Método colorimétrico Anthrone para cuantificar el glucógeno en hígado de rata y músculo esquelético

Resumen

Este protocolo describe un método colorimétrico anthro para cuantificar el glucógeno en el hígado y el músculo esquelético de rata a través de diferentes estados metabólicos.

Resumen

El glucógeno es una importante reserva intracelular de glucosa en el hígado y el músculo esquelético y desempeña un papel fundamental en el metabolismo de los carbohidratos. El glucógeno hepático es esencial para preservar la homeostasis glucémica sistémica, mientras que el glucógeno del músculo esquelético favorece la actividad física y el rendimiento del ejercicio. Por tanto, la cuantificación precisa del glucógeno tisular es fundamental para estudios en los que el metabolismo del glucógeno está regulado dinámicamente o alterado patológicamente. Aquí describimos un método colorimétrico anthro fiable y sensible para cuantificar el contenido de glucógeno en el hígado y el músculo esquelético de rata. El protocolo consta de pasos secuenciales, incluyendo digestión alcalina, desproteinización, precipitación de glucógeno, lavado con alcohol y revelado de color utilizando reactivo anthrone. La aplicabilidad de este método se demuestra en ratas sometidas a tres condiciones fisiológicamente relevantes: alimentación ad libitum , ayuno nocturno y realimentación a corto plazo. Estos paradigmas experimentales capturan estados metabólicos clave asociados al almacenamiento, agotamiento y resíntesis de glucógeno. El análisis de blot occidental ortogonal de enzimas clave, glucógeno sintasa y glucógeno fosforilasa, proporciona apoyo mecanicista a los cambios metabólicos observados. La aplicabilidad de este método se demuestra aún más en animales tratados con epinefrina para modelar la descomposición aguda del glucógeno inducida por estrés. En conjunto, este método proporciona un amplio rango dinámico y una sensibilidad suficiente para cuantificar el glucógeno tisular a través de estados fisiológicos marcadamente diferentes. Ofrece una herramienta fiable para investigar el metabolismo del glucógeno in vivo y también puede aplicarse a modelos de cultivo celular in vitro.

Introducción

El glucógeno es un polisacárido altamente ramificado que actúa como un importante reservorio energético en el músculo esquelético y el hígado de los mamíferos, y en menor medida en otros órganos como el cerebro, el riñón, el corazón y el tejido^{adiposo 1}. Durante la alimentación, el excedente de glucosa se polimeriza o se vuelve lipogénesis de novo, y se almacena en forma de glucógeno o lípidos. Sin embargo, durante el ayuno o el esfuerzo físico, el glucógeno sufre una degradación enzimática, asegurando un suministro constante y rápido de glucosa para satisfacer las necesidades energéticas. Esta capacidad de amortiguación del glucógeno es esencial para mantener la homeostasis glucémica durante los ciclos fisiológicos de ayuno y realimentación².

La síntesis de glucógeno es catalizada por la glucógeno sintasa (GYS), que existe en dos isoformas mamíferas: GYS1 y GYS2. GYS1 se expresa predominantemente en el músculo esquelético, mientras que GYS2 es la isoforma hepática. La actividad catalítica de GYS se suprime mediante fosforilación en múltiples sitios, incluido Ser641, bajo condiciones de ayuno, mientras que su actividad se estimula al desfosforilar bajo condiciones de alimentación. La descomposición del glucógeno es catalizada por la glucógeno fosforilasa. La isoforma hepática es PYGL, y la isoforma muscular es PYGM. A diferencia de GYS, su actividad catalítica se estimula al fosforilar en Ser15 durante el ayuno y se suprime tras la desfosforilación tras^{alimentarse 3}.

La correcta regulación del metabolismo del glucógeno es fundamental para numerosos procesos biológicos, y se ha identificado un metabolismo del glucógeno desregulado como un factor causal en muchas enfermedades. Específicamente, el alterado metabolismo hepático del glucógeno está asociado con diversos trastornos metabólicos, incluyendo las enfermedades de almacenamiento de^{glucógeno 4}, diabetes^{tipo 2 5}, enfermedad hepática esteatótica asociada a disfunción metabólica ^6,7 y respuesta contrregulatora alterada a la hipoglucemia⁸. Además, el glucógeno cerebral es esencial para la formación de memoria^{a largo plazo 9}, mientras que el glucógeno del músculo esquelético es un regulador clave de la capacidad de resistencia¹⁰. Por ello, la cuantificación precisa del glucógeno tisular es fundamental para estudios en los que el metabolismo del glucógeno está regulado dinámicamente o alterado patológicamente, lo que permite investigar los mecanismos de la enfermedad y evaluar intervenciones moduladoras del glucógeno.

Se han reportado varios métodos de cuantificación de glucógeno, incluyendo el método de^{Anthrone 11,12}, el método de amiglucosidasa¹³, el método de ácido fenolsulfúrico¹⁴ y el método no invasivo de espectroscopía de resonancia magnética nuclear (^{MRS) 15}, cada método con ciertas ventajas y limitaciones. Aquí describimos un protocolo detallado para el método colorimétrico anthrone para cuantificar el glucógeno en el hígado y el músculo esquelético de rata (Figura 1). Este protocolo incluye pasos secuenciales de digestión alcalina, desproteinización, precipitación de glucógeno, lavado de alcohol y revelado de color utilizando reactivo anthrone. Este método es sencillo, económico y requiere una instrumentación especializada mínima. Para demostrar su sensibilidad y reproducibilidad, calculamos el límite de detección (LOD), el límite de cuantificación (LOQ), así como el coeficiente de variación intra-ensayo e inter-ensayo (CV%), utilizando una serie de estándares de glucógeno. Para demostrar su aplicabilidad, se evaluaron los niveles de glucógeno en el hígado y el músculo esquelético bajo tres condiciones fisiológicamente relevantes: alimentación ad libitum, ayuno nocturno de 16 horas y realimentación a corto plazo. Además, el método se demostró utilizando animales tratados con epinefrina para modelar la descomposición del glucógeno inducida por estrés agudo. Se realizó un análisis de western blot ortogonal de enzimas clave implicadas en el metabolismo del glucógeno para corroborar los cambios metabólicos observados.

