Este protocolo describe un método para grabar datos sincronizados de vídeo y audio durante interacciones sociales con varios ratones. El método utiliza una matriz de micrófonos y localización de fuentes sonoras para asignar vocalizaciones ultrasónicas (USVs) a ratones individuales, permitiendo un análisis cuantitativo del comportamiento vocal en animales y contextos sociales.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Detección y asignación de vocalizaciones ultrasónicas a ratones individuales durante interacciones sociales
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Los ratones (Mus musculus) se comunican mediante vocalizaciones ultrasónicas (USVs) durante las interacciones sociales. Sin embargo, dado que los USVs en ratones no están asociados con indicadores visuales claros y aparecen en frecuencias fuera del rango auditivo humano, sigue siendo difícil identificar ratones vocalizantes individuales dentro de un grupo. Este protocolo describe un método para grabar datos sincronizados de vídeo y audio ultrasónico durante interacciones sociales entre varios animales, permitiendo la captura simultánea del comportamiento y la actividad vocal. Se describe una cadena computacional que integra el seguimiento de múltiples animales, la detección de vocalizaciones, la localización de fuentes sonoras y la asignación de vocalizaciones a animales individuales. Se describen con detalle los procedimientos de validación utilizados para evaluar la precisión del seguimiento, la extracción vocalizada, la precisión de localización y la confianza en la asignación en cada etapa de la canalización. La aplicación de este protocolo a un conjunto de datos de demostración de cuatro animales produce seguimiento de vocalización resuelto individualmente, estimaciones espacialmente precisas de fuentes sonoras y medidas cuantitativas de la salida vocal y las características acústicas. En conjunto, estos enfoques proporcionan un marco sólido para vincular la comunicación vocal con el comportamiento individual y permiten análisis posteriores de diferencias sexuales, variabilidad individual y comunicación social en ratones que interactúan libremente.
Introducción
La comunicación social en todo el reino animal es un componente esencial de la dinámica conductual, ayudando en procesos como la supervivencia y la reproducción 1,2. Entre los mamíferos, los ratones se comunican acústicamente mediante USVs, que abarcan frecuencias de 35 a 110kHz 3. Los USV presentan características complejas, transmitiendo información dependiendo del contextoconductual 4. Las hembras muestran preferencia por los USVsmacho 5,6, y los ratones macho y hembra interactúan vocalmente durante los comportamientos decortejo 7, lo que indica que los USVs funcionan como señales sociales clave. Dado que características específicas del VSU están vinculadas a distintos estados conductualesdel ratón 8, asignar vocalizaciones con precisión a los individuos es esencial para comprender las interacciones sociales.
A pesar de los extensos esfuerzos para esclarecer las funciones de los USVs y su relación con el comportamientosocial 8, un desafío constante en el campo ha sido asignar USVs a ratones individuales durante las interacciones grupales. Las dificultades surgen tanto por la falta de movimientos visibles de la boca durantela producción 4 del USV como por el rango de frecuencias de los USV que es inaudible para el oídohumano 3. Como resultado, estudios previos sobre la relación entre los VSU y el comportamiento social se han restringido a ensayos simplificados o entornos restringidos que limitan el rango de comportamientos observables en grupo, proporcionando solo una visión parcial de cómo se desarrolla el comportamiento vocal en animales que interactúan libremente.
Para refinar la comprensión de la relación entre la comunicación auditiva y el comportamiento social, es necesario capturar una gama completa de comportamientos en ratones y asignar vocalizaciones a individuos dentro de un grupo. Resolver las identidades de los vocalizadores es esencial para determinar los rangos vocales dependientes del sexo y del contexto en losindividuos 8, probar hipótesis causales sobre cómo características vocales específicas impulsan el comportamiento conspecífico 10,11,12 y, cuando corresponda, correlacionar la salida vocal con señales cerebrales medidas simultáneamente (por ejemplo, electrofisiología)13. Históricamente, se creía que los ratones machos eran los únicos vocalizadores; sin embargo, la localización de la fuente sonora reveló que las hembras también producen USVs en entornosgrupales 7 o cuando se emparejan con unmacho 14. Sin determinar qué animal emitió un USV, vincular las características vocales con el comportamiento individual y los resultados sociales en grupos que interactúan libremente sigue siendo limitado. Por lo tanto, es esencial utilizar un sistema de localización que permita asignar vocalizaciones a animales individuales manteniendo la dinámica natural de interacción.
