Artículo de método

Cribado in vivo paralelo de la eliminación y activación génica en la glándula mamaria del ratón

DOI:

10.3791/71115

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24 de julio de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un enfoque escalable de cribado intraductal CRISPR que permite estudios paralelos in vivo de eliminación y activación génica en la glándula mamaria del ratón.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los cribados de genética directa se emplean rutinariamente para perturbar miles de elementos genéticos de forma agrupada con el objetivo de producir mapas a gran escala de genotipo a fenotipo. Aunque a menudo se realiza en sistemas de cultivo celular, la acumulación de evidencia apoya que los cribados in vivo tienen el poder de revelar nueva biología que no puede recapitularse in vitro. Sin embargo, la aplicación generalizada de este enfoque ha estado limitada por dos grandes desafíos: un enfoque predominante en perturbaciones por pérdida de función más que en la activación génica y los importantes obstáculos técnicos para entregar bibliotecas genéticas complejas a tejidos específicos in vivo. Para superar estos desafíos, describimos una estrategia de inyección intraductal sencilla y versátil que permite un cribado genómico funcional eficiente y rápido en la glándula mamaria del ratón, generando decenas de miles de clones epiteliales discretos. Además, proporcionamos todos los detalles necesarios para la generación de librerías, inyección intraductal, deconvolución de pantalla y análisis de bibliotecas CRISPR-Knockout y Activation para pantallas in vivo completas. Utilizando estas herramientas, que denominamos CRISPR-KOALA (Ensayo Enlazado por Eliminación y Activación), hemos identificado nuevos supresores tumorales y oncogenes dentro del genoma codificante y no codificante en bibliotecas agrupadas que van desde 46 loci hasta una quinta parte del genoma. Es importante destacar que este enfoque y análisis pueden aplicarse a otros órganos para estudiar la función biológica de cualquier gen durante la homeostasis o enfermedad.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los cribados de genómica funcional proporcionan un marco potente para interrogar la función génica a escala1. El desarrollo de tecnologías de edición genética CRISPR-Cas ha permitido la perturbación sistemática de cientos a miles de genes en paralelo, y los cribados basados en CRISPR agrupados en líneas celulares de mamíferos se han convertido en una piedra angular de la investigación moderna en biologíadel cáncer 2. Estos enfoques in vitro han identificado genesesenciales 3, supresorestumorales 4 e interacciones letalessintéticas 5 en diversos contextos cancerígenos. Sin embargo, una limitación central es la incapacidad para captar las complejas características biológicas de los tumores in vivo, incluyendo las interacciones con el sistema inmunitario y el estroma, los gradientes de nutrientes y la arquitectura tisular dentro delmicroambiente 2. En consonancia con esta limitación, estudios recientes han demostrado que muchos genes auténticos que impulsan el cáncer no ejercen efectos medibles in vitro, especialmente cuando su función depende de señales microambientales ausentes en el cultivocelular 6,7,8,9,10.

La glándula mamaria del ratón proporciona un contexto tisular especialmente ventajoso para el cribado genómico funcional in vivo. Las células epiteliales mamarias son altamente regenerativas, sufren rondas de expansión clonal durante el ciclo estrol y están organizadas en una red ductal ramificada que puede ser fácilmente accedida y manipuladagenéticamente 11,12,13. Estas características han apoyado décadas de análisis genéticos en mosaico y experimentos de trazo de linaje, y han establecido la glándula mamaria como un sistema manejable para interrogar la función génica intrínseca de las células y dependiente del microambiente durante la homeostasis y enfermedadtisular 14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. Es importante destacar que las perturbaciones genéticas pueden restringirse al compartimento epitelial, lo que permite el estudio directo de los factores específicos del epitelio para la transformación, la competencia celular, la fidelidad del linaje y la progresión tumoral en un contexto de tejido intacto.

Aunque se han desarrollado varias estrategias para entregar perturbaciones genéticas directamente a la glándula mamaria adulta in situ, persisten obstáculos técnicos significativos para aplicaciones de alto rendimiento. La administración mediada por adenovirus de Cre recombinasa se ha utilizado ampliamente para inducir la recombinación somática de alelos condicionales en la glándula mamariaadulta 34,35,36,37, ofreciendo un medio eficiente para manipular la función génica sin la compleja reproducción germinal requerida por los modelos de ratón genéticamente modificados tradicionalmente (GEMMs). Aunque el adenovirus de alto título también puede suministrar componentes CRISPR-Cas9 a las células residentes en tejidos, estos vectores no se integran en el genomadel huésped 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49 . Esto limita severamente la escala de los cribados a ~10–55 genes, ya que cada sitio objetivo del gRNA debe ser secuenciado individualmente usando las sondas de inversiónmolecular 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47. Además, los métodos actuales de administración intraductal permiten el acceso directo al sistema mamario ductal, pero requieren una exposición quirúrgica invasiva de la glándula mamaria50 o depender del uso de jeringuillas Hamilton comparativamente grandes que sonengorrosas 51. Aunque son eficaces para la entrega localizada del virus, estos enfoques son comparativamente invasivos, técnicamente desafiantes y no están optimizados para la entrega escalable de bibliotecas lentivirales agrupadas. En conjunto, estos estudios demuestran que las perturbaciones virales in situ son factibles, pero las herramientas actuales no soportan las perturbaciones estables, agrupadas y recuperables por secuencia necesarias para el cribado CRISPR in vivo de alto rendimiento en vivo.

Para abordar estas limitaciones, nosotros y otros hemos recurrido a la integración de vectores lentivirales, que permiten modificaciones genéticas estables y heredables. A diferencia de los sistemas de cultivo celular, los tejidos in vivo imponen restricciones estrictas sobre el número de células perturbadas que pueden generarse dentro de un solo órgano, lo que hace impracticable el cribado a nivel genómico. En consecuencia, las pantallas CRISPR in vivo requieren el diseño de bibliotecas dirigidas y biológicamente informadas que equilibren la cobertura con la viabilidad. Además, la mayoría de los cribados CRISPR in vivo, revisadosaquí 2, se han centrado casi exclusivamente en perturbaciones de pérdida de función lentiviral, a pesar de la creciente evidencia de que la activación génica puede revelar conocimientos biológicos complementariosy no solapados 52,53,54,55. Nosotros y otros hemos demostrado anteriormente que integrar perturbaciones lentivirales de CRISPR en el epitelio mamario adulto permite una modificación genética estable y hereditaria in situ, y que pueden recuperarse y cuantificarse a partir del ADNgenómico 36,55,56,57,58. Utilizando este enfoque, realizamos cribados CRISPR in vivo agrupados que identificaron nuevos factores que impulsan la transformaciónoncogénica 36,55, estableciendo tanto la viabilidad como la relevancia biológica de la administración lentiviral y el cribado CRISPR. Sin embargo, estos estudios también pusieron de manifiesto la necesidad de un protocolo simple, estandarizado y escalable que pudiera adoptarse ampliamente y ampliarse para incluir tanto modelos de cribado de pérdida como de ganancia de función dentro de la misma glándula.