Figura 1: Visión general del flujo de trabajo de cuantificación del glucógeno. Representación esquemática del flujo de trabajo experimental para la cuantificación del glucógeno en el hígado y el músculo esquelético. El procedimiento incluye recogida de tejidos, digestión alcalina, precipitación de proteínas, aislamiento de glucógeno y detección colorimétrica basada en anthrone. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Protocolo

Todos los protocolos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC; #1905019) de la Universidad Médica de Nankín.

1. Preparación de reactivos

1. Consulte la Tabla de Materiales para todos los reactivos utilizados en este estudio.
2. Prepara todas las soluciones antes de que comiencen los experimentos.
3. Escala los volúmenes de la solución según sea necesario.
4. Prepara 1 solución de hidróxido de sodio (NaOH)
   1. Peso 40 g de pellets de NaOH.
   2. Añade los pellets de NaOH a 800 mL de agua destilada.
   3. Remover la solución con una varilla de vidrio hasta que no queden partículas sin disuelver en la base del recipiente.
   4. Transfiere la solución a un matraz volumétrico de 1 L.
   5. Lleva el volumen exactamente a 1 L con agua destilada.
   6. Guarda la solución en una botella bien cerrada a temperatura ambiente (RT; 18°C–23°C).
      PRECAUCIÓN: NaOH es corrosivo. Lleva gafas de seguridad, guantes y bata de laboratorio. Los pellets comerciales de NaOH no son 100% puros y absorben agua. Evita la exposición prolongada de pellets al aire.
5. Prepara una solución de stock de cloruro de litio (LiCl) al 20%
   1. Pesa 20 g de polvo LiCl anhidro.
   2. Añade el polvo de LiCl a 80 mL de agua destilada.
   3. Remueve la solución hasta que no queden partículas sin disuelver en la base del recipiente.
   4. Transfiere la solución a un matraz volumétrico de 100 mL.
   5. Lleva el volumen exactamente a 100 mL con agua destilada.
   6. Guarda la solución en un frasco bien cerrado en RT.
      NOTA: LiCl puede irritar la piel, los ojos y las vías respiratorias. Lleva gafas de seguridad, guantes y bata de laboratorio. El LiCl es altamente higroscópico. Minimiza la exposición al aire para evitar la absorción de agua.
6. Preparar la solución de reacción anthrone
   1. Coloca 28 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1 L.
   2. Añade 72 mL de ácido sulfúrico concentrado de alta pureza (98%) (H₂SO₄) al agua.
   3. Deja que la mezcla se enfríe hasta que se enfríe a la RT.
   4. Añade 50 mg de anthrone a la solución.
   5. Remueve hasta que el trono se disuelva.
   6. Añade 3 g de tiourea a la solución.
   7. Remueve hasta que la tiourea se disuelva.
   8. Transfiere la solución a una botella de vidrio envuelta en ámbar o papel de aluminio.
   9. Guarda la solución en un frigorífico (2°C–8°C) durante un máximo de una semana.
      PRECAUCIÓN: El ácido sulfúrico es altamente corrosivo, causa quemaduras químicas graves y reacciona violentamente con el agua. Lleva bata de laboratorio, guantes resistentes a productos químicos y pantalla facial. Realiza todos los pasos en una campana extractora certificada para químicos. La dilución genera un calor intenso. Siempre añade ácido al agua.
7. Prepara etanol al 95% que contenga 0,1% de LiCl
   1. Añade 95 mL de etanol absoluto a una botella de cristal.
   2. Añade 4,5 mL de agua destilada.
   3. Añade 0,5 mL de solución de stock LiCl al 20%.
   4. Mezcla bien.
8. Preparar metanol al 80% que contenga 0,1% de LiCl
   1. Añade 80 mL de metanol absoluto a una botella de cristal.
   2. Añade 19,5 mL de agua destilada.
   3. Añade 0,5 mL de solución de stock LiCl al 20%.
   4. Mezcla bien.
9. Prepara una solución de ácido tricloroacético (TCA) al 100% (v/p)
   1. Peso 100 g de polvo TCA.
   2. Añade el polvo de TCA a 80 mL de agua destilada.
   3. Remueve hasta que se disuelva.
   4. Transfiere la solución a un matraz volumétrico de 100 mL.
   5. Lleva el volumen exactamente a 100 mL con agua destilada.
   6. Guarda la solución en una botella de cristal bien cerrada en RT.
10. Prepara una solución saturada de ácido benzoico
    1. Añade 0,5 g de cristales de ácido benzoico a 100 mL de agua destilada en un vaso de cristal de 250 mL.
    2. Calienta la mezcla a 90°C en una placa caliente con agitación magnética continua.
    3. Sigue calentando hasta que no queden partículas sin disuelver en la base del recipiente.
    4. Deja que la solución se enfríe a RT.
    5. Aspira el sobrenadante transparente que esté libre de partículas visibles.
    6. Guarda la solución en un frasco de cristal bien sellado en RT.
11. Prepara estándares de glucosa
    1. Disuelva 50 mg de glucosa en polvo en una solución saturada de ácido benzoico de 50 mL para preparar una solución de 1 mg/mL de fondo.
    2. Preparar estándares de glucosa (0, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 y 1 mg/mL) en tubos microcentrífugas de 1,5 mL mediante dilución en serie con ácido benzoico saturado de la siguiente manera.
       1. Añadir 500 μL de solución de 1 mg/mL de stock al tubo 1 para preparar el estándar de 1 mg/mL.
       2. Añadir 250 μL de solución de stock y 250 μL de ácido benzoico saturado al Tubo 2 para preparar el estándar de 0,5 mg/mL.
       3. Añadir 200 μL de solución del tubo 2 y 300 μL de ácido benzoico saturado al tubo 3 para preparar el estándar de 0,2 mg/mL.
       4. Añadir 250 μL de solución del Tubo 3 y 250 μL de ácido benzoico saturado al Tubo 4 para preparar el estándar de 0,1 mg/mL.
       5. Añadir 250 μL de solución del Tubo 4 y 250 μL de ácido benzoico saturado al Tubo 5 para preparar el estándar de 0,05 mg/mL.
       6. Añadir 200 μL de solución del Tubo 5 y 300 μL de ácido benzoico saturado al Tubo 6 para preparar el estándar de 0,02 mg/mL.
       7. Añadir 250 μL de solución de Tubo 6 y 250 μL de ácido benzoico saturado al Tubo 7 para preparar el estándar de 0,01 mg/mL.
       8. Añadir 500 μL de ácido benzoico saturado a un tubo separado para preparar el cigarro (0 mg/mL).
    3. Tapa cada tubo y haz el vórtice brevemente durante 10 segundos para mezclar bien.

