Una plataforma web para la cuantificación automatizada basada en imágenes de islotes pancreáticos aislados de humanos y roedores

Resumen

Este protocolo describe muestreo estandarizado, tinción, adquisición de imágenes y cuantificación automatizada en web de islotes pancreáticos humanos y roedores aislados mediante análisis de imágenes asistido por aprendizaje profundo y control de calidad visual.

Resumen

El propósito de esta publicación es proporcionar un protocolo paso a paso escrito y vídeo en acción real para el uso estandarizado de IsletNet, una plataforma web para la cuantificación automatizada de islotes pancreáticos aislados en imágenes, desde el muestreo y adquisición de imágenes hasta la subida de imágenes, validación visual y generación automática de informes. La plataforma fue desarrollada para la evaluación estandarizada y automatizada de imágenes microscópicas bidimensionales de islotes pancreáticos aislados para apoyar flujos de trabajo clínicos y experimentales de aislamiento de islotes. La segmentación de imágenes basada en aprendizaje profundo se utiliza para identificar islotes y tejidos exocrinos de los que se extraen contornos para el análisis de imágenes. Los algoritmos computacionales cuantifican posteriormente el conteo, volumen y pureza de islotes. La herramienta visual de Control de Calidad permite validar por expertos análisis automáticos de imágenes permitiendo a los usuarios aceptar, corregir manualmente o excluir imágenes inválidas. El módulo de Aislamiento de Islotes Clínicos soporta análisis por lotes de fracción de pureza y genera informes automáticos en PDF junto con imágenes descargables y archivos de datos tabulares para el registro y el análisis. El módulo de Comparación Simple compara estimaciones automatizadas con resultados de referencia obtenidos localmente enviados junto con las imágenes de muestra correspondientes para evaluar la idoneidad de imágenes estandarizadas localmente para análisis automatizados. El protocolo también describe recomendaciones para reentrenar utilizando imágenes estandarizadas generadas localmente cuando sea necesario. Datos representativos de aislamientos de islotes de roedores y humanos, incluidos ejemplos desafiantes, demuestran una mejora en el rendimiento del análisis automatizado tras el entrenamiento adecuado.

Introducción

El trasplante de islotes pancreáticos aislados en receptores diabéticos reduce o elimina la necesidad de administración externa^{de insulina 1}. El proceso de aislamiento de islotes de donantes cadavéricos o vivos está sujeto a heterogeneidad biológica y procedimental, reflejada en variaciones en el rendimiento y la calidad. El volumen total de islotes representa la principal entrada para la determinación de la dosis y la toma de decisiones clínicas sobre la idoneidad para el trasplante². El histograma del tamaño del islote y el número del índice del islote explican las diferencias en la efectividad relacionada con el tamaño³. Por ello, se presta atención a los islotes individuales además del volumen total, que actualmente actúa como marcador sustituto del contenido de células beta. Los islotes humanos aislados son menos densos que los de roedores y a menudo no están bien separados del tejido exócrino. Por ello, son más difíciles de distinguir a menos que estén teñidos. Se adoptó un método rápido y sencillo de tinción con zinc utilizando ditizona, en el que la luz roja intensa se refleja desde los gránulos de insulina enriquecida^{con zinc 4}. Dada la opacidad del tejido, solo se recoge la luz reflejada desde la superficie, lo que permite el uso de instrumentos simples de microscopía estereoscópica o invertida equipados con una fuente de luz y una cámara.

Se han realizado numerosos intentos para reducir la variación entre laboratorios empleando herramientas de análisis de imágenes^digitales 5,6,7,8,9,10,11,12; sin embargo, estos enfoques presentan varias limitaciones. En estos métodos, la segmentación de islotes y tejido exocrino se basa en un umbral manual, que es propenso a errores^subjetivos 5,6,7,8,9,10, o utiliza enfoques de segmentación totalmente ^{automatizados 11,12}. Además, la instalación local de software suele requerirse 5,6,7,8,9,10,11 y puede estar restringida a hardware ^{específico 10,11}, limitando la accesibilidad general y la estandarización.

El objetivo general de la presente publicación es proporcionar un flujo de trabajo estandarizado para la cuantificación automatizada de islotes pancreáticos aislados en imágenes utilizando una plataforma web de aprendizaje profundo con supervisión de expertos humanos. IsletNet aborda las limitaciones asociadas tanto con la disponibilidad como con la fiabilidad del análisis de imágenes de islotes. En este artículo, presentamos las directrices recomendadas para muestrear injertos de islotes, generar imágenes microscópicas adecuadas y utilizar correctamente las herramientas de IsletNet . El protocolo introduce el concepto de supervisión humana de los resultados generados automáticamente y presenta flujos de trabajo para usuarios potenciales y establecidos (Figura 1). La herramienta Simple Comparison permite a los usuarios potenciales comparar directamente los resultados de IsletNet con métodos de referencia obtenidos localmente (Figura 1A). Dado que las imágenes estandarizadas generadas localmente pueden diferir sustancialmente entre centros, IsletNet puede requerir reentrenamiento antes de poder realizar un análisis fiable (Figura 1B). Para facilitar este proceso, se proporcionan recomendaciones para la estandarización de tintes y la adquisición de imágenes. Para usuarios consolidados, la herramienta Clinical Islet Isolation está diseñada para soportar el flujo de trabajo de aislamiento humano de islotes (Figura 1C). Los informes descargables junto con tablas y visualizaciones adicionales generadas por IsletNet se describen en la Tabla 1, mientras que los parámetros clave calculados se resumen en la Tabla 2.

