Un flujo de trabajo rentable para inmunofluorescencia mono y multiplex en cultivos celulares bidimensionales adherentes sobre cubreobjetos de vidrio

Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo rentable para inmunofluorescencia (IF) mono y multiplex en cultivos celulares adherentes en dos dimensiones, que reduce los costos experimentales mediante cubreobjetos de vidrio económicos, placas estándar de 24 pocillos y condiciones de tinción con bajo volumen que minimizan el consumo de anticuerpos, al tiempo que proporciona un enfoque representativo para la localización proteica mediante microscopía de fluorescencia convencional.

Resumen

La microscopía de inmunofluorescencia (IF) es una técnica ampliamente utilizada para visualizar la localización y distribución conjunta de proteínas a resolución individual celular, manteniendo al mismo tiempo la morfología celular y la organización subcelular. El objetivo de este protocolo es presentar un procedimiento práctico y económico para tinciones de inmunofluorescencia mono y multiplex en cultivos celulares adherentes en 2D, utilizando materiales de laboratorio estándar. El método se basa en el cultivo de células sobre cubreobjetos de vidrio económicos colocados en placas convencionales de 24 pocillos, e implementa el multiplexado mediante la separación por especie huésped de los anticuerpos primarios, fluoróforos espectroscópicamente distintos y condiciones de control robustas, incluyendo controles sin anticuerpo primario, sin anticuerpo, con tinción individual y de interferencia cruzada, para garantizar la interpretabilidad de la IF multiplex. Se utilizan pasos de tinción con bajo volumen para reducir el consumo de reactivos y anticuerpos sin comprometer la calidad de la señal. Este procedimiento elimina la necesidad de placas o cámaras de imagen especializadas y es compatible con microscopía de fluorescencia de campo amplio o confocal de rutina. En conjunto, este protocolo proporciona un flujo de trabajo de inmunofluorescencia accesible y práctico para la evaluación representativa de la localización y distribución conjunta de proteínas en cultivos celulares adherentes. La adaptación a otros tipos celulares o paneles de anticuerpos requiere una optimización específica según el blanco, incluyendo la validación de anticuerpos, condiciones de fijación y permeabilización, selección de fluoróforos y compatibilidad con el microscopio y conjuntos de filtros.

Introducción

La microscopía de inmunofluorescencia (IF) se utiliza ampliamente para visualizar la localización subcelular, abundancia relativa y colocalización de proteínas en células fijadas, vinculando así marcadores moleculares con la morfología celular y el contexto subcelular^1,2. A diferencia de las mediciones en masa (por ejemplo, inmunotransferencia) o los ensayos disociativos a nivel de célula individual (por ejemplo, citometría de flujo), la IF conserva la organización espacial celular y resulta particularmente útil para evaluar la heterogeneidad fenotípica entre células y los cambios en la distribución subcelular de proteínas a resolución individual^3,4,5. A medida que las preguntas experimentales requieren cada vez más la evaluación simultánea de múltiples marcadores, la inmunofluorescencia múltiple permite la detección concurrente de dos o más dianas en un mismo espécimen, generalmente combinando anticuerpos primarios generados en especies huésped diferentes con fluoróforos espectrales distintos⁶ (Figura 1), mediante estrategias de detección directa y/o indirecta (Figura 2). Sin embargo, la multiplexación introduce desafíos técnicos clave, especialmente la reactividad cruzada de anticuerpos y la interferencia espectral, que pueden comprometer la interpretación si no se abordan mediante un diseño cuidadoso del panel y condiciones de control rigurosas^7,8.

El objetivo general de este método es proporcionar un flujo de trabajo práctico y de bajo costo ampliamente aplicable a anticuerpos validados mediante inmunofluorescencia y optimizado para el análisis rutinario de cultivos adherentes en 2D. La multiplexación se implementa mediante la separación por especie del huésped, fluorocromos espectrales distintos y grupos de control que verifican los niveles de fondo y el rendimiento de la tinción^9,10. Al utilizar cubreobjetos de vidrio de 12 mm en placas estándar de 24 pocillos en lugar de portaobjetos con cámaras especializadas, este flujo de trabajo evita el uso de consumibles dedicados y más costosos, optando por materiales que son habituales en la mayoría de los laboratorios de cultivo celular. Asimismo, este procedimiento utiliza considerablemente menos solución de tinción por unidad de área de crecimiento (150 µL para ≈1,13 cm², o ≈133 µL/cm²) que los formatos comparables con cubreobjetos con cámaras^11,12, que normalmente requieren entre 300 y 500 µL/cm², lo que representa una reducción aproximada de 2 a 4 veces en el consumo de anticuerpos y reactivos por área. Por consiguiente, el protocolo permite la evaluación cualitativa de múltiples dianas respecto a la localización y co-distribución de marcadores, empleando microscopios de campo amplio o confocales convencionales, junto con contratiñones del citoesqueleto y del núcleo. Este flujo de trabajo está destinado a la inmunofluorescencia múltiple convencional en células fijadas, basada en la separación por especie del huésped y la distinción espectral, y no está diseñado para enfoques de multiplexación iterativos o de alta dimensionalidad.

Protocolo

Este estudio no involucró participantes humanos ni sujetos animales. Todos los experimentos se realizaron utilizando la línea celular de osteosarcoma canino D17, una línea celular establecida obtenida de un banco público de células (Banco de Células do Rio de Janeiro, Cat. No. 0276). Por lo tanto, no se requirió aprobación ética.

1. Mantenimiento de la línea celular

1. Mantenga las células adherentes en condiciones de cultivo estándar (37 °C, 5% CO₂, incubadora humedecida) utilizando el medio completo adecuado para la línea celular utilizada.
   NOTA: Como ejemplo representativo, las células de osteosarcoma canino D17 (Banco de Células do Rio de Janeiro [BCRJ], Cat. No. 0276) se mantienen en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de antibiótico-antimicótico, se subcultivan al 70–80% de confluencia utilizando tripsina-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) y se utilizan dentro de un rango de pases validado (por ejemplo, pases 5–20).
2. Confirme el estado negativo para micoplasma antes de los experimentos mediante un ensayo validado de detección de micoplasma.

2. Preparación de la placa de 24 pocillos y las cubreobjetos de vidrio

NOTA: Las superficies de las láminas de cubrimiento deben limpiarse mediante inmersión en etanol al 70 % (5 min, repetido 3 veces)×) antes de la esterilización por cualquiera de los métodos descritos a continuación; después de la esterilización, las laminillas deben almacenarse en un recipiente cerrado a temperatura ambiente hasta su uso.