2. Tratamiento animal

1. Manejo general
   1. Ratas macho Sprague–Dawley domésticas (230–270 g) en una instalación animal bajo condiciones específicas libres de patógenos (estado sanitario VAF/Plus, Charles River Laboratories), certificadas libres de patógenos comunes de roedores, incluyendo el virus Sendai, Mycoplasma pulmonis y parvovirus de rata.
   2. Proporciona una dieta estándar para comer y permite el acceso libre al agua.
   3. Mantén a los animales en un ciclo de 12 horas luz/oscuridad (luces encendidas a las 08:00 h y luces apagadas a las 20:00).
   4. Mantener la RT entre 22°C y 23°C.
   5. Mantén la humedad relativa entre el 30% y el 70%.
2. Ayuno nocturno
   1. Traslada ratas a jaulas de vivienda normales.
   2. Quita la comida y proporciona acceso libre al agua.
   3. Mantener el ayuno durante 16 horas desde las 16:30 hasta las 08:30 de la mañana siguiente.
3. Realimentación
   1. Proporciona comida para comida regular (200 g) a ratas que ayunan durante la noche.
   2. Permite que los animales se alimenten a voluntad durante 2 horas.
4. Desafío de la epinefrina
   1. Prepara una solución de clorhidrato de epinefrina.
      1. Pesa 5 mg de polvo de clorhidrato de epinefrina usando una balanza analítica calibrada.
      2. Transfiere el polvo a un tubo centrífugo de 15 mL y añade 10 mL de suero salino.
      3. Tapa el tubo e invierte 10 veces para preparar una solución de fondo de 0,5 mg/mL.
   2. Inyectar intraperitonealmente a ratas no en ayunas con solución de cloruro de epinefrina a un volumen de 1 mL/kg de peso corporal (0,5 mg/kg de peso corporal)³.
      1. Sujeta al animal con la cabeza hacia abajo para permitir que el contenido abdominal se desplace cranealmente.
      2. Inserta una aguja calibre 25 en el cuadrante inferior derecho del abdomen en un ángulo de 45°.
      3. Aspira para confirmar la ausencia de sangre o contenido entérico antes de la inyección.
   3. Inyectar a los animales de control intraperitonealmente con solución salina a un volumen de 1 mL/kg.
   4. Recoge muestras de sangre de las venas caudales.
      1. Sujeta la rata para exponer la cola.
      2. Comprime y calienta la cola durante 10 segundos para facilitar el flujo sanguíneo.
      3. Pincha la vena lateral de la cola a 3 cm de la punta con una aguja estéril calibre 25.
      4. Descarta la primera gota de sangre usando gasas limpias para evitar la contaminación del líquido tisular.
      5. Recoge la segunda gota de sangre para medir la glucosa.
   5. Mide la glucosa en sangre usando un glucómetro cada 15 minutos durante 60 minutos.
      1. Calibra el glucómetro según las instrucciones del fabricante.
      2. Verifica la precisión del glucómetro mensualmente utilizando soluciones de control.
      3. Guarda las tiras reactivas en su recipiente original para evitar la exposición a la humedad.
      4. Utiliza tiras reactivas inmediatamente después de sacarlas del recipiente.
      5. Inserta una tira reactiva en el glucómetro para activar el medidor automáticamente.
      6. Deja que la muestra de sangre entre en la tira por acción capilar.
      7. Registra el valor de glucosa en sangre que se mostra.