Figura 1: Flujo de trabajo para usuarios potenciales y establecidos de la plataforma. (A) Flujo de trabajo de validación local usando el módulo de Comparación Simple. (B) El reentrenamiento requiere un conjunto que represente imágenes localmente estandarizadas. (C) Flujo de trabajo de uso rutinario utilizando el módulo de Aislamiento de Islotes Clínicos. Se resumen los pasos clave del flujo de trabajo para la subida de imágenes, el análisis, el control de calidad visual (vQC) y la generación de informes. Las barras de báscula no son aplicables. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1: Archivos de resultados descargables generados por la plataforma. Lista de archivos de salida descargables generados por las herramientas Clinical Islet Isolation y Simple Comparison, agrupados según formato de archivo y categoría de salida. La tabla incluye archivos de informes, salidas de imágenes segmentadas, archivos de visualización y exportaciones de hojas de cálculo para el recuento de islotes, volumen, pureza e análisis de histogramas. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Parámetros clave incluidos en informes descargables y salidas de hojas de cálculo. Lista detallada de metadatos, configuraciones definidas por el usuario y parámetros de análisis cuantitativo incluidos en archivos XLSX y CSV descargables generados por las herramientas Clinical Islet Isolation and Simple Comparison. Los parámetros incluyen metadatos de sesión, ajustes de adquisición de imágenes y métricas de cuantificación de islotes para imágenes y islotes individuales. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Protocolo

Los procedimientos para animales fueron aprobados por el Ministerio de Sanidad de la República Checa (Aprobación nº 49/2023) de acuerdo con la Directiva 86/609/CEE del Consejo de las Comunidades Europeas. Los procedimientos de aislamiento y uso de islotes humanos fueron aprobados por el Instituto Estatal para el Control de Drogas (Aprobación nº sukls111286/2023). Se analizaron imágenes microscópicas estandarizadas de preparaciones de islotes de rata y humanos utilizando las herramientas de Comparación Simple y Aislamiento Clínico de Islotes para comparar el análisis automatizado con el conteo manual. La tabla de conversión estándar (corta)¹³ se utilizó tanto para cálculos manuales como automáticos equivalentes a islotes.

1. Supervisión humana

1. Vista inicial de los resultados primarios (Figura 2)
   1. Espera a que aparezcan los valores generados automáticamente para el recuento, volumen y pureza de islotes, junto con la visualización gráfica de las anotaciones automáticas correspondientes (por ejemplo, contornos o segmentaciones), en la ventana de Resultados por lotes.
   2. Consulta los resultados resumidos de la imagen de muestra actual en el panel de información de la izquierda (Figura 2A).
   3. Consulta los valores replicados (Figura 2B) y los promedios por lotes (Figura 2C) en la tabla de la derecha.
   4. Navega en la vista previa de la imagen (Figura 2D, E) usando los enlaces (Figura 2F). Haz clic derecho en la vista previa de la imagen y sigue el menú emergente para descargar una sola imagen si es necesario.
   5. Explora imágenes de ejemplo usando las flechas de navegación (Figura 2G) o selecciona directamente desde la tabla.
   6. Abre la ventana de Inspección haciendo clic dentro de la vista previa actual de la imagen (Figura 2D) para evaluar la calidad de los contornos generados automáticamente y validar los resultados.
2. Control de calidad visual
   1. Muévete alrededor de la imagen y haz zoom (Figura 3A) hacia dentro o hacia fuera para inspeccionar los contornos en busca de posibles errores.
   2. Alterna entre las vistas de Contorno (solo las que cuentan con islotes), imagen original y vistas de visualización adicionales.
      NOTA: Las vistas disponibles se listan en la leyenda en el lado derecho de la ventana (Figura 3B) y pueden accederse mediante los atajos de teclado o los enlaces en la barra superior de navegación (Figura 3C; Tabla 3).
   3. Procede a la siguiente imagen pulsando la tecla de flecha hacia abajo si los contornos son aceptables (Tabla 3).
   4. Corrige los errores de contorneado manualmente cuando sea posible. Si no se detecta, se detecta parcialmente o quedan islotes espurios, clasifica la imagen como inválida y exclúyela del análisis.
      NOTA: Las imágenes excluidas están marcadas en la ventana de Resultados por lotes (Figura 2J) y en todos los archivos descargados.
3. Errores corregibles: islotes adyacentes no separados
   1. Separar manualmente los islotes adyacentes cuando sea necesario.
   2. Haz clic izquierdo fuera de los islotes para iniciar una línea de separación (Figura 3D).
   3. Añade clics intermedios izquierdos para guiar la línea de separación entre islotes adyacentes (Figura 3E).
   4. Haz clic derecho fuera de los islotes para completar la línea de separación (Figura 3F).
   5. Presenta la línea de separación para actualizar el resultado (Figura 3G).
      NOTA: Activa o desactiva la visualización de las líneas de separación añadidas según sea necesario (Figura 3H).
4. Errores corregibles: Islotes espurios
   1. Utiliza la herramienta de separación para dividir un islote espurio en varios objetos más pequeños que el umbral de tamaño del islote.
   2. Evita contar fragmentos pequeños de islotes estableciendo el umbral mínimo predefinido de tamaño de islote (convencionalmente 50 μm). Ajusta el umbral según la práctica del laboratorio local si es necesario.
   3. Haz clic derecho en cualquier punto de la línea y selecciona la opción adecuada en el menú emergente para eliminar una o todas las líneas de separación añadidas manualmente (Figura 3I).
5. Errores no corregibles: islotes ausentes, parcialmente segmentados o espurios
   1. Activa la vista de Segmentación para verificar si se detectaron los islotes.
   2. Excluye del cálculo del promedio por lotes cualquier imagen inválida que contenga islotes no detectados, parcialmente detectados o múltiples islotes espurios (Figura 3J).
6. Errores no corregibles: objetos mal clasificados
   1. Excluir la imagen de la evaluación si tejido exócrino, artefactos de fondo o burbujas están clasificados incorrectamente como islotes (Figura 3J).

Figura 2. Ventana de resultados de lotes. (R) Resumen actual de resultados de muestra. (B) Resultados para imágenes de muestra replicadas. (C) Valores promedio por lotes solo de imágenes aceptadas. (D, E, F) Previsualizaciones gráficas de resultados con enlaces. (G) Ejemplo de flechas de navegación. (H, I, J) Imágenes modificadas, aceptadas y excluidas. (K) Barra superior de navegación de IsletNet . (L, M) Cabecera y pie de página de la ventana de resultados por lotes. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3. Ventana de inspección para vQC y corrección manual de contorno. (A) Pantalla de zoom de imagen. (B) Leyenda y pistas de navegación. (C) Barra superior de navegación de la ventana de Inspección. (D–G) Construcción y presentación de una línea de separación manual para islotes adyacentes. (H) Interruptor para mostrar u ocultar líneas de separación manual. (I) Retirada de líneas de separación manual. (J) Interruptor para excluir una imagen de las estadísticas. Las barras de escala no se muestran en esta vista de interfaz. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 3: Modos de vista, atajos de teclado y controles de navegación disponibles en la ventana de Inspección. Resumen de los modos de visualización de imagen, atajos de teclado y funciones de navegación disponibles durante la revisión de calidad virtual y la revisión manual de los resultados de segmentación en la ventana de Inspección. La tabla incluye superposiciones de contornos, pantallas de segmentación, visualización de histogramas y controles de navegación de imágenes utilizados en las herramientas Clinical Islet Isolation y Simple Comparison. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

2. Navegación por la plataforma

1. Versión de visualización e información técnica
   1. Revisa la versión actual del software y la fecha de entrenamiento más reciente que se muestra en la barra de navegación superior (Figura 2K).
   2. Abre la sección de Inicio para acceder a la descripción técnica y a la información de referencia asociada.
2. Evaluación preliminar de imágenes locales
   1. Determinar si las imágenes estandarizadas generadas localmente ya pueden ser analizadas correctamente por la plataforma, basándose en los criterios de error descritos en los pasos 1.2.4 y 1.5.2, o si es necesario reentrenar para imágenes estandarizadas locales (Figuras 1A y 1B).

3. Comparación sencilla y formación externa con imágenes locales

1. Comparación sencilla
   NOTA: Utilice la herramienta de Comparación Simple para comparar resultados de análisis automatizados con un método de referencia establecido localmente, normalmente el conteo manual^{estándar 13}, tablas^{alternativas 7,11,18} o^{modelos 5,6}. Sube imágenes estandarizadas generadas localmente junto con los valores de referencia correspondientes y el tipo de método de referencia. El resultado incluye tablas, imágenes e informes PDF descargables (Tabla 1).
   1. Abre el panel de Comparación Simple desde la barra de navegación superior (Figuras 4A y 4B).
   2. Revisa la sección de Pistas para conocer las propiedades de imagen requeridas (Figura 4C).
   3. Descarga la plantilla de form.xlsx (Figura 4D).
   4. Contar islotes en múltiples muestras utilizando un método de referencia establecido localmente.
   5. Adquiere imágenes microscópicas estandarizadas correspondientes a las muestras contadas.
   6. Asegúrate de que todos los islotes contados estén completamente incluidos dentro del marco de la imagen.
   7. Introduce los nombres exactos de los archivos de imagen y los valores de parámetros correspondientes en la plantilla de form.xlsx usando los puntos decimales en inglés (Figura 4E).
   8. Sube la hoja de cálculo completada y los archivos de imagen correspondientes arrastrando y soltando o usando los botones de carga (Figura 4F).
   9. Seleccione la tabla de conversión o modelo utilizado para la estimación del volumen de islotes (Figura 4G).
   10. Haz clic en Enviar lote para generar la comparación lado a lado.
   11. Espera a que aparezcan los resultados del análisis.
   12. Abre la ventana de Inspección para realizar la validación visual de las curvas de nivel.
   13. Excluye las imágenes del análisis si los contornos son incorrectos (Figura 3J).
       NOTA: La edición manual de contornos no está disponible en la herramienta Simple Comparison.
   14. Descarga los resultados en tablas, imágenes e informes en PDF (Tabla 1).
2. Formación en IsletNet para imágenes estandarizadas localmente
   1. Contacta con el equipo de desarrollo del Instituto de Medicina Experimental (IKEM) en info@isletnet.com.
   2. Comparte imágenes representativas que cubren la gama de calidad de imagen que se obtiene localmente.
   3. Habla sobre los requisitos de calidad de imagen con el equipo de desarrollo.
      NOTA: Los parámetros clave de calidad de imagen incluyen suficiente contraste, inclusión completa de islotes dentro del marco de imagen y una superposición mínima entre islotes adyacentes. La coloración de los islotes puede variar de rojo a rosa o violeta, siempre que la distinción con el tejido exócrino sea clara.
   4. Crea un conjunto de imágenes de entrenamiento que cubra el rango esperado de purezas, aumentos y variaciones de color en los islotes.

Figura 4. Herramienta simple de comparación, panel de control y flujo de trabajo. (A) Barra de navegación superior. (B) Panel de control de comparación simple. (C) Sube pistas e instrucciones. (D, E) form.xlsx descarga y visualización de parámetros subidos. (F) Área de subida de arrastrar y soltar para imágenes y hojas de cálculo. (G) Seleccionar la conversión tamaño a volumen del islote. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Muestreo

NOTA: Los islotes sedimentan rápida y de forma diferencial según el tamaño y la forma, lo que puede sesgar los resultados de muestreo.

PRECAUCIÓN: Realiza todos los procedimientos de manipulación de islotes dentro de una campana de flujo laminar mientras llevas el equipo de protección personal adecuado.

1. Usa tubos de 50 mL o 250 mL para la suspensión del islote.
2. Determinar la fracción de muestreo requerida según el volumen y la pureza observados de los pellets utilizando los procedimientos operativos estándar locales.
3. Mezcla bien la suspensión del islote invirtiendo suavemente el tubo cinco veces justo antes de la recogida de la muestra.
4. Extrae la muestra inmediatamente con una punta de pipeta de gran calibre para evitar obstrucciones por tejido exocrino y minimizar el daño en los islotes.

5. Optimización de la adquisición de imágenes de islotes

1. Preparación de la ditizona
   NOTA: Se requiere una tinción consistente con ditizona para asegurar un contraste suficiente entre islotes y tejido exocrino. A continuación se describen dos métodos de preparación más habituales.
   PRECAUCIÓN: La ditizona es una toxina reproductiva sospechosa. El dimetilsulfóxido (DMSO) es tóxico y penetrante en la piel. El hidróxido de sodio es altamente corrosivo y puede causar quemaduras químicas graves. Manipular todos los productos químicos mientras se lleva el equipo de protección personal adecuado, evitar el contacto con la piel y desechar los residuos según los procedimientos institucionales de residuos peligrosos.
   1. Resuspensión en DMSO¹³
      1. Pesa 50 mg de polvo de ditizona.
      2. Disuelve la ditizona en 5 mL de DMSO.
      3. Incubar la solución a 37°C y hacer un vórtice vigoroso durante 1 minuto cada 5 minutos hasta que la disolución esté completa.
      4. Diluye 1 mL de la solución de base con 20 mL de la Solución Sal Balanceada de Hank's que contiene 2% de suero fetal bovino para preparar la solución de trabajo.
      5. Filtra la solución a través de un filtro de jeringuilla de 0,22 μm.
      6. Envuelve el tubo en papel de aluminio para proteger la solución de la luz.
         NOTA: Utiliza la solución de trabajo en aproximadamente 12 horas.
   2. Resuspensión en solución alcohólica alcalina (alternativa a la Ref. 8)
      1. Pesa 50 mg de polvo de ditizona.
         NOTA: Prepara las alicuotas con antelación si así lo deseas.
      2. Añade 800 μL de etanol al 70% a la ditizona.
      3. Añadir 400 μL de 1 M de solución de hidróxido de sodio y usar el vórtice hasta que la disolución esté completa.
      4. Diluir la solución con solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,2 mg/mL de albúmina humana hasta obtener un volumen final de 20 mL.
      5. Filtra la solución a través de un filtro de jeringuilla de 0,22 μm.
      6. Envuelve el tubo en papel de aluminio para proteger la solución de la luz.
         NOTA: Utiliza la solución de trabajo en aproximadamente 12 horas.
2. Tinción de islotes
   1. Añade 25 μL de solución de trabajo de ditizona al centro de un plato de 35 mm.
   2. Añade 50 μL de islotes suspendidos en la Solución Salina Balanceada de Hank que contiene albúmina, medio de cultivo completo o medio de trasplante.
      NOTA: El volumen real de la muestra varía entre 20 y 50 μL dependiendo del pellet de pureza-fracción, con una concentración final de ditizona de 0,85 mg/mL a 1,37 mg/mL.
   3. Pipetea la suspensión dentro y fuera tres veces usando el primer tope lentamente para mezclar las soluciones suavemente y evitar la formación de burbujas.
   4. Incubar la muestra a 20°C–25°C durante 1–2 minutos mientras se monitoriza visualmente la tinción bajo el microscopio hasta que los islotes parezcan de un rojo brillante. Algunas preparaciones pueden contener islotes mal teñidos, para los cuales IsletNet también está entrenado.
   5. Utiliza una jeringuilla de 10 mL para inyectar rápidamente 4 mL de solución salina con fosfato bufferizada con 0,2 mg/mL de albúmina directamente en la muestra manchada, evitando burbujas y salpicaduras.
   6. Inmediatamente agita el plato vigorosamente en un movimiento circular para mezclar las soluciones, moviendo los islotes hacia el centro antes de asentarse.
      OPCIÓN 1: Añadir cuidadosamente 4 mL de PBS/alpómina alrededor, dejando los islotes en ditizona intactos. Luego, gira suavemente el plato en círculos para mezclar las soluciones que mantienen los islotes en el centro. Espera a que la ditizona se disperse en el plato.
      OPCIÓN 2 (adecuada para estereomicroscopio): En lugar de diluir los islotes, extiende la gota de disizona en una capa fina usando una punta o aguja de pipeta en lugar de diluir para reducir las reflexiones.
   7. Inspecciona la muestra bajo el microscopio y devuelve inmediatamente cualquier islote desplazado al campo de la cámara suavemente, girando la solución circundante con la punta de una pipeta.
   8. Comienza la adquisición de imágenes inmediatamente para minimizar la citotoxicidad y los cambios en el volumen de los islotes.
3. Adquisición de imágenes
   NOTA: Utilice un microscopio estereoscópico o invertido equipado con un objetivo de baja ampliación y una fuente de luz estable. Protege la antena parabólica de fuentes de luz adicionales, como la iluminación de la habitación.
   1. Enciende la fuente de luz y deja que la bombilla halógena se caliente durante 5 minutos.
   2. Establece una intensidad de luz estandarizada para evitar deslumbramiento y subexposición. El rango exacto depende del hardware de imagen utilizado.
      NOTA: La intensidad óptima de la luz puede variar según la magnificación y la pureza de la muestra.
   3. Selecciona el objetivo y la configuración de zoom que permitan que todos los islotes permanezcan dentro del campo de visión de la cámara.
   4. Mantén la misma ampliación para todas las muestras dentro de un lote y, preferiblemente, en todos los lotes de pureza.
   5. Calibra el balance de blancos usando una corredera blanca normalizada si es necesario. Si la calidad de imagen sigue siendo insatisfactoria debido a características únicas de la preparación del islote, ajusta los valores RGB y/o los ajustes de gamma.
   6. Ajusta el tiempo de exposición y, si es necesario, la intensidad o ganancia de iluminación usando el histograma de color evitando la sobreexposición.
      NOTA: Las muestras que contienen abundante tejido exocrino pueden requerir diferentes ajustes de cámara o iluminación debido a la luz reflejada del tejido no islote. Para asegurar la reproducibilidad, guarda estos parámetros como un archivo de configuración separado para referencia futura.
   7. Captura la imagen y guarda el archivo en un formato compatible, incluyendo JPG, PNG, TIFF o BMP.
      NOTA: Incluye la fecha, fracción de pureza, aumento o tamaño de píxel, y dilución en el nombre del archivo para facilitar futuros reanálisis (por ejemplo, iz260105_H1_obj1.25x_1000x.jpg).
   8. Obtén una imagen del micrómetro de escenario usando los mismos ajustes de aumento y zoom que se usan para la imagen de muestras.

6. Herramienta clínica de aislamiento de islotes

NOTA: Los pasos clave del flujo de trabajo se resumen en la Figura 1C. Analizar imágenes en lotes de fracción de pureza a medida que las muestras estén disponibles.

1. Configuración del tamaño del píxel
   NOTA: El tamaño calculado del píxel solo es válido cuando la imagen del micrómetro de etapa se adquiere usando los mismos ajustes de aumento y zoom que las muestras analizadas.
   1. Abre el panel de Aislamiento de Islotes Clínicos .
   2. Haz clic en Subir micrómetro de etapa y selecciona la imagen del micrómetro de etapa.
   3. Dibuja los extremos de la línea roja de medición a lo largo de una distancia conocida en la regla digital.
      NOTA: Utiliza una distancia de calibración más larga cuando sea posible para mejorar la precisión de las mediciones.
   4. Introduce la distancia conocida en micrómetros (μm).
   5. Envía el tamaño del píxel calculado.
      NOTA: La plataforma conserva el tamaño calculado del píxel hasta que se modifica manualmente.
2. Carga por lotes de imágenes de fracción de pureza
   NOTA: Utilice 3–4 muestras replicadas para asegurar un cálculo fiable de la media por lotes y los valores de desviación estándar. Usa la misma dilución para todas las muestras dentro de un lote.
   1. Imágenes de arrastrar y soltar que representan muestras replicadas de la misma fracción de pureza en el área de subida.
      NOTA: La plataforma impide el uso repetido de la misma imagen basándose en el reconocimiento de nombres de archivo.
   2. Modifica el tamaño del píxel si es necesario.
   3. Introduce el umbral mínimo de tamaño de islote.
   4. Introduce el valor de la dilución de la muestra (por ejemplo, 1000).
   5. Introduce el volumen de la pastilla en mililitros registrado desde el matraz original.
   6. Introduce las iniciales del operador.
      NOTA: Las iniciales del operador aparecen en el informe generado.
   7. Introduce el ID de sesión que representa el procedimiento de aislamiento actual.
   8. Introduce el ID del lote (por ejemplo, 1 Alta Pureza).
      NOTA: La plataforma ordena las fracciones alfanuméricamente según el ID del lote.
   9. Haz clic en Enviar lote para comenzar el análisis.
3. Revisar y finalizar los resultados del lote
   NOTA: Cierra la ventana de Resultados del lote anterior haciendo clic en el encabezado si es necesario (Figura 2L).
   1. Espera a que aparezcan los resultados numéricos y gráficos en la ventana de Resultados por lotes.
   2. Abre la ventana de Inspección haciendo doble clic en la vista previa de la imagen en la ventana de Resultados por lotes.
   3. Revisa y, si es necesario, corrige los contornos tal y como se describe en el Paso 1.
   4. Procede a la siguiente imagen usando la flecha hacia abajo si los contornos son aceptables.
   5. Añade otro lote o procede al resumen de la sesión usando los botones situados en la parte inferior de la ventana (Figura 2M).
4. Edición por lotes
   NOTA: La plataforma almacena nombres de archivos de imagen a lo largo de la sesión para evitar el uso repetido involuntario de la misma imagen. Esto incluye imágenes eliminadas. Renombra las imágenes antes de reutilizarlas si es necesario.
   1. Haz clic en Editar lote para añadir o eliminar imágenes, corregir las especificaciones de muestra o renombrar el lote (Figura 2L).
      NOTA: Registre los nombres de los archivos de imagen antes de modificar el lote si se prevé la reutilización de imágenes.
   2. Haz clic en Eliminar lote para eliminar el lote por completo (Figura 2L).
5. Visualización del resumen y generación de informes
   1. Haz clic en Mostrar resumen para mostrar la visión general de la sesión (Figura 2M).
      NOTA: Vuelve a lotes anteriores y edítalos si es necesario.
   2. Consulta el recuento total de islotes, volumen y volumen de pellets para la sesión junto con los valores medios correspondientes por lotes.
6. Descarga el informe.
   NOTA: El informe breve incluye el recuento total de islotes, volumen, pureza, valores de los pellets, histogramas y resúmenes de pureza-fracción. El informe completo incluye además información gráfica para cada imagen de muestra, con los valores aceptados en rojo y los valores excluidos en negro.

Resultados

Islotes de Rata Pura

En el primer experimento, se adquirieron 36 imágenes que representaban 12 muestras que contenían un total de 249 islotes purificados de rata durante cuatro sesiones independientes de imagen. Las imágenes se generaban utilizando un estereomicroscopio bajo tres condiciones de iluminación estandarizadas pero distintas, empleando fuentes de luz halógenas y de diodos emisores de luz (LED) junto con diferentes configuraciones de cámara. Las segmentaciones de precisión en el terreno (GT) se generaron manualmente para tres imágenes representativas por un experto en formación de IsletNet .

Cuando las imágenes se analizaron utilizando la versión pública de la herramienta Simple Comparison, ninguno de los contornos generados automáticamente pasó el control de calidad visual (vQC, Figura 5F). Posteriormente, la plataforma fue reentrenada utilizando imágenes locales representativas, y todos los contornos generados por la versión experimental reentrenada superaron vQC (Figura 5C).

La proporción de estimaciones de volumen de islotes automatizadas y manuales demostró un rendimiento consistente en las tres condiciones de imagen tras el reentrenamiento, con valores medianos de 1,03, 0,98 y 0,94 para las condiciones de iluminación A, B y C, respectivamente (Figura 5A). Estos resultados representaron una mejora sustancial en comparación con el modelo de entrenamiento original (Figura 5B).

La comparación píxel por píxel con segmentaciones GT demostró una estrecha concordancia entre los contornos automatizados y los generados manualmente tras el reentrenamiento (Figura 5D), correspondiente a la colocación precisa de los contornos en imágenes representativas (Figura 5C). En contraste, el modelo de entrenamiento original mostró una proporción aumentada de píxeles falsos negativos (Figura 5G) y desplazamiento incorrecto de contorno (Figura 5F), lo que resultó en un desplazamiento hacia categorías de islotes más pequeñas en los histogramas correspondientes de tamaño de islote (Figura 5E frente a 5H).

Figura 5. Evaluación del reentrenamiento de plataformas utilizando tres sistemas de imagen y preparaciones de islotes de ratas. (A) Comparación de estimaciones de IsletNet y equivalentes manuales de islotes (IEQ) tras reentrenamiento utilizando tres configuraciones de imagen. (B) Comparación de estimaciones de IEQ de IsletNet y manuales utilizando el modelo original de formación pública. (C, F) Colocación representativa de contornos usando la herramienta vQC después y antes de reentrenar el modelo, respectivamente. Las puntas de flecha blancas indican la colocación correcta de los contornos y las puntas magenta indican una colocación incorrecta de los contornos. (Re, Sol) Comparación píxel por píxel con la verdad terrenal tras el reentrenamiento y con el modelo de entrenamiento original, respectivamente. Las regiones de verdadero positivo, falso positivo, falso negativo y verdadero negativo están indicadas en la leyenda. (E, H) Histogramas representativos del tamaño de islotes tras el reentrenamiento y con el modelo de entrenamiento original, respectivamente, en comparación con el recuento manual. Configuración de imagen 1 = iluminación LED; Configuración de imagen 2 = iluminación halógena; configuración de imagen 3 = iluminación LED en campo oscuro. Barras de escala = 100 μm. Los diagramas de caja se muestran según la convención de Tukey; los bigotes se extienden a puntos de datos dentro de 1,5 × rango intercuartílic entre el primer y tercer cuartiles. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Preparaciones clínicas de islotes humanos

En el segundo experimento, se analizaron 17 imágenes que representaban un procedimiento de aislamiento de islote humano con tres pares de pureza-fracción utilizando la versión pública de la plataforma. Se perdió una muestra. Tras la vQC, todas las imágenes que representaban fracciones de pureza media y baja fueron excluidas debido a la detección espuria de islotes (datos no mostrados). Posteriormente, la plataforma fue reentrenada utilizando imágenes locales representativas.

Tras el reentrenamiento, todas las imágenes superaban la vQC tras la adición de tres líneas de separación manual. La comparación por lotes con el recuento manual demostró una subestimación global del ≤5% para el recuento total de islotes y estimaciones de volumen. Las muestras diluidas entre 2.000 y 4.000 veces contenían entre 80 y 4 islotes, dependiendo de la fracción de pureza. La contribución relativa de las fracciones individuales de pureza a la preparación final se muestra en la Figura 6A. La fracción de alta pureza 1VC2 contribuyó predominantemente con islotes más pequeños en comparación con la fracción de pureza media 2SC1. El histograma del tamaño total del islote generado automáticamente por la plataforma se muestra en la Figura 6B.

Figura 6. Cuantificación y análisis de muestras de aislamiento de islotes humanos. (A) Estimaciones del recuento de islotes y del volumen equivalente de islotes utilizando IsletNet y métodos manuales de conteo a lo largo de fracciones de pureza del injerto completo. (B) Histograma del tamaño final del islote generado por IsletNet usando valores medios por lotes. (C) Comparación de estimaciones de IsletNet y manuales para el recuento y volumen en 17 imágenes individuales. (D) Detalle representativo de la imagen de la muestra 3NC1 que muestra la imagen original y la colocación de contornos generada por IsletNet reentrenado. (E) Comparación píxel por píxel de la segmentación de IsletNet con la verdad sobre el terreno generada por el experto que cuenta manualmente frente al experto en formación de IsletNet (GT1 vs. GT2). Las regiones de verdadero positivo, falso positivo, falso negativo y verdadero negativo están indicadas en la leyenda. (F) Histograma representativo del tamaño de islote para la misma imagen comparando los resultados de IsletNet y manuales. Las puntas de flecha magenta indican un cambio de nivel y de categoría de islote. Barras de escala = 100 μm. Los diagramas de caja se muestran según la convención de Tukey; los bigotes se extienden a puntos de datos dentro de 1,5 × rango intercuartílic entre el primer y tercer cuartiles. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Posteriormente, se compararon estimaciones automáticas y manuales para todas las imágenes individuales (Figura 6C). Las proporciones medianas entre estimaciones automatizadas y manuales fueron de 1,00 para el recuento de islotes y 0,93 para el volumen de islotes, observándose varios valores atípicos. En una muestra representativa de baja pureza (3NC1), la plataforma identificó el mismo número de islotes que el conteo manual (cinco islotes), pero estimó un volumen de islotes un 29% menor. Estos datos se indican con puntas de flecha en la Figura 6C.

El islote más grande, parcialmente atrapado en tejido exocrino, de esta imagen representativa se muestra en la Figura 6D, incluyendo la imagen original y la capa de contorno generada automáticamente. La comparación píxel por píxel con segmentaciones GT generadas de forma independiente por dos expertos se muestra en la Figura 6E. Los histogramas correspondientes del tamaño de los islotes demostraron un cambio en la distribución de tamaño entre segmentaciones manuales y automatizadas (Figura 6F).

Rendimiento operativo del análisis automatizado

El rendimiento operativo de las herramientas de Simple Comparison y Clinical Islet Isolation se evaluó bajo condiciones estándar de internet, con velocidades medias de descarga y subida de 50 Mbps y 30 Mbps, respectivamente. Se analizaron cinco lotes de imágenes con 12 imágenes cada uno utilizando tamaños de imagen que iban desde archivos JPEG de 0,5 MB hasta archivos TIFF de 20 MB. Se midió la duración de descarga para los paquetes completos de resultados ZIP.

Los tiempos de visualización del análisis y la duración de la descarga aumentaron progresivamente con el tamaño de la imagen para ambas herramientas (Tabla 4). La herramienta de Aislamiento de Islotes Clínicos requería tiempos de procesamiento más largos que la herramienta de Comparación Simple para conjuntos de imágenes equivalentes. Estos resultados demuestran la relación práctica entre la resolución de imagen, el formato de archivo y el rendimiento de análisis durante la operación rutinaria.

Tabla 4: Tiempos de visualización del análisis y duraciones de descarga para las herramientas de Aislamiento Clínico de Islotes y Comparación Simple. Comparación de tiempos de procesamiento necesarios para la visualización de resultados y descarga de archivos utilizando lotes de imágenes de diferentes tamaños y formatos de archivo. Las mediciones se obtuvieron utilizando lotes que contenían 12 imágenes y se informan como tiempo transcurrido desde la presentación por lote hasta la visualización del resultado o la finalización de la descarga. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

El protocolo presentado aquí describe el flujo de trabajo práctico para usuarios potenciales y consolidados de IsletNet, con énfasis en dos características críticas de la plataforma: vQC experto y reentrenamiento de redes neuronales. Los resultados representativos demuestran que la cuantificación automatizada precisa depende no solo del rendimiento de segmentación de imagen, sino también de la capacidad del usuario para evaluar críticamente la colocación de contornos y la idoneidad de la imagen antes de aceptar los resultados. Se utilizaron dos herramientas avanzadas adicionales, Comparación Píxel a Píxel y Mis Segmentaciones, para generar resultados de validación seleccionados; sin embargo, estas herramientas están destinadas principalmente al soporte de entrenamiento de redes neuronales y, por tanto, no están incluidas en el flujo de trabajo del protocolo.

IsletNet fue desarrollado como una herramienta de referencia colaborativa y ampliamente accesible para el análisis estandarizado de imágenes de islotes en laboratorios. La red neuronal fue entrenada y validada mediante segmentaciones GT anotadas manualmente de imágenes microscópicas bidimensionales originales de islotes humanos y de rata^aislados 14,15,16. Se generaron dos modelos separados para preparaciones teñidas con ditizona y un modelo de investigación adicional para islotes de ratas sin teñir, con acceso disponible bajo solicitud. La versión de la plataforma y la fecha de entrenamiento se muestran en la interfaz de usuario. IsletNet segmenta automáticamente islotes y tejidos exocrinos y, posteriormente, calcula el número, volumen y pureza de islotes utilizando el tamaño de píxel definido por el usuario y el umbral mínimo de tamaño de islote. La elección del umbral de tamaño de islote depende de la calidad de imagen y del propósito del análisis (comparación lado a lado con el conteo manual frente al estudio de islotes pequeños) más que de la especie. Dada la resolución de la microscopía convencional, el tamaño mínimo significativo de los islotes es de 50 μm 7,8,9,12, pero puede reducirse hasta 10 μm para imágenes obtenidas con un instrumento ^{adecuado 10}. Las estimaciones del volumen de islotes se generan utilizando la tabla de conversión estándar basada en^{esferas 13}, así como tablas de conversión^{alternativas 7,18,19}, incluyendo las aproximaciones ajustadas de elipse ^5,6 y los modelos de Spinacle y Sphiracle^{basados en contornos 17}. Los valores resultantes se informan en equivalentes de islotes y nanolitros, mientras que la pureza se calcula a partir de la superficie o el volumen estimado del tejido. Un paso crítico en el protocolo es la adquisición de imágenes microscópicas estandarizadas adecuadas para la segmentación automatizada. IsletNet fue entrenado utilizando imágenes adquiridas con microscopios estereoscópicos e invertidos equipados con una gama de cámaras y sistemas de iluminación complementarios de óxido metálico. Los objetivos de baja ampliación (1–2×) son ventajosos porque permiten que la muestra completa permanezca dentro del campo de visión, manteniendo un tamaño de píxel compatible con la detección fiable de pequeños islotes. Una iluminación constante, un balance de blancos estable y la evitación de la sobreexposición de la imagen son esenciales para una generación fiable de contornos. Los resultados representativos demuestran que el reentrenamiento utilizando imágenes locales representativas puede mejorar sustancialmente el rendimiento de segmentación a través de condiciones de imagen heterogéneas. Como guía práctica, las imágenes son generalmente adecuadas para el entrenamiento en IsletNet cuando los límites de islotes y tejido exocrino son claramente distinguibles para un observador experimentado. Las imágenes que contienen islotes agrupados o muy solapados deben evitarse siempre que sea posible.

El protocolo también destaca varias limitaciones y consideraciones de resolución de problemas asociadas con el análisis automatizado de imágenes. Aunque IsletNet aumenta sustancialmente el rendimiento, la objetividad y la reproducibilidad en comparación con el recuento completamente manual, el método sigue siendo sensible a la calidad de imagen. Ocasionalmente puede ocurrir una colocación incorrecta de los contornos (detección espuria de islotes y falta de sepa ratear islotes adyacentes) que afectan a la cuantificación aguas abajo. Una vQC rutinaria sigue siendo esencial antes de aceptar resultados automatizados. La aplicación inmediata in situ a IsletNet es ventajosa porque las imágenes inadecuadas pueden recuperarse con parámetros de imagen ajustados. La corrección manual de curvas automáticas de nivel es posible dentro de la ventana de inspección, salvo para islotes ausentes o múltiples islotes espurios. Además, el algoritmo de separación automatizada se basa en la geometría de los contornos y las estadísticas de distribución del tamaño de los islotes, por lo que puede diferir de la interpretación inicial de un experto individual, pero seguir siendo analíticamente aceptable.

La fiabilidad de IsletNet se determina principalmente por la consistencia entre la calidad local de la imagen y el conjunto de datos de entrenamiento, más que por la especie única. Aunque el conjunto de entrenamiento actual contiene islotes humanos de diferentes purezas y islotes de rata de alta pureza, la plataforma puede extenderse a otras especies siempre que las características de la imagen se mantengan coherentes con los datos de entrenamiento. Por ejemplo, los islotes porcinos purificados por cultivo pueden parecerse a islotes humanos incrustados presentes en el conjunto de datos de entrenamiento. En cambio, los islotes cultivados extensamente con tinción débil de ditizona no estuvieron representados durante el entrenamiento y pueden requerir entrenamiento adicional. Por lo tanto, la herramienta Simple Comparison soporta un paso importante de validación para nuevos usuarios o nuevas configuraciones de imagen. Los resultados presentados aquí subrayan cómo las diferentes interpretaciones de expertos de islotes embebidos pueden influir en la generación de GT y la estimación de volumen aguas abajo. Para abordar la ausencia de un amplio consenso de expertos en futuros estudios multicéntricos, se desarrolló la aplicación^{IsletSwipe 20} para facilitar la anotación de imágenes basada en consenso.

En comparación con el recuento manual convencional bajo microscopio, IsletNet ofrece un rendimiento sustancialmente mayor, documentación digital permanente y resultados cuantitativos estandarizados, a la vez que reduce la variabilidad dependiente del operador. El recuento manual puede seguir proporcionando mayor confianza en la identificación de tejidos en casos límite, pero está limitado por una estimación subjetiva del tamaño, menor escalabilidad y extensos requisitos de formación del personal. Como servicio basado en la web, IsletNet permite la comparabilidad entre laboratorios mediante análisis centralizado pero anónimo. La velocidad de análisis sigue dependiendo del ancho de banda local de internet, el tamaño del archivo de imagen y la complejidad de la imagen. Los archivos TIFF más grandes pueden mejorar la fidelidad de la imagen, pero requieren tiempos de subida y descarga más largos en comparación con imágenes JPEG comprimidas.

En general, los resultados presentados aquí demuestran que se puede lograr una cuantificación automatizada fiable cuando la adquisición local de imágenes sigue siendo reproducible y coherente con el conjunto de entrenamiento. Se anima a los usuarios a incorporar la vQC en su rutina y a considerar el reentrenamiento siempre que se introduzcan cambios sustanciales en las condiciones locales de imagen.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
35 mm Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5481	No estéril
200 µL pipette tips, wide-bore	Sigma-Aldrich	AXYT205WBCRS	Para la distribución de la suspensión de islotes antes de la tinción
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Grado GC o grado de cultivo celular
Dithizone (DTZ)	Sigma-Aldrich	D5130	Polvo
Ethanol, 70%	Proveedor local	N/A	(v/v) en H2O; para la preparación de DTZ
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10270106	Inactivado por calor, calificado
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	Con o sin rojo fenol (especificar según el ensayo)
Human albumin	Grifols	61953-0001-2	Solución de alta concentración (200 g/L)
Infinity 1-3C	Lumenera	3-1URC	CMOS, 3 MP
Infinity Capture	Lumenera	N/A	Software estándar de adquisición de imágenes
Inverted microscope CKX41	Olympus	N/A	Objetivos 1.25x y 2x
LED-High-Power-Spots (2-arm)	Photonics	10068	Fuente de luz LED; guía de cuello de ganso dual
Light source Highlight 2000	Olympus	5-HL2000	Fuente de luz halógena (14.5 V, 90 W); control manual de intensidad; guía de cuello de ganso dual
Laboratory essentials	Varios	N/A	Pipetas, tubos, agujas, jeringas, temporizadores de laboratorio, EPI estándar
MicroCam software	Bresser	N/A	Software estándar de adquisición de imágenes
MikroCam 3.0M	Bresser	86000180	CMOS, cámara de 3.1 MP
Millex-MP filter unit	MilliporeSigma	SLMP025SS	Tamaño de poro de 0.22 µm, membrana de PES
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010023	pH 7.4
Promicam Pro 3-5 CP	Promicam	E61MPR937	CMOS, cámara de 5 MP de alto rango dinámico
QuickPHOTO	Promicra	N/A	Software estándar de adquisición de imágenes
Sodium hydroxide (1 M NaOH)	Proveedor local	N/A	Para el ajuste de pH y solubilización durante la preparación de DTZ
Stage micrometer	Thorlabs	R1L3S1P	10 mm de longitud; divisiones de 50 µm para calibración
Stereo microscope SZH10	Olympus	N/A	Objetivo apocromático 1x