1. Coloque cubreobjetos de vidrio redondos limpios de 12 mm en una placa de Petri de vidrio (o portacubreobjetos) y esterilice en autoclave. También esterilice un par de pinzas metálicas de punta fina.
2. Alternativa: limpie los cubreobjetos y las pinzas con etanol al 70 %, déjelos secar al aire y descontamine la superficie mediante exposición a luz ultravioleta (UV) (30 min) dentro de una cabina de seguridad biológica antes de su uso. Almacene los cubreobjetos esterilizados en un recipiente cerrado a temperatura ambiente hasta su uso.
3. En una cabina de seguridad biológica, utilice las pinzas estériles para transferir un cubreobjeto estéril a cada pocillo designado para los grupos experimentales en una placa de cultivo celular de 24 pocillos.
4. Opcional: recubra los cubreobjetos con recubrimientos que promuevan la adhesión siguiendo las instrucciones del fabricante o las directrices establecidas del laboratorio, si es necesario para el tipo celular utilizado.
   NOTA: Las opciones de recubrimiento (poli-L-lisina, colágeno I o fibronectina) y sus concentraciones de trabajo se enumeran en la Tabla de materiales. Para la mayoría de las líneas celulares adherentes cultivadas sobre vidrio, son suficientes cubreobjetos sin recubrir y esterilizados; los componentes del recubrimiento pueden ser antigénicos, por lo que el recubrimiento seleccionado no debe presentar reacción cruzada con ningún anticuerpo del panel.
5. Si los cubreobjetos fueron recubiertos, aspire la solución de recubrimiento en exceso, enjuáguelos una vez con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) y déjelos secar al aire en la cabina de seguridad biológica antes de sembrar las células.

3. Grupos experimentales

1. Incluya un panel de controles adecuados al diseño de multiplexación.
   NOTA: Un control sin anticuerpo (sin anticuerpo primario ni secundario) revela la autofluorescencia intrínseca, y un control sin primario (cóctel de anticuerpos secundarios sin ningún primario) evalúa la unión no específica del secundario y el fondo en todos los canales simultáneamente; dado que este protocolo utiliza exclusivamente anticuerpos secundarios espectroscópicamente distintos, este único control evalúa independientemente cada secundario dentro de su canal respectivo, cumpliendo así la misma función que un control individual por fluoróforo solo con el anticuerpo secundario. Los controles de tinción individual, en los que se aplica por separado cada par primario–secundario, validan el desempeño de cada anticuerpo antes de la combinación en multiplex y, mediante la comparación con la condición de multiplex, permiten evaluar la interferencia espectral entre cada par de fluoróforos. Siempre que sea posible, se utiliza un control positivo que exprese el antígeno diana para confirmar el desempeño del ensayo.

4. Siembra celular (plaqueo) sobre cubreobjetos

1. En una cabina de seguridad biológica, desprenda las células utilizando tripsina (o cualquier otro método de disociación adecuado), neutralice y resuspenda en medio de cultivo completo.
2. Contar las células utilizando un contador celular automatizado o un hemocitómetro.
3. Diluya las células a 6 × 10⁴–1 × 10⁵ células/mL.
4. Agregue 0,5 mL de suspensión celular por pocillo (final: 3 × 10⁴–5 × 10⁴ células/pocillo).
   NOTA: Si es necesario, se puede usar una punta estéril de pipeta para asegurar suavemente que la lámina cubreobjetos quede plana en el fondo del pocillo, evitando rayarla.
5. Incube las células en condiciones estándar (37 °C, 5 % CO₂) hasta que las células se adhieran y alcancen el grado de confluencia deseado o se llegue al punto temporal experimental.

5. Tratamiento celular (Opcional)

1. Seleccione el momento del tratamiento según el diseño experimental. El tratamiento puede incluir terapia farmacológica, estimulación con citoquinas, manipulación genética para inducir o silenciar la expresión del gen objetivo, u otras intervenciones experimentales, según corresponda.
2. Etiquete las pocilas para identificar los grupos control y tratados.
3. Incube durante los tiempos requeridos; evite la sobreconfluencia, ya que el crecimiento excesivo aumenta el fondo y compromete la morfología.
   NOTA: Las células deben estar adheridas al cubreobjetos antes de la fijación, a menos que el diseño requiera fijación inmediatamente después de la siembra.
4. Para objetivos secretados rápidamente (por ejemplo, citoquinas), agregue brefeldina A (BFA) al medio de cultivo a una concentración final de 1–10 µg/mL (comúnmente 5 µg/mL) e incube durante 4–6 h a 37 °C, 5% CO₂ antes de la fijación.
5. Retire el medio que contiene BFA y continúe inmediatamente con la Fijación.

6. Tinción por inmunofluorescencia

NOTA: A partir de la fijación, no se requiere técnica estéril; la tinción puede realizarse sobre la bancada, utilizando una campana extractora de gases cada vez que se manipule un reactivo con PRECAUCIÓN. Las muestras no deben secarse en ningún momento; al aspirar, se deja una película delgada de tampón y se agrega inmediatamente la siguiente solución.