3. Extracción de tejidos

1. Eutanasia y preparación
   1. Eutanasiar animales mediante sobredosis de isoflurano. Coloca a los animales en una cámara de inducción y expónlos al 5% de isoflurano administrado en 100% de oxígeno a 2 L/min durante al menos 3 minutos.
   2. Verifica la muerte confirmando el cese de la respiración.
   3. Confirma pérdida de reflejo corneal y de pellizco en el dedo del pie.
      1. Toca suavemente la córnea usando un aplicador estéril con punta de algodón para confirmar la ausencia de una respuesta de parpadeo.
      2. Aplica un apretón firme en la membrana entre los dedos de la pata trasera usando pinzas romas para confirmar la ausencia de respuesta motora.
   4. Coloca el lado ventral de la rata hacia arriba sobre una bandeja de disección.
   5. Moja la piel abdominal con etanol al 75% usando un pulverizador.
      NOTA: Minimizar el tiempo entre la eutanasia y la preservación de los tejidos para reducir la degradación del glucógeno causada por la isquemia post mortem.
2. Disección hepática
   1. Haz una pequeña incisión en la piel de aproximadamente 1 cm caudal respecto al proceso xifoide.
   2. Extiende la incisión hacia el esternón.
   3. Separa la piel del músculo subyacente.
   4. Realizar una laparotomía transversal bilateral realizando una incisión horizontal de 4 cm aproximadamente 1 cm caudal al proceso xifoides y extendiéndose lateralmente hacia los márgenes subcostales izquierdo y derecho para exponer completamente la cavidad abdominal.
   5. Identifica el hígado.
   6. Extirpe el lóbulo medio derecho (Figura 2A).
   7. Pesa el tejido en 1 minuto.
   8. Coloca el pañuelo en un recipiente de plástico de polipropileno.
   9. Congela el tejido en hielo seco.
3. Disección del músculo esquelético
   1. Utiliza el músculo gastrocnemio como muestra representativa porque contiene una población mixta de fibras de contracción rápida y lenta que reflejan las características metabólicas y contráctiles de la extremidad^{posterior 16}.
   2. Coloca a la rata boca abajo.
   3. Realizar una incisión longitudinal cutánea a lo largo de la parte posterior de la extremidad posterior, desde la fosa poplítea hasta la tuberosidad calcánea.
   4. Separa la piel.
   5. Identificar y reflejar los músculos bíceps femoral y semitendinoso.
      1. Identifica el bíceps femoral como el músculo grande y lateralmente situado que cubre la mitad superior del muslo posterior.
      2. Identifica el semitendino como el músculo estrecho en forma de correa que recorre medialmente la parte posterior del muslo e inserta cerca de la rodilla.
   6. Expone el músculo gastrocnemio.
   7. Transectar el tendón de Aquiles en su inserción distal en el calcáneo usando tijeras quirúrgicas finas.
   8. Separa el músculo sóleo.
   9. Liberar la unión proximal del músculo gastrocnemio en los epicóndilos medial y lateral del fémur.
   10. Extirpa todo el músculo gastrocnemio (Figura 2B).
   11. Pesa el tejido en 1 minuto.
   12. Coloca el pañuelo en un recipiente de plástico de polipropileno.
   13. Congela el tejido en hielo seco.

Figura 2: Procedimientos de disección de tejidos para el hígado y el músculo esquelético. (A) Pasos secuenciales para exponer la cavidad abdominal y extraer tejido hepático, incluyendo incisión cutánea, extensión de incisión, separación de la piel del músculo subyacente y laparotomía transversal. (B) Pasos secuenciales para aislar el músculo gastrocnemio, incluyendo incisión longitudinal, reflexión de los músculos superyacentes, identificación de estructuras anatómicas y escisión del músculo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Ensayo colorimétrico de glucógeno

1. Día 1: Digestión alcalina
   1. Añade 0,4 g de tejido a un tubo centrífuga de 50 mL. Se permite una tolerancia de ± 0,1 g para asegurar un procesamiento rápido y minimizar la degradación del tejido.
   2. Añade 10 mL de solución de NaOH de 1 M al tubo.
   3. Pica el tejido con cuchillas estériles o tijeras hasta que los fragmentos de tejido midan aproximadamente 1–2 mm de tamaño.
   4. Coloca el tubo en un baño maria a 95°C ± 5°C.
   5. Incuba durante 30 minutos.
   6. Haz un vórtice de la muestra a 2.500 rpm durante 10 segundos cada 10 minutos durante la incubación.
   7. Quita el tubo del baño marea.
   8. Deja que la muestra se enfríe a RT.
2. Preparación del lisato para ensayo proteico
   1. Transfiere 1 mL de lisato alcalino a un tubo de microcentrífuga usando un pipetador calibrado P1000.
   2. Centrifugar a 8.000 × g durante 10 minutos.
   3. Recoge el sobrenadante.
   4. Reserva el sobrenadante para el ensayo de proteínas BCA.
3. Desproteinización mediada por TCA
   1. Transfiere 3 mL de lisato alcalino a un tubo centrífuga de 15 mL.
   2. Añade 1 mL de solución TCA al 100% (v/v).
   3. Añade 6 mL de agua destilada para llevar el volumen total a 10 mL.
   4. Haz un vórtice de la mezcla a 2.500 rpm durante 10 segundos.
   5. Coloque el tubo sobre hielo (0°C–4°C).
   6. Incuba durante 1 hora para precipitar proteínas.
4. Colección de sobrenadantes desproteinizados
   1. Transfiere 1 mL de la mezcla a un tubo microcentrífuga.
   2. Centrifugar a 8.000 × g durante 10 minutos en RT.
   3. Reserva el sobrenadante.
5. Precipitación de glucógeno
   1. Transfiere 0,4 mL del sobrenadante a un nuevo tubo microcentrífuga.
   2. Añade 0,8 mL de etanol al 95% que contiene 0,1% de LiCl.
   3. Haz un vórtice de la mezcla a fondo.
   4. Incubar en RT durante 16 horas.
6. Día 2: Pelleteo de glucógeno
   1. Centrifugar la muestra a 1.000 × g durante 15 minutos en RT para obtener un pellet blanco firme y semitranslúcido de glucógeno (Figura 3A y Figura 3B).
   2. Descarta el sobrenadante.
7. Primer lavado de glucógeno
   1. Añade 1,5 mL de metanol al 80% que contiene 0,1% de LiCl al pellet.
   2. Haz un vórtice de la muestra a 2.500 rpm durante 10 segundos.
8. Centrifugación tras el lavado
   1. Centrifugar a 1.000 × g durante 5 minutos en RT.
   2. Descarta el sobrenadante.
9. Segundo lavado con glucógeno
   1. Repite el paso de lavado una vez.
   2. Elimina cualquier líquido residual aspirando cuidadosamente con una pipeta P200 con punta fina para asegurar que la pellet de glucógeno permanezca intacta.
10. Disolución de glucógeno
    1. Añade 0,8 mL de agua destilada al pellet.
    2. Vórtice a 2.500 rpm hasta lograr una solución clara y homogénea sin partículas visibles.
11. Preparación de estándares y muestras
    1. Preparar tubos microcentrífugas de 1,5 mL para estándares de glucosa, muestras en blanco y muestras desconocidas en triplicado.
       NOTA: Añade reactivos a cada tubo según la Tabla 1.
    2. Añade 50 μL de cada estándar de glucosa a los tubos designados.
    3. Añade 50 μL de agua destilada al tubo en blanco.
    4. Añade una muestra de glucógeno de 50 μL a cada tubo de muestra desconocido.
    5. Añade 200 μL de solución de reacción anthrone a cada tubo.
12. Revelado del color Anthrone y medición de absorbancia
    1. Prueba todos los tubos con el vórtice a fondo.
    2. Coloca los tubos en un baño maria a 95°C ± 5°C.
    3. Incuba durante 15 minutos.
    4. Quita los tubos y deja que se enfríen hasta que se enfríen para hacer RT.
    5. Transfiere 200 μL de cada tubo a una placa de 96 pozos.
    6. Mide la absorbancia a 620 nm usando un lector de microplacas (modo final, 25°C) con corrección automática de longitud de camino hasta 1 cm.
    7. La curva estándar debe tener un coeficiente de determinación (R²) de ≥0,995, determinado por regresión lineal, para considerarse aceptable.
    8. Cualquier estándar o muestra individual replicada con un CV% de >20% entre mediciones triplicadas debe considerarse poco fiable y repetirse.

