Detección de alta precisión de sitios de edición de ARN mediante escáner calibrado diferencial de edición de ARN

Resumen

Este protocolo describe el uso del Calibrated Differential RNA Editing Scanner (CADRES), un flujo de trabajo computacional que integra la llamada de variantes articuladas ADN–ARN, recalibración optimizada para señales y modelado estadístico consciente de replicaciones para identificar con alta precisión los sitios diferenciales de edición de ARN.

Resumen

La delimitación precisa de la edición de ARN sigue siendo técnicamente un reto porque las alteraciones genuinas post-transcripcionales deben distinguirse de variantes genómicas y artefactos de secuenciación. Esta dificultad es especialmente evidente en la edición de citidina-uridina catalizada por enzimas APOBEC, donde los cambios mezclados de ADN y ARN oscurecen la verdadera señal de edición. El Calibrated Differential RNA Editing Scanner (CADRES) proporciona un marco computacional estructurado para abordar estas limitaciones mediante la interrogación integrada de variantes ADN–ARN y la preservación dirigida de firmas de edición auténticas. Este protocolo presenta el flujo de trabajo CADRES, incluyendo la preparación de datos, la llamada conjunta de variantes de ARN, la recalibración de la calidad base que preserva la señal, el filtrado de artefactos y la evaluación diferencial de la edición de ARN entre condiciones experimentales. CADRES soporta la secuenciación de ARN-seq emparejada y de genoma completo o exoma completo con replicación biológica.  Una estrategia de filtrado en varias etapas, que incluye la eliminación de homopolímeros y el cribado de paraólogo basado en PBLAT, reduce sistemáticamente los falsos positivos mientras preserva los eventos de edición de baja frecuencia. Al combinar la calibración con el modelado consciente de réplicas, CADRES aumenta la precisión y reproducibilidad del análisis de edición de ARN, permitiendo interrogar la dinámica de edición en diversos contextos biológicos. En comparación con los métodos establecidos, CADRES está diseñado para mejorar la precisión en la detección de la edición de ARN, especialmente para eventos C-to-U mediados por APOBEC.

Introducción

La edición de ARN constituye una capa dinámica de regulación post-transcripcional que permite sustituciones de nucleótidos específicas dentro de los transcritos de ARN sin alterar la secuencia de ADN subyacente. En los metazoos, la desaminación de adenosina-inosina (A>I) mediada por enzimas ADAR es la forma predominante y contribuye a la diversificación de los transcritos, la estabilidad del ARNm, la modulación inmune innata y la función^{neuronal 1,2}. Citidina-a-uridina (C>U) (en adelante "C>U" en contexto biológico; La deaminación "C>T" en el contexto de secuenciación), catalizada por miembros de la familia APOBEC, opera junto a estas vías y está implicada en el metabolismo lipídico, la restricción viral, la mutagénesis y los roles reguladores emergentes en la biología inmunitaria y del^cáncer 3,4,5,6,7. Trabajos recientes han demostrado que varias enzimas APOBEC, incluyendo APOBEC1, APOBEC3A y APOBEC3B (A3B), catalizan la edición de ARN en contextos fisiológicos y^patológicos 3,4,7,8,9,10. APOBEC3 enzimas también inducen la edición del ADN, produciendo firmas mutacionales superpuestas que complican la discriminación entre la edición de ARN y la variación^genómica 8,10,11,12.

La secuenciación de nueva generación ha permitido identificar a nivel transcriptoma de posibles sitios de edición de ARN, aunque distinguir las ediciones reales de los SNVs genómicos o del ruido técnico sigue siendo difícil. Los eventos A>I y C>U aparecen como sustituciones A>G y C>T en bibliotecas de ADNc y pueden confundirse por errores de cebado, errores de polimerasa, artefactos de mapeo y cambios específicos de expresión según el contexto. Recursos públicos como REDIportal¹³ catalogan millones de sitios A>I, mientras que las anotaciones C>U siguen siendo escasas, reflejando tanto limitaciones biológicas como analíticas. Por tanto, la identificación fiable de la edición C>U —especialmente los cambios entre condiciones— sigue siendo una necesidad analítica no cubierta.