1. Fijación (elegir una):
   NOTA: El fijador se selecciona según la localización del blanco y la sensibilidad del epítopo (ver Discusión): el paraformaldehído (PFA) (formaldehído preparado a partir de paraformaldehído) es adecuado para la mayoría de los blancos y es compatible con la faloídicina; el metanol puede favorecer ciertos epítopos nucleares/fosfoepítopos, pero perjudica la tinción de F-actina.
   1. Fijación con PFA (recomendada para la mayoría de los blancos):
      1. Aspire el medio y enjuague suavemente una vez con solución salina tamponada con Tris (TBS) (0,5 mL/pocillo).
      2. Añada PFA al 4 % en PBS (solución salina tamponada con fosfato) (0,5 mL/pocillo) e incube durante 10 min a temperatura ambiente (≈25 °C).
      3. Aspirar el PFA y lavar 3 veces× con TBS (aspirar rápidamente; no dejar que los pocillos sequen).
         NOTA: PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico y un posible agente carcinógeno. Manipule las soluciones de PFA en una campana extractora de gases químicos certificada y utilizando el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes y protección ocular). Evite la inhalación y el contacto con la piel, y deseche los residuos de acuerdo con las directrices institucionales de seguridad química.
2. Alternativamente, fijación con metanol (útil para algunos antígenos nucleares y ciertos epítopos fosforilados):
   1. Enfriar previamente metanol al 100% a −20 °C.
   2. Añada metanol frío directamente a las células (0,5 mL/pocillo) e incube durante 5 min a −20 °C.
   3. Lavar 3 veces× con TBS (aspirar inmediatamente; no permitir que los pocillos sequen).
      NOTA: Tras la fijación con metanol, puede no ser necesaria una permeabilización adicional, y esta debe optimizarse según el anticuerpo o epítopo. La fijación con metanol puede dañar los epítopos de membrana e interferir con la tinción de faloína conjugada con fluoróforo/F-actina. PRECAUCIÓN: El metanol es tóxico, volátil y altamente inflamable. Manipúlese en un área bien ventilada o en cabina de gases químicos; úsese equipo de protección personal adecuado; y manténgase alejado de llamas abiertas y fuentes de calor. PUNTO OPCIONAL DE INTERrupCIÓN: Tras la fijación, almacene las muestras a 4 °C en PBS que contenga una baja concentración de fijador (por ejemplo, PBS + 0.1 % PFA) durante hasta una semana; validar el tiempo de almacenamiento para cada antígeno.
3. Apagado del aldehído (Opcional)
   1. Incubar con glicina 50 mM en TBS (0,5 mL/pocillo) durante 5 min a temperatura ambiente (≈25 °C).
   2. Lavar 3 veces× con TBS + 0,05 % de polisorbato 20.
      NOTA: La glicina neutraliza los grupos aldehído libres que quedan tras la fijación con PFA, reduciendo la autofluorescencia relacionada con la fijación y mejorando la especificidad de la tinción con anticuerpos.
4. Permeabilización
   1. Si se dirige a proteínas de membrana, omita la permeabilización y continúe con el paso 6.5.1.
   2. Si se dirige contra proteínas intracelulares o nucleares, permeabilice con un detergente no iónico al 0,1-0,3 % en TBS (0,5 mL/pocillo) durante 5-10 min a temperatura ambiente (≈25 °C).
   3. Lavar 3 veces× con TBS + 0,05 % de polisorbato 20 (TBST).
      NOTA: La concentración y el tiempo de exposición del detergente no iónico octilfenol etoxilado se optimizan según el blanco; la adecuación se evalúa mediante la señal en el compartimento correcto, la morfología conservada, la F-actina bien definida y un fondo bajo (véase la Discusión). Si se utiliza saponina, debe mantenerse en todos los tampones posteriores de anticuerpos y lavados. PRECAUCIÓN: El detergente no iónico octilfenol etoxilado es perjudicial si se inhala o entra en contacto con la piel y puede causar irritación ocular. Manipúlelo con guantes y evite la formación de aerosoles.
5. Bloqueo
   1. Añadir 0,5 mL por pocillo de solución bloqueante (5 % de albúmina sérica bovina (BSA) en TBS) e incubar durante 30 min a temperatura ambiente (≈25 °C).
   2. Aspirar el tampón de bloqueo.
   3. Pase directamente a la incubación con el anticuerpo primario (no lave).
6. Incubación con anticuerpo primario
   NOTA: Las diluciones de los anticuerpos primarios y secundarios se establecen empíricamente mediante titulación (véase la Discusión).
   1. Preparar paneles de anticuerpos primarios simples o multiplex en tampón salino con Tris que contenga polisorbato 20 al 0,05 % y BSA al 1 % (TBST-BSA) 1%), utilizando concentraciones de anticuerpos pre-optimizadas para cada blanco.
   2. Para inmunofluorescencia múltiple, combine todos los anticuerpos primarios no conjugados dirigidos contra antígenos distintos procedentes de especies huésped diferentes (por ejemplo, ratón anti-interferón-β (IFN-β) + conejo anti-p14ARF + cabra anti-actina) en un solo cóctel de anticuerpos.
   3. Añadir 150 µL por pocillo, asegurando que toda la laminilla esté completamente cubierta por la solución de anticuerpo.
      NOTA: Para prevenir la evaporación en volúmenes bajos, la placa se incuba en una cámara humidificada (por ejemplo, una caja sellada con papel absorbente húmedo).
   4. Incubar durante 1,5 h a temperatura ambiente (≈25 °C) o 12–16 h a 4 °C.
   5. Lavar 3 veces× con TBST durante 3 min cada uno a temperatura ambiente (≈25 °C), aspire inmediatamente después de cada lavado.
7. Incubación con el anticuerpo secundario (y con primarios directamente conjugados, cuando corresponda)
   NOTA: A partir de este paso, las muestras se mantienen protegidas de la luz para evitar el fotoblanqueo. Se utilizan fluorocromos espectroscópicamente distintos en los anticuerpos secundarios y en cualquier anticuerpo primario directamente conjugado para minimizar la interferencia cruzada, y se emplean anticuerpos secundarios altamente cruz-adsorbidos y específicos de especie para reducir la unión a anticuerpos primarios no específicos. El diseño del panel de fluorocromos, que incluye marcadores nucleares y del citoesqueleto, así como la compatibilidad con los sistemas de excitación y emisión del microscopio, se aborda en la Discusión.
   1. Diluya los anticuerpos secundarios en solución de TBST con BSA al 1 % utilizando concentraciones previamente optimizadas. Para la detección multiplex, combine todos los anticuerpos secundarios correspondientes a las especies huésped de los anticuerpos primarios utilizados (un anticuerpo secundario por especie huésped) en una única mezcla.
   2. Añadir 150 µL por pocillo, asegurando que todo el cubreobjetos quede completamente cubierto.
   3. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente (≈25 °C).
      NOTA: Si el panel incluye uno o más anticuerpos primarios directamente conjugados, añádalos junto con el cóctel de anticuerpos secundarios y prolongue la incubación a 1,5 h a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C).
   4. Lavar 3 veces× con TBST durante 3 min cada uno a temperatura ambiente (≈25 °C), aspirando rápidamente después de cada lavado.

7. Tinción nuclear de contraste y tinción de f-actina

1. Añada la contratiñación nuclear Hoechst 33342 (1:5000) diluida en TBS e incube durante 15 min a temperatura ambiente (≈25 °C), protegido de la luz. Si se va a marcar la F-actina con faloidina en lugar de con un anticuerpo anti-actina, incluya faloidina (1:400) en la misma solución.
2. Lavar 3 veces× con TBST, aspirando rápidamente después de cada lavado (no permita que los pocillos se sequen).
3. Añada 0,5 mL de TBS a cada pocillo para mantener las laminillas sumergidas hasta su recuperación/montaje.

8. Recuperación del cubreobjetos y montaje del portaobjetos

1. Mientras las laminillas permanezcan sumergidas en TBS, inserte la punta de una aguja fina o un escalpelo bajo el borde de la laminilla y levántela suavemente hasta que un lado quede parcialmente elevado. Con pinzas finas, tome la laminilla y retírela del pocillo.
   NOTA: Retirar una laminilla cuando no está sumergida puede hacer que se adhiera firmemente al fondo del pocillo debido a la tensión superficial, lo que aumenta el riesgo de rotura.
2. Sosteniendo la laminilla con pinzas, absorba cuidadosamente el exceso de TBS de los bordes utilizando un aspirador de vacío o papel absorbente. Evite tocar la superficie que contiene las células.
   NOTA: Se debe evitar el líquido residual excesivo, ya que puede diluir el medio de montaje y comprometer la claridad y el contraste de la imagen.
3. Coloque la laminilla con la cara de las células hacia abajo sobre un portaobjetos limpio que contenga una pequeña gota (≈3 µL) de medio de montaje.
   NOTA: Puede utilizarse un medio antifade comercial autorreparable o un medio casero basado en glicerol al 80 %/solución salina tamponada con fosfato (PBS); los montajes a base de glicerol se sellan con esmalte de uñas transparente, y tras la contratinción se seleccionan medios sin tinción nuclear. En la Discusión se proporcionan indicaciones sobre los límites de almacenamiento y la estabilidad de los fluoróforos.
4. Deje que los portaobjetos se curenen horizontalmente durante ≈24 h, protegidos de la luz, antes de la adquisición de imágenes.