Figura 3: Aislamiento y cuantificación del glucógeno bajo diferentes estados nutricionales. (A) Imagen representativa de pellets de glucógeno precipitados a partir de muestras de hígado en condiciones de alimentación, ayuno y refed. (B) Imagen representativa de pellets de glucógeno precipitado a partir de muestras de músculo esquelético bajo condiciones de alimentación, ayunas y refed. (C) Curva estándar generada a partir de estándares de glucosa que muestra la relación lineal entre la absorbancia a 620 nm y la concentración de glucosa. (D) Niveles de glucosa en sangre bajo condiciones alimentadas, en ayunas y con refrigeración. (E) Contenido hepático de glucógeno en condiciones alimentadas, en ayunas y refed. (F) Contenido de glucógeno muscular esquelético bajo condiciones de alimentación, ayunas y refed. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 6 por grupo). El análisis estadístico se realizó mediante análisis ordinario unidireccional de la varianza (ANOVA) con múltiples comparaciones corregidas mediante el método de Benjamini–Hochberg. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, ns: no significativo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Reactivos	0 mg/mL	0,01 mg/mL	0,02 mg/mL	0,05 mg/mL	0,1 mg/mL	0,2 mg/mL	0,5 mg/mL	1 mg/mL	Blank	Muestra desconocida
Solución estándar de glucosa	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	–	–
Agua destilada (H₂O)	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL	–
Muestra de glucógeno	–	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL
Solución de reacción de Anthrone	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL

Tabla 1: Configuración de la reacción para el ensayo colorimétrico de glucógeno. Configuración de reacción para estándares de glucosa, muestras de glucógeno en blanco y desconocidas utilizadas en el ensayo colorimétrico de Anthrone. Volúmenes definidos de estándares de glucosa, agua destilada o muestras de glucógeno se combinaron con la solución de reacción anthrone antes de la incubación y la medición de la absorbancia.

5. Cálculo del contenido de glucógeno tisular

NOTA: Normalizar el glucógeno medido en peso húmedo del tejido o en masa total de proteínas.

1. Determinación estándar de curva y concentración
   1. Utiliza lecturas de absorbancia de los ocho tubos estándar de glucosa.
   2. Resta valores en blanco de las lecturas de absorbancia antes de graficarlos frente a las concentraciones de glucosa.
   3. Ajusta una curva de regresión lineal usando la regresión ordinaria de mínimos cuadrados en Excel (Figura 3C).
   4. Calcula la concentración de glucosa en cada muestra de glucógeno desconocida (C_desconocida) interpolando su absorbancia restada en blanco sobre la curva estándar lineal usando la ecuación de regresión obtenida en el Paso 5.1.3.
2. Normalización al peso húmedo del tejido
   1. Calcula el contenido de glucógeno usando la siguiente ecuación:
      
   2. Defina C_desconocida como la concentración de glucosa (mg/mL) en la muestra de glucógeno desconocida determinada en el Paso 5.1.4.
   3. Define 0,8 como el volumen de la muestra disuelta de glucógeno (mL) en el paso 4.10.1.
   4. Defina 0,9 como el factor utilizado para convertir el valor de glucosa en valor de glucógeno.
   5. Defina 2,5 como el factor de dilución introducido durante la precipitación de glucógeno en el Paso 4,5.
   6. Defina 10 como el factor de dilución que contabiliza la aliteracia de 1 mL analizada a partir de la mezcla total de 10 mL preparada en el Paso 4.3.3.
   7. Defina 10/3 como el factor de dilución que contabiliza los 3 mL de aalícuota utilizados de los 10 mL totales de digestión alcalina preparados en el Paso 4.1.2.
3. Normalización a masa total de proteínas
   1. Calcula el contenido de glucógeno usando la siguiente ecuación:
      
   2. Defina C_desconocida como la concentración de glucosa (mg/mL) en la muestra de glucógeno desconocida determinada en el Paso 5.1.4.
   3. Define 0,8 como el volumen de la muestra disuelta de glucógeno (mL) en el paso 4.10.1.
   4. Defina 0,9 como el factor utilizado para convertir el valor de glucosa en valor de glucógeno.
   5. Defina 2,5 como el factor de dilución introducido durante la precipitación de glucógeno en el Paso 4,5.
   6. Defina 10 como el factor de dilución que contabiliza la aliteracia de 1 mL analizada a partir de la mezcla total de 10 mL preparada en el Paso 4.3.3.
   7. Defina 1/3 como el factor de corrección que tiene en cuenta los 3 mL de alicota usados del digesto alcalino en el Paso 4.3.1.
   8. Defina la concentración de proteínas como la concentración de proteína total (mg/mL) en la digestión alcalina determinada mediante el ensayo BCA en el Paso 4.2.4.