El objetivo principal del método presentado aquí, el Calibrated Differential RNA Editing Scanner (CADRES), es la identificación precisa de Variantes Diferenciales en ARN (DVRs): sitios de edición que sufren cambios estadísticamente significativos en la profundidad de edición entre dos o más condiciones^{definidas 14}. Al desarrollar este protocolo, buscamos abordar dos obstáculos persistentes. Primero, las ediciones reales de ARN deben distinguirse de las variantes codificadas en ADN. En segundo lugar, las diferencias de edición deben cuantificarse de manera estadísticamente robusta entre conjuntos de datos de RNA-seq replicados biológicamente. La innovación central de CADRES radica en su integración de la llamada conjunta de variantes de ADN/ARN con un tratamiento calibrado de variantes de ARN durante la recalibración de puntuación de calidad base (BQSR). Esta estrategia de "recalibración de potencia" preserva los sitios de edición de ARN recién descubiertos durante la BQSR, evitando así una degradación sistemática de la calidad que comúnmente erosiona la sensibilidad para ediciones de baja^{frecuencia 15, 16, 17}. Este enfoque reduce los falsos negativos y mejora la especificidad en comparación con las pipelines que dependen únicamente de bases de datos incompletas de edición de ARN.

CADRES se sitúa dentro de un panorama de métodos que abordan diferentes aspectos del análisis de la edición de ARN. Artefactos filtrados^{SNPiR 18} y^{RVboost 19} de conjuntos variantes solo de ARN; ^{VaDiR 20} incorpora comparaciones ADN–ARN pero no modela la estructura replicada; ^{rMATS-DVR 21} realiza pruebas diferenciales basadas en GLMM pero se basa exclusivamente en RNA-seq; y JACUSA/JACUSA2^22,23 soportan detección consciente de replicaciones pero no incorporan estrategias conjuntas de interrogación o recalibración de ADN–ARN. CADRES unifica el modelado estadístico consciente de la replicación, la llamada conjunta de variantes de ADN/ARN y la recalibración enriquecida para sitios de edición de novo, proporcionando un flujo de trabajo único optimizado para detectar la edición de ARN dependiente de la condición, incluyendo eventos C>U vinculados a la actividad^APOBEC 10,11,12.

En este contexto, los usuarios pueden considerar que CADRES es apropiado cuando su sistema experimental cumple los siguientes criterios. Primero, está disponible la secuenciación emparejada de ARN-seq y genoma completo o de todo el exoma a partir de las mismas muestras, lo que permite una partición rigurosa de eventos derivados de ARN a partir de variantes codificadas en ADN. En segundo lugar, la cuestión biológica se refiere a los cambios en la edición de ARN entre condiciones —como la inducción enzimática, el estrés ambiental, las etapas de desarrollo o los estados patológicos— donde es esencial la modelización estadística de la profundidad específica de los alelos entre réplicas. En tercer lugar, el investigador busca una mayor especificidad en la detección de edición C>U, donde distinguir eventos de ARN de la mutagénesis de ADN impulsada por APOBEC es indispensable. CADRES es especialmente valioso en sistemas donde la actividad APOBEC induce tanto ediciones de ARN como de ADN, como se demuestra en los modelos A3B^{inducibles 10, 11, 12} y donde los métodos convencionales solo de ARN presentan tasas infladas de falsos positivos debido a SNVs confundentes o artefactos de secuencia repetitiva.

CADRES ofrece varias ventajas prácticas. Su llamada conjunta de variantes de ADN/ARN reduce los falsos positivos provocados por SNV. La recalibración de impulso preserva señales de edición reales, incluyendo eventos novedosos ausentes de las bases de datos de referencia. El GLMM derivado de rMATS proporciona un marco estadísticamente basado en principios para el análisis de edición diferencial entre réplicas. En conjunto, estas características proporcionan una plataforma calibrada y de alta precisión para estudiar la edición dinámica de ARN en entornos experimentales y de enfermedades. En nuestro estudio^{anterior 14}, CADRES fue rigurosamente comparado con métodos establecidos de detección de edición de ARN utilizando conjuntos de datos simulados in silico y modelos reales de células A3B inducibles. En la evaluación in silico, CADRES logró consistentemente puntuaciones de precisión de 0,85–0,95 y puntuaciones de precisión de 0,92–0,98 en números de réplica. El flujo de trabajo general de CADRES se ilustra en la Figura 1.