Aquí describimos una estrategia de inyección intraductal sencilla y versátil que permite el cribado in vivo paralelo de bibliotecas de eliminación y activación de CRISPR, denominadas CRISPR-KOALA, dentro de la glándula mamariaadulta del ratón 55. CRISPR-KOALA emplea un ARN convencional 'guía simple' (sg) de 20-21 pb para capacidades CRISPR-KO o un ARN 'guía muerto' (dg)ARN de 14 pbs para CRISPR-A. El dgRNA guía eficazmente a Cas9 hasta su sitio objetivo pero impide la actividad de las endonucleasasde Cas9 59,60,61, permitiendo así el uso de un solo ratón que exprese Cas9 activo tanto para las modalidades de eliminación como de activación. La introducción de dos horquillas PP7 en el trcr de ARNdg permite el reclutamiento de un transactivador62 de PP7 y conduce a una sobreexpresión eficiente de genes in vivo55 (Figura 1). Al combinar el diseño de bibliotecas de gRNA dirigidas con la producción de lentivirales de alto título y la entrega intraductal no quirúrgica mediante microcapilares de vidrio, este enfoque genera decenas de miles de clones epiteliales espacialmente discretos mientras preserva la arquitectura tisular y las interacciones microambientales. Es importante destacar que la integración lentiviral en el genoma del huésped permite la recuperación y cuantificación de los gRNAs mediante secuenciación de alto rendimiento, facilitando cribados genómicos funcionales agrupados in vivo. Juntos, esto permite perturbaciones paralelas o simultáneas (en la misma célula) de CRISPR-KO y CRISPR-A dentro de la misma glándula mamaria de un ratón que expresa Cas9.

Presentamos un protocolo detallado paso a paso que abarca el diseño de bibliotecas de gRNA, la producción y concentración de lentivirales, la entrega intraductal, la deconvolución de bibliotecas y el análisis de datos (Figura 1). En conjunto, este método proporciona un marco práctico y escalable para el cribado knockout y/o activación in vivo de CRISPR en la glándula mamaria del ratón y puede adaptarse para estudiar la función génica durante la homeostasis tisular, diferentes contextos de enfermedades, otros tejidos y otras especies como la rata.

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Protocolo

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Todos los procedimientos animales se realizaron conforme a las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado Animal y fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal del Centro de Fenogenómica (protocolo 26-0272H).

1. Clonación de bibliotecas CRISPR

NOTA: Esta sección describe la clonación agrupada de las librerías de eliminación y activación de CRISPR desde oligonucleótidos sintetizados en matrices hacia esqueletos lentivirales. Rutinariamente generamos bibliotecas que contienen hasta 4.000 gRNAs, que pueden ser evaluadas a una cobertura de 400X-1.000X en 8-20 ratones. El número de gRNAs y la cobertura pueden ajustarse según sea necesario, lo que afectará al número de ratones necesarios para mantener la potencia estadística. Recomendamos mantener una cobertura mínima de 400X, lo que puede ser suficiente para fenotipos de ganancia de función fuertes.

  1. Diseño de bibliotecas de ARN guía
    1. Compilar una lista de todos los genes del ratón que se seleccionarán dentro de un único experimento para el diseño posterior de bibliotecas CRISPR, manteniendo listas de objetivos separadas para las bibliotecas CRISPR knockout (CRISPR-KO) y activación CRISPR (CRISPR-A).
      NOTA: las bibliotecas CRISPR-KO y CRISPR-A se generan por separado y pueden combinarse en la fase de transducción lentiviral para un cribado simultáneo.
    2. Para las bibliotecas CRISPR-KO, selecciona de cuatro a cinco ARN guía simples (sgRNAs) por gen utilizando algoritmos de predicción de alta puntuación como CRISPick62,63, CHOPCHOP64 o VBCScore 65.
      NOTA: La puntuación VBC ofrece una eficacia muy alta y una actividad en el objetivo66. Independientemente de la herramienta, prioriza guías con alta actividad prevista en el objetivo, mínimo potencial fuera del objetivo y exones codificadores de objetivo.
    3. Para las bibliotecas CRISPR-A, selecciona entre ocho y diez guías por gen usando CRISPick62,63 o CHOPCHOP64. Para herramientas que permiten longitudes de guía especificadas por el usuario (como CHOPCHOP), fija la longitud de la guía a 14 pb antes de la generación. Si se utiliza una herramienta que solo genera guías de 20 pb, convierte estas secuencias en ARN guía muerto (dgARN) manteniendo la secuencia de 14 pbs inmediatamente a 5' del motivo adyacente al protoespaciador, que apunta a las regiones promotoras de los genes.
      NOTA: los dgRNAs son secuencias guía truncadas diseñadas para permitir la activación transcripcional basada en CRISPR con aproximadamente el 50-85% de la efectividad de los sgRNAs de longitudcompleta 55 sin inducir la clivación delADN 59,60,61.
    4. Agrupar todos los sgRNAs o dgRNAs correspondientes a un solo experimento en listas separadas para permitir la clonación uniforme, la producción viral y el cribado in vivo .
      NOTA: los sgRNA y dgARNs que se van a analizar juntos se agruparán tras la producción viral.
    5. Generar bibliotecas de control negativo agrupadas para cribados CRISPR-KO y CRISPR-A, incluyendo secuencias de gRNA no dirigidas55,67 y secuencias degRNA no génicas 68, como se describió anteriormente, para controlar efectos de fondo independientemente de la alteración o activación génica.
      NOTA: Si se desea, se pueden crear bibliotecas separadas de gRNAs no objetivo y no génicos para crear dos bibliotecas independientes de control negativo.
  2. Diseño y amplificación de piscinas de oligonucleótidos
    1. Diseñar oligonucleótidos agrupados de modo que cada gRNA contenga la secuencia de direccionamiento, sobresaldos enzimáticos de restricción compatibles con la columna vertebral lentiviral de destino y secuencias cebadoras específicas de la biblioteca para permitir la amplificación selectiva a partir de un complejo conjunto de oligonucleótidos (Figura 1, Tabla 1).
    2. Asignar un par único de cebadores a cada biblioteca de gRNA para permitir la amplificación independiente de librerías individuales desde un pool compartido de oligonucleótidos. Los pares únicos de imprimadores se enumeran en la Tabla 1.
    3. Ordenar bibliotecas de oligonucleótidos agrupados desde una plataforma comercial de síntesis de arrays, asegurando la representación equimolar de todos los gRNAs dentro de cada pool.
    4. Amplifica las bibliotecas individuales de gRNA a partir de la plantilla de oligonucleótidos agrupados utilizando cebadores específicos de la biblioteca en la siguiente mezcla de reacción. La reacción puede modificarse para ajustarse a la composición recomendada de la polimerasa específica. Prepara tres reacciones con una plantilla de oligonucleótidos agrupados y una reacción de control negativo sin plantilla.
      Plantilla de oligonucleótidos agrupados de 4 ng
      2,5 μL 10 μM Cebador específico de biblioteca hacia adelante
      2,5 μL 10 μM Cebador inverso específico de la biblioteca
      10 μL 5x Buffer de reacción
      0,5 μL ADN polimerasa de alta fidelidad
      X μL Agua libre de nucleasa
      50 μL Volumen total
    5. Realizar amplificación por PCR utilizando las siguientes condiciones de ciclo, ajustando la temperatura de recocido según la temperatura de fusión específica del cebador de la biblioteca:
      1 ciclo de 98 °C durante 30 s
      18 ciclos de 98 °C durante 10 s, 62–65 °C durante 20 s y 72 °C durante 3 s
      1 ciclo de 72 °C durante 5 minutos
      NOTA: No excedas los 18–19 ciclos de amplificación para preservar una representación igual del gRNA dentro de la biblioteca.
    6. Resolver los productos de PCR en un gel de agarosa al 2,5% a 120 V durante aproximadamente 45 minutos y eliminar la banda correspondiente al tamaño esperado del inserto de gRNA (aproximadamente 100 pb, dependiendo del diseño del cebador; Figura 2A).
    7. Purificar los productos de PCR usando un kit de extracción en gel y eluir en 20 μL de agua ultrapura durante la etapa final de la elución.
      NOTA: (Punto de pausa) Los insertos de ARNg purificados pueden almacenarse a -20 °C antes de la clonación.
  3. Preparación y digestión de los esqueles lentivirales
    1. Prepara plásmidos lentivirales de la columna vertebral que contengan una secuencia de relleno extraíble para clonar insertos de gRNA. Para bibliotecas in vivo CRISPR-KO y CRISPR-A, se utilizan pLKO-Cre (Addgene Plasmid #158032 o 256774) y pXPR502-PPH-Cre (Addgene Plasmid #256776), respectivamente.
    2. Digiera entre 5 y 10 μg de ADN lentiviral en un volumen total de reacción de 200 μL utilizando la enzima de restricción y el tampón apropiados. Usa Esp3I para la columna vertebral pLKO-Cre CRISPR-KO y SapI para la columna vertebral pXPR502-PPH-Cre CRISPR-A.
      Plásmido de columna vertebral de 5–10 μg
      20 μL 10x Buffer enzimático
      Enzima de restricción de 5 μL
      X μL Agua libre de nucleasa
      200 μL Volumen total
    3. Incubar reacciones digestivas durante 2–3 horas a 37 °C.