6. Western Blot de enzimas clave que cataliza el metabolismo del glucógeno

1. Consideraciones generales
   1. Consulte los protocolos previamente descritos para los procedimientos estándar de western^{blot 17,18}.
2. Extracción de proteínas
   1. Peso 75 mg de tejido congelado de golpe. Se permite una tolerancia de ± 25 mg para asegurar un procesamiento rápido y minimizar el descongelamiento de los tejidos.
   2. Añadir 1 mL de tampón de lisis RIPA helado (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 1% Triton X-100; 0,5% desoxicolato de sodio; 0,1% SDS; y 1 mM EDTA) suplementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa.
   3. Homogeneiza el tejido usando un homogeneizador rotor-estator portátil.
3. Preparación del lisado
   1. Incuba homogeneados sobre hielo durante 30 minutos.
   2. Haz un vórtice de las muestras a 2.500 rpm durante 10 segundos cada 10 minutos durante la incubación.
   3. Centrifugar a 10.000 × g usando un rotor de ángulo fijo durante 5 minutos a 4°C.
4. Cuantificación de proteínas
   1. Recoge el sobrenadante como lisato total de proteínas.
   2. Realizar un ensayo de BCA para determinar la concentración de proteínas.
   3. Preparar los estándares de BSA de 0, 0,025, 0,125, 0,25, 0,5, 0,75 y 1 mg/mL diluidos en buffer de lisis RIPA.
   4. En una microplaca de 96 pozos, carga 20 μL de cada muestra estándar o desconocida en pozos individuales.
   5. Añade 200 μL de reactivo de trabajo BCA (preparado mezclando 50 partes de reactivo A con 1 parte de reactivo B) a cada pozo.
   6. Incuba la placa de reacción a 37°C durante 30 minutos.
   7. Tras enfriar a RT (18°C–23°C), mide la absorbancia a 562 nm usando un lector de microplacas (modo terminal, 25°C) con corrección automática de la longitud de trayectoria a 1 cm.
5. SDS-PAGE
   1. Mezcla 15 μg de proteína con el buffer de carga SDS-PAGE.
   2. Calienta las muestras a 95°C durante 5 minutos.
   3. Enfría las muestras sobre hielo.
   4. Carga las muestras sobre un gel SDS-PAGE al 10%.
   5. Resuelve proteínas mediante electroforesis en un tampón de funcionamiento (25 mM Tris, 192 mM glicina y 0,1% SDS).
   6. Haz correr el gel a 100 V constantes hasta que el frente del tinte azul de bromofenol llegue al fondo del gel.
6. Transferencia y bloqueo de proteínas
   1. Transfiere proteínas a una membrana de nitrocelulosa o PVDF.
   2. Para las membranas de nitrocelulosa, equilibrar la membrana en tampón de transferencia (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanol, pH 8,3) durante 10 minutos.
   3. Para las membranas PVDF, actívala por inmersión en metanol al 100% durante 30 segundos, y luego equilibra en el tampón de transferencia durante 10 minutos.
   4. Monta el sándwich de transferencia en el siguiente orden: esponja, papel filtro, gel, membrana, papel filtro, esponja.
   5. Realiza la transferencia de proteínas a una corriente constante de 200 mA durante 90 minutos a 4°C.
   6. Preparar 3% (p/v) de BSA en TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; y 0,1% Tween-20).
   7. Bloquea la membrana en RT durante 1 hora con mecimientos constantes.
      NOTA: Utiliza BSA en lugar de leche desnatada al detectar proteínas fosforiladas.
7. Incubación primaria de anticuerpos
   1. Preparar la solución primaria de anticuerpos en un tampón bloqueador con una dilución de 1:1.000.
   2. Incuba la membrana con anticuerpo primario a 4°C durante la noche con mecimientos constantes.
8. Lavado
   1. Lava la membrana con TBST.
   2. Repite el lavado tres veces durante 10 minutos cada una.
9. Incubación secundaria de anticuerpos
   1. Preparar anticuerpos secundarios conjugados con HRP en un tampón bloqueador con una dilución de 1:10.000.
   2. Incuba la membrana en RT durante 1 hora con mecerío constante.
10. Lavado
    1. Lava la membrana con TBST.
    2. Repite el lavado tres veces durante 10 minutos cada una.
11. Detección quimioluminiscente
    1. Prepara el sustrato quimioluminiscente mezclando volúmenes iguales de soluciones de luminol/potenciador y peróxido estable.
    2. Aplicar el sustrato a un volumen de 0,1 mL/cm de superficie^{de membrana 2} e incubar durante 2 minutos en RT sobre un agitador orbital (100 rpm).
    3. Captura señales usando un generador quimioluminiscente.
    4. Pruebas tiempos de exposición que van de 10 a 300 s y selecciona una exposición dentro del rango de detección lineal para cada mancha.
    5. Verifica la linealidad de la señal confirmando la ausencia de saturación de píxeles usando el software integrado del instrumento.
12. Análisis de imágenes
    1. Analizar la intensidad de bandas usando el software ImageJ (versión 1.51, NIH).
    2. Convierte las imágenes a escala de grises de 8 bits y aplica la resta de fondo con bola rodante con un radio de 50 píxeles.
    3. Define cada banda usando una región rectangular de interés de dimensiones idénticas y resta el fondo local de un área en blanco adyacente para obtener valores integrados de densidad en bruto.
13. Tinción total de proteínas
    1. Incubar la membrana en solución de tinta India al 0,1% en TBST a RT durante 1 hora con mecimiento constante.
    2. Lava la membrana tres veces durante 10 minutos cada una con TBST.
    3. Cuantifiquen múltiples bandas teñidas como controles de carga para normalizar las señales de inmunobloting.
       NOTA: Utilizar tinción total de proteínas en lugar de genes de mantenimiento (HKG), ya que la expresión de HKG puede variar bajo diferentes condiciones^{experimentales 19}.