Protocolo

Este protocolo describe un flujo de trabajo puramente computacional de bioinformática para identificar eventos de edición de ARN C>U utilizando el marco CADRES. Todos los pasos se realizan dentro de un entorno Linux usando la línea de comandos. Solo se utilizan conjuntos de datos de secuenciación disponibles públicamente, y no participan sujetos humanos ni vertebrados.

1. Configuración del entorno e instalación de software

NOTA: Los requisitos mínimos de computación para el flujo de trabajo CADRES son los siguientes: CPU ≥ 8 núcleos (se recomienda 16 núcleos), RAM ≥ 32 GB (64 GB recomendados para conjuntos de datos de genoma completo) y espacio en disco ≥ 100 GB.

1. Confirma que existe un sistema operativo Linux disponible. Abre una ventana de terminal y asegúrate de que hay permiso disponible para instalar en el entorno de usuario actual.
2. Instala un gestor de paquetes Conda si no está ya presente en el sistema. Descarga un instalador para una distribución mínima de Conda desde su página web oficial. Ejecuta el script de instalación siguiendo las instrucciones en pantalla.
3. Verifica que Conda esté activo introduciendo el siguiente comando y asegúrate de que el comando imprima un número de versión válido.
   $ conda --versión
4. Crea un directorio funcional para el flujo de trabajo de CADRES. Navega por este directorio usando:
   $ CD /camino/a/working_directory
5. Descarga el código fuente de CADRES ejecutando:
   $ git clone --branch v1.0.0 https://github.com/junsun-hash/CADRES
6. Introduce el directorio clonado ejecutando:
   $ cd CADRES
7. Crea un entorno Conda dedicado utilizando el archivo environment.yml proporcionado en el repositorio CADRES. Ejecuta el siguiente comando y permite que el proceso de instalación se complete sin interrupciones.
   $ conda env create -f environment.yml
8. Activa el entorno recién creado introduciendo el siguiente comando. Confirma que el entorno ha sido activado comprobando que el aviso del terminal ahora muestra su nombre.
   $ conda activar CUADROS
9. Verifica que las herramientas de línea de comandos necesarias estén instaladas correctamente. Ejecuta cada comando a continuación y confirma que devuelven un número de versión en lugar de un mensaje de error:
   $ python --version
   $ samtools --versión
   $ gatk --ayuda
   $ bedtools --versión
   $ pblat
   NOTA: El conjunto exacto de herramientas incluidas en el entorno CCORES puede variar ligeramente según las actualizaciones del archivo environment.yml. Si falta una herramienta, recrea el entorno o actualiza la lista de dependencias según sea necesario.
10. Asegúrate de que haya suficiente espacio en disco disponible. Confirma que existen al menos 100 GB de espacio libre para genomas de referencia, índices de alineación y archivos intermedios BAM introduciendo:
    $ df -h
11. Confirma que hay permisos de escritura disponibles en todos los directorios de trabajo, de salida y temporales creando un archivo de prueba:
    $ toca test_file.txt
12. Elimina el archivo después introduciendo:
    $ rm test_file.txt

2. Preparación de datos

NOTA: El conjunto de datos representativo utilizado en este protocolo consiste en: HEK293T células con A3B–GFP inducible por doxiciclina; WGS a las 33×; RNA-seq de extremo emparejado específico de cadena (2×150 bp, ≥60 lecturas/muestra); n = 3 réplicas biológicas por condición (DMSO vs. doxiciclina 72 h). Datos completos: SRA PRJNA1211186. Un subconjunto de demostración chr22 se proporciona en el repositorio CADRES.