Resultados

Este protocolo permite la tinción inmunofluorescente mono y multiplex de células tumorales caninas adherentes cultivadas sobre cubreobjetos de vidrio, lo que posibilita la visualización simultánea de marcadores nucleares, citoplasmáticos y del citoesqueleto, manteniendo al mismo tiempo la morfología celular. Los resultados representativos se ilustran en la Figura 3.

En experimentos exitosos, las células de osteosarcoma canino D17 modificadas genéticamente para expresar p14ARF canino e IFN-β canino (sección 5.1) mostraron señales fluorescentes intensas y espacialmente adecuadas, con bajo fondo y tinción inespecífica mínima. En las células que expresaban p14ARF (Figura 3A), la inmunofluorescencia reveló una localización predominantemente nuclear, consistente con la distribución subcelular conocida de p14ARF. El uso de detergente no iónico etoxilato de octilfenol al 0,3 % permitió un acceso eficiente de los anticuerpos a los epítopos nucleares, preservando al mismo tiempo la morfología nuclear y la integridad del citoesqueleto, tal como se confirmó mediante tinción nuclear de contraste clara y estructuras de actina visualizadas con un anticuerpo anti-actina (fluoróforo emisor de color naranja).

Para células que expresan IFN-β (Figura 3A), se observó una señal citoplasmática tras la incubación con BFA para bloquear la secreción de proteínas, lo que permitió la acumulación intracelular y la detección de esta citocina soluble. En estas condiciones, una permeabilización más suave fue suficiente para permitir la penetración de los anticuerpos sin extraer excesivamente los contenidos citoplasmáticos. La tinción exitosa se caracterizó por una fluorescencia citoplasmática de tipo puntiforme a difusa, una interferencia mínima con el núcleo y una arquitectura de actina preservada.

Se observaron resultados subóptimos cuando los parámetros clave no se optimizaron adecuadamente. Una permeabilización insuficiente dio lugar a una señal nuclear débil o ausente de p14ARF, como se muestra en la condición sin permeabilizar (0 % de detergente no iónico etoxilato de octilfenol; Figura 3B y Figura Suplementaria 1). Por el contrario, una permeabilización excesiva (≥0,5 % de detergente no iónico etoxilato de octilfenol o tiempos prolongados de incubación) puede provocar una pérdida parcial de la tinción del citoesqueleto, un aumento de la fluorescencia de fondo y una morfología celular comprometida. En experimentos con proteínas secretadas rápidamente (por ejemplo, IFN-β), la omisión de BFA frecuentemente produjo una señal intracelular más débil, lo que refleja una secreción rápida y no un fallo del protocolo.

Los controles de tinción individual (Supplementary Figure 2) mostraron señal únicamente en el canal correspondiente a cada diana, lo que respalda la especificidad de la tinción de inmunofluorescencia observada. Las condiciones de control negativo, incluyendo controles sin anticuerpo primario y sin anticuerpo (Supplementary Figure 2), mostraron tinción nuclear esperada, con señal despreciable en los canales dependientes de anticuerpos, lo que indica baja autofluorescencia y unión mínima no específica del anticuerpo secundario.

En conjunto, estos resultados representativos demuestran que el protocolo permite la detección de proteínas con localizaciones subcelulares distintas cuando la fijación, la intensidad de la permeabilización y las estrategias específicas según el blanco (por ejemplo, bloqueo de la secreción) se ajustan a la biología del blanco. Una optimización adecuada produce una fluorescencia intensa y específica con bajo fondo y morfología celular preservada, mientras que condiciones no óptimas dan lugar a señales más débiles o más ruidosas y a una estructura celular alterada.

Figura 1: Diagrama de flujo general del protocolo de inmunofluorescencia mono- y multiplex. Los pasos principales, desde el mantenimiento del cultivo celular hasta la adquisición de imágenes, incluyendo los dos puntos de decisión que requieren selección según el blanco: el método de fijación (PFA frente a metanol) y la permeabilización (según la localización subcelular del blanco). El tratamiento experimental opcional, incluyendo el pretratamiento con brefeldina A (BFA) para blancos de secreción rápida, se indica como una bifurcación antes de la fijación. Los pasos opcionales no mostrados por claridad (por ejemplo, la eliminación de aldehídos) se describen en el Protocolo completo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Representación esquemática de las estrategias de detección por fluorescencia basadas en anticuerpos. La detección directa utiliza anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos, mientras que la detección indirecta emplea anticuerpos primarios no conjugados emparejados con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos, que es la estrategia utilizada en todo este protocolo. Para aplicaciones multiplex, la detección indirecta requiere anticuerpos primarios no conjugados producidos en diferentes especies huésped, lo que permite que cada anticuerpo secundario reconozca selectivamente a su anticuerpo primario correspondiente sin reacciones cruzadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Inmunofluorescencia múltiple de células de osteosarcoma canino D17. Las células D17 (5 × 10⁴) se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio en placas de 24 pocillos y se fijaron con paraformaldehído al 4 % (PFA) durante 10 min a 25 °C. Las células se sometieron a inmunofluorescencia múltiple utilizando los anticuerpos primarios anti-p14ARF (1:200; fluoróforos emisores de luz verde), anti-actina (1:200; fluoróforos emisores de luz naranja) y anti-interferón-β (IFN-β) (1:200; fluoróforos emisores de luz roja lejana), junto con los anticuerpos secundarios correspondientes en una dilución de 1:500. Los núcleos se contratiñeron. Antes de la detección de IFN-β, las células se trataron con BFA (5 µg/mL, 4 h) para bloquear la secreción de proteínas. (A) Las células se permeabilizaron con detergente no iónico al 0,3 % durante 10 min a 25 °C. (B) Células procesadas sin permeabilización (0 % de detergente no iónico). Imágenes representativas de 2 réplicas biológicas independientes, cada una realizada con 2 réplicas técnicas. En esta figura solo se muestran los canales combinados; los canales individuales se proporcionan en la Figura Suplementaria 1. Se observan diferencias en la marcación entre las condiciones, particularmente para p14ARF (A; flechas), un blanco intranuclear, cuya señal estuvo ausente en el grupo sin permeabilizar (B). Los paneles A y B se adquirieron y procesaron utilizando configuraciones idénticas (Tabla Suplementaria 1). Los controles negativos y de tinción individual correspondientes a este panel se muestran en la Figura Suplementaria 2. Barra de escala: 100 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Canales individuales de fluorescencia correspondientes a la Figura 3, organizados por marcador con muestras permeabilizadas (columna izquierda) y no permeabilizadas (columna derecha). Condiciones mostradas lado a lado: Hoechst 33342 (A, B), p14ARF (C, D; fluoróforos emisores de luz verde), actina (E, F; fluoróforo emisor de luz naranja) e IFN-β (G, H; fluoróforos emisores de luz infrarroja lejana), junto con los paneles fusionados correspondientes (I, J), que coinciden con las Figuras 3A y 3B, respectivamente. Las flechas indican tinción nuclear representativa de p14ARF; las elipses indican tinción representativa de actina (E) e IFN-β (G), respectivamente. Se observa pérdida de la señal nuclear de p14ARF, junto con una marcación subóptima de IFN-β y actina, bajo condiciones no permeabilizadas. La señal residual observada en (D; asterisco) refleja interferencia espectral proveniente de fluoróforos co-presentes, lo cual se confirmó por su ausencia en los controles de tinción individual y solo con el anticuerpo secundario (Figura suplementaria 2). Barra de escala: 100 µm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Controles combinados de inmunofluorescencia correspondientes al panel múltiple de la Figura 3. Para cada grupo control, se muestran los canales individuales (Hoechst 33342, fluoróforos emisores de verde, fluoróforo emisor de naranja y fluoróforos emisores de infrarrojo lejano) junto con la imagen fusionada (quinta columna).A–EControl sin anticuerpo: células procesadas sin anticuerpos primarios ni secundarios.F–JControl solo con anticuerpo secundario: células incubadas con la mezcla de anticuerpos secundarios en ausencia de anticuerpos primarios. (K–O) control individual de p14ARF (fluoróforos emisores de color verde). (P–T) Control con tinción individual de actina (fluoróforo emisor de color naranja). (U–Y) IFN-β control de tinción individual (fluoróforos que emiten en el infrarrojo lejano). La adquisición y los ajustes de procesamiento fueron idénticos a los utilizados en la Figura 3 (Tabla suplementaria 1). Barra de escala: 100 µm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Especificaciones de los cubos de filtro para fluorescencia y orden de adquisición. Las imágenes se adquirieron secuencialmente en un microscopio de fluorescencia invertido de campo amplio (objetivo 40×/0,80) utilizando los cubos de filtro que se indican a continuación, en el orden mostrado, para cada campo de imagen presentado en la Figura 3, la Figura suplementaria 1 y la Figura suplementaria 2. Las imágenes se adquirieron como planos ópticos individuales (sin apilamiento en z). La intensidad de excitación se ajustó mediante el control de intensidad de fluorescencia a los niveles indicados, manteniendo la diafragma del campo de luz incidente en la posición 6 para todos los canales. La configuración de la cámara (digitalización de 8 bits, formato 3072×2048, gamma 1,0) y un ajuste fijo de enfoque digital fueron idénticos para todos los canales y paneles, incluidas las imágenes de control de la Figura suplementaria 2. Se aplicó un único ajuste lineal de brillo/contraste de forma idéntica a todos los canales y paneles para su presentación. Las imágenes se exportaron en formato TIFF. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Guía de solución de problemas para problemas técnicos comunes en el protocolo de inmunofluorescencia. Problemas frecuentes, causas probables y acciones correctivas a lo largo del protocolo.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Varios pasos son fundamentales para el rendimiento consistente de este protocolo de inmunofluorescencia basado en cubreobjetos. Todos los procedimientos se realizan dentro del entorno confinado de un pocillo de cultivo de 24 pocillos, lo que simplifica el manejo, limita la manipulación de las muestras y permite cubrir completamente el cubreobjetos utilizando bajos volúmenes de reactivo, reduciendo así el consumo de anticuerpos por experimento. Dado que estas soluciones de bajo volumen son propensas a la evaporación, las incubaciones se deben realizar preferiblemente en una cámara humidificada, y las muestras nunca deben secarse: incluso un secado breve aumenta la fluorescencia de fondo y degrada la morfología celular. Al aspirar, se deja una película delgada de tampón sobre el cubreobjetos, y se añade inmediatamente la siguiente solución.

La densidad adecuada de siembra celular y el control preciso de la confluencia en el momento de la fijación son esenciales para limitar el fondo y preservar la morfología, ya que el crecimiento excesivo incrementa el fondo y compromete la arquitectura celular. Asimismo, se requiere un control preciso del tiempo y la temperatura de incubación durante todo el proceso, ya que ambos factores influyen en la eficiencia de fijación, la unión de anticuerpos y la señal de fondo^5,13. Cuando las condiciones ambientales fluctúan, el uso de un incubador controlado por temperatura o un horno seco ajustado a 25 °C, combinado con un tiempo de incubación constante entre réplicas, mejora la reproducibilidad.

La fijación es el primer paso decisivo, ya que determina la preservación del antígeno y la arquitectura celular⁵, y el fijador se selecciona según la localización del blanco y la sensibilidad del epítopo. Se recomienda el PFA para la mayoría de los blancos asociados a la membrana, citoplasmáticos, nucleares y del citoesqueleto, ya que preserva la arquitectura, mantiene la distribución de los antígenos y es compatible con la tinción de F-actina basada en faloidina. El metanol puede ser preferible para ciertos antígenos nucleares que se detectan mal tras la fijación por reticulación, particularmente epítopos fosforilados o epítopos sensibles a aldehídos, pero altera la integridad de la membrana, extrae proteínas solubles y perjudica la tinción de faloidina/F-actina; se debe validar la compatibilidad para cada blanco ^13,14,15,16. Para citocinas solubles y otras proteínas secretadas rápidamente, la fijación con PFA combinada con un pretratamiento con BFA retiene la señal intracelular antes de la fijación: la BFA bloquea el transporte de proteínas desde el retículo endoplásmico hasta el aparato de Golgi, promoviendo la acumulación intracelular de proteínas secretadas y permitiendo su detección mediante inmunofluorescencia. Cuando deben detectarse simultáneamente blancos con requisitos de fijación contradictorios, se requiere una optimización empírica. Se ha descrito al glicoxal, un dialdehído pequeño, como una alternativa al PFA, con reticulación más rápida, mejor preservación de antígenos y compatibilidad con inmunofluorescencia y microscopía de superresolución; no tenemos experiencia directa con la fijación con glicoxal y la presentamos como una opción respaldada por la literatura^17,18.

Después de la fijación, una permeabilización adecuada permite el acceso de los anticuerpos a epítopos intracelulares y nucleares, manteniendo la integridad estructural⁵. Una permeabilización insuficiente suele producir una señal débil o ausente a pesar de una morfología intacta, lo que indica un acceso restringido de los anticuerpos, mientras que una permeabilización excesiva extrae proteínas solubles, altera las membranas, provoca la pérdida de la tinción del citoesqueleto y aumenta el fondo. Por lo tanto, el tipo, la concentración y el tiempo de incubación del detergente se optimizan según el blanco. Una permeabilización adecuada puede evaluarse mediante cuatro criterios: (i) señal específica en el compartimento subcelular esperado; (ii) morfología conservada, con límites nucleares y citoplasmáticos bien definidos resueltos por Hoechst 33342 y faloína, respectivamente; (iii) tinción bien definida de F-actina, ya que una señal difusa o perdida del citoesqueleto indica una permeabilización excesiva; y (iv) fondo bajo en los controles negativos. Si no se cumplen estos criterios, se ajusta empíricamente la concentración y/o el tiempo de incubación del detergente no iónico octylphenol ethoxylate. Cuando se combinan antígenos asociados a membrana y antígenos intracelulares en un solo panel, condiciones más suaves (baja concentración de detergente, tiempo de incubación más corto) preservan los epítopos de membrana permitiendo el acceso intracelular, y resulta útil realizar un curso temporal que comience en 5 min y aumente progresivamente. Si se utiliza saponina en lugar de otro detergente, debe mantenerse en todos los tampones posteriores de lavado y de anticuerpos, ya que su efecto permeabilizante es reversible.

Las concentraciones de anticuerpos se establecen empíricamente mediante titulación, en lugar de adoptar recomendaciones genéricas. Un enfoque práctico consiste en una serie de diluciones en serie que abarque al menos 3–4 concentraciones por encima y por debajo de la dilución sugerida por el fabricante (por ejemplo, 1:50, 1:100, 1:200 y 1:400 para una dilución recomendada de 1:200), aplicada a cubreobjetos en réplica bajo condiciones idénticas. Cada dilución se evalúa en función de la intensidad de la señal específica en el compartimento esperado; la relación señal-fondo, comparando muestras teñidas con el control sin anticuerpo primario y el fondo del secundario con el control sin anticuerpo; y la preservación de la morfología. Se selecciona la concentración más baja que produzca una señal fuerte y específica con fondo mínimo. El fondo persistentemente alto suele reducirse mediante una titulación adicional, bloqueo prolongado o aumento de la severidad de los lavados, mientras que una señal débil puede deberse a una fijación excesiva, una concentración subóptima de anticuerpo, la incapacidad del anticuerpo primario para reconocer su epítopo diana, una incompatibilidad entre el anticuerpo secundario y la especie huésped del primario (por ejemplo, un secundario anti-conejo aplicado a un primario de ratón), o la pérdida de señal del fluoróforo debido a la degradación del anticuerpo secundario causada por vencimiento o almacenamiento inadecuado, especialmente exposición repetida a la luz. Si no hay señal en ninguna de las diluciones, conviene extender el tiempo de incubación con el anticuerpo primario o cambiar a incubación nocturna a 4 °C, confirmar la expresión del antígeno en la línea celular, verificar la compatibilidad del anticuerpo con las condiciones de fijación y permeabilización, revisar el lote, almacenamiento y fecha de caducidad de los anticuerpos primario y secundario, asegurarse de que el microscopio disponga de los filtros de excitación y emisión adecuados para el fluoróforo, y, si el problema persiste, probar un clon alternativo. Al preparar las soluciones de trabajo, el volumen necesario del cóctel es igual al número de pocillos multiplicado por 150 µL más aproximadamente un 10 % adicional para compensar las pérdidas por pipeteo; el volumen de stock de cada anticuerpo equivale a este volumen total dividido por su factor de dilución (por ejemplo, 825 µL ÷ 200 = 4,13 µL para una dilución 1:200), completando el resto con TBST–BSA al 1 %. El mismo cálculo se aplica al cóctel secundario, sustituyendo el factor de dilución correspondiente.

El rendimiento de la multiplexación depende finalmente del diseño del panel de fluorocromos. Los fluorocromos asignados a los objetivos principales, la contratincción nuclear y el marcador del citoesqueleto deben coordinarse para evitar solapamiento espectral o duplicación de señales, y el sistema de imagen debe permitir la excitación y detección de cada fluorocromo seleccionado^9,10; los rangos de excitación y emisión para cada cubo de filtros se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1, lo que permite una comparación directa de la compatibilidad espectral entre los componentes del panel. Se recomienda a los usuarios que adapten este panel a otros fluorocromos seleccionar combinaciones con solapamiento mínimo entre canales adyacentes cuando sea posible, y verificar la ausencia de diafonía en controles de tinción individual antes de combinar los objetivos, tal como se realizó aquí. Se observó señal residual atribuible a fluorocromos coexistentes en todos los canales adquiridos en el panel de multiplexación (Figura Suplementaria 1), pero estuvo ausente en los controles correspondientes de tinción individual y solo con anticuerpos secundarios (Figura Suplementaria 2), lo que indica diafonía espectral derivada de los conjuntos de filtros de banda ancha utilizados en la adquisición por campo amplio (potencialmente reducible mediante excitación láser confocal). Dada la separación espacial entre la localización nucleolar de p14ARF y la distribución filamentosa/citoplasmática de la actina y del IFN-β, esta diafonía no compromete la interpretación de la localización de p14ARF en el panel de multiplexación. Este protocolo se basa en la multiplexación convencional mediante fluorocromos, en la cual el número de objetivos resolubles simultáneamente está limitado por las especies huésped disponibles para los anticuerpos y los fluorocromos espectroscópicamente distintos. Se puede lograr una multiplexación de orden superior mediante inmunofluorescencia cíclica o imágenes espectrales, que permiten tinción/eliminación iterativa o desmezclado lineal de fluorocromos superpuestos, respectivamente, pero requieren equipos y software especializados que no se tratan aquí^19,20.

El medio de montaje afecta tanto la calidad de la imagen como la duración de la señal. Puede utilizarse un medio antifade comercial autorreparable o, como alternativa casera, glicerol al 80 % en PBS (sin antifade, sin autorreparación); los montajes caseros a base de glicerol se sellan con esmalte transparente para uñas a fin de evitar el secado y el movimiento del cubreobjetos, y se eligen medios sin colorantes nucleares una vez que se ha realizado la contracoloración nuclear. Las imágenes se deben adquirir preferiblemente poco después del endurecimiento. Cuando no es posible la adquisición inmediata, las muestras endurecidas pueden almacenarse en una caja oscura a 4 °C durante 2–4 semanas o a −20 °C durante hasta 6 meses, teniendo en cuenta que los fluoróforos altamente fotolábiles (por ejemplo, fluoróforos que emiten luz verde) pierden señal con el tiempo incluso bajo condiciones óptimas de almacenamiento. Los medios antifade comerciales prolongan considerablemente la estabilidad de los fluoróforos en comparación con los medios caseros a base de glicerol; cuando se utilizan estos últimos, se recomienda encarecidamente realizar la adquisición dentro de las 24–48 horas. El esmalte transparente para uñas es compatible con la mayoría de los fluoróforos y no afecta apreciablemente la conservación de la señal, siempre que se permita un endurecimiento en la oscuridad de al menos 30 minutos antes del almacenamiento.

A partir del paso de fijación, ya no se requiere técnica estéril, y la tinción puede realizarse sobre la bancada, reservando una campana extractora química certificada para cualquier reactivo etiquetado como PRECAUCIÓN. Las líneas celulares derivadas de tumores, como D17 y otras, se manipulan de acuerdo con las directrices institucionales de bioseguridad para materiales del grupo de riesgo 1 o 2, según corresponda. Todos los materiales que hayan estado en contacto con células cultivadas, cubreobjetos, puntas, medio y residuos líquidos se descontaminan antes de su eliminación: los residuos líquidos se inactivan con lejía hasta una concentración final del 10 % durante al menos 30 minutos, y los residuos sólidos se descartan en contenedores adecuados para residuos biológicos. Los residuos químicos que contengan PFA, metanol o detergente no iónico etoxilado de octilfenol se separan y eliminan de acuerdo con las regulaciones institucionales de seguridad química.

Aunque fue diseñado para ser ampliamente útil, este procedimiento debe considerarse más bien como susceptible de adaptación dependiente del blanco, en lugar de un procedimiento rígido y universal; su aplicación exitosa depende de la comprensión por parte del investigador de la localización, solubilidad, accesibilidad del epítopo y sensibilidad a la fijación y permeabilización de cada antígeno. Deben enfatizarse dos limitaciones. Primero, la evaluación de la tinción aquí es cualitativa, basada en la comparación con controles negativos y la localización subcelular esperada, más que en una cuantificación formal de la relación señal-fondo; por lo tanto, la consistencia reportada aquí refleja una tinción cualitativa reproducible entre cubreobjetos y condiciones de control replicados, y no un rendimiento validado cuantitativamente. Se proporciona una guía consolidada de solución de problemas que resume problemas comunes, causas probables y acciones correctivas en Supplementary Table 2. Los laboratorios que requieran lecturas cuantitativas pueden utilizar software de análisis de imágenes de código abierto para la medición de intensidad media, sustracción de fondo, cuantificación basada en regiones de interés (ROI) y perfilado de intensidad²¹. Segundo, los datos representativos provienen de una única línea tumoral canina adherente (D17), por lo que la extensión a otros tipos celulares, especies o combinaciones de antígenos requerirá una reoptimización específica del blanco en cuanto a las condiciones de fijación, permeabilización y anticuerpos.

En resumen, este protocolo proporciona un flujo de trabajo flexible y rentable para inmunofluorescencia mono y multiplex en cultivos adherentes en 2D, combinando un bajo consumo de reactivos con un rendimiento de tinción constante en equipos de laboratorio estándar, a la vez que permite adaptaciones informadas dependientes del blanco.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos	Corning	3524	Siembra y tinción de cubreobjetos
Antibiótico-antimicótico	Gibco	15240062	Se utiliza para prevenir la contaminación bacteriana y fúngica en cultivos celulares.
Solución diluyente de anticuerpos (TBST-BSA al 1%)	Preparado en el laboratorio	—	Para 10 mL: 2 mL de la solución bloqueante de BSA al 5% + 5 µL de Tween-20 + 7,995 mL de TBS 1x (solución de trabajo) hasta un volumen final de 10 mL (final: BSA al 1%, Tween-20 al 0,05% en TBS; pH 7,6). Preparar fresco; si se almacena, mantener a 4 °C protegido de la contaminación y usar dentro de 1 semana.
Solución bloqueante	Preparado en el laboratorio	—	Para 10 mL: 0,5 g de BSA disueltos en 10 mL de TBS 1x (1 mL de stock de TBS 10x + 9 mL de agua destilada); pH 7,6. Incubar 30 min a 25 °C; preparar fresco.
(BSA al 5% en TBS)
Brefeldina A	Sigma-Aldrich	B7651	5 µg/mL; tratamiento previo de 4 h para bloquear la secreción de proteínas antes de la detección de citocinas.
BSA (albúmina sérica bovina)	Sigma-Aldrich	A7906	Al 5% en TBS para bloqueo; al 1% en TBS + 0,05% de Tween-20 para dilución de anticuerpos.
Reactivo a base de colágeno (recubrimiento de cubreobjetos, opcional)	Corning	354231	Colágeno tipo I derivado de dermis bovina; diluido a 50 µg/mL en HCl 0,01 N; aplicar a 5–10 µg/cm² (≈100 µL/pocillo); incubar 1 h a temperatura ambiente (≈25°C); aspirar y enjuagar con PBS antes de sembrar las células.
Cubreobjetos de vidrio, redondos de 12 mm	Knittel Glass	100013	Sustrato para cultivo celular adherente y tinción.
Línea celular de osteosarcoma canino D17	Banco de células do Rio de Janeiro	276	Modelo celular representativo; mantener en DMEM suplementado con 10% de SFB y antibiótico-antimicótico; mantener a 37 °C, 5% de CO2.
(BCRJ)
Agua desionizada/destilada	Preparado en el laboratorio	—	Preparación de tampones.
DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco)	Gibco	12100-046	Medio completo para cultivo celular.
Etileno	Supelco	1.00983	Descontaminación de cubreobjetos/forceps.
Suero bovino fetal	Sigma-Aldrich	F7524	Suplemento en medio de cultivo celular.
(SFB)
Fibronectina	Gibco	33016015	Glicoproteína de matriz extracelular; diluida a 0,0125 mg/mL en medio de cultivo celular; aplicar a 100 µL/pocillo e incubar durante 1 h a temperatura ambiente (≈25°C) antes de sembrar las células.
Forceps metálicos de punta fina	Varios	—	Manipulación de cubreobjetos.
Microscopio de fluorescencia	Leica Microsystems	DMi8	Microscopio de fluorescencia de campo amplio DMi8 (Leica Microsystems), objetivo HC PL FLUOTAR 40×/0,80 DRY; compatible con fluorocromos del panel (AF488, AF555, AF647, Hoechst).
Portaobjetos de vidrio	Bioslide	—	Montaje de cubreobjetos teñidos para imágenes.
Placa de Petri de vidrio o soporte para cubreobjetos	Varios	—	Esterilización/almacenamiento de cubreobjetos.
Glicina	Sigma-Aldrich	8.16E+09	Para 10 mL de solución 50 mM: 37,5 mg de glicina disueltos en 10 mL de TBS 1x; pH 7,6. 5 min a 25 °C; paso opcional de eliminación de aldehídos tras la fijación, antes de la permeabilización; preparar fresco.
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Para 10 mL de solución de trabajo: diluir stock 1:5000 en TBS. Contratinción nuclear; incubar protegido de la luz; preparar fresco.
Cámara húmeda	Varios/Preparado en el laboratorio	—	Para incubación con anticuerpos; alternativamente, se puede armar con una caja de plástico sellada con papel absorbente humedecido.
ImageJ	Código abierto (NIH)	—	Utilizado para análisis de imágenes tras la adquisición.
Software de adquisición de imágenes	Leica Microsystems	LAS X 3.7.3	Utilizado para la adquisición de imágenes en Leica DMi8.
Metanol	Merck	1.06009	Fijación alternativa (antígenos nucleares/epítopos fosforilados); preenfriado a −20 °C, incubación de 5 min; puede afectar la tinción de faloídicina/F-actina.
Medio de montaje	Sigma-Aldrich	G2289	Para 10 mL: 8 mL de glicerol + 2 mL de PBS, pH 7,6, mezclar bien. No tiene propiedades antifade y no se cura por sí solo. Sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas para evitar el secado/desplazamiento, almacenar las preparaciones a 4 °C protegidas de la luz e imaginar rápidamente para minimizar el fotoblanqueo.
(a base de glicerol)
Medio de montaje (ProLongTM Glass)	Invitrogen	P36984	Contiene reactivos antifade y se cura (endurece) en ~24 h a temperatura ambiente, protegido de la luz, formando un montaje permanente (no requiere sellado con esmalte de uñas). Almacenar las preparaciones a 2–8 °C, protegidas de la luz hasta la adquisición de imágenes.
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Componente iónico del tampón TBS; mantiene la osmolaridad fisiológica para preservar la morfología celular y tisular durante los pasos de lavado e incubación con anticuerpos.
Aguja (de calibre fino, por ejemplo, 25–27G)	Varios	—	Se utiliza como palanca para levantar/desprender suavemente el cubreobjetos del fondo del pocillo sin dañar la monocapa celular.
Paraformaldehído (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Para 10 mL: 0,4 g de polvo de paraformaldehído disueltos en 8 mL de PBS, calentados a 60–65 °C con unas gotas de NaOH 1N hasta que quede transparente, enfriar, ajustar el pH a 7,4 y completar a 10 mL con PBS; filtrar a través de un filtro de 0,2 µm antes de usar. Preparar fresco o alícuotar y almacenar a −20 °C, evitando ciclos repetidos de congelación-descongelación.
Faloídicina, conjugada con fluorocromo.	Invitrogen	Dependiendo del color de fluorescencia elegido.	Para 10 mL de solución de trabajo: diluir stock 1:400 en TBS, pH 7,6, según las indicaciones del fabricante. Etiqueta alternativa del citoesqueleto/F-actina; preparar fresco, protegido de la luz.
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma-Aldrich	P4474-1L	Tampón fosfato isotónico (pH 7,4); mantiene la osmolaridad fisiológica para preservar la morfología celular durante los pasos de fijación y lavado.
(PBS)
Polilisina-L (recubrimiento de cubreobjetos, opcional)	Sigma-Aldrich	P8920	Reactivo sintético de recubrimiento policatiónico que mejora la adhesión celular electrostática; se utiliza a 0,1 mg/mL en agua destilada; volumen suficiente para cubrir la superficie del cubreobjetos; incubar 30 min a 25 °C antes de sembrar las células.
Anticuerpo primario, anti-actina (huésped caprino)	Santa Cruz Biotechnology	SC-1615	Anticuerpo anti-actina; policlonal, no conjugado, detectado con anticuerpo secundario anti-cabra. Se utiliza a una dilución de trabajo de 1:200.
Anticuerpo primario, anti-IFN-β (huésped murino)	Aviva Systems Biology	OAPB00536	Anticuerpo anti-IFN-β; policlonal, no conjugado, detectado con anticuerpo secundario anti-ratón. Se utiliza a una dilución de trabajo de 1:200.
Anticuerpo primario, anti-p14ARF (huésped de conejo)	Calbiochem	PC409	Anticuerpo anti-p14ARF; policlonal, no conjugado, detectado con anticuerpo secundario anti-conejo. Este producto ha sido discontinuado; se deberá validar un nuevo anticuerpo si se planea trabajar con este blanco. Se utiliza a una dilución de trabajo de 1:200.
Anticuerpo secundario, anti-conejo, conjugado con Alexa Fluor 488	Thermo Fischer Scientific	A32731TR	Anticuerpo anti-conejo conjugado con AF488. Se utiliza a una dilución de trabajo de 1:500.
Anticuerpo secundario, anti-cabra, conjugado con Alexa Fluor 555	Thermo Fischer Scientific	A-21432	Anticuerpo anti-cabra conjugado con AF555. Se utiliza a una dilución de trabajo de 1:500.
Anticuerpo secundario, anti-ratón, conjugado con Alexa Fluor 647	Thermo Fischer Scientific	A-21235	Anticuerpo anti-ratón conjugado con AF647. Se utiliza a una dilución de trabajo de 1:500.
Solución salina tamponada con Tris (TBS), stock 10x	Preparado en el laboratorio	—	Para 100 mL: disolver 6,06 g de Tris base y 8,77 g de NaCl en 80 mL de agua destilada; ajustar el pH a 7,6 con HCl concentrado; completar a volumen final de 100 mL; autoclavar. Diluir 1:10 en agua destilada para obtener la solución de trabajo (TBS 1x) (final: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6); almacenar a temperatura ambiente o a 4 °C hasta 3 meses.
TBST (TBS + 0,05% de Tween-20)	Preparado en el laboratorio	—	Para 10 mL: 1 mL de stock de TBS 10x + 8,995 mL de agua destilada + 5 µL de Tween-20 (0,05% v/v); pH 7,6. Tampón de lavado entre los pasos de tinción; preparar fresco, usar en ~1 semana a 4 °C.
Tris base	Sigma-Aldrich	252859	Agente tampón utilizado para preparar la solución stock de TBS; mantiene la estabilidad del pH en el rango fisiológico (pH 7,6) para los tampones de lavado y dilución en inmunofluorescencia.
Triton X-100 (detergente no iónico etoxilado de octilfenol)	Sigma-Aldrich	X100	Para 10 mL: 10 µL de Triton X-100 en 9,99 mL de TBS 1x para TX100 al 0,1%; 30 µL en 9,97 mL de TBS 1x para TX100 al 0,3% (depende del blanco; los blancos nucleares requieren concentraciones más altas).
Tripsina-EDTA	Gibco	25200056	Utilizado para el desprendimiento celular.
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	Utilizado en TBS como tampón de lavado (TBST) y diluyente de anticuerpos (TBST-BSA al 1%).