7. Sensibilidad y reproducibilidad del método

1. Preparación de estándares de glucógeno
   1. Prepara una solución de 20 mg/mL de glucógeno en 1 M NaOH.
   2. Preparar una serie de estándares de glucógeno (0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 y 1 mg/mL) en tubos centrifugadores de 15 mL mediante dilución escalonada con 1 M de NaOH, como se describe a continuación.
      1. Prepara el Tubo 1 (1 mg/mL) mezclando una solución de glucógeno de 500 μL con 9,5 mL de 1 M NaOH.
      2. Prepara el Tubo 2 (0,5 mg/mL) mezclando una solución de glucógeno de 250 μL con 9,75 mL de 1 M de NaOH.
      3. Prepara el Tubo 3 (0,2 mg/mL) mezclando 100 μL de solución de glucógeno con 9,9 mL de 1 M NaOH.
      4. Prepara el Tubo 4 (0,1 mg/mL) mezclando 50 μL de solución de glucógeno con 9,95 mL de 1 M NaOH.
      5. Prepara el tubo 5 (0,05 mg/mL) mezclando una solución de glucógeno de 25 μL con 9,975 mL de 1 M de NaOH.
      6. Prepara el tubo 6 (0,02 mg/mL) mezclando una solución de glucógeno de 10 μL con 9,99 mL de 1 M NaOH.
      7. Preparar el tubo 7 (0,01 mg/mL) mezclando 100 μL de solución del tubo 1 con 9,9 mL de NaOH 1M.
      8. Preparar el Tubo 8 (0,005 mg/mL) mezclando 50 μL de solución del Tubo 1 con 9,95 mL de NaOH 1 M.
      9. Prepara el blank (0 mg/mL) añadiendo 10 mL de 1 M NaOH a un tubo de centrífuga de 15 mL.
   3. Tapa cada tubo y pon el vórtice a 2.500 rpm durante 10 segundos para mezclar.
2. Ensayo colorimétrico de Anthrone
   1. Extrae glucógeno y realiza el ensayo colorimétrico de anthrone según los pasos 4.1.4–4.12.6.
   2. Registrar lecturas de absorbancia a 620 nm (A₆₂₀).
3. Cálculo de la concentración de glucógeno
   1. Genera la curva estándar de glucosa y calcula la concentración de glucosa en cada muestra estándar (_estándar C) según lo especificado en el Paso 5.1.
   2. Calcula la concentración de glucógeno en cada tubo estándar usando la siguiente ecuación:
      
   3. Defina_{el estándar} C como la concentración de glucosa (mg/mL) determinada en cada muestra estándar.
   4. Defina 0,8 como el volumen de la muestra de glucógeno (mL).
   5. Define 0,9 como el factor para convertir el valor de glucosa en valor de glucógeno.
   6. Define 2,5 como factor de dilución.
   7. Defina 10 como el factor de dilución que contabiliza la aliteracia de 1 mL analizada a partir de la mezcla total de 10 mL preparada en el Paso 4.3.3.
   8. Defina 1/3 como el factor de corrección que tiene en cuenta los 3 mL de alicota usados del digesto alcalino en el Paso 4.3.1.
   9. Repite el procedimiento completo tres veces más en un día, para un total de cuatro intentos.
   10. Repite las cuatro carreras en cuatro días, para un total de 16 recorridas.
4. Cálculo de LOD y LOQ
   1. Grafica las 16 lecturas de absorbancia en el eje y frente a cada concentración estándar de glucógeno en el eje x.
   2. Calcula la curva de regresión lineal y^R2. Se considera aceptable una regresión lineal con R² de ≥0,995.
   3. Calcula el LOD y el LOQ usando las siguientes ecuaciones:
      
      
   4. Defina σ como el error estándar de la respuesta (intersección y).
   5. Define S como la pendiente de la curva de regresión lineal.
5. Cálculo del CV% intraensayo e interensayo
   1. Para cada estándar de glucógeno, se calcula el CV% intra-ensayo de los valores calculados de las cuatro etapas del Día 1 usando la siguiente ecuación:
      
   2. Defina s₁ como la desviación estándar de los valores respecto a las cuatro carreras del Día 1.
   3. Define como el valor medio de las cuatro carreras del Día 1.
   4. Repite este cálculo para el día 2, día 3 y día 4 para obtener CV₂,_{CV 3} y_{CV 4}.
   5. Calcular el CV% final intra-ensayo usando la siguiente ecuación:
      
   6. Calcula el porcentaje de CV entre ensayos usando la siguiente ecuación:
      
   7. Defina s_inter como la desviación estándar de CV₁, CV₂,_{CV 3} y CV₄.
   8. Definamos como el valor medio de CV₁, CV₂,_{CV 3} y CV₄.

Resultados

Niveles de glucógeno hepático y esquelético bajo diferentes estados nutricionales

El ayuno nocturno redujo significativamente los niveles de glucosa en sangre (media ± error estándar del MSEM medio) de 7,9 ± 0,4 mM en ratas alimentadas ad libitum a 5,4 ± 0,3 mM. Los niveles de glucosa en sangre se restauraron a 8,3 ± 0,1 mM tras 2 horas de realimentación (Figura 3D). En coherencia con estos cambios, los niveles de glucógeno hepático (medi...