    4. Añadir 2 μL de fosfatasa alcalina recombinante a cada reacción digestiva e incubar durante 1 hora a 37 °C para desfosforilar la columna vertebral digerida.
    5. Resolver los productos digeridos en un gel de agarosa al 1% y eliminar la banda correspondiente a la columna vertebral linealizada (Figuras 2B,C)
      NOTA: Para ambas columnas, el fragmento de empacador es visible como una banda distinta aproximadamente entre 2000 y 2500 pb, dependiendo del vector.
    6. Purifica el ADN de la columna vertebral extirpado usando un kit de extracción en gel y eluye en un volumen mínimo de agua ultrapura para mantener una alta concentración de ADN (normalmente 20 μL).
      NOTA: (PUNTO DE PAUSA) Las columnas vertebrales purificadas y digeridas pueden almacenarse a -20 °C antes de la ligadura.
  4. Digestión y ligación de bibliotecas de gRNA
    1. Establecer reacciones de digestión y ligadura todo en uno utilizando 750 ng de ADN lentiviral purificado, 43 ng de ADN insertado en la biblioteca de ARNG, 3 μL de enzima de restricción, 7,5 μL de ligadura de ADN T4, 15 μL de 10 mM de ATP y la cantidad adecuada de tampón de reacción y agua destilada estéril para alcanzar un volumen total de reacción de 150 μL.
      NOTA: Utiliza la misma enzima de restricción que se usó inicialmente en el paso de digestión de la columna vertebral del plásmido. Una proporción de 750 ng de columna vertebral lentiviral purificada por 43 ng de ADN insertado de biblioteca da una proporción aproximada vector-inserto molar de 1:7 cuando se utilizan los esqueles recomendados.
    2. Divide cada mezcla de ligación en tres alicuotas iguales para aumentar la eficiencia de transformación y la complejidad de la biblioteca.
    3. Preparar una única reacción de control negativa que contenga ADN de columna vertebral pero sin inserciones de ARNg para evaluar la ligadura de fondo.
    4. Incubar las reacciones digestivas durante la noche a 30 °C.
    5. A la mañana siguiente, añadir 1 μL de la enzima de restricción adecuada a cada alícuta de reacción e incubar durante 1 hora a 37 °C para completar la digestión de la columna vertebral.
    6. Añadir 2 μL de 10 mM de ATP y 2 μL de ligasa de ADN T4 a cada reacción e incubar a 25 °C durante 2–3 horas para completar la ligadura.
    7. Agrupar las tres reacciones de digestión y ligación individuales por biblioteca, purificar las reacciones mediante un método de limpieza de oligonucleótidos en columnas y eluir cada una en 21 μL de agua destilada ultrapura y estéril. Eluir la única reacción de control negativa purificada en 7 μL de agua destilada ultrapura y estéril.
      NOTA: No eluir productos de ligadura en tampones que contengan sal o EDTA, ya que estos reducen significativamente la eficiencia de electroporación bacteriana. (PUNTO DE PAUSA) Los productos de ligadura purificados pueden almacenarse a -20 °C antes de la electroporación.
  5. Electroporación y expansión de la biblioteca
    1. Preenfriar cubetas de electroporación de 0,1 cm, tubos de microcentrífuga que contienen 2 μL de aliteraciones purificadas y tubos de cultivo de polipropileno de fondo redondo de 14 mL sobre hielo durante al menos 20 minutos antes de la electroporación.
    2. Descongelar las células bacterianas electrocompetentes sobre hielo y mezclar suavemente 25 μL de células con 2 μL de producto de ligadura purificado en el tubo de microcentrífuga preenfriado mediante pipeteo.
    3. Transfiere la mezcla célula-ADN a una cubetas de electroporación preenfriada de 0,1 cm y electropora a 1,8 kV, 25 μF y 200–600 Ω.
      NOTA: Una electroporación exitosa suele dar una constante de tiempo entre 4,6 ms y 4,9 ms.
    4. Añadir inmediatamente 1 mL de medio de recuperación precalentado a 37 °C proporcionado con las celdas electrocompetentes a la cubeta, resuspender suavemente las celdas y transferir la suspensión a un tubo de polipropileno de fondo redondo de 14 mL.
    5. Incuba las células recuperadas a 30 °C mientras agitas a 180 rpm durante 90 minutos.
    6. La lámina 10 μL de las células recuperadas se diluye en 90 μL de caldo LB sobre placas de LB-agar que contienen ampicilina e incuba durante la noche a 30 °C para evaluar la eficiencia de transformación y la ligación de fondo.
      NOTA: Una clonación exitosa debería resultar en cientos de colonias en la placa con inserto y pocas (> 30) colonias en la placa de control negativa solo de columna vertebral (Figura 3).
    7. Valida aún más la biblioteca eligiendo ~10 colonias para miniprep y secuenciación Sanger hacia adelante desde el promotor U6. Las bibliotecas clonadas con éxito tendrán < 90% de los minipreps que contienen secuenciación clara de un gRNA, sin guías repetidas a lo largo de los 10 minipreps. Además, la enzima de restricción digiere los minipreps y la biblioteca de plásmidos agrupados (paso 1.5.10) y se ejecuta sobre un gel de agarosa para comprobar el tamaño de las bandas y asegurarse de que los constructos lentivirales no hayan sufrido recombinaciones aberrantes.
      NOTA: La representación de la biblioteca puede evaluarse comparando el recuento de colonias de placas de dilución con el número total de gRNAs en la biblioteca, buscando una cobertura de 1.000 veces más. Se pueden utilizar múltiples diluciones en serie para ayudar en este cálculo.
    8. Si la eficiencia de transformación es suficiente, colocar las células recuperadas restantes en placas LB-agar de 15 cm que contienen el antibiótico adecuado e incubar durante la noche a 30 °C para generar un césped denso de colonias.
      NOTA: Colocar 100 μL de células recuperadas sobre cada una de las diez placas de agar de 15 cm LB para recuperar suficientes colonias.
    9. Al día siguiente, utiliza un raspador de células para raspar colonias bacterianas en 500 mL de caldo LB con ampicilina y así generar un único cultivo bacteriano que represente la biblioteca de ARNg clonado.
    10. Expande el cultivo bacteriano agrupado a 30 °C agitando durante aproximadamente 3 horas y aísla el ADN plasmídico usando un kit de maxiprep.

2. Producción de lentivirales para cribado in vivo

NOTA: Para el parto intraductal y el cribado agrupado in vivo , las preparaciones lentivirales deben concentrarse para lograr títulos altos (idealmente entre 1 x 108 pfu/mL y 1 x 109 pfu/mL) para asegurar la transducción eficiente de las células epiteliales mamarias. El siguiente protocolo describe la producción de lentivirales de alto título optimizada para su uso in vivo .

  1. Preparación de células productoras de lentivirales
    1. Mantener HEK293TN células en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementadas con suero bovino fetal al 10%, 1% penicilina-estreptomicina, y cultivar células a 37 °C con 5% deCO2.
    2. Las células del paso se aplican cada 2–3 días para mantener el crecimiento logarítmico y asegurar que las células no superen el 90% de confluencia. Utiliza células en los conductos <20 para una producción viral óptima.
    3. Un día antes de la transfección, recubre 15 cm de placas de cultivo de tejido con poli-L-lisina (0,02 mg/mL) durante 1 hora a temperatura ambiente. Prepara nueve platos para un lote de preparación viral.
    4. Retira la solución de poli-L-lisina y lava las placas dos veces con solución salina tamponada con fosfato.
    5. Siembra 1,1 x 107 HEK293TN células sobre cada una de las nueve placas de cultivo de tejido de 15 cm recubiertas de poli-L-lisina, asegurando que las células alcancen una confluencia del ~90% en el momento de la transfección.
      NOTA: Para aplicaciones que no requieren títulos virales máximos, la producción lentiviral puede reducirse a menos placas (por ejemplo, tres o seis placas) con rendimientos proporcionalmente reducidos. Reduce la escala de los reactivos (ADN plasmídico, PEI y DMEM) para la transfección en consecuencia.
  2. Transfección lentiviral basada en PEI
    1. Preparar ADN plasmídico para la producción lentiviral utilizando un sistema de tres plásmidos que consiste en 95 μg del plásmido de la biblioteca de ARNg, 95 μg del plásmido de envase psPAX2 (Addgene Plasmid #12260) y 65 μg del plásmido de envoltura VSV-G pMD2.G (Addgene Plasmid #12259).
    2. Combina los tres plásmidos para la producción lentiviral en 10,8 mL de DMEM libre de suero y mezcla bien mediante vórtices durante aproximadamente 10 s.
    3. Añade 366 μL de 1 mg/mL de polietilenimina (PEI) gota a gota a la solución de ADN diluido, mezcla bien mediante vórtices durante aproximadamente 10 s e incuba los complejos ADN-PEI a temperatura ambiente durante 10–30 minutos.
    4. Durante la formación del complejo, aspira el medio de cultivo de las placas de HEK293TN y añade 14 mL de DMEM libre de suero.
      NOTA: El suero fetal bovino puede inhibir la absorción de plásmidos por parte de las células.
    5. Distribuye 1,2 mL del complejo ADN-PEI gota a gota por toda la placa y roca para asegurar una distribución uniforme.
    6. Incubar las células a 37 °C con 5% de CO2 durante 6–8 horas.
    7. Sustituye el medio de cada placa por 20 mL de DMEM precalentado suplementado con suero bovino fetal al 10% (sin 1% de penicilina-estreptomicina) y continúa cultivando las células a 37 °C con un 5% de CO2.
      NOTA: No se recomienda la transfección nocturna, ya que la exposición prolongada a PEI y la falta de suero reducen el rendimiento viral.
  3. Cosecha viral y ultracentrifugación
    1. Preparar 200 mL de una solución de cojín de sacarosa combinando 40 g de sacarosa, 11,7 g de cloruro de sodio, 4 mL de 1 M HEPES (pH 7,4) y 1 mL de 0,5 M EDTA (pH 7,9) en un volumen adecuado de agua destilada estéril y filtrar mediante una unidad de filtración de polietersulfona de baja unión a proteínas de 0,45 μm. Esta solución puede almacenarse a 4 °C durante varios meses.
    2. Recoger el sobrenadante lentiviral entre 48 y 72 horas después de la transfección.
    3. Pasar 10 mL de DMEM suplementados con suero fetal bovino al 10% a través de la unidad de filtración polietersulfona de baja unión a proteínas de 0,45 μm. Descarta el flujo a través de la corriente. Carga el sobrenadante en el filtro y aplica el vacío.
      NOTA: Si la concentración no puede realizarse inmediatamente, almacenar el supernadante viral clarificado a 4 °C durante la noche.
    4. Añade 30 mL de sobrenadante viral clarificado a un tubo ultracentrífuga.
    5. Aplicar lentamente el sobrenadante viral clarificado con 4 mL de solución de cojín de sacarosa.
    6. Coloca el tubo de la ultracentrífuga en un adaptador compatible para un rotor de cubo giratorio y equilibra con precisión los tubos.
    7. Centrifugar los tubos a 104.000 × g durante al menos 2 horas a 4 °C.
      NOTA: Se requiere un rotor de cubo oscilante, como el rotor Beckman JS24.38, para pelletar correctamente el virus a través del cojín de sacarosa.
    8. Decantar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar la boluleta viral, que puede aparecer como una película blanca tenue o translúcida en la parte inferior del tubo.
    9. Deja que los tubos se sequen al aire al menos 10 minutos y usa una toallita de laboratorio para eliminar la mayor cantidad posible de líquido residual del interior sin alterar el pellet.
      NOTA: El secado adecuado del tubo es fundamental para alcanzar altas concentraciones virales, ya que reduce el volumen final de recuperación.
    10. Resuspende los pellets virales en 20 μL de solución salina fría tamponada con fosfato y haz una pipete cuidadosamente arriba y abajo, asegurándote de evitar burbujas de aire.
    11. Incuba los tubos sobre hielo durante 2 horas con una agitación suave para resuspender completamente los pellets virales.
    12. Transfiere el virus concentrado a un tubo de microfuga limpio y clarifica la solución mediante centrifugación a 2.000 × g durante 5 minutos a 4 °C.
      NOTA: Este centrifugado elimina los restos y partículas residuales que obstruyen la aguja de inyección durante la cirugía.
    13. Alicuota, el virus concentrado en volúmenes de un solo uso para evitar repetidos congelamientos y deshielos, y almacena a -80 °C.
  4. Titulación lentiviral usando fibroblastos embrionarios de ratón LSL-tdTomato mouse (MEFs)
    1. Placar 100.000 MEFs LSL-tdTomato (derivados de Rosa-LSL-tdTomato [JAX# 007909]) en una placa de 6 pozos un día antes de la infección en DMEM, suplementado con suero bovino fetal al 10%, 1% Penicilina-Estreptomicina, y cultivar las células a 37 °C con 5% de CO2. Emplata un pozo extra para contar células.
      NOTA: LSL-tdTomato MEFs actúan como reporteros de Cre dentro del lentivirus. Se puede utilizar cualquier sistema de reporteros adecuado para la titulación viral de otras columnas vertebrales.
    2. Al día siguiente, cuenta el número de MEFs LSL-tdTomato de un pozo extra para cuantificar el número de células presentes en el momento de la infección.
    3. Preparar diluciones en serie de lentivirus concentrado que codifica la recombinasa Cre en un total de 2 mL del medio modificado Eagle de Dulbecco, suplementado con un 10% de suero fetal bovino. Generalmente, 0,4 μL, 0,1 μL y 0,025 μL de virus concentrado proporcionan un rango lineal dinámico limpio (Figura 4A–D).
    4. Añade 2 mL de diluciones virales a cada pozo de MEFs LSL-tdTomato y 2 μL de 10 mg/mL de polibrena a cada uno.
    5. Infecta los MEFs centrifugándolos a 400 × g durante 90 minutos a 37 °C.
    6. Sustituir el medio viral por 2 mL de DMEM suplementados con suero bovino fetal al 10%, 1% penicilina-estreptomicina, y cultivar las células a 37 °C con 5% deCO2 durante 48–72 horas.
    7. Cuantifique las células td-toto-positivas mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo para determinar la fracción de células infectadas en cada dilución.
    8. Calcula el título funcional en función de la fracción de células infectadas y el número de células presentes en el momento de la infección.
      NOTA: los virus CRISPR-KO y CRISPR-A se producen, concentran y titulan por separado. Funcionalmente, los títulos determinados mediante LSL-tdTomato MEFs se utilizan para mezclar los virus CRISPR-KO y CRISPR-A en una proporción definida antes de la inyección intraductal.
  5. Evaluación de calidad de bibliotecas de plásmidos y lentivirus
    1. Para asegurar que las bibliotecas de gRNA se clonen con suficiente profundidad/cobertura y que todos los gRNAs se mantengan durante la clonación y la producción del virus, se recomienda encarecidamente secuenciar el conjunto de plásmidos así como los MEFs transductos.
    2. Para evaluar la cobertura lentiviral, transfecte los MEFs con lentivirus a >1000× de cobertura basada en el título viral calculado. No es necesario asegurar una infección única de células durante este paso.
    3. Después de 48–72 horas, se desconectan las células usando tripsina o un raspador de células y se les pelletan. Extrae el ADN usando un kit comercial de extracción de ADNG.
    4. Secuencia 1 μg de plásmido y 3 μg de ADN MEF extraído usando el protocolo descrito en la Sección 5. La secuenciación profunda de 5 millones de lecturas es suficiente para la mayoría de las bibliotecas personalizadas con <5000 gRNAs.
      NOTA: Una fuerte correlación (R2> 0,6) entre las lecturas del conjunto de plásmidos y una representación relativamente igual de las guías (>70% de las guías en 1 log-decade) sin que haya una guía individual dominante en el número de bibliotecas indica buena calidad (Figura 4E).

3. Inyección lentiviral intraductal en la glándula mamaria del ratón

  1. Dilución de agujas y virus
    1. Extrae las agujas microcapilares de vidrio utilizando un extractor de micropipeta para generar capilares de punta fina adecuados para la inyección intraductal de volúmenes de 9–10 μL. Usa un par de pinzas finas para romper la punta de la aguja.
      NOTA: La ubicación óptima crea un tamaño de aguja lo suficientemente grande para cargarse con líquido pero lo bastante fino para caber fácilmente en la abertura del pezón.
    2. Diluir las preparaciones lentivirales a una concentración final de 1 × 107 pfu/mL en solución salina estéril protegida con fosfato, suplementada con un colorante Fast Green FCF al 0,05% (p/v).
    3. Si se mezclan virus CRISPR-KO y CRISPR-A para cribrar dentro del mismo conjunto complejo, ajusta ambas bibliotecas a un título viral igual con solución salina estéril protegida con fosfato y mezclalas en una proporción que asegure una representación igual de los gRNAs en ambas bibliotecas.
  2. Preparación de ratones para la inyección intraductal
    1. Anestesiar a una ratona adulta (de 8 a 20 semanas de edad) con menos del 4% de isoflurano y 1 L/min de oxígeno y aplicar lubricante oftálmico estéril en ambos ojos para evitar el resecamiento corneal durante el procedimiento.
      NOTA: La inyección intraductal es un procedimiento no invasivo y no requiere analgesia. Utiliza ratones Rosa26-LSL-Cas9, H11-Cas9 o Rosa-LSL-tdTomato para estos experimentos.
    2. Asegura al ratón en posición supina sobre una almohadilla térmica cubierta en modo bajo para mantener la temperatura corporal y mantén la anestesia usando isoflurano al 2% con 1 L/min de oxígeno mediante el naso durante todo el procedimiento.
    3. Eliminar el pelaje que rodea el tercer pezón torácico y el cuarto pezones abdominales usando crema depilatoria aplicada con un hisopo de algodón estéril en un área circular de aproximadamente 0,5 cm de radio durante 10–15 segundos. Retira inmediatamente la crema con gasas estériles y agua estéril para evitar irritaciones de la piel.
      NOTA: La tercera y la cuarta glándulas mamarias suelen ser las más fáciles de inyectar. Alternativamente, la segunda y quinta glándulas pueden prepararse para la inyección de la misma manera.
    4. Desinfecta la piel que rodea cada pezón aplicando hisopos secuencialmente con alcohol isopropílico al 70% y yodo utilizando gasas estériles.
    5. Coloque el ratón bajo un microscopio disecador dentro de un armario de bioseguridad para permitir una visualización clara de los pezones.
    6. Usando pinzas finas limpias con etanol al 70%, retira suavemente cualquier piel muerta que cubra el pezón para exponer la abertura ductal.
      NOTA: Esta capa muerta queratinizada está flojamente unida y puede obstruir la entrada de la aguja. La extracción no debe dañar la piel viable ni el tejido subyacente.
  3. Inyección intraductal
    1. Carga 8 μL del virus diluido en un microcapilar de vidrio extraído.
    2. Sujeta la zona del pezón con un par de pinzas finas e inserta suavemente la punta de la aguja en la abertura del pezón (Figura 5A). Una aguja colocada adecuadamente entrará en el conducto con una resistencia mínima. Dispensa lentamente la suspensión viral en el conducto mamario durante un periodo de 5–10 segundos.
      NOTA: 8 μL de un lentivirus de 1 × 10 pfu/mL proporcionarán aproximadamente un 30% de infectividad de las células epiteliales mamarias luminales y un 5% de infectividad de las células epiteliales mamarias basales, con una infección despreciable (< 0,5%) del estroma36. El título viral puede ajustarse para lograr una infección mayor o menor.
    3. Monitoriza la propagación del tinte Fast Green durante la inyección con el microscopio de disección. Confirmar la entrega intraductal exitosa observando la dispersión del colorante a lo largo de la red ductal bajo la piel (Figura 5B).
    4. Identificar inyecciones fallidas agrupando el tinte dentro de la almohadilla grasa mamaria adyacente al pezón en lugar de a lo largo del árbol ductal (Figura 5C).
    5. Repite el procedimiento de inyección para la tercera glándula torácica y la cuarta abdominal en ambos lados, inyectando un total de cuatro glándulas por ratón.
      NOTA: Con la experiencia, el parto intraductal exitoso se logra en el >95% de las inyecciones. Las inyecciones fallidas confinadas a la almohadilla grasa no se asocian con efectos adversos, y las glándulas restantes pueden seguir utilizándose. Se puede realizar una validación adicional de las inyecciones mediante inmunohistoquímica y citometría de flujo (Figuras 5D, E).
    6. Suspende la anestesia y traslada al ratón a una jaula de recuperación limpia.
    7. Monitoriza al ratón hasta que esté completamente deambulando y devuelvo al alojamiento de bioseguridad designado una vez que se observe el comportamiento normal.
    8. Tres días después de la inyección, realiza un cambio completo de jaula, descartando cualquier alojamiento y cama como desechos virales, y transfiere al ratón a una jaula limpia que pueda devolverse a su alojamiento estándar.

4. Aislamiento genómico de ADN de glándulas mamarias y tumores

NOTA: Eutanasiar ratones mediante exposición a CO2 o sobredosis de anestésicos seguidas de dislocación cervical, de acuerdo con las directrices de cuidado animal. Extraer glándulas mamarias o tumores mamarios en los momentos deseados o en el punto final humano según las directrices regulatorias. Las células infectadas se han extraído tan pronto como 48 horas después de la infecciónlentiviral 36,55 o tan tarde como 5+ meses después de la inyección en ratonessalvajes 36, o >24 meses en fondos oncogénicos55. Los siguientes pasos deben realizarse en un espacio limpiado con borrado de ADN y con equipos libres de plásmidos que contengan casetes de sgRNA/dgRNA. Incluso cantidades traza de ADN plasmídico son suficientes para provocar la contaminación de muestras de tejido, y se deben realizar posteriormente PCRs profundas y controles negativos (sin tejido) para asegurar preparaciones limpias.

  1. Disociación tisular
    1. Para las glándulas mamarias, digiera cada glándula mamaria en 2 mL de medio completo Epicult-B (ratón) suplementado con 0,2 mL de colagnasa suave/hialuronidasa en un tubo cónico de 15 mL e incube durante la noche a 37 °C.
    2. El pellet disoció las células a 450 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    3. Transfiere cuidadosamente la capa grasa superior usando una punta de pipeta recubierta de albúmina sérica bovina a un nuevo tubo cónico de 15 mL y descarte el sobrenadante restante.
      NOTA: La capa grasa superior en este paso suele contener organoides epiteliales residuales que no se han separado y permanecen asociados con el tejido adiposo. Procesar esta fracción en un tubo separado aumenta considerablemente la recuperación de las células epiteliales.
    4. Lava tanto la fracción grasa como el pellet celular una vez con 5 mL de suero salino tamponado con fosfato, centrifuga a 450 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente y desecha los sobrenacionantes.
    5. Combina la fracción grasa lavada y el pellet celular de la misma glándula mamaria en un único tubo cónico de 15 mL que contiene 5 mL de solución salina tamponada con fosfato.
    6. Pelleta el material combinado a 450 × g durante 5 minutos y descarta el sobrenadante.
    7. Para tumores mamarios, pica tejido en pequeños trozos usando tijeras estériles o un bisturí y transfiere directamente a un tubo de microfuga de 2 mL.
  2. Aislamiento de ADN genómico
    NOTA: La extracción de ADN genómico puede realizarse utilizando el kit de sangre y tejido Qiagen DNEasy siguiendo las instrucciones del fabricante o utilizando el siguiente protocolo fenol-cloroformo.
    1. Prepara el tampón de lisis de ADN combinando 5 mL de 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 mL de EDTA (pH 8,0), 25 mL de 5 M NaCl y 50 mL de SDS al 10%, y lleva el volumen final a 500 mL con agua destilada estéril.
    2. Añadir 1 mL de tampón de lisis de ADN y 10 μL de Proteinasa K (20 mg/mL) a cada muestra y mezclar cuidadosamente por inversión.
    3. Incubar muestras a 56 °C durante la noche para permitir la lisis completa.
    4. La centrífuga lisa a 16.000 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente para pelletar residuos insolubles.
    5. Transfiere el sobrenadante clarificado a un nuevo tubo microcentrífuga de 2 mL.
      PRECAUCIÓN: El fenol:cloroformo:el alcohol isoamílico es tóxico y corrosivo. Realiza todos los pasos que involucren disolventes orgánicos en una campana extractora química mientras llevas el equipo de protección personal adecuado.
    6. Añade un volumen igual de fenol:cloroformo:isoamílico alcohol y mezcle vigorosamente vórtice durante aproximadamente 15 s hasta que se forme una mezcla homogénea.
    7. Centrifugar a 16.000 × g durante 10 minutos a 4 °C para separar las fases orgánica e inorgánica.
    8. Transfiere cuidadosamente la fase acuosa superior a un tubo nuevo sin alterar la interfase.
      NOTA: Evite aspirar material de la interfase blanca para minimizar la contaminación por proteínas y ARN.
    9. Añadir 0,7 volúmenes de isopropanol a la fase acuosa recuperada y mezclar vigorosamente mediante vórtices durante aproximadamente 15 segundos.
    10. Centrifugar a 16.000 × g durante 10 minutos a 4 °C.
    11. Desecha cuidadosamente el sobrenadante y enjuaga el pellet de ADN con 500 μL de etanol al 70%.
    12. Centrifuga a 16.000 × g durante 10 minutos a 4 °C y elimina completamente el etanol.
    13. Seca la pelota de ADN al aire a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    14. Resuspende la pelota de ADN en 50 μL de agua destilada estéril.
    15. Incubar muestras a 37 °C durante 1 hora o a 4 °C durante la noche para facilitar la resuspensión total del ADN genómico.
    16. Mide la concentración y pureza del ADN mediante nanodrop o cuantificación fluorométrica.

5. Secuenciación de nueva generación de bibliotecas CRISPR


NOTA: Generar una muestra de referencia para permitir el cálculo de los cambios en el pliegue del gRNA a lo largo del tiempo. Los MEFs transducidos (Sección 2) o las glándulas mamarias (Sección 4) extraídos 3 días después de la infección, así como el plásmido original maxiprep, pueden usarse para determinar la representación de la guía en la biblioteca inicial y en el stock viral.

  1. Amplificación por PCR de casetes de ARNg a partir de ADN genómico
    1. Utiliza pares de cebadores listados en la Tabla 2 para indexar muestras de forma única, permitiendo la multiplexación y desmultiplexación de hasta 306 muestras tras la secuenciación.
    2. Prepara reacciones PCR utilizando 1 μg de ADN genómico como plantilla en un volumen total de reacción de 50 μL que contiene 25 μL de 2x Master Mix Q5, 2,5 μL de cebador directo de 10 μM y 2,5 μL de cebador inverso de 10 μM.
    3. Incluye una reacción de control sin plantilla en paralelo para monitorizar la contaminación.
    4. Realizar amplificación por PCR utilizando las siguientes condiciones de ciclo, ajustando la temperatura de recocido según la temperatura de fusión específica del cebador de la biblioteca:
      1 ciclo de 98 °C durante 30 s
      5 ciclos de 98 °C durante 10 s, 68 °C (-1 °C/ciclo) durante 10 s y 72 °C durante 15 s
      20 ciclos de 98 °C durante 10 s, 63 °C durante 30 s y 72 °C durante 15 s
      1 ciclo de 72 °C durante 2 minutos
    5. Resolver productos de PCR en un gel de agarosa al 2,5% para verificar el tamaño correcto del amplicon.
    6. Confirmar la presencia de bandas aproximadamente a 306 pb para bibliotecas de sgRNA basadas en pLKO y 430 pb para bibliotecas de dgRNA basadas en pXPR502 (Figura 6).
      NOTA: Un control claro sin plantilla garantiza la pureza de los reactivos y confirma que el ensayo está libre de contaminación cruzada.
    7. Purificar los productos de PCR utilizando un método adecuado de purificación de ADN y cuantificar la concentración de ADN mediante cuantificación fluorométrica.
  2. Secuenciación de nueva generación
    1. Determinar la profundidad de secuenciación requerida en función de la complejidad esperada de la biblioteca y la clonalidad de la muestra.
      NOTA: Para tumores sospechosos de clonación, aproximadamente 1 millón de lecturas por muestra son suficientes para cuantificar con precisión la representación de guías. Para calcular la profundidad de secuenciación a partir de las glándulas mamarias, multiplica el número de guías en la biblioteca por la cobertura de 1.000 veces y luego multiplica por 6 pg de ADN/célula genómica para calcular la masa total de ADN genómico por muestra que debe amplificarse por PCR. El número total de lecturas necesarias para la secuenciación es igual al número de guías en la biblioteca multiplicado por 1.000.
    2. Agrupar bibliotecas purificadas de diferentes muestras a concentraciones equimolares.
    3. Bibliotecas agrupadas de secuencias usando una plataforma de secuenciación Illumina de lectura corta.
  3. Análisis de datos
    1. Demultiplexar archivos FASTQ de secuenciación en bruto usando índices específicos de muestra.
    2. Trim lee la secuencia del protoespaciador de gRNA usando Trimmomatic69. Para muestras de CRISPR-A, las lecturas de trim se registran a 14 pb, y para CRISPR-KO, las lecturas de trim a 20 pbs desde el extremo del cebador delantero.
    3. Alinear las lecturas recortadas a la biblioteca de referencia de gRNA correspondiente usando Bowtie70. Utiliza parámetros de alineación -v 2 y -m 1 para CRISPR-KO y -v 2 y -m 2 para CRISPR-A y piscinas mixtas.
      NOTA: Normalmente, más del 90% de las lecturas se alinean con éxito. La baja alineación suele resultar de errores de recorte, formateo incorrecto de los archivos de entrada o contaminación de muestras durante la PCR.
    4. Cuantifica las lecturas alineadas para cada gRNA usando la función de recuento enMAGeCK 72 para generar tablas finales de recuento de gRNA para análisis posteriores.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí ofrecemos un protocolo para el cribado CRISPR in vivo agrupado en la glándula mamaria del ratón. Esta cadena puede utilizarse de extremo a extremo para diseñar y amplificar bibliotecas de gRNA agrupadas de matrices de oligonucleótidos, clonar las bibliotecas de gRNA en esqueletas lentivirales, producir lentivirus de alto título, realizar la entrega intraductal de bibliotecas lentivirales agrupadas en la glándula mamaria adulta y recuperar gRNAs para la deconvolución basada ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una consideración clave para el cribado CRISPR in vivo compartido es lograr una cobertura suficiente de biblioteca manteniendo la transducción escasa y unicelular para preservar la resoluciónclonal 2. En la glándula mamaria del ratón, el compartimento epitelial consta conservadoramente de aproximadamente 3,5 × 105 células porglándula 36. Con una tasa media de transducción lentiviral del 15%, que minimiza la frecuencia de...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.S. es consultor y fundador de ViVerita Therapeutics, y su laboratorio ha patrocinado acuerdos de investigación y de servicios con ViVerita Therapeutics.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a todos los miembros de nuestros laboratorios sus útiles comentarios y discusiones relacionadas con este trabajo. También agradecemos y reconocemos al Centro de Fenogenómica toda la ayuda y experiencia con el trabajo con ratones en el Instituto de Investigación Lunenfeld-Tanenbaum (LTRI), Toronto, Canadá. Este estudio fue financiado por una subvención de proyecto de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (PJT462506) y una subvención del Programa de Proyectos del Instituto de Investigación Terry Fox para D.S. (TFRI Project #1107) a D.S. y por la Fundación Familia Nicol. E.R.L. contó con el apoyo del Premio de Formación en Investigación de la Sociedad Canadiense del Cáncer y el Fondo Conmemorativo Frank Fletcher. K.N.A. contó con el apoyo de una beca postdoctoral H.L. Holmes y subvenciones 1318698 y 26089 de la Sociedad de Investigación del Cáncer. J.N. contó con el apoyo de una beca de posgrado de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud de Canadá y de una Beca de Investigación Doctoral de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (#193389). Y.L contó con el apoyo de la beca Research Excellence, Diversity, and Independence (#ED6-190718) de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.45 micron filterSigmaS2HVU02RE
12k or 92k oligo chipCustomarray Inc. (Genscript)
15 cm cell culture platesCorningCLS353004
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
Alkaline phosphataseNEBM0290L
AmplicillinFisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
ATPNEBP0756S
Cutsmart bufferNEBB6004S
Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq)Illumina
DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kitQiagen69506
Dulbecco’s modified Eagle mediumWisent319-015-CL
Endura electrocompetent cellsLucigen60242-1
EpiCult-B Mouse Medium KitStemcell Technologies05610
Esp3INEBR0734L
Fetal Bovine SerumWisent090-150
Gel DNA-cleanup kitZymo ResearchD4008
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation CuvettesBioRad1652089
Gentle Collagenase/HyaluronidaseStemcell Technologies7919
H11-Cas9Jackson LabratoriesJAX#028239
High-Speed CentrifugeBeckman CoulterMLS-50
Kim-wipeKimberly-Clark34155
LB AgarWisent Technologies800-011-LG
Micropipette pullerSutter InstrumentP97
Mini-prep plasmid KitFrogga BioPDH300
NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI)NEBR0580L
Oligo Clean and ConcentratorZymo ResearchD4061
Oligo cleanup kitZymo researchD4060
PAGE purified illumina sequencing primerIDT DNA
PCR MicropipettesDrummond5-000-1001-X10
PEI (polyethyleneimine)Sigma408727-100ML
Penicillin and StreptinomycinWisent450-201-EL
pLKO-CreAddgene158032
pMD2.GAddgene12259
Poly-L-LysineSigmaP2636-100MG
psPAX2Addgene12260
pXPR502-PPH-CreAddgene256776
Q5 Polymerase 2x Master mixNEBM0494L
Qubit Fluorometric QuantificationInvitrogenQ33327
R26-LSL-Cas9-EGFPJackson LabratoriesJAX#024857
R26-LSL-TdTomato miceJackson LabratoriesJAX#007909
SapINEBR0569L
T4 DNA ligaseNEBM0202L
Ultra-centrifuge tubesBeckman Coulter344058
Vacuum Filter UnitsFisher ScientificSCHVU02RE

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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