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Artículo de método

Protocolo integrado para la evaluación de linfáticos meníngeos: inyección de cisterna magna, imagen de ganglios linfáticos, disección meníngea y tinción de montaje completo

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DOI:

10.3791/71140

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29 de mayo de 2026

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1School of Medicine, School of Life Sciences, Shanghai University, 2Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University, 3Children's Hospital of Fudan University, National Children's Medical Center, 4First Clinical College, Fujian Medical University; Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian Key Laboratory of Laboratory Medicine

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para evaluar los vasos linfáticos meníngeos (MLVs) de ratón, que desempeñan un papel importante en múltiples enfermedades neurológicas. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método integrado que permita tanto la evaluación funcional del drenaje de trazadores como la caracterización morfológica detallada de la red de MLVs dorsales.

Resumen

Los vasos linfáticos meníngeos (MLVs) han surgido como reguladores críticos de la homeostasis del sistema nervioso central (SNC), y la disfunción de los VLM ha estado implicada en diversos trastornos neurológicos. Por tanto, una evaluación exhaustiva de la morfología y función de los MLV es esencial para comprender su papel en la fisiología y las enfermedades del SNC. Este protocolo describe un método integrado para evaluar los MLV en ratones utilizando cuatro técnicas clave: inyección intra-cisterna-magna (i.c.m.) de trazadores fluorescentes, imagen en vivo de ganglios linfáticos cervicales (CLNs), disección meníngea y tinción de montaje completo. Primero, la aguja de 30 g se conecta a la jeringuilla y a la bomba de infusión mediante un tubo de polietileno (PE). Tras la anestesia del ratón, la duramadre queda expuesta mediante una disección roma de los músculos del cuello y la aguja de inyección se introduce en la cisterna magna (CM) para administrar el trazador al líquido cefalorraquídeo (LCR) con un control preciso. El drenaje trazador hacia los CLNs puede visualizarse en tiempo real, mientras que la posterior disección meníngea y la tinción de montaje completo permiten un análisis morfológico detallado de los MLVs dorsales. Todo el procedimiento puede completarse en un plazo de 3 horas, incluyendo inyección de pies por minuto, perfusión de tejidos, aislamiento del cráneo y colocación en solución fiadora. Este protocolo también puede adaptarse para la administración intracraneal de fármacos o combinarse con análisis moleculares, ya que el procedimiento de disección meníngea es compatible con tejidos frescos y no fijados adecuados para la extracción de ARN y proteínas.

Introducción

Los MLVs se encuentran dentro de los senos durales y pueden transportar componentes del LCR y células inmunitarias desde el SNC hasta losCLNs 1,2. El descubrimiento de las MLVs ha desafiado el concepto tradicional de "privilegio inmunitario" del sistema nervioso central y se ha convertido en un punto caliente de investigaciónen los últimos años 3. Los estudios han demostrado que la función deficiente de los MLV está estrechamente asociada con diversas enfermedades, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, el deterioro cognitivo relacionado con la edad, tumores cerebrales e infecciones del SNC 4,5,6,7. A medida que avanza la investigación en este campo, existe una necesidad creciente de métodos experimentales integrados, reproducibles y bien estandarizados.

La mayoría de los protocolos existentes para la investigación de vasos linfáticos se centran en los vasos linfáticosperiféricos 8,9,10. En estudios relacionados con las MLV, un estudio describió un procedimiento sencillo de canulación cervical que permite el acceso directo al LCR sin dañar el parénquima del cráneo odel cerebro 11. Cuando se combina con técnicas de imagen, este método puede evaluar eficazmente la función del sistema glymphático y la dinámica del LCR. Sin embargo, no se han documentado bien protocolos experimentales detallados para estudiar la función y morfología de los MLV.