El sistema de localización de fuentes sonoras por matriz de micrófonos descrito aquí, publicadopreviamente el 7,15, estima el origen espacial de los USV dentro de una arena y rastrea las posiciones de todos los animales presentes en el momento de la vocalización, permitiendo asignar vocalizaciones al emisor. Las estimaciones de fuentes sonoras y las posiciones de animales rastreadas se integran entonces utilizando una métrica basada en probabilidades para apoyar la asignación de USVs a animales individuales. La asignación de vocalización convierte grabaciones vocales grupales previamente ambiguas en datos vocales animalesetiquetados 7,15, permitiendo análisis cuantitativos que vinculan el tipo y el momento de vocalización con el comportamiento y la posterior acción conspecífica. El propósito del presente trabajo es proporcionar un protocolo detallado para implementar este método, que previamente fue cuantificado yvalidado 15. El siguiente protocolo describe la configuración, calibración e implementación de este sistema, incluyendo geometría de matriz de micrófonos, sincronización audio-vídeo, detección automática de sonido y estimación probabilística de fuentes, seguimiento de posición de varios animales y el procedimiento de asignación utilizado para atribuir los USVs al animalemisor 7,15.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los protocolos que involucran animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal de la Universidad de Delaware (número de protocolo: 1275) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Construcción del equipo de localización de la fuente de sonido
- Prepara la cámara de grabación.
- Montar un marco cúbico (76,2 cm × 76,2 cm × 61 cm; ancho × longitud × altura), que sirva como arena de grabación, y colócalo en una caja atenuadora de sonido.
- Utiliza malla de nylon para crear las paredes y forra el exterior del recinto con espuma acústica para reducir las reflexiones del sonido.
- Coloca un termómetro fuera, pero cerca de la cámara de grabación del recinto, para monitorizar la temperatura ambiente durante las grabaciones.
- Realiza todas las grabaciones en condiciones de oscuridad.
NOTA: Mantener condiciones ambientales estables durante las sesiones de grabación y registrar parámetros ambientales.
- Configura los sistemas de grabación de vídeo y audio.
- Instala iluminación infrarroja sobre la arena para permitir la grabación de vídeo en la oscuridad.
- Coloca una cámara de vídeo sobre la arena y configúrala para grabar continuamente a 30 Hz.
- Configura el sistema de adquisición de audio para grabar señales ultrasónicas de una matriz de micrófonos de ocho canales a una frecuencia de muestreo de 250 kHz.
NOTA: Se usaron ocho micrófonos en este sistema, pero el número de micrófonos puede ajustarse según las necesidades experimentales. - Sincroniza las grabaciones de vídeo y audio usando un disparador externo compartido para asegurar la alineación temporal.
- Confirma que los datos de vídeo y audio se graban simultáneamente y se almacenan en cada sesión.
NOTA: El hardware y el software de adquisición se listan en la Tabla de Materiales y en la Tabla 1, respectivamente.
- Coloca los micrófonos y la arena.
- Distribuye los micrófonos de forma uniforme a lo largo de las paredes de la arena (dos por pared).
- Coloca los centros del micrófono separados por 38,1 cm, a 19,05 cm de cada esquina y a 10,8 cm sobre el suelo de la arena.
- Marca visualmente la ubicación de los micrófonos para facilitar la calibración y validación posteriores.
NOTA: Los LEDs pueden usarse para marcar posiciones de micrófonos.
2. Preparativos para registrar el comportamiento social
- Prepara los animales experimentales.
- Selecciona los ratones que se van a grabar. Aquí se utilizaron grupos de 2 ratones machos y 2 hembras de ratones C57BL/6J entre 8 y 12 semanas de edad en el momento de la grabación.
NOTA: La cepa, la proporción de sexos, el rango de edad de los ratones y el número de días de registro en el paradigma experimental actual son ajustables según los diferentes objetivos experimentales. Para la demostración de este método, se reutilizó un subconjunto de ratones experimentales durante dos días de grabación. Los ratones C57BL/6J mayores de 12 semanas pueden mostrar una sensibilidad reducida a sonidos de altafrecuencia 16.
- Selecciona los ratones que se van a grabar. Aquí se utilizaron grupos de 2 ratones machos y 2 hembras de ratones C57BL/6J entre 8 y 12 semanas de edad en el momento de la grabación.
- Alojar a los animales.
- Aloja cada ratón individualmente durante 14 días antes de la grabación.
NOTA: La vivienda individual minimiza la influencia de la experiencia social previa en las interacciones grupales. - Proporciona a cada jaula cama, enriquecimiento y acceso improvisado a comida y agua.
- Aloja cada ratón individualmente durante 14 días antes de la grabación.
- Marca los animales para identificarlos visualmente.
- Dos días antes de la grabación, anestesiar a cada ratón usando un 2,5% de isoflurano en oxígeno a un caudal de 1 L/min mediante un vaporizador de precisión en una cámara sellada. Una vez que cada ratón está anestesiado, transfiere fuera de la cámara, tumbado plano con la espalda accesible, recibiendo la anestesia de un cono nasal durante el procedimiento de marcado.