Discusión

En este artículo, describimos un método colorimétrico anthrone modificado para cuantificar el glucógeno en tejidos animales. Además de los pasos secuenciales convencionales de extracción de tejidos, digestión alcalina, precipitación de glucógeno, lavado con alcohol y desarrollo de color basado en el anthrone, incorporamos un paso de desproteinización para reducir la interferencia de fondo (Figura 1). Posteriormente aplicamos este método para evaluar cambios ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1.5 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-15-M	Utilizados para el procesamiento de muestras y configuración de reacciones
15 mL microcentrifuge tubes	LABGIC	BS-150-M-S	Utilizados para el manejo de lisados y pasos de precipitación
20X TBST	Solarbio Life Sciences	T1082	Buffer para el lavado de membranas en western blot
37 oC Incubator	Shanghai Jinghong Instrument	HWS-150	Incubación de placas BCA
50 mL centrifuge tubes	LABGIC	CT-112-50A	Utilizados para la digestión y extracción de tejidos
96-well plate	LABGIC	BS-MP-96W-CL	Medición de absorbancia basada en placas
Analytical balance	Changzhou Xingyun	FA2204N	Pesar polvos químicos
Anthrone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	A108571	Reactivo para la detección colorimétrica de glucógeno
Anti-GYS1 antibody	Proteintech	10566-1-AP	Detección de la glicógeno sintasa 1
Anti-GYS2 antibody	Proteintech	22371-1-AP	Detección de la glicógeno sintasa 2
Anti-phospho-GYS1/2 (Ser641) antibody	Cell Signaling Technology	47043S	Detección de GYS fosforilado
Anti-phospho-PYGL (Ser15) antibody	Abcam	ab227043	Detección de la glicógeno fosforilasa fosforilada
Anti-PYGL antibody	Proteintech	15851-1-AP	Detección de la glicógeno fosforilasa hepática
Anti-PYGM antibody	Novus Biologicals	NBP2-16689	Detección de la glicógeno fosforilasa muscular
BCA assay kit	Beyotime	P0012	Cuantificación de proteínas
Benzoic acid	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	B116255	Preparación de solución saturada para estándares
Blunt forcepts	Shanghai Jinzhong	J42010	Pinzado de dedos; disección de tejido
BSA Fraction V	Beyotime	ST023	Agente bloqueador en western blot
Chemiluminescent imager	Tanon	Tanon 5200 Multi	Detección de señales de western blot
Chemiluminescent substrate (ECL)	Beyotime	P0018S	Desarrollo de señal en western blot
Distilled water	Beyotime	ST872	Solvente para la preparación de reactivos
Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642	Inducción de la degradación del glucógeno in vivo
Ethanol	Macklin	E809065	Precipitación y lavado de glucógeno
Fine surgical scissors	Shanghai Jinzhong	JA2601	Disección de tejido
Fresco 17 centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	Centrifugación de muestras
Glucometer	i-SENS	CareSens N	Medición de glucosa en sangre
Glucometer	i-SENS	CareSens N	Medir el nivel de glucosa en sangre de la vena de la cola
Glucometer strips	i-SENS	CareSens N Strips	Medir el nivel de glucosa en sangre de la vena de la cola
Glucose	Macklin	G6172	Preparación de curva estándar
Glycogen stock	Beyotime	D0812	Preparación de una serie de estándares de glucógeno
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	31462	Detección de anticuerpos primarios
Handheld homogenizer	GreenPrima	PB100	Homogeneización de tejido
India ink	Sigma-Aldrich	198285	Tinción de proteína total para normalización
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	Eutanasia animal
Laboratory heating block	Changzhou Guowang	GWJ300-1	Calentamiento de muestras durante los ensayos
Lithium chloride	Macklin	767397	Mejora la precipitación de glucógeno
Methanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	M116115	Paso de lavado de glucógeno
Microplate reader	BioTek	ELx800	Medición de absorbancia a 620 nm
Nitrocellulose membrane	Millipore	HATF04700	Membrana de transferencia de proteínas
Orbital shaker	DLAB SCIENTIFIC CO.,LTD	SK-O180-S	Incubación de sustrato quimioluminiscente
P1000 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641100N	Transferencia de solución
P200 Pipettor	Thermo Fisher Scientific	4641080N	Eliminación de líquido residual
Phosphatase inhibitors (PhosSTOP)	Roche	4906845001	Preservación de la fosforilación de proteínas
Plastic containers (for tissue storage)	Thermo Fisher Scientific	6A0008	Almacenamiento de tejidos recolectados
Protease inhibitors cocktail	MCE	HY-K0011	Prevención de la degradación de proteínas
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013B	Extracción de proteínas
SDS-PAGE gel kit	Beyotime	P0012A	Separación de proteínas
SDS-PAGE loading buffer (6X)	Beyotime	P0015F	Mezclar con muestras de proteínas antes de cargarlas en los pocillos del gel SDS-PAGE
SDS-PAGE running buffer (5x)	Beyotime	P0014D	Electroforesis SDS-PAGE
Small Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science	R500	Eutanasia animal
Sodium hydroxide	Macklin	S817977	Digestión de tejidos y extracción de glucógeno
Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories	Crl: CD(SD)	Modelo de animal experimental
Spray bottle	Beyotime	TB6310	Aplicación de etanol al 75% en el pelaje del animal para humedecer y desinfectar
Standard chow diet	Jiangsu-Xietong, Inc.	XTI01ZJ-009	Dieta de mantenimiento para roedores
Surgical scissors	Shanghai Jinzhong	J22010	Disección de tejido
Syringe (sterile) with 25-gauge needle	Beyotime	FS801	Inyección intraperitoneal y punción de vena caudal
Thiourea	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	T112512	Estabiliza el reactivo de antrona
Transfer buffer (10x)