CADRES requiere: (i) WGS (≥33×) o WES (≥33×); (ii) seq de ARN de extremo emparejado específico para cadena (≥60 millones de lecturas por muestra); (iii) dos condiciones experimentales con ≥2 réplicas biológicas cada una.

1. Prepara el genoma de referencia y la anotación.
   1. Descarga el genoma de referencia (FASTA) y el archivo de anotación GTF desde Ensembl o un repositorio similar. El genoma de referencia recomendado es el ensamblaje primario de Ensembl GRCh38: https://ftp.ensembl.org/pub/release-111/fasta/homo_sapiens/dna/ y la anotación recomendada de GTF es la versión 45 de GENCODE:
      https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_45/.
   2. Indexa la referencia FASTA:
      $ samtools faidx FASTA_FILE.fa
      Asegúrate de que las convenciones de nombres cromosómicos (por ejemplo, "chr1" frente a "1") sean consistentes en todos los materiales de referencia.
2. Obtén los datos de secuenciación.
   1. Obtén archivos DNA-seq FASTQ (WGS o WES) con ≥33× de profundidad.
   2. Obtener archivos FASTQ de ARN-seq de extremo emparejado específicos para cadena con ≥60 millones de lecturas por muestra, en dos condiciones biológicas y al menos dos réplicas biológicas por grupo.
3. Alinea las lecturas de secuenciación de ADN usando BWA-MEM.
   1. Crea un índice BWA:
      Índice de $ bwa Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa -p bwaindex -a bwtsw
   2. Alinea y convierte a BAM:
      $ bwa mem -R '@RG\tID:ID\tPL:platform\tLB:library\tSM:sample_name' bwaindex wgs_R1.fq.gz wgs_R2.fq.gz | Vista de Samtools -B > wgs.bam
4. Alinea las lecturas de secuenciación de ARN usando STAR.
   1. Generar el índice genómico STAR:
      $ STAR --runMode genomeGenerate \
      --genomeFastaFiles Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      --genomeDir STAR_index \
      --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GRCh38.gtf
   2. Alinear lecturas de ARN
      $ STAR \
      --genomeDir STAR_index \
      --readFilesCommand zcat \
      --leerArchivosEn rna_sample1.fq.gz rna_sample2.fq.gz \
      --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GRCh38.gtf \
      --outSAMtype BAM No clasificado \
      --outSAMmapqUnique 60 \
      --outNombreFilyoPrefijo pass1_
      NOTA: Esto produce un archivo de unión de empalme (pass1_SJ.out.tab) que contiene tanto uniones anotadas como novedosas.
   3. Regenerar el índice genómico STAR incorporando nuevas uniones:
      $ cat pass1_SJ.out.tab > SJ_all.tab
      $ STAR --runMode genomeGenerate \
      --genomeFastaFiles Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      --genomeDir STAR_index_2pass \
      --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GRCh38.gtf \
      --sjdbFileChrStartEnd SJ_all.tab
   4. Realiza la alineación de segunda pasada usando el índice actualizado:
      $ STAR \
      --genomeDir STAR_index_2pass \
      --readFilesCommand zcat \
      --leerArchivosEn rna_sample1.fq.gz rna_sample2.fq.gz \
      --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GRCh38.gtf \
      --outSAMtype BAM OrdenadoPorCoordenadas \