NOTA: El protocolo de anestesia descrito en el paradigma experimental actual está aprobado en nuestro protocolo animal y se aplicó a cada ratón en serie, pero es ajustable para diferentes animales u objetivos experimentales. - Mientras cada ratón está bajo anestesia, aplica un patrón único en su espalda usando tinte no tóxico para permitir la identificación visual durante el seguimiento.
- Vigila cada animal de forma continua mientras el contraste se asienta manteniendo la anestesia durante aproximadamente 15 minutos, y registra la duración de la anestesia.
- Enjuaga y coloca a cada ratón en una jaula de recuperación calentada hasta que esté completamente en marcha.
- Devuelve a cada ratón a una jaula limpia individual con cama, enriquecimiento y acceso a comida y agua.
NOTA: Aplicar marcas a las hembras antes que a los machos para minimizar la transmisión de señales de olor macho que podrían influir en el comportamiento posterior.
- Dos días antes de la grabación, anestesiar a cada ratón usando un 2,5% de isoflurano en oxígeno a un caudal de 1 L/min mediante un vaporizador de precisión en una cámara sellada. Una vez que cada ratón está anestesiado, transfiere fuera de la cámara, tumbado plano con la espalda accesible, recibiendo la anestesia de un cono nasal durante el procedimiento de marcado.
- Realiza exposición a personas de sexo opuesto.
- Un día antes de grabar, prepara jaulas limpias sin cama.
- Para cada ratón experimental, coloca al animal en una jaula seguido de un ratón nuevo del sexo opuesto.
- Permite que los animales interactúen durante 10 minutos.
- Observa las interacciones y registra manualmente los eventos de comportamiento.
- Tras la exposición, devuelva a los animales de experimentación a alojamientos individuales tras la exposición.
NOTA: La exposición a personas de sexo opuesto es específica del paradigma experimental actual, ya que aumenta la probabilidad de comportamiento vocal durante grabaciones grupalesposteriores 17; sin embargo, no es un componente obligatorio de los métodos descritos. Separa a los animales si se observa comportamiento copulatorio.
- Determinar los estados estroles de las hembras de ratón.
- Aproximadamente 2 horas antes de la grabación, evalúa el estado estroso de cada ratón hembra (si se utilizan sujetos hembras).
- Realizar lavado vaginal utilizando 30 μL de solución salina tamponada con fosfato.
- Transfiere la muestra de lavado a una lámina de microscopio limpia y extiende uniformemente.
- Deja que las láminas se sequen completamente.
- Aplica tinte violeta cristalino en cada lámina y usa una pipeta para enjuagar suavemente con agua.
- Examina las láminas bajo un microscopio óptico.
- Clasificar el estado estrolo en función de las proporciones relativas de células epiteliales nucleadas, células epiteliales cornificadas yleucocitos 18.
- Registra el estado estrol de cada hembra.
NOTA: Como los USVs pueden afectar la receptividad femenina durante elestro 19,20, determinar el estado estral es específico del paradigma experimental actual. sin embargo, no es un componente obligatorio de los métodos descritos.
3. Grabaciones de interacción social
- Prepara la arena de grabación.
- Añadir ropa de cama con papel blanco al suelo de la arena a una profundidad uniforme de aproximadamente 1,25 cm.
- Asegúrate de que la ropa de cama cubra todas las esquinas de forma uniforme.
- Verifica que todos los micrófonos estén alineados, sin obstáculos y orientados hacia la arena.
- Antes de las grabaciones experimentales, coloca una regla y un objeto de alto contraste en el centro de la arena para verificar el enfoque de la cámara y establecer la escala espacial.
- Retira los objetos de calibración antes de que comiencen los registros de comportamiento.
NOTA: La cama blanca a base de papel proporciona contraste para animales de pelaje más oscuro, facilitando el seguimiento. Si se utilizan animales de pelaje más claro, entonces una cama negra de papel ayudaría a rastrear. Si la duración de la grabación se alarga, añade comida y agua a la arena. Añadir marcadores direccionales Norte/Sur y Este/Oeste a la regla facilita la identificación de los ocho micrófonos.
- Realiza grabaciones previas al comportamiento del sistema.
- Inmediatamente antes de las grabaciones de comportamiento, graba 15 segundos de ruido de fondo con luces infrarrojas encendidas.
- Registro de 15 segundos de una prueba de localización de micrófono con luces infrarrojas apagadas y luces indicadoras de micrófono encendidas.
- Guarda todas las grabaciones previas al comportamiento para una verificación posterior del rendimiento del sistema.
NOTA: Estas grabaciones se utilizan para verificar la función del micrófono y los niveles de ruido base. Los scripts usados para la grabación están disponibles en el repositorio de código asociado.
- Registrar el comportamiento social del grupo.
- Prepara todos los ajustes de grabación con antelación para minimizar la interacción con los animales antes de la recogida de datos.
- Coloca a las ratones hembras en la arena.
- Coloca a los ratones machos en la arena.
NOTA: Si grabas varios animales del mismo sexo, coloca ambos animales simultáneamente. - Cierra el recinto y comienza a grabar.
- Graba el comportamiento social del grupo de forma continua durante 10 minutos.
NOTA: La duración de la grabación es ajustable. - Verifica que los archivos de vídeo y audio sean legibles y libres de corrupción antes del preprocesamiento.
- Al finalizar la grabación, retira todos los animales excepto uno.
- Registrar animales individuales.
- Graba al ratón que queda solo en la arena durante 10 minutos.
- Repite grabaciones individuales para cada uno de los ratones restantes.
- Pesa cada ratón inmediatamente después de las grabaciones individuales.
NOTA: Las grabaciones individuales se utilizan para entrenar y validar el seguimiento multi-animal. Documenta la temperatura dentro del equipo antes de cada sesión de grabación, ya que la temperatura afecta a la propagación del sonido. Repite la sesión de grabación si los archivos de vídeo o audio están corruptos o incompletos.
4. Preprocesamiento de vídeo
- Prepara los archivos de vídeo.
- Verifica que todas las grabaciones de vídeo estén almacenadas en un único directorio asociado al experimento.
- Ajusta la intensidad del vídeo para el seguimiento.
- Si es necesario, aplica un ajuste uniforme de brillo a todos los fotogramas de vídeo añadiendo un valor constante (brightness_adjustment x 255) a cada píxel, donde brightness_adjustment es un escalar que normalmente varía de 0,1 a 0,6 dependiendo de las condiciones de iluminación.
- Si es necesario, aplicar un ajuste global de contraste usando remapeo de intensidad (por ejemplo, la función de ajuste de MATLAB) con un rango de entrada definido (por ejemplo, [0,2, 0,8]), que mapea las intensidades de píxeles al 20% del máximo a negro y del 80% del máximo a blanco, y escala linealmente valores intermedios. Este paso se realiza para aumentar la separación entre las marcas de identificación de color claro y el fondo.
- Recorta las intensidades de píxeles al rango válido para la profundidad de bits del vídeo (es decir, de 0 a 255 para vídeo de 8 bits).
NOTA: Se deben aplicar parámetros de preprocesamiento idénticos a todas las tramas dentro de una grabación y entre ellas para garantizar la consistencia. Estos ajustes son opcionales y dependen de las condiciones de grabación. Para los datos representativos presentados aquí, no se aplicaron ajustes de brillo ni de contraste. Cuando se necesitan ajustes, los usuarios deben previsualizar el primer fotograma procesado para confirmar el contraste adecuado entre los animales y la arena antes de procesar todo el vídeo.
- Exporta los vídeos preprocesados.
- Guarda los archivos de vídeo preprocesados usando la misma tasa de fotogramas y alineación temporal que las grabaciones originales.
- Conserva los archivos de vídeo originales para referencia y verificación.
NOTA: Los scripts usados para el preprocesamiento de vídeo y los valores específicos de los parámetros aplicados están disponibles en el repositorio de código asociado.
5. Rastreo de múltiples animales
- Prepara el software de seguimiento y los datos.
- Instala un software de seguimiento multi-animal y todas las dependencias necesarias. Este estudio utilizó MOuse TRacker (MoTR; Tabla 1) porque el formato de salida es compatible con Muse (Tabla 1), otro software en nuestra pipeline utilizado para cálculos de localización de fuentessonoras 21.
NOTA: Otros programas automatizados de seguimiento, como Social Leap Estimates Animal Poses (SLEAP)22 oDeepLabCut 23, podrían usarse para rastrear animales, siempre que se generen la posición del animal, la dirección de dirección y la posición de la nariz. - Organiza los archivos de vídeo preprocesados para que las grabaciones de un solo animal y las de varios animales estén claramente separadas.
- Verifica que todos los archivos de vídeo tengan tasas de fotogramas y resoluciones espaciales consistentes.
NOTA: Las instrucciones de instalación de software y los requisitos de dependencias se proporcionan en el repositorio de código asociado.
- Instala un software de seguimiento multi-animal y todas las dependencias necesarias. Este estudio utilizó MOuse TRacker (MoTR; Tabla 1) porque el formato de salida es compatible con Muse (Tabla 1), otro software en nuestra pipeline utilizado para cálculos de localización de fuentessonoras 21.
- Entrena a los modelos de un solo animal.
- Selecciona grabaciones de un solo animal correspondientes a cada sujeto experimental.
- Entrena un clasificador de identidad separado para cada animal usando características extraídas del registro de un solo animal de ese animal. Durante las grabaciones en grupo, estos resultados de clasificador por animal se combinan con información de trayectoria a través de los fotogramas para mantener la identidad animal.
- Verifica que la formación se complete con éxito antes de continuar.
NOTA: Las grabaciones de un solo animal se utilizan para iniciar el seguimiento específico de identidad en sesiones con múltiples animales.
- Graba grabaciones con varios animales.
- Aplica el modelo de seguimiento entrenado a grabaciones de interacción social con múltiples animales.
- Genera estimaciones fotograma a cuadro de la posición, orientación y forma corporal de los animales para cada sujeto.
- Guarda las salidas de seguimiento para análisis posteriores.
6. Segmentación acústica
- Prepara los datos de audio.
- Verifica que todas las grabaciones de audio de los canales individuales del micrófono estén presentes y accesibles.
- Detectar vocalizaciones.
- Ejecuta el software de segmentación acústica, Ax (Tabla 1), en cada grabación para detectar los USVs.
- Configura los parámetros tiempo-frecuencia definidos en un archivo de entrada considerado por Ax. La frecuencia de muestreo del micrófono se estableció en 250 kHz.
NOTA: Se consideraron tres tamaños de ventana para la transformada rápida de Fourier no uniforme, incluyendo 64, 128 y 256 muestras. Se aplicó un producto de tiempo y ancho de banda multi-taper de 3 con 5 tapers, junto con un umbral de significación de 0,05. Se utilizó una duración mínima de 0 muestras, con un corte de baja frecuencia de 30 kHz y un corte de alta frecuencia de 110 kHz. El tamaño de la convolución se ajustó para cubrir 1001 Hz por 0,001 s. Se incluyó una bandera para fusionar señales relacionadas armónicamente. Para detalles específicos, véase Neunuebel et al.7. - Extrae los USVs candidatos basándose en estas características de tiempo-frecuencia.
- Guarda las salidas de segmentación como una hoja de cálculo para cada grabación.
NOTA: Las instrucciones de instalación de software, scripts y ajustes de parámetros se proporcionan en el repositorio de códigoasociado 7.
- Compila las salidas de segmentación.
- Genera una lista consolidada de eventos de vocalización detectados que contenga los tiempos de inicio, los tiempos de desplazamiento y los límites de frecuencia.
- Guarda los archivos de vocalización consolidados para análisis de localización aguas abajo.
7. Localización de fuentes sonoras
- Prepara las entradas para la localización.
- Confirma que hay salidas de segmentación acústica y resultados de seguimiento multi-animal disponibles para cada grabación.
- Organizar las entradas de localización para que los datos de audio, los datos de seguimiento y la geometría de la arena sean accesibles para el software de localización.
NOTA: Los scripts utilizados para organizar los archivos de entrada, definir las estructuras de directorios requeridas y recopilar información geométrica de la arena se proporcionan en el repositorio de código asociado.
- Estima la ubicación de las fuentes sonoras.
- Aplicar el algoritmo de localización de la fuente sonora, MUSE (Tabla 1), a cada vocalizacióndetectada 7.
- Utilizando grabaciones de matriz de micrófonos, estima el origen espacial de cada vocalización dentro de la arena.
- Para cada vocalización, estima la ubicación de la fuente sonora usando remuestreo con navaja repetiendo el procedimiento de localización ocho veces, omitiendo cada vez un micrófono para que cada estimación se base en los siete micrófonos restantes. Esto genera ocho estimaciones por vocalización.
NOTA: Las diferencias en el tiempo de llegada entre micrófonos son fundamentales para estimar la ubicación de la fuente sonora. El remuestreo con jackknife se utiliza para evaluar la fiabilidad de la localización y reducir la sensibilidad a canales individuales de micrófono. Los scripts usados para estimar la ubicación de la fuente sonora se proporcionan en el repositorio de códigoasociado 7.
- Calcular las distribuciones de probabilidad de localización de la fuente sonora.
- Para cada vocalización, calcula una matrizde covarianza 24 y utiliza esta y las estimaciones medias de puntos jackknife para calcular la densidad de probabilidad en el suelo de la arena.
- Integra la localización con las posiciones de los animales.
- Extrae las posiciones rastreadas de la cabeza o la nariz de todos los animales en el momento de cada vocalización.
- Para cada vocalización, evalúa la densidad de probabilidad de localización en la ubicación de la nariz de cada animal.
- Para cada vocalización, calcula una métrica de confianza de la asignación para cada animal basada en los valores de probabilidad. La métrica de confianza de asignación se calcula para cada animal como el valor de densidad en la nariz de ese animal dividido por la suma de los valores de densidad de todos los animales. Nos referimos a esta métrica como el índice de probabilidad del ratón (MPI)15.
- Asigna vocalizaciones.
- Si la métrica de confianza de asignación para un solo ratón supera 0,95, la señal se asigna a eseratón 7,15.
- Etiqueta las vocalizaciones que no cumplen los criterios de asignación como no asignadas.
- Guarda las salidas de localización y asignación para validación y análisis posteriores.
NOTA: Los umbrales de asignación, criterios de confianza y código se proporcionan en los scripts de análisis asociados.
8. Validación de resultados
- Valida el seguimiento de varios animales.
- Carga las salidas de seguimiento finalizadas para cada grabación.
- Superponía las posiciones y la forma corporal de los animales sobre los fotogramas de vídeo correspondientes.
- Inspecciona visualmente los resultados del seguimiento para confirmar la posición precisa del ratón y la asignación consistente de identidad entre tramas.
NOTA: Los resultados de seguimiento incluyen elipses codificadas por colores que indican la dirección de la cabeza superpuestas en cada ratón en cada fotograma de vídeo. El tamaño de la elipse y la orientación del cuerpo deben coincidir respectivamente con el tamaño y la orientación del ratón en cada fotograma. El color de la elipse debe ser consistente para cada ratón a lo largo de la grabación. - Identificar y corregir los errores de seguimiento.
Guarda los resultados de seguimiento corregidos para análisis posteriores.
NOTA: Los errores comunes de seguimiento ocurren durante interacciones sociales cercanas o cerca de los límites de la arena. Corrige todos los casos de giros cabeza-cola, cambios de identidad y saltos y derrapes con la elipse.
NOTA: En el repositorio de código se proporcionan programas para ver la salida de seguimiento y corregir errores.
- Valida la extracción de vocalización.
- Carga las salidas de segmentación acústica para cada grabación.
- Genera espectrogramas a partir de datos de audio en bruto para ventanas temporales representativas.
- Superpone los eventos de vocalización detectados, incluyendo rangos individuales de tiempo y frecuencia, sobre espectrogramas.
- Confirma visualmente la correspondencia entre los eventos detectados y las vocalizaciones observadas en los espectrogramas.
- Si se observan errores sistemáticos, ajusta los parámetros de segmentación antes de repetir los pasos de extracción y localización, o ajusta manualmente cualquier caso de error de segmentación (es decir, error de identificación del tiempo o rango de frecuencias de vocalización).
- Valida la asignación de vocalización.
- Carga la localización de la fuente de sonido y las salidas de asignación.
- Para cada vocalización, visualiza estimaciones de localización, distribuciones espaciales de probabilidad y posiciones de animales superpuestas en fotogramas de vídeo.
- Confirma que las densidades de probabilidad de localización están centradas cerca de la cabeza del animal asignado y claramente separadas de los demás animales.
- Verifica que las vocalizaciones que no cumplan los criterios de la tarea estén etiquetadas como no asignadas.
NOTA: Las comprobaciones de la salida de la asignación incluyen verificar que se han generado todas las salidas esperadas y que el mapa de probabilidad para cada vocalización esté ubicado dentro de los límites de la arena y alrededor del ratón asignado a la vocalización. - Guarda los resultados validados de la asignación para análisis posteriores.
NOTA: Los umbrales de confianza de la asignación y los criterios de validación están definidos en los scripts de análisis asociados.
9. Análisis de datos
- Visualiza la localización de la fuente sonora.
- Para sesiones de grabación con un solo o varios animales, selecciona fotogramas de vídeo durante los cuales se detectaron vocalizaciones.
- Generar representaciones esquematizadas de los fotogramas de vídeo seleccionados.
- Genera un esquema espacial a partir de la salida MUSE graficando las posiciones de todos los micrófonos, las estimaciones individuales de puntos de la fuente sonora, la ubicación estimada de la fuente sonora, la distribución de probabilidad espacial, la posición del ratón, la identidad inferida del vocalizador y una barra de escala.
- Genera espectrogramas de la vocalización correspondiente tal como se graba en cada canal de micrófono.
NOTA: Estas visualizaciones son útiles para evaluar cualitativamente el rendimiento de la localización tanto en contextos individuales como grupales.
- Cuantifica el error de localización y la precisión.
- Calcular la distancia entre la ubicación estimada de la fuente sonora y la posición del animal grabado para cuantificar el error de localización. Utiliza grabaciones con ratón individual para estos cálculos, ya que solo hay un emisor y la fuente es conocida.