El protocolo actual integra la imagen funcional con el análisis morfológico, permitiendo la adquisición simultánea de datos de función de drenaje y morfología estructural del mismo animal, reduciendo así el número de animales utilizados y mejorando la comparabilidad y consistencia de los datos. En general, este protocolo puede utilizarse para estudiar los cambios estructurales y funcionales en los MLVs en diversos modelos de enfermedades, así como para evaluar los efectos de intervenciones farmacológicas o genéticas sobre los MLVs. El protocolo proporciona descripciones detalladas de los pasos operativos, precauciones clave y orientación para la solución de problemas. Además, la técnica de inyección de i.c.m. descrita en este protocolo puede aplicarse de forma independiente para la administración intracraneal de fármacos, y el procedimiento de disección meníngea es compatible con tejido fresco para la extracción posterior de ARN o proteínas, ofreciendo una flexibilidad y escalabilidad considerables.

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Protocolo

Los procedimientos para ratones descritos en este protocolo se realizaron en cumplimiento del protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Shanghái (Aprobación nº ECSHU 2023-099).

1. Preparación de instrumentos quirúrgicos y amortiguadores

PRECAUCIÓN: Operar en una campana extractora química y llevar guantes para minimizar los riesgos potenciales al trabajar con PFA, una sustancia moderadamente tóxica y cancerígena. Todas las operaciones que impliquen alcohol isoamílico deben realizarse en una campana extractora química alejada de las fuentes de inflamación, usando guantes y mascarilla, para reducir los riesgos de exposición.

  1. Prepara instrumentos quirúrgicos, como un par de tijeras rectas, dos pares de pinzas curvas de punta fina, dos pares de pinzas de punta roma, un par de microtijeras y un par de micropinzas rectas con puntas lisas (no dentadas).
    NOTA: Limpia los instrumentos quirúrgicos con etanol al 75% y mantenlos secos tanto antes como después del experimento.
  2. Preparad los amortiguadores.
    1. 1x PBS.
    2. 4% de solución paraformaldehído (4% PFA).
    3. Solución bloqueante (1x PBS que contiene albúmina sérica bovina al 3%, 0,5% Triton X-100 y 2% suero bovino fetal).
    4. Buffer de dilución de anticuerpos (1x PBS que contiene 3% de BSA y 0,5% de Triton X-100).
    5. Medio de montaje antifade.
      NOTA: El reactivo preparado puede almacenarse a 4 °C durante un mes.
  3. Prepara solución anestésica 2,2,2-Tribromoetanol (Avertin, 1,25%, 50 mL)
    1. Pesa 0,625 g de Tribromoetanol en un tubo de 2 mL, añade 1,25 mL de alcohol isoamílico y disuelve bien (agitador de 37 °C).
    2. Transfiere la solución completamente disuelta de Tribromoetanol-isoamílico a un tubo cónico de 50 mL, añade 1 PBS para llevar el volumen total a 50 mL y mezcla bien.
    3. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 μm en un armario de seguridad biológica.
  4. Prepara Ovalbumina, solución conjugada de Alexa Fluor 647 (OVA-647) (2 mg/mL). Disolver 2 mg de OVA-647 en 1 mL de líquido cefalorraquídeo artificial (LCR).

2. Montaje de la aguja de inyección y conexión a la bomba de microinyección

  1. Utiliza pinzas romas para romper la aguja de 30 g y mantener la punta11 (diámetro exterior 0,30 mm, diámetro interior 0,15 mm, longitud 8 mm).
  2. Utilice un tubo de PE-10 de 30 cm (diámetro exterior 0,64 mm, diámetro interior 0,28 mm) para conectar la aguja rota de 30 G a la aguja de microinyección que contiene una aguja de 30 G (Figura 1).
  3. Monta la aguja de microinyección, con el tubo y la aguja de 30 G conectados, en la bomba de microinyección.

3. Inyección de I.C.M. e Imagen en Vivo

PRECAUCIÓN: Si la aguja se introduce demasiado profundamente y penetra en el parénquima cerebral, la inyección se administrará en el tejido cerebral en lugar de en el compartimento del LCR, comprometiendo la precisión del resultado y potencialmente conduciendo a la mortalidad de ratones. Durante la intervención quirúrgica se requiere una monitorización fisiológica continua del ratón. La profundidad de la anestesia debe evaluarse cada 15 minutos utilizando el reflejo de pellizco del dedo para asegurar que el animal permanezca sin dolor. La temperatura corporal debe mantenerse en 37 °C ± 0,5 °C utilizando una almohadilla térmica para prevenir la hipotermia y sus efectos asociados en la función fisiológica. Además, la respiración y la frecuencia cardíaca deben registrarse cada 30 minutos, evaluándose observando los movimientos torácicos y palpando el ápice cardíaco. Durante la inyección de CIM, si la aguja se introduce demasiado profundamente y provoca sangrado, esto indica una inyección fallida. Termina el experimento y sacrifica al animal.

  1. Pesa al ratón y administra 200 mg/kg de Avertin mediante inyección intraperitoneal para anestesiarlo.
    NOTA: Se pueden usar anestésicos alternativos (por ejemplo, ketamina/xilazina).
  2. Aplica crema depilatoria en la región cervical para eliminar el vello de los ganglios linfáticos cuando el reflejo de pellizco del dedo del pie cesa y la respiración se vuelve lenta y constante.
  3. Afeita la zona dorsal del cuello.
  4. Coloca el ratón en un marco estereotáxico sobre una almohadilla térmica con la cabeza inclinada en un ángulo de 120° respecto al tronco (Figura 2A).
  5. Limpia la zona secuencialmente con povidona-yodo y etanol al 75%.
  6. Aplica pomada oftálmica de eritromicina.
  7. Haz una incisión en la línea media de la piel del cuello y separa de forma directa las capas musculares.
    NOTA: Usando dos pares de pinzas de punta roma, separa las capas musculares para minimizar el sangrado.
  8. Disecciona el músculo con pinzas de punta fina hasta que la duramadre translúcida que cubre el MC se haga visible  (Figuras 2B, C).
    NOTA: Utiliza una pinza curva de punta fina para retraer los músculos y mantener una exposición constante del muco cervical.
  9. Bajo un estereomicroscopio, se utiliza pinzas romas para sujetar la aguja e insértala en un ángulo de 45° respecto al plano de la duramadre, a una profundidad aproximada de 1–2 mm. Colocar el bisel de la aguja paralelo a la duramadre de modo que quede completamente debajo de la misma (Figura 2D).
    NOTA: Aplica una fuerza suave con la aguja para perforar la duramadre. La perforación exitosa se indica por una pérdida palpable de resistencia, junto con la visualización de la punta de la aguja bajo la duramadre y la salida de LCR.
  10. Usa papel absorbente para secar cualquier líquido cefaloridacular que haya fugas.
  11. Configura la bomba de microinyección para que entregue a 1 μL/min. Inyectar 5 μL de solución de OVA-647 (2 mg/mL) en el CM4 (Figura 2E).
  12. Deja la aguja en su sitio durante 2 minutos para evitar el reflujo de líquidos.
  13. Aplica una gota de pegamento biológico sobre las meninges.
  14. Cierra la incisión quirúrgica.
  15. Realiza imágenes in vivo del ratón para monitorizar la intensidad del contraste en los CLNs en varios momentos (30 min, 60 min). Utiliza los siguientes parámetros de imagen: tiempo de exposición: 0,5 s; filtro de excitación: 640 nm; Filtro de emisión: 680 nm.

4. Aislamiento de la parte dorsal del cráneo del ratón

NOTA: Confirme la ausencia del reflejo de pellizco del dedo y la cesación de la respiración espontánea antes de iniciar la disección torácica.

  1. Eutanasiar al ratón con una sobredosis de Avertin (600 mg/kg) y realizar perfusión cardíaca con 20 mL de PBS 1x o solución salina normal.
  2. Decapita al ratón para aislar la cabeza.
  3. Haz una incisión a lo largo de la línea media del cráneo para abrir el cuero cabelludo.
  4. Utiliza dos hemostatos curvos para separar el cuero cabelludo bilateralmente mediante una suave retracción. Posteriormente, se insertan los hemostatos curvados en las fosas orbitarias y se retira cuidadosamente el cuero cabelludo residual de las regiones nasal y oral (Figuras 3A–C).
    NOTA: Este método permite una separación rápida y completa del cuero cabelludo.
  5. Retira la mandíbula manteniendo el cráneo intacto (Figura 3D).
  6. Extrae el hueso de la base del cráneo para exponer la parte ventral del cerebro (Figura 3E).
  7. Extraer cuidadosamente el cerebro con pinzas romas, evitando el contacto con la duramadre de los huesos parietales (Figura 3F).
  8. Sumergir completamente el cráneo dorsal en 5 mL, 4% de PFA y fijar durante 24 horas a 4 °C (Figura 3G).
    PUNTOS DE PAUSA: Guardar cráneos fijos a 4 °C durante no más de una semana. Retira la muestra de 4 °C y deja que vuelva a la temperatura ambiente antes de la disección meníngea.

5. Disección de meninges del cráneo del ratón

  1. Lava el cráneo fijo con 5 mL de 1 PBS, repitiendo el lavado tres veces (10 min cada una).
  2. Coloca el cráneo con el lado dorsal hacia abajo en un plato de 10 cm lleno con 1x PBS  (Figura 4A).
  3. Utiliza la punta de una pinza de punta fina para agarrar o presionar la bulla timpánica y retirarla del cráneo (Figura 4B).
    NOTA: Retirar la bulla timpánica es un paso crítico para evitar desgarros meníngeos causados por la adhesión durante la separación del cráneo.
  4. Recorta de cerca a lo largo de la superficie ventral del cráneo durante una distancia de unos 2 mm con tijeras para alisarlos (Figura 4C).
  5. Utiliza pinzas finas, limpia meticulosamente el tejido blanco residual de la región de confluencia de senos nasales (COS) de las meninges (Figura 4D).
    NOTA: La eliminación incompleta del tejido residual es una causa importante de tinción inespecífica en la inmunomarcación.
  6. Utiliza pinzas micro finas para levantar suavemente un borde de las meninges desde el borde del cráneo, luego levanta el borde opuesto (Figuras 4E, Fa).
  7. Agarra el borde en forma de cuenco de las meninges y tira para separarlo del cráneo en la región COS (Figura 4G).
  8. Retira el hueso maxilar con tijeras (Figura 4H).
  9. Agarra de nuevo el borde en forma de cuenco de las meninges y tira para separar las meninges del cráneo en la zona del hueso frontal (Figura 4I).
  10. Coloque las meninges intactas en una placa de 24 pozos que contiene 1 mL de PBS 1x, lista para la teñida.
    NOTA: Si las meninges se rompen durante la autopsia, especialmente en la unión de los senos sagital superior y transverso, la muestra puede no ser adecuada para un análisis posterior. Si se observa una alta tinción de fondo inespecífica, añade un paso de temple tras la fijación de PFA (por ejemplo, incubar con solución de glicina 0,1 M durante 40 min12) para reducir aún más la señal de fondo.

6. Tinción de bloqueo, anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios

  1. Utiliza una pipeta de 1 mL para aspirar el PBS 1x y así las meninges se adhieran al fondo de la placa del pozo.
  2. Bloquear las meninges de montaje completo con una solución bloqueadora de 200 μL en una placa de 24 pozos durante 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: Extiende suavemente las meninges completamente en la solución de bloqueo usando pinzas para asegurar una exposición uniforme.
  3. Usa una pipeta para eliminar la solución bloqueadora.
  4. Incubar las meninges de toda la montura con 200 μL de anticuerpo anti-LYVE-1 diluido (marcador específico de vasoslinfáticos 13) a una dilución 1:200 (concentración final de 1 μg/mL) durante la noche a 4 °C.
  5. Usa una pipeta para eliminar la solución de anticuerpos.
  6. Lava tres veces con 1 PBS (10 minutos cada uno).
  7. Incubar meninges de montaje completo con DAPI (concentración final 1 μg/mL) y Alexa Fluor 488 anti-rata IgG (concentración final 2 μg/mL) durante 1 hora a temperatura ambiente en 1x PBS.
    NOTA: Protege de la luz durante la incubación de anticuerpos.
  8. Usa una pipeta para eliminar la solución de anticuerpos.
  9. Lava tres veces con 1 PBS (10 minutos cada uno).

7. Montaje e imagen

  1. Pipete 100 μL de 1x PBS en el centro de una lámina.
  2. Flota y extiende las meninges de toda la montura dentro de la gota (Figura 5A).
  3. Aspira el PBS 1x para permitir que el tejido se adhiera planamente al portaobjetos (Figura 5B).
  4. Aplica 20 μL de medio de montaje sobre las meninges de montaje completo.
  5. Coloque una capa de cobertura sobre el pañuelo (Figura 5C).
  6. Seque al aire las láminas a temperatura ambiente y guarda las láminas a 4 °C.
    PUNTOS DE PAUSA: Las diapositivas pueden almacenarse a 4 °C durante un mes. Quita la lámina de 4 °C y deja que vuelva a la temperatura ambiente. Elimina cualquier condensación de la superficie deslizante con papel absorbente.
  7. Utiliza un objetivo de 20x para adquirir imágenes de MLV. Configura el canal en FL Green con una longitud de onda de emisión de 518 nm y un tiempo de exposición de 100 ms.

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Resultados

Tras la inyección de OVA-647 en ci.c.m., la imagen in vivo de animales pequeños reveló señales fluorescentes ovaladas distintas distribuidas bilateralmente en la región cervical (Figura 6A). En las inyecciones exitosas, el trazador era claramente visible en los CLNs tras la inyección, con una intensidad de fluorescencia que alcanzaba un pico de aproximadamente 60 minutos (Figura 6B). Además, se observaron señales fluore...

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Discusión

Este protocolo proporciona un método integral para evaluar la función y morfología de los MLV mediante la integración de inyección de CMI, imágenes in vivo de CLNs, disección meníngea y tinción de montaje completo. Una ventaja clave de este enfoque integrado frente a los métodos convencionales es que permite la evaluación simultánea de la función de drenaje linfático y la morfología de los vasos dentro del mismo animal, eliminando la necesidad de cohortes separadas y, por tanto,...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por fondos del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2023YFC2306500), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82502108) y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2024M760542).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ACSF (Artificial Cerebrospinal Fluid)Tocris  Cat# 3525
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (1:1000 dilution)InvitrogenCat# A-21208
Antifade Mounting MediumBeyotimeCat# P0126
Blunt-tipped forcepsRWD Life ScienceCat# F12011-10
BSABeyotimeCat# ST023
CoverslipsCITOTESTCat# 80312-3161
Curved sharp forcepsRWD Life ScienceCat# F11003-11
DAPISigma-AldrichCat# D9542
Depilatory creamVeetN/A
Dish-10 cmThermo Fisher ScientificCat# 150464
Disposable intravenous (IV) infusion needleZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Ethanol-75%Sinopharm Chemical Reagent Cat# 80176961
Fetal Bovine SerumExcellCat# FSD500
Filter-0.22 µmMerck Millipore Cat# SLGPR33RB
Glass slidesCITOTESTCat# 80340-3610
Isoamyl alcoholSinopharm Chemical Reagent Cat# 10003218
IVIS SpectrumPerkinElmerN/A
Micro forcepsShinva Medical Instrument Cat# ZD372RB 
Micro scissorsShinva Medical Instrument Cat# ZO13056R
Microinjection needle (25 µL)Shanghai Gaoge Industry & Trade N/A
Microinjection pumpVoyage PowerCat# QHZS-001A
Mouse: C57BL/6 wild-type, 8 weeks old, male CavensN/A
Needle-30GZhejiang Kindly Medical Devices N/A
Normal SalineBeyotimeCat# ST341
Ovalbumin, Alexa Fluor™ 647 ConjugateThermo Fisher ScientificCat# O34784
Paraformaldehyde Fix Solution-4%BeyotimeCat# P0099
PE-10 tubingShanghai Qiujing Biochemical Reagent and InstrumentN/A
Phosphate-buffered saline (1x PBS)BeyotimeCat# ST447
Rat anti-LYVE-1 (1:200 dilution)Santa CruzCat# sc-65647
StereomicroscopeJonecCat# JSZ6
Stereotaxic frameRWD Life ScienceCat# 68030
Straight scissorsRWD Life ScienceCat# S12007-10
Syringe-1-mL Zhejiang Kindly Medical Devices N/A
Tissue Adhesive I3M VetbondCat# 1469SB
TribromoethanolSigma-AldrichCat# T48402
Triton X-100 Sigma-Aldrich Cat# T8787
VS120 High-throughput fluorescence imaging systemOlympusN/A

Referencias

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