      --outSAMmapqUnique 60 \
      --outNombreFileroPrefijo output_name
5. Prepara recursos auxiliares de referencia.
   1. (Recomendado) Obtener dbSNP VCF
      Descarga el VCF humano GRCh38 dbSNP (por ejemplo, la versión 150 de dbSNP) desde el servidor FTP NCBI:
      https://ftp.ncbi.nih.gov/snp/latest_release/VCF/ Coloca el archivo descargado (por ejemplo, dbsnp_150.vcf.gz) en el directorio de trabajo.
      NOTA: Las entradas derivadas del ARN (molType="cDNA") en dbSNP pueden enmascarar los verdaderos sitios de edición de ARN. Excluyéndolos utilizando:
      $ bcftools view -i 'INFO/molType!="cDNA"' dbsnp.vcf.gz -Oz -o dbsnp_no_cDNA.vcf.gz
   2. (Recomendado) Ordenar el VCF de dbSNP
      Ordena el VCF para que sea compatible con el genoma de referencia y el GATK:
      $ gatk SortVcf \
      -Yo dbsnp_150.vcf.gz \
      -O dbsnp_150.sorted.vcf.gz \
      --diccionario de secuencias Homo_sapiens. GRCh38.dict
   3. (Recomendado) Indexa el dbSNP VCF ordenado
      Crea un índice para el VCF ordenado de dbSNP:
      $ gatk IndexFeatureFile -I dbsnp_150.sorted.vcf.gz
      NOTA: Se requiere un diccionario de referencia correspondiente. Si el expediente Homo_sapiens. GRCh38.dict falta, généalo de la siguiente manera:
      $ gatk CreateSequenceDictionary \
      -R Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      -O Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.dict
   4. (Recomendado) Obtener VCF de la línea germinal de gnomAD
      Descarga el VCF de los sitios variantes de la línea germinal gnomAD de GRCh38 desde: https://gnomad.broadinstitute.org/downloads Utiliza el VCF genómico apropiado para la tubería (por ejemplo, gnomad.genomes.vX.X.sites.vcf.gz).
   5. (Recomendado) Ordenar el VCF de gnomAD
      Ordena el VCF de gnomAD usando el mismo diccionario de referencia para asegurar la compatibilidad:
      $ gatk SortVcf \
      -Yo gnomad.vcf.gz \
      -O gnomad.sorted.vcf.gz \
      --diccionario de secuencias Homo_sapiens. GRCh38.dict
   6. (Recomendado) Indexar el VCF ordenado de gnomAD
      Crea un índice para el VCF ordenado de gnomAD:
      $ gatk IndexFeatureFile -I gnomad.sorted.vcf.gz
      NOTA: Asegúrese de que la denominación cromosómica (por ejemplo, "chr1" frente a "1") coincida con la referencia FASTA antes de ejecutar SortVcf.
6. Obtén una referencia conocida de edición de ARN.
   NOTA: Un archivo de referencia REDIportal compatible (rediportal.txt) adecuado para CADRES está curado dentro del repositorio CADRES y puede descargarse directamente desde:
   https://github.com/junsun-hash/CADRES/releases/tag/v1.0.0. Este archivo se utiliza para anotar eventos de edición conocidos en el Paso 3.
7. Prepara anotaciones genéticas en formato RefGene. Descarga la anotación RefGene (por ejemplo, refGene.txt.gz de UCSC). Descomprime si es necesario y asegúrate de que los nombres de los cromosomas coincidan con los del genoma de referencia.
   NOTA: Un ejemplo adecuado para CADRES está seleccionado dentro del repositorio CADRES y puede descargarse directamente desde:
   https://github.com/junsun-hash/CADRES/releases/tag/v1.0.0

