Modelos tumorales trasplantables clínicamente relevantes para estudiar el cáncer de ovario metastásico y la respuesta terapéutica en ratones

Resumen

Aquí presentamos un protocolo paso a paso para establecer los modelos de tumores intraperitoneal e intrabursal para estudiar la progresión, metástasis y respuesta terapéutica del cáncer de ovario. Además, describimos cómo utilizar imágenes in vivo no invasivas basadas en luciferasa en estos modelos para monitorizar la progresión tumoral en ratones.

Resumen

El cáncer de ovario metastásico es una malignidad ginecológica extremadamente letal que carece de opciones de tratamiento efectivas. El desarrollo de enfoques terapéuticos clínicamente traducibles para pacientes con cáncer de ovario depende de comprender los factores que impulsan la metástasis del cáncer de ovario. Aunque la mayoría de los tumores sólidos presentan metástasis hematógenas, las células cancerosas de ovario se dispersan principalmente por la vía intraperitoneal. Este proceso implica el desprendimiento y la liberación de células cancerosas del tumor primario hacia la cavidad peritoneal, que adquieren propiedades que les permiten resistir anoikis y formar agregados multicelulares. Estos agregados celulares se adhieren e invaden el revestimiento mesotelial del peritoneo, formando lesiones metastásicas. Los modelos in vivo clínicamente relevantes son esenciales para entender cómo los factores celulares y el microambiente tumoral influyen en los diferentes pasos del proceso metastásico y para probar nuevas estrategias terapéuticas. Dos modelos de tumores de ratón trasplantables ampliamente utilizados para estudiar la metástasis y la respuesta terapéutica del cáncer de ovario son los modelos intraperitoneal e intrabursal. En este informe, describimos la metodología paso a paso para establecer estos modelos y destacamos sus ventajas y limitaciones. Además, describimos cómo utilizar la imagen bioluminiscente para monitorizar de forma no invasiva la progresión tumoral utilizando estos modelos.

Introducción

A pesar de los avances significativos en nuestra comprensión de los factores que impulsan la progresión del cáncer de ovario, el cáncer de ovario sigue siendo la segunda malignidad ginecológica más letal en Estados^Unidos. Debido a la falta de síntomas evidentes y a la ausencia de marcadores diagnósticos tempranos fiables, más del 70 por ciento de los pacientes con cáncer de ovario presentan enfermedad metastásica avanzada en el diagnóstico ^2,3. Las terapias actuales no son eficaces para tratar el cáncer de ovario metastásico y, en consecuencia, las tasas de supervivencia a 5 años para pacientes con enfermedad en estadio avanzado permanecen por debajo del 30^{por ciento 4.} Una causa principal de la falta de éxito terapéutico es la aparición de la^{quimiorresistencia 5}. Por ello, existe una necesidad urgente de identificar los factores que impulsan la metástasis y la quimioresistencia del cáncer de ovario. Abordar esta brecha de conocimiento será fundamental para desarrollar estrategias terapéuticas más efectivas que aborden esta enfermedad. Para alcanzar estos objetivos, necesitamos modelos in vivo que imiten con precisión los pasos clave de la progresión del cáncer de ovario.

Aunque las líneas celulares de cáncer de ovario y los modelos in vitro tridimensionales han contribuido enormemente a nuestra comprensión de los factores que afectan la metástasis y la respuesta terapéutica, estos modelos presentan varias ^{limitaciones 6,7,8}. Por ejemplo, estos modelos no tienen en cuenta las diferentes células no cancerosas que forman parte del microambiente tumoral, ni capturan las complejas interacciones que ocurren dentro del microambiente ^{tumoral 6,7,8}. Además, es extremadamente difícil estudiar factores sistémicos y su impacto en la progresión tumoral y la respuesta a fármacos utilizando modelos in^{vitro 6,7,8}. Estas limitaciones de los modelos in vitro ponen de manifiesto la necesidad de modelos in vivo que imiten con precisión los distintos pasos en la metástasis del cáncer de ovario, incluyendo interacciones complejas con otros tipos celulares y factores dentro de su microambiente.

Los modelos de ratones genéticamente modificados (GEMMs) ofrecen una plataforma in vivo en la que los tumores surgen espontáneamente en un microambiente natural con un sistema inmunitario^intacto. Sin embargo, son lentos, desafiantes y costosos de generar y mantener¹⁰. La mayoría de los GEMMs del cáncer de ovario también tienen un largo periodo de latencia para el desarrollo tumoral, lo que hace que trabajar con ellos sea lento y costoso, incluso después de haber sido^{generados 10}. Los modelos trasplantables, como los modelos de xenoinjertos y aloinjertos, ofrecen un buen equilibrio entre relevancia biológica y facilidad experimental, y a menudo son mucho menos costosos de generar que los^{GEMMs 11}. Además de tener una latencia menor que los GEMM, la facilidad con la que las células tumorales pueden modificarse genéticamente in vitro hace que estos modelos sean convenientes y adecuados para estudiar cómo diferentes factores genéticos afectan a la progresión^{tumoral 10}. Gracias a estos beneficios, los modelos tumorales trasplantables han surgido como herramientas valiosas tanto para la investigación básica como traslacional en el cáncer de ovario.

En este informe, describimos el protocolo para establecer dos modelos diferentes de tumores de ratón trasplantables que se utilizan ampliamente para estudiar el cáncer de ovario metastásico: (1) el modelo intraperitoneal y (2) el modelo ortotópico o intrabursal. Ambos modelos pueden establecerse como modelos de xenoinjerto o aloinjerto. En el modelo intraperitoneal, las células cancerosas se inyectan en la cavidad peritoneal de los ratones. La introducción de células del cáncer de ovario en el espacio intraperitoneal refleja la etapa en la metástasis del cáncer de ovario, donde las células metastásicas del cáncer de ovario se desprenden del tumor primario a la cavidad peritoneal. De forma similar al proceso metastásico en humanos, estas células de cáncer de ovario trasplantadas deberán adaptarse al hostil microambiente peritoneal, adherirse e invadir la capa mesotelial que recubre la cavidad peritoneal, y formar lesiones metastásicas en órganos y tejidos intraperitoneales como el omento, el mesenterio, el hígado y el diafragma. Dependiendo de la línea celular cancerosa utilizada para generar el modelo intraperitoneal, los tumores metastásicos pueden ir acompañados de ascitis, como se observa en enfermedades en estadios avanzados en humanos. Así, el modelo intraperitoneal se ha utilizado ampliamente para comprender los factores que impulsan la metástasis del cáncer de ovario y su progresión hacia la enfermedad^{en estadio avanzado 12}. Estos modelos también son útiles para determinar la eficacia de nuevas estrategias terapéuticas para el cáncer de ovario^{metastásico 12}. En el modelo intrabursal u ortotópico, las células cancerosas se implantan en la bursa, una estructura membranosa que rodea el ovario del ratón. Este modelo imita las primeras etapas de la tumorigénesis y metástasis ováricas. En esta etapa, las células cancerosas siguen confinadas a la trompa de Falopio y al ovario. Es a partir de estos lugares de donde las células cancerosas se liberan hacia la cavidad peritoneal, que finalmente metastatizan a otros órganos. Por lo tanto, el modelo intrabursal es útil para estudiar tanto las primeras etapas de la tumorogénesis ovárica como los eventos que conducen a su posterior metástasis transcolómica a través de la cavidad^{peritoneal 12}.

Así, aunque tanto los modelos intraperitoneal como intrabursal son excelentes herramientas para estudiar la metástasis y la respuesta terapéutica del cáncer de ovario, difieren en la etapa específica del proceso metastásico que imitan. Aunque los modelos intrabursales pueden imitar la progresión del cáncer de ovario desde las primeras etapas hasta las etapas posteriores del proceso metastático, debido a la latencia asociada a este proceso, suelen utilizarse para estudiar eventos tempranos en la metástasis del cáncer de ovario. Para estudios centrados en etapas avanzadas de la metástasis del cáncer de ovario, el modelo intraperitoneal es más adecuado. Además, el modelo intrabursal también es técnicamente más difícil de establecer en comparación con el modelo^{intraperitoneal 12}. Establecer el modelo intrabursal requiere acceso a una sala de operaciones equipada con equipos microquirúrgicos que permitan la inyección precisa de células cancerosas en la bursa ovárica. La capacidad de las células cancerosas para establecer tumores ("tasa de absorción" o "tasa de enjerto") también suele ser menor en los modelos intrabursales en comparación con los modelos intraperitoneales. Además, dado que los tumores no pueden observarse fácilmente tras inyecciones ortotópicas o intraperitoneales, normalmente se emplea una técnica de imagen bioluminiscente no invasiva para monitorizar la progresión tumoral. Por lo tanto, tanto los modelos intraperitoneales como los intrabursal requieren equipos adicionales que permitan la imagen no invasiva de^{tumores 12}. En última instancia, los objetivos experimentales, la disponibilidad de recursos y el conjunto de habilidades técnicas determinarán la elección del modelo para cada estudio.

Este informe describe el protocolo paso a paso para establecer modelos de xenoinjertos intraperitoneales e intrabursales de ratón utilizando líneas celulares de cáncer de ovario humano. Estos modelos pueden establecerse trasplantando las células en cepas de ratones inmunodeprimidas como NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ) o el Foxn1 nude (B6. Cg-Foxn1 nu/J). El mismo método puede adaptarse para generar modelos aloinjertos (singénicos). Al establecer modelos de aloinjertos, se implantan células de cáncer de ovario de ratón en ratones inmunocompetentes con el mismo origen genético. A medida que los modelos de aloinjertos se desarrollan utilizando ratones inmunocompetentes, resultan útiles para estudiar cómo diferentes factores regulan el microambiente tumoral de ovario, el papel del sistema inmunitario en la progresión del cáncer de ovario y la eficacia de la inmunoterapia. Además de establecer los modelos ratones de xenoinjerto intraperitoneal e intrabursal, este informe también describe cómo utilizar la imagen bioluminiscente para monitorizar de forma no invasiva la progresión tumoral en estos modelos.

Protocolo

Todos los procedimientos animales descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad de Maryland, Condado de Baltimore (Investigador Principal - Achuth Padmanabhan; Número de protocolo - 1947).  La lista completa de materiales y equipos utilizados en este protocolo y sus números de catálogo se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de líneas celulares de cáncer de ovario para trasplante en ratones

Nota: Para todos los modelos in vivo descritos en este protocolo, las células de cáncer de ovario deben prepararse para trasplante en ratones. Las células de cáncer de ovario deben prepararse en una capucha de cultivo de tejido de flujo laminar, como se describe a continuación, a temperatura ambiente, salvo que se especifique:

1. Cultivar células de cáncer de ovario a 37 ^°C en_{una incubadora} de CO 2 con chaqueta de agua mantenida al 5% de_CO2 utilizando medios estándar recomendados en la literatura. Si se desea una imagen in vivo no invasiva del tumor, las células cancerosas de ovario deben ser modificadas para expresar de forma estable la luciferasa antes del trasplante.
2. Cuando las células alcanzan una confluencia de alrededor del 80%–85%, se extraen en condiciones estériles, como se describe a continuación:
   1. Aspira el medio de la placa de cultivo de tejidos.
   2. Lava las células adheridas dos veces con solución fisiológica 1X estéril con suero tamponado con fosfato (PBS) sin calcio ni magnesio. La presencia de calcio y magnesio en el PBS puede interferir con la actividad de la tripsina y favorece la adhesión celular. Aspira el PBS de la placa de cultivo tisular.
   3. Añade 0,05% de tripsina-EDTA a la placa de cultivo de tejidos. La cantidad de tripsina a utilizar dependerá del tamaño de la placa de cultivo de tejido y de la línea celular en la que se trabaja. Para la mayoría de las líneas celulares que crecen en una placa de 100 mm, se utiliza 1 mL de tripsina-EDTA al 0,05%. Para líneas celulares de cáncer de ovario fuertemente adherentes, como OVCA420, se recomienda 1 mL de tripsina-EDTA al 0,25%.
   4. Transfiere la placa con las células de nuevo a la incubadora de_CO2 con chaqueta de agua de 37 ^°C utilizada para cultivo de tejidos e incuba durante 1–5 minutos. El tiempo exacto de incubación requerido dependerá de la línea celular. Algunas líneas celulares, como TYK-Nu y HEYA8, se desprenden muy rápido (1–2 minutos), mientras que otras, como OVCA420, tardan más (4–5 minutos).
   5. Una vez separadas las células, añade medios que contengan FBS para detener la acción de la tripsina. Añade 6 mL de medios que contengan FBS por cada 1 mL de tripsina. Pipetea suavemente arriba y abajo para desalojar células de la placa de cultivo tisular y disociarlas en una suspensión unicelular.
      Nota: Cuando se observan bajo un microscopio de campo brillante invertido, las células desprendidas parecen redondeadas (en lugar de planas/alargadas) y flotan libremente en lugar de quedarse pegadas al fondo de la placa.
   6. Recoge las celdas en un tubo cónico y centrifuga a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   7. Retirar el sobrenadante que contiene tripsina y volver a suspender el pellet celular en un medio de cultivo celular fresco que contenga FBS.
3. Cuenta las células usando un colorante de viabilidad celular como el azul de tripán y un hemocitómetro. Alternativamente, se puede usar un contador automático de celdas para contar celdas.
4. Reconstituir las células en un volumen definido de PBS 1X estéril (pH 7,4) de modo que se alcance la concentración deseada de células por unidad de volumen. El número recomendado de células para inyectar en líneas celulares de cáncer de ovario humano comúnmente utilizadas se muestra en la Tabla 1¹³.
   Nota: El volumen máximo que se puede inyectar de forma segura en ratones depende del modelo. Para el modelo intraperitoneal, el volumen máximo recomendado es de 500 μL (véase la sección 2.1). Para el modelo intrabursal, el volumen máximo recomendado es de 5 μL (véase la sección 2.2).
5. Mantén la suspensión de la célula en hielo hasta que llegue el momento de inyectársela en ratones. Inyecta las células en ratones lo antes posible, preferiblemente en un plazo de 30–45 minutos tras prepararlas.

2. Establecimiento de modelos trasplantables de cáncer de ovario en ratones

1. Establecimiento del modelo intraperitoneal del cáncer de ovario
   Nota: En este proceso, las células del cáncer de ovario que expresan luciferasa de forma estable se inyectan en la cavidad peritoneal de una ratona adulta. El uso de células que expresen luciferasa de forma estable permitirá un seguimiento longitudinal y no invasivo de la progresión tumoral con el Sistema de Imagen In Vivo (IVIS).
   1. Preparar las células según lo descrito en la sección 1. Resuspende las células suavemente usando una micropipeta de 1000 μL y asegúrate de que permanezcan disociadas.
      Nota: No desalojar los grumos hará que las agujas se obstruyan.
   2. Extrae 500 μL de suspensión de celdas en una jeringuilla de 1 mL y coloca una aguja de 21G x 1 pulgada. Asegúrate de que no haya burbujas de aire en la jeringuilla.
      Nota: El volumen máximo que se puede inyectar intraperitonealmente en una ratón adulta hembra (25–30 g) es de 500 μL. Por lo tanto, resuspende las células en un volumen tal que el número requerido de celdas esté contenido en un volumen máximo de 500 μL. El número recomendado de células para inyectar en líneas celulares de cáncer de ovario humano comúnmente utilizadas se muestra en la Tabla 1¹³.
      Nota: Si el ratón pesa entre 20 y 25 g, se recomienda inyectar un volumen menor (menos de 400 μL).
   3. Saca al animal de la jaula y colócalo sobre una superficie rugosa o con alambre para sujetarlo.
   4. Sujeta al ratón acariciando suavemente la piel suelta en la base del cuello con la mano no dominante, como se muestra en la Figura 1A.
   5. Levanta suavemente al ratón y gíralo de modo que su lado ventral esté hacia arriba. Asegura la cola del animal con los dedos, como se muestra en la Figura 1B.
   6. Dibuja una línea imaginaria a lo largo del centro del abdomen. Para localizar el lugar de la inyección, imagina un triángulo entre la línea media y los dos pezones en el cuadrante inferior derecho. Asegúrate de que el lugar de inyección esté en el centro de este triángulo imaginario. Consulte la Figura 1B.
   7. Inclina ligeramente la cabeza del ratón hacia el suelo, haciéndola más baja que la parte trasera. Sujetar al ratón en esta posición ayuda a que el contenido abdominal se desplace cranealmente. Esto reduce el riesgo de perforar órganos internos durante la inyección.
   8. Utiliza un hisopo estéril de alcohol para limpiar la zona de la inyección.
   9. Con la mano dominante, inserta la aguja en el lugar de la inyección en un ángulo de 45° o menos. Avanza solo 0,5 pulgadas y no más de la mitad de la longitud de la aguja. Asegúrate de que la aguja se mantenga estable, ya que el movimiento en la cavidad abdominal puede causar lesiones en órganos internos.
   10. Dispensa las células a un ritmo lento y constante en la cavidad abdominal del ratón.
   11. Saca la aguja del ratón en el mismo ángulo de inserción. Coloca inmediatamente un manómetro esterilizado sobre el lugar de la inyección para evitar fugas.
   12. Tira la aguja y la jeringuilla en el recipiente correspondiente para objetos punzantes.
   13. Antes de meter al ratón en la jaula, tócale con las orejas usando el método que prefieres. El etiquetado auditivo permitirá identificar el ratón inyectado más adelante.
2. Establecimiento del modelo intrabursal del cáncer de ovario
   Nota: En el modelo intrabursal, las células cancerosas de ovario que expresan luciferasa de forma estable se inyectan directamente en la bursa ovárica de una ratona adulta. La bursa es un saco membranoso que rodea los ovarios murinos. La expresión estable de luciferasa en células de cáncer de ovario permitirá un seguimiento longitudinal no invasivo de la progresión tumoral mediante IVIS.
   1. Día 1 – Preparación del equipo y del ratón para la cirugía de trasplante intrabursal
      1. Autoclave: los instrumentos necesarios para la cirugía. La lista de instrumentos es (Figura 2A):
         Tijeras de punta fina, pinzas curvas de punta fina de 5 pulgadas, portaagujas Mayo-Heger, micropinzas de joyero diseccionadoras, punta fina, instrumentos para diseccionar pinzas con puntas finas
      2. Administrar analgesia preoperatoria de carprofeno (15 mg/Kg) cada 24 horas mediante inyección subcutánea en el ratón.
         Nota: Administrar el analgésico carprofeno por vía subcutánea cada 24 horas, comenzando un día antes de la cirugía y continuando durante 3 días después de la operación.
   2. Día 2 – Trasplante intrabursal de células de cáncer de ovario en ratón
      1. Prepara las células cancerosas de ovario para la inyección como se describe en la sección I. El volumen máximo que se puede inyectar de forma segura intrabursal en un ratón es de 5 μL. Por lo tanto, es preferible tener células a una concentración de 10⁴ células/μL. Esto permitirá el trasplante de 5 x 10⁴ células.
         Nota: El número recomendado de células para inyectar en líneas celulares de cáncer de ovario humano comúnmente utilizadas se muestra en la Tabla 1 13.
      2. Guarda las celdas en hielo hasta que se usen. Una vez extraído, se recomienda inyectar células lo antes posible, preferiblemente en un plazo de 30–45 minutos.
      3. Induce la anestesia colocando al ratón en una cámara de isoflurano con un caudal de isoflurano del 4 por ciento y un caudal de oxígeno de 3,5 L/min. Confirma que el ratón está anestesiado comprobando la inmovilización y la ausencia del reflejo de pellizco en el dedo del pie.
      4. Transfiere al ratón anestesiado a una cortina quirúrgica estéril que se coloca sobre una almohadilla térmica para roedores mantenida a 37 °C. Coloca rápidamente un cono nasal y mantén la anestesia con un 1,5% de isoflurano y un 98,5% de osígeno. Asegúrate de que el ratón esté anestesiado confirmando la ausencia del reflejo pellizco en el dedo del pie.
      5. Asegúrate de que el ratón permanezca anestesiado durante todo el procedimiento confirmando la ausencia del reflejo de pellizco cada 15 minutos. Controla la frecuencia respiratoria del ratón durante la anestesia para asegurarte de que sea lenta y suave. Si la frecuencia respiratoria cambia, ajusta la dosis de isoflurano. Si el ratón muestra dificultad para respirar o jadear, reduce la dosis. Por el contrario, si el ratón muestra un aumento en la frecuencia respiratoria, aumenta ligeramente la dosis de isoflurano.
         Nota: Evita que el ratón esté bajo anestesia durante más de 40 minutos. Para lograrlo, es importante ser eficiente y rápido durante la cirugía.
      6. Coloca el ratón con el lado en el que se van a trasplantar las células del cáncer de ovario intrabursamente, hacia arriba como se muestra en la Figura 2B.
      7. Aplica pomada ocular en ambos ojos del ratón para protegerlos de la sequedad (desecación corneal).
      8. Si el ratón tiene pelo, afeita el pelo de la mitad inferior del ratón en el lado que está hacia arriba. Limpia bien la zona afeitada y coloca el ratón sobre una nueva almohadilla estéril. Si trabajas con el Foxn1 desnudo (B6. Cg-Foxn1 nu/J) cepa de ratón, sáltate este paso.
      9. Utiliza una cortina quirúrgica estéril para cubrir al ratón de modo que solo quede al descubierto la mitad inferior del cuerpo.
      10. Lávate bien las manos con jabón antes de empezar la cirugía y ponte un par de guantes quirúrgicos estériles nuevos. Evita tocar cualquier zona o objeto no estéril después de ponerte los guantes quirúrgicos.
      11. Utiliza un aplicador estéril de punta de algodón para aplicar el líquido de betadine en el lugar de la cirugía en un movimiento circular en sentido horario desde dentro hacia fuera. Después, utiliza un hisopo estéril de alcohol para limpiar la misma zona de forma similar. Repite este procedimiento dos veces más.
          Nota: No toque objetos o zonas no estériles durante la cirugía. Cambia los guantes inmediatamente si se produce contacto con una superficie no estéril. Se recomienda encarecidamente contar con otra persona que ayude durante la inyección intrabursal. Esta persona puede ayudar a manipular objetos no estériles durante la cirugía.
      12. Espera 1 minuto a que el alcohol se seque.
      13. Localiza el lugar que está aproximadamente a 1,5 cm por encima de la pata trasera y a 5 mm de la caja torácica del ratón, como se muestra en la Figura 2B. Levanta la piel en este lugar con las pinzas curvas y luego haz una incisión vertical de 5 mm con unas tijeras de punta fina.
          Nota: Antes de hacer la incisión, asegúrese de que el ratón esté completamente bajo la influencia de la anestesia confirmando la ausencia del reflejo de pellizco en el dedo del pie.
      14. Sujeta la piel de un lado con micropinzas de punta fina y haz una incisión en el tejido subcutáneo en el mismo sitio.
      15. En este punto, la capa peritoneal bajo el tejido subcutáneo se hará visible. Utiliza una pinza curva, dentada y de punta fina para sujetar la capa peritoneal, y haz una incisión de unos 2,5 mm de largo con tijeras de punta fina.
      16. Sujeta el lateral del colgajo de la incisión peritoneal con las pinzas dentadas y localiza la almohadilla grasa ovárica usando pinzas finas. El ovario se encuentra bajo la almohadilla grasa.
      17. Saca suavemente un poco de la almohadilla grasa ovárica junto con el ovario a través de la incisión.
      18. Utiliza las pinzas de disección para sujetar la almohadilla de forma que el ovario quede hacia arriba e inmóvil.
          Nota: No sujetes el ovario con pinzas. Usa siempre pinzas dentadas para sujetar la almohadilla grasa porque el tejido es resbaladizo.
      19. Pide a la persona que ayuda que prepare la jeringuilla que contiene la suspensión celular. Se recomienda usar una jeringuilla de insulina de 0,3 mL.
      20. Inserta suavemente la aguja con el bisel hacia arriba en la bursa ovárica desde la unión de la trompa de Falopio y el ovario. Asegúrate de que todo el bisel va dentro de la bursa antes de presionar el émbolo.
          Nota: Ten cuidado de no perforar la bursa en el extremo opuesto del lugar de inserción.
      21. Empuja suavemente el émbolo y transfiere el contenido de la jeringuilla a la bursa ovárica. Quita la aguja rápidamente.
      22. La hinchazón de la bursa que rodea el ovario indicará una inoculación exitosa de las células.
      23. Espera 5 segundos y coloca suavemente el ovario de nuevo en la cavidad peritoneal.
      24. Cierra el peritoneo usando una sutura monofilamentosa absorbible 6-0 con uno o dos puntos quirúrgicos interrumpidos simples.
      25. Cierra la incisión cutánea usando la sutura monofilamento absorbible 6-0 con un punto quirúrgico sencillo y corriente. Asegúrate de que no haya sangrado en la zona de la incisión.
      26. Aplica una pomada antibiótica triple (Bacitracina, Neomicina y Polimixina B) en el lugar de la incisión tras cerrarla.
      27. Administrar Carprofeno 15 mg/Kg subcutáneamente al ratón para aliviar el dolor.
      28. Etiqueta el ratón con un método preferente. El etiquetado auditivo permitirá identificar el ratón inyectado más adelante.
      29. Transfiere al ratón a una jaula nueva. Coloca esta jaula con la mitad sobre una almohadilla eléctrica durante al menos 60 minutos. Asegúrate de que el efecto de la anestesia haya desaparecido por completo y que el ratón esté despierto y activo.
          Nota: Los ratones son propensos a la hipotermia bajo anestesia. Por ello, es importante proporcionar calor externo para regular la temperatura corporal.
      30. Revisa a los ratones después de 4-5 horas tras la cirugía para detectar signos de sangrado en la zona de la incisión u otra molestia.
      31. Administra carprofeno a ratones 15 mg/kg por vía subcutánea cada 24 horas durante los siguientes 3 días.
      32. Si las células inoculadas están genéticamente modificadas para expresar luciferasa de forma estable, la carga tumoral puede medirse mediante IVIS desde el primer día tras la inyección, como se describe en la sección 3.

3. Imagen no invasiva de un tumor de ratón utilizando el Sistema de Imagen In Vivo (IVIS)

Un objetivo importante en varios estudios que utilizan los modelos tumorales trasplantables descritos en este informe es obtener datos longitudinales sobre la progresión tumoral. Aunque el volumen de tumores subcutáneos puede estimarse con un calibrador vernier, esta no es una opción viable para tumores formados mediante los modelos intraperitoneal e intrabursal. Para superar este desafío y determinar la carga tumoral intraperitoneal, la mayoría de los laboratorios utilizan imágenes bioluminiscentes no invasivas basadas en luciferasa. Para ello, se diseñan células cancerosas trasplantadas para expresar de forma estable la luciferasa, que produce bioluminiscencia al administrar el sustrato, la D-luciferina. La bioluminiscencia se detecta de forma no invasiva mediante un Sistema de Imagen In Vivo (IVIS). Esta señal se cuantifica para rastrear la carga tumoral y revelar información sobre la metástasis y la eficacia terapéutica de los fármacos. A continuación, describimos el protocolo para el seguimiento de la carga tumoral mediante imágenes bioluminiscentes no invasivas basadas en luciferasa con IVIS en ratones.

1. Preparación del sustrato de D-luciferina
   1. Preparar una solución de 15 mg/mL de D-luciferina en 1X PBS (pH 7,4) en condiciones estériles.
   2. Esteriliza la solución con filtro usando un filtro de 0,22 μm.
   3. Envuelve la solución en papel de aluminio para protegerla de la luz hasta que la uses.
2. Inicialización del imagador IVIS para adquisición de imágenes
   1. Abre el software de "imagen viva" en el ordenador conectado al ividor IVIS e inicia sesión.
   2. El generador de imágenes debe inicializarse para la adquisición de imágenes. Esto se hace de la siguiente manera:
      1. Al iniciar sesión, se abrirá una ventana del panel de control IVIS como se muestra en la Figura 3A.
      2. Haz clic en el botón "inicializar" situado en la parte inferior derecha de la ventana (Figura 3A). El sistema tardará un par de minutos en inicializarse.
         Nota: Inicialmente, la barra de temperatura en la parte inferior de la ventana se vuelve roja, indicando que la cámara de imagen está en proceso de alcanzar su temperatura objetivo de -90 °C (Figura 3B).
      3. Cuando la cámara de imagen alcanza la temperatura objetivo (-90 °C), la barra de temperatura se pondrá verde y el estado del sistema dirá "Listo para usar" (Figura 3C). Ahora el generador de imágenes está listo para hacer imágenes del ratón.
         Nota: El tiempo de exposición, el binning y el f/stop pueden ajustarse según los requisitos del usuario.
3. Preparación del ratón para la imagen IVIS
   Antes de hacer la imagen del ratón, la D-luciferina debe inyectarse intraperitonealmente.
   1. Saca el ratón de la jaula y colócalo sobre una superficie áspera o con alambre. Sujeta suavemente a los ratones para sujetarlos correctamente, como se describe en la sección 2.1.
   2. Coge el ratón y gíralo de modo que su lado ventral esté orientado hacia arriba.
      Nota: Si el ratón está correctamente sujeto, las cuatro patas se extenderán hacia fuera al levantarlas, como se muestra en la Figura 1B. Sujeta su cola entre los dedos como medida extra de sujeción durante el procedimiento.
   3. Utilice un hisopo estéril de alcohol para limpiar el lugar de la inyección, tal y como se indica en el protocolo de inyección intraperitoneal en la sección 2.1.
   4. Utilice una jeringuilla de 1 ml de TB y una aguja de 30 g y media pulgada para inyectar intraperitonealmente un volumen adecuado de D-luciferina de la solución original y así lograr una dosis final de 150 mg/kg de D-luciferina.
      Nota: Consulte el protocolo de inyección intraperitoneal en la sección 2.1 para las instrucciones sobre cómo realizar la inyección intraperitoneal. Si se utilizan ratones C57BL/6 (para modelos de aloinjerto singénico), se recomienda encarecidamente eliminar el pelaje antes de realizar imágenes bioluminiscentes con IVIS. El pelaje negro y la piel pigmentada atenúan significativamente la luz, reduciendo la intensidad de la señal.
   5. Coloca suavemente al ratón de nuevo en la jaula. El tiempo exacto de espera y de exposición deberá determinarse empíricamente. Esto puede determinarse de la siguiente manera.
      1. Anestesiar al ratón inmediatamente después de la inyección de D-luciferina y obtener imágenes según la Sección 3.4 cada 2 minutos durante 20 minutos.
         Nota: Al realizar este experimento por primera vez, se recomienda determinar cómo varía la señal de luciferasa a lo largo del tiempo tras administrar D-luciferina. Esto ayudará a determinar el momento más adecuado para obtener imágenes del ratón tras administrar D-luciferina en experimentos posteriores. La señal bioluminiscente puede variar dependiendo de varios factores, incluyendo la línea celular, el modelo de xenoinjerto en ratón, el nivel de expresión de luciferasa, etc.
      2. En cada intervalo toma estimaciones de 5, 10 y 15 s.
      3. Utiliza estos datos para trazar una curva estándar. En función de la curva, elige el tiempo de espera y de exposición en el que la señal alcanza una meseta manteniendo la intensidad más alta.
         Nota: Normalmente este tiempo es entre 5 y 10 minutos, aunque puede variar según el modelo.
4. Imagen no invasiva de tumores de ratón mediante IVIS
   1. Tras el periodo de espera, coloque al ratón en una cámara de isoflurano con tasa de isoflurano del 4% y un caudal de oxígeno de 3,5%.
   2. Confirma que el ratón está anestesiado comprobando la ausencia del reflejo de pellizco en el dedo del pie.
   3. Coloca el ratón en el escenario dentro del sensor IVIS y desliza la nariz dentro del cono nasal para mantener la anestesia durante la imagen. Asegúrate de que se mantengan dentro de las líneas marcadas del enfoque de la cámara y cierra la puerta del imagador.
      Nota: Habrá cinco posiciones en el escenario dentro del imagador. Cada posición también tendrá sus respectivos conos nasales anestésicos. Esto permite obtener imágenes de 5 ratones simultáneamente. Dependiendo del número de ratones para la imagen, ajusta el campo de visión de la cámara en la caja del panel de control de "D" (campo más amplio) a "A" (enfoque estrecho). El ratón puede colocarse en cualquier parte del escenario siempre que sus narices permanezcan dentro de los conos nasales de anestesia durante toda la duración de la imagen. Se recomienda obtener imágenes secuenciales de los ratones primero en sus lados dorsales y luego en sus lados ventrales.
   4. Ajusta el tiempo de exposición y haz clic en "Adquirir" en el panel de control (Figura 3C).
      Nota: Asegúrate de que luminiscencia, fotografía y superposición estén "ACTIVADAS" en el panel de control.
      Una vez capturada la imagen, aparecerá en la pantalla la imagen del ratón con la señal de luciferasa.
   5. Abre el sensor y gira el ratón para que el lado ventral quede hacia arriba y haz clic en "Adquirir" después de cerrar la puerta del imagador.
      Nota: Asegúrese de que la nariz del ratón esté dentro del cono nasal para garantizar el mantenimiento de la anestesia durante la imagen.
   6. Una vez adquiridas las imágenes dorsales y ventrales, se abre la puerta del generador de imágenes y se vuelve a colocar el ratón en su jaula.
   7. Espera 5-10 minutos para asegurarte de que el ratón recupera la conciencia.
5. Análisis de la imagen de IVIS para determinar la carga tumoral en el ratón
   1. Ajuste de la escala de color de las imágenes
      1. Guarda las imágenes raw en la carpeta correspondiente haciendo clic en "archivo" seguido de "guardar como".
         Nota: El generador de imágenes ajusta automáticamente la escala de color en función de la intensidad de la señal. Es recomendable mantener la escala de color constante en todas las imágenes tomadas a lo largo del experimento. La escala de color también puede ajustarse más adelante abriendo la imagen raw usando este software.
      2. Para el ajuste manual, aparece otra ventana de la paleta de herramientas en la esquina superior derecha de la pantalla (Figura 3D), ve a "Ajuste de imagen" y luego elige "manual" para escalar. Introduce el número mínimo y máximo deseado para el valor de la escala y haz clic en "Enter" (Figura 3E).
         Nota: Al ajustar la escala de color de una imagen adquirida previamente, primero abre el archivo de imagen en bruto guardado infoclick.txt de la carpeta correspondiente usando "archivo" seguido de "abrir".
         3.5.1.3. Guarda esta imagen por separado de la imagen raw en la carpeta correspondiente.
   2. Análisis de la carga tumoral en el ratón
      Nota: Para la medición cuantitativa de la carga tumoral, puedes medir la intensidad de la señal de cada ratón a través de imágenes tomadas durante todo el periodo. Puedes colocar esos valores en Excel o GraphPad Prism para análisis estadísticos y para generar gráficos lineales de progresión tumoral.
      1. Abre el archivo infoclick.txt crudo guardado de la carpeta correspondiente.
      2. Ve a la sección ROI (Región de Interés) de la ventana de la paleta de herramientas que aparece en la esquina superior derecha (Figura 3F).
      3. Dibuja el área de retorno del retorno de inversión en cada ratón manual o automáticamente con la ayuda de la función "dibujar" usando cualquier forma que mejor te funcione. Para hacerlo manualmente, mantén el área consistente para todas las imágenes de todos los ratones que se están comparando.
         Nota: Para la inoculación intraperitoneal, la selección manual del ROI para todo el tórax y abdomen en la imagen ventral del ratón es la mejor opción. Para la inoculación intrabursal, la selección manual del ROI en la zona de imagen dorsal con señal funciona mejor.
         Nota: La selección automática de retorno solo seleccionará regiones con mayor intensidad de señal de imagen.
      4. Haz clic en "Mid ROI" (Figura 3F). Esto abrirá otra ventana con datos sobre los conteos totales y medios de cada ROI seleccionado.
      5. Guarda este archivo en la carpeta correspondiente para que pueda accederse a él más adelante. Utiliza estos datos para graficar el gráfico en MS Excel o GraphPad Prism.

Resultados

En la Figura 4 se muestran datos representativos de un modelo de cáncer de ovario intraperitoneal utilizando células OVCAR8 marcadas con luciferasa en ratones desnudos inmunodeprimidos de Foxn1. La expresión estable de luciferasa en estas células permitió el seguimiento longitudinal de la progresión tumoral mediante imágenes bioluminiscentes no invasivas utilizando el imagador IVIS, tal como se describe en la sección III. La inyección intraperitoneal de 5 mi...

Discusión

La capacidad de imitar interacciones complejas entre células tumorales, microambiente y factores sistémicos convierte a los modelos de ratón en un recurso excelente para estudiar la progresión del cáncer^{de ovario 12}. Además de avanzar en nuestra comprensión de los factores que impulsan la progresión y la metástasis del cáncer de ovario, los modelos ratones in vivo también desempeñan un papel importante en la evaluación preclínica de moléculas pequeñas y en las est...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro estéril de jeringuilla 0,22 um, 33 mm	Fisher Scientific	09-720-004
Jeringuilla de 1 ml TB	BD	309659
21G, aguja de 1 pulgada	BD	305167
30G, ½ aguja de pulgada	BD	305106
Pinzas curvas de punta fina de 5 pulgadas	Fisher Scientific	1631
Sutura monofilamento absorbible 6-0	MaxonTM	6532-11
Hisopo de alcohol (alcohol isoprolilo al 70%)	Dukal Corp	80003156
Betadina (solución de yodo al 1%)	Productos Purdue	367618150085
Carprofen Inj, 50mg/ml	Levafen	RXLEVA50-20INJ
Centrifugadora	Eppendorf	5702
D-luciferina	Laboratorios Syd	MB000102-R70170
Micropinzas de joyero diseccionando, punta fina	Fisher Scientific	08-953E
Pomada para ojos	Medvet	11897
Tijeras de punta fina	Fisher Scientific	8940
Almohadilla térmica	Rayo de sol	731-500
Instrumentos que diseccionan pinzas con puntas finas	Fisher Scientific	S08096
Jeringa de insulina 3/10ml	BD	328438
Isofurano	Fluriso	Fluriso250
IVIS	Perkin Elmer	IVISLMIII
Mayo- Portaagujas rectas Heger	Fisher Scientific	08-966
Estéril 1X PBS, sin calcio ni magnesio	Corning	21-040-CV
Aplicadores estériles de punta de algodón	McKeesson	24-106-1S
Calibre estéril	Kendall	3033
Compresa/toalla/drapeado estéril, sin ventanas	Henry-Schein	100-9687
Triple pomada antibiótica	Globo	4006-4SL
Tripsina-EDTA (0,25%), fenol rojo	Gibco	25200-056