- Para evaluar la precisión de la tarea, transforma las estimaciones de la fuente sonora y las posiciones correspondientes de los animales en un marco de referencia centrado en el animal que vocaliza.
- Visualiza la distribución espacial de las estimaciones de la fuente sonora en relación con la posición del animal centrado.
- Genera espectrografías para visualizar vocalizaciones.
- Identifica episodios de vocalización de interés usando salidas de extracción vocal que contienen la identidad del vocalizador, los tiempos de inicio y desplazamiento de la vocalización, y los límites de frecuencia alta y baja.
- Selecciona ventanas de tiempo que abarquen desde antes del inicio de la primera vocalización hasta después del desplazamiento de la última vocalización en cada combate.
- Extrae las trazas de voltaje de los archivos de canales de audio para las ventanas temporales seleccionadas.
- Genera espectrogramas transformando las trazas de voltaje extraídas del dominio temporal al dominio de la frecuencia.
- Marca los puntos de tiempo correspondientes a las vocalizaciones asignadas y no asignadas usando colores distintos en el espectrograma.
- Para las sesiones de interacción social, identifica los episodios de vocalización producidos por diferentes individuos y genera espectrografías con las identidades de los vocalizadores indicadas usando colores específicos de cada identidad.
- Cuantifica la salida vocal por individuo.
- Utiliza la salida del código de localización de la fuente sonora para asignar a cada vocalización una etiqueta de identidad, de modo que las identidades de animales no localizadas, localizadas pero no asignadas y individuales se codifiquen numéricamente.
- Suma el número de vocalizaciones producidas por cada animal individual.
- Compara los recuentos de vocalización entre individuos y entre sexos.
- Analiza las características vocales.
- Extrae los contornos de frecuencia para cada vocalización.
- Cuantifica parámetros vocales como la frecuencia máxima, mínima, frecuencia media, ancho de banda y duración de la vocalización.
- Compara los parámetros vocales entre sexos.
- Realizar análisis estadísticos apropiados basados en las propiedades distributivas de los datos.
NOTA: Seleccione métodos estadísticos para que coincidan con las propiedades paramétricas de las variables medidas. Aquí, el número de sujetos es demasiado bajo para comparaciones estadísticas.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Los resultados presentados en este artículo provienen de grabaciones realizadas durante 2 días y tienen como objetivo ilustrar la salida del protocolo, publicado originalmente en Warren et al.15. Estos datos no pretenden apoyar inferencias estadísticas ni conclusiones generales.
Extracción y asignación de USVs
Los USVs se grababan tanto en sesiones de interacción social individual como grupal utilizando el sistema de...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La atribución fiable de los VSUs a animales individuales durante las interacciones grupales ha sido una limitación técnica importante en el estudio de la comunicación vocal en ratones. Aunque los ratones se utilizan ampliamente para estudiar la comunicación social, la incapacidad para asignar vocalizaciones a individuos específicos ha limitado el análisis cuantitativo del comportamiento vocal en entornos sociales naturalistas. Por tanto, es esencial un método que permita el seguimiento v...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al personal del Centro de Investigación de Vida y Ciencias de la Universidad de Delaware por el cuidado animal, a Jim Farmer y Jamie Quesenberry por la ayuda en la construcción del equipo de laboratorio, y al Grupo de Computación de Alto Rendimiento de la Universidad de Delaware por su apoyo en el mantenimiento del clúster informático. Agradecemos a Andre Yichong Ma su ayuda en la recopilación de datos. El trabajo fue financiado por los NIH, con subvenciones R01MH122752 y T32GM142603.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alpha-Dri Bedding | Shepherd Specialty Papers | ALPHA-dri | Necesario para el sistema de localización de fuente de sonido |
| Extrusión de aluminio | 8020 | Construido a medida para coincidir con el área de grabación | Necesario para el sistema de localización de fuente de sonido |
| BNC-2110 | National Instruments | 777643-01 | Necesario para el sistema de localización de fuente de sonido |
| Panel acrílico transparente | Home Depot | MC-24 | Necesario para el sistema de localización de fuente de sonido |
| CM16/CMPA40-5V | Avisoft | 40014 | Necesario para el sistema de localización de fuente de sonido |
| Computadora | Hewlett–Packard | Z620 | Necesario para el sistema de localización de fuente de sonido |
| Grasshopper 3 | FLIR | GS3-U3-41C6M-C | Necesario para el sistema de localización de fuente de sonido |
| Luces IR | GANZ | IR-LT30 | Necesario para el sistema de localización de fuente de sonido |
| NI PXIe-1073 | National Instruments | 781161-01 | Necesario para el sistema de localización de fuente de sonido |
| NI PXIe-6356 | National Instruments | 781053-01 | Necesario para el sistema de localización de fuente de sonido |
| Nice ‘N Easy, Born Blonde Maxi | Clairol | 2523721 | Necesario para el sistema de localización de fuente de sonido |
| Malla de nylon para paredes de jaulas | McMaster-Carr | 9318T25 | Necesario para el sistema de localización de fuente de sonido |
| Cable de alimentación | National Instruments | 763000-01 | Necesario para el sistema de localización de fuente de sonido |
| SCHC68-68-EPM | National Instruments | 192061-02 | Necesario para el sistema de localización de fuente de sonido |
| Espuma Sonex | Pinta Acoustic | VLW-35 | Necesario para el sistema de localización de fuente de sonido |
Referencias
- Barfield, R. J., Thomas, D. A. The role of ultrasonic vocalizations in the regulation of reproduction in rats. Ann N Y Acad Sci. 474 (1), 33-43 (1986).
- Placer, J., Slobodchikoff, C. N. A fuzzy-neural system for identification of species-specific alarm calls of Gunnison's prairie dogs. Behav Processes. 52 (1), 1-9 (2000).
- Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3 (12), e386 (2005).
- Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 7 (1), e29401 (2012).
- Shepard, K. N., Liu, R. C. Experience restores innate female preference for male ultrasonic vocalizations. Genes Brain Behav. 10 (1), 28-34 (2011).
- Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic songs with approach behaviour. Biol Lett. 5 (5), 589-592 (2009).
- Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. E. R. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. Elife. 4, e06203 (2015).
- Sangiamo, D. T., Warren, M. R., Neunuebel, J. P. Ultrasonic signals associated with different types of social behavior of mice. Nat Neurosci. 23 (3), 411-422 (2020).
- Zala, S. M., Reitschmidt, D., Noll, A., Balazs, P., Penn, D. J. Sex-dependent modulation of ultrasonic vocalizations in house mice (Mus musculus musculus). PLoS One. 12 (12), e0188647 (2017).
- Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 7 (7), e41133 (2012).
- Musolf, K., Hoffmann, F., Penn, D. J. Ultrasonic courtship vocalizations in wild house mice Mus musculus musculus. Anim Behav. 79 (3), 757-764 (2010).
- Warburton, V. L., Sales, G. D., Milligan, S. R. The emission and elicitation of mouse ultrasonic vocalizations the effects of age sex and gonadal status. Physiol Behav. 45 (1), 41-47 (1989).
- Chen, P., Hong, W. Neural circuit mechanisms of social behavior. Neuron. 98 (1), 16-30 (2018).
- Heckman, J. J., et al. High-precision spatial localization of mouse vocalizations during social interaction. Sci Rep. 7 (1), 3017 (2017).
- Warren, M. R., Sangiamo, D. T., Neunuebel, J. P. High channel count microphone array accurately and precisely localizes ultrasonic signals from freely moving mice. J Neurosci Methods. 297, 44-60 (2018).
- Johnson, K. R., Erway, L. C., Cook, S. A., Willott, J. F., Zheng, Q. Y. A major gene affecting age-related hearing loss in C57BL/6J mice. Hear Res. 114 (1), 83-92 (1997).
- Zala, S. M., et al. Primed to vocalize wild-derived male house mice increase vocalization rate and diversity after a previous encounter with a female. PLoS One. 15 (12), e0242959 (2020).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal cytology of the laboratory rat and mouse: review and criteria for the staging of the estrous cycle using stained vaginal smears. Toxicologic pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Floody, O. R., Pfaff, D. W., Lewis, C. D. Communication among hamsters by high-frequency acoustic signals II determinants of calling by females and males. J Comp Physiol Psychol. 91 (4), 807-819 (1977).
- McIntosh, T. K., Barfield, R. J., Geyer, L. A. Ultrasonic vocalisations facilitate sexual behaviour of female rats. Nature. 272 (5649), 163-164 (1978).
- Ohayon, S., Avni, O., Taylor, A. L., Perona, P., Egnor, S. E. R. Automated multi-day tracking of marked mice for the analysis of social behaviour. J Neurosci Methods. 219 (1), 10-19 (2013).
- Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nat Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 21 (9), 1281-1289 (2018).
- Peña, D., Prieto, F. J. Multivariate outlier detection and robust covariance matrix estimation. Technometrics. 43 (3), 286-310 (2001).
- Matsumoto, J., et al. Acoustic camera system for measuring ultrasound communication in mice. iScience. 25 (8), 104812 (2022).
- Waidmann, E. N., Yang, V. H. Y., Luo, E., Doyle, W. C., Jarvis, E. D. Mountable miniature microphones to identify and assign mouse ultrasonic vocalizations. Cell Rep Methods. 5 (6), 101081 (2025).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