3. Ejecución del flujo de trabajo analítico CADRES

NOTA: La sección 3 se ejecuta en el terminal Linux con el entorno CADRES Conda activado.

1. Calibración y recalibración de sobrealimentación
   NOTA: El paso 1 estandariza los archivos BAM y realiza la recalibración Boost—un BQSR mejorado que incorpora dbSNP, gnomAD y un conjunto preliminar de candidatos a la edición de ARN para preservar señales de edición genuinas. Lista todos los archivos ARN BAM separados por espacios. Salida: BAMs recalibrados (sufijo: _recalibration.bam) y sitios candidatos Boost.
   1. Para ejecutar el Paso 3.1:
      $ Python pipeline_step1_calibration.py \
      --rna_bams /camino/hac/rna_sample1.bam /camino/hac/rna_sample2.bam ... \
      --dna_bam /camino/hacia/wgs_normal.bam \
      --genoma /path/to/hg38.fa \
      --known_snv /camino/hacia/dbsnp.sorted.vcf.gz \
      --output_dir ./output/step1_calibration \
      --prefijo project_demo
      NOTA: Los candidatos de impulso se construyen a partir de una llamada preliminar conjunta ADN-ARN Mutect2 (--máximos-eventos-en-región 4, solo filtro PASS; sin umbrales adicionales de AF/calidad). El filtrado por homopolímero y el filtrado repetido se gestionan en el Paso 3.2.
2. Llamada de variantes, estimación de contaminación y filtrado
   NOTA: El paso 3.2 realiza la llamada conjunta de variantes ADN-ARN con estimación de contaminación (vía gnomAD), luego filtra los candidatos por contexto de homopolímero y realineamiento PBLAT. Salida: {prefijo}.final.vcf.
   1. Para ejecutar el Paso 3.2:
      $ Python pipeline_step2_variant_calling.py \
      --rna_bams ./output/step1_calibration/rna_sample1_split_recalibration.bam ... \
      --dna_bam ./output/step1_calibration/DNA_processed_recalibration.bam \
      --genoma /path/to/hg38.fa \
      --gnómada /camino/hacia/gnomad.sorted.vcf.gz \
      --output_dir ./output/step2_variant_calling \
      --prefijo project_demo
      NOTA: Este paso produce el conjunto final de llamadas variantes (project_demo.final.vcf), estrictamente filtrado, que representa diferencias ARN-ADN de alta confianza en todas las muestras. Parámetros clave: Mutect2 --calidad base mediana mínima 12, --eventos máximos en la región 4; PBLAT minbasequal 5; todos están preconfigurados en el script de la pipeline.
3. Pruebas estadísticas y anotación funcional
   NOTA: El paso 3.3 cuantifica la edición diferencial de ARN usando un GLMM adaptado de rMATS (corrección de Benjamini-Hochberg FDR), y anota cada sitio con la región génica, símbolo génico y estado de edición conocido. Salida: {prefijo}_Result.txt (DVRs con valores P y FDR).
   El filtro de realineamiento PBLAT elimina candidatos que mapean a múltiples loci genómicos, mejorando la especificidad en regiones repetitivas. Su THREAD_COUNT interna está controlada por la bandera --threads en pipeline_step2_variant_calling.py.
   1. Para ejecutar el Paso 3.3:
      $ Python pipeline_step3_statistical_test.py \
      --group1_rna_bams ./output/step1_calibration/control_rep1.bam ... \
      --group2_rna_bams ./output/step1_calibration/treated_rep1.bam ... \
      --final_vcf ./output/step2_variant_calling/project_demo.final.vcf \
      --genoma /path/to/hg38.fa \
      --known_snv /camino/hacia/dbsnp.sorted.vcf.gz \
      --known_editing /camino/hacia/rediportal.txt \
      --gene_anno /camino/hacia/refGene.txt \
      --output_dir ./output/step3_statistical_test \
      --etiquetas controladas
      NOTA: Parámetros clave: samtools mpileup -q 30 (calidad mínima de mapeo), -Q 17 (calidad mínima de base); prueba de razón de verosimilitud rMATS-GLMM con corte Δψ = 0,0001, enlace logit binomial con penalización normal multivariante consciente de réplicas (rho = 0,9); corrección de Benjamini-Hochberg FDR; todos están preconfigurados en el script de la tubería
      Los tres pasos de la tubería soportan la ejecución multihilo mediante la bandera --threads (por defecto: 4 por paso). El paso 2 además acepta --contamination_threads (por defecto: 2).

4. Inspección y visualización de resultados

1. Una vez completado el flujo de trabajo CADRES, navega al directorio de salida. El archivo principal de resultados, {prefijo}_Result.txt, lista todas las variantes diferenciales de ARN (DVRs) detectadas, incluyendo coordenadas genómicas, alelos, conteo de alelos a nivel de réplica, fracciones de edición, diferencias entre grupos y métricas estadísticas asociadas (valor P y FDR). También se incluyen anotaciones a nivel de gen (símbolo del gen, región, cadena, tipo de variante, estado conocido del SNP/edición). El archivo resumen adjunto, {prefijo}_Result_summary.txt, proporciona recuentos de cada tipo de sustitución y su clasificación en DVRs SNP, DVