaciones entre varios grupos)
4. Consideremos la p. < 0,05 estadísticamente significativa.
5. Realizar análisis estadísticos y generación de grafos usando GraphPad Prism (versión 10.6.1).

Resultados

El RI induce la formación de focos de RAD51 en los DSB de ADN en las células OVCAR-8
Para evaluar funcionalmente la actividad de la HR, se examinó la formación de focos RAD51 en células de cáncer de ovario OVCAR-8 con profección en HR tras la inducción de DSB de ADN por RI. Para establecer la especificidad del ensayo y confirmar que los focos observados representan eventos de HR auténticos dependientes de RAD51, las células fueron transfectadas con siRNA de lucife...

Discusión

La detección basada en inmunofluorescencia de focos nucleares de RAD51 descrita aquí proporciona un enfoque fiable y funcional para evaluar la actividad de la HR en células de cáncer de ovario cultivadas. A diferencia de los análisis genómicos o transcriptómicos que infieren el estado de HR de forma indirecta, la formación de focos de RAD51 refleja directamente la capacidad de la célula para reclutar y ensamblar la maquinaria central de HR en los sitios de los DSB de ADN. Por ello, este ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10% Polyacylamide gel recipe (Lower gel buffer 20 ml,ddH2O 33.4 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 26.6 mL. 10% APS (fresh) 200 µL  TEMED 70 µL)	Hecho en casa	NA	Gel de resolución para SDS-PAGE
10% Polyacylamide gel recipe (Upper gel buffer 10 mL, ddH2O 23.6 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 6.4 mL 10% APS (fresh) 160 µL  TEMED 40 µL)	Hecho en casa	NA	Gel de apilado para SDS-PAGE
100 mL Trypsin EDTA 1X, 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA in Sodium Bicarbonate	Corning	25-053-C1	Usado para desprender células adherentes durante el paso rutinario y antes de la siembra celular.
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Bio-Rad	1610780	Diluido a 1× y se utiliza para pasos de lavado, solución de bloqueo, diluciones de anticuerpos, fijación y permeabilización.
10X Running buffer (6 L) Tris 181.8 g +Glycene 864.0 g+SDS 60 g	Hecho en casa	NA	Ejecutar para muestra de proteínas en el gel
10X Transfer (6 L) Tris 181.8 g+ Glycene 864 g	Hecho en casa	NA	Transferir la proteína del gel a la membrana
10x Tris Buffered saline	Bio-Rad	1706435	buffer
30%  (w/v)Acrylamide ;0.8(w/v)/Bis-acrylamide stock solution (37.5:1)	Ultrapure EC-890	EC-890	Para SDS-PAGE
ABTR2 cells	Mayo clinic	NA	Líneas celulares de cáncer de ovario resistentes a PARPi adquiridas
AKT Lysis Buffer Recipe (50 mM HEPES (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na3VO4, 10 mM 2-glycerophosphate, 10 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinin, 5 μg/mL pepstatin, and 20 mM microcystin-LR.	Hecho en casa	NA	Buffer de lisis celular
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	16107000	Biología molecular como catalizador de polimerización para geles y agente oxidante utilizado como iniciador de radicales libres
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301	Sigma-Aldrich	05-636	Anticuerpo primario utilizado para detectar γH2AX focos. Se utiliza en una dilución de 1:1000
Anti-Rad51 (Ab-1) Rabbit pAb	Sigma-Aldrich	PC130	Anticuerpo primario utilizado para detectar RAD51 focos nucleares como marcador de la actividad de recombinación homóloga. Se utiliza en una dilución de 1:1000
Bovine serum albumin Protease free	GoldBio	A-420-250	Utilizado para preparar la solución de bloqueo (5% BSA en PBS) para reducir la unión de anticuerpos no específicos durante la tinción por inmunofluorescencia.
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	12003154	Sistema de imágenes
Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	Zeiss LSM 780	Imágenes de inmunofluorescencia, análisis de focos γH2AX, cuantificación de focos RAD51, colocalización de proteínas y adquisición de imágenes 3D
Countess II FL Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAF1000	Contador de células automatizado
Cover slips	Cardinal Health	M6045-10A	Colocados sobre muestras montadas para proteger las células teñidas y permitir imágenes de alta resolución.
ECM 830 Square Wave Electroporation System	Hbio-BTX	45-2052	Sistema de electroporación adecuado para aplicaciones de entrega de genes en células de mamíferos
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Añadido a RPMI-1640 (como 8%) para apoyar el crecimiento y la viabilidad celular.
Glycine	Thermo Fisher Scientific	A13816.0C	Buffer
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	Anticuerpo secundario utilizado para detectar el anticuerpo primario γH2AX. Se utiliza en una dilución de 1:350
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034	Anticuerpo secundario utilizado para detectar el anticuerpo primario RAD51. Se utiliza en una dilución de 1:350
GraphPad Prism	GraphPad Software	versión 10.6.1	Análisis estadístico, generación de gráficos y visualización de datos.
HEPES 1M	Corning	25060-C1	Buffer de mantenimiento de pH en el rango de pH 7.2-7.6
Hoechst 33342 solution (20 mM, 5 mL)	Thermo Fisher Scientific	62249	se utilizó para tinción nuclear
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse immunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7076S	Anticuerpo secundario utilizado para la detección del anticuerpo primario de ratón (β-actina) en Western blotting.
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbitimmunoglobulin G	Cell Signaling Technology	7074S	Anticuerpo secundario utilizado para la detección del anticuerpo primario de conejo (RAD51) en Western blotting.
Instant non-fat dry milk	Hyvee	G461A323	Reactivo de bloqueo
Laemmli Sample Buffer (4×)	Bio-Rad	1610747	Sample Buffer
Lonza's MycoAlert Mycoplasma Detection Assays	Lonza Bioscience	LT07-218	Utilizado para confirmar rutinariamente que las culturas celulares están libres de contaminación por micoplasma.
Lower gel Recipe is (1 L)(Tris 181.7 g+SDS 4.0 g)PH to 8.8 w/cenc HCl	Hecho en casa	NA	Gel de resolución para SDS-PAGE
Mouse monoclonal Anti-beta Actin antibody	Abcam	ab8226	Anticuerpo primario utilizado para detectar β-actina como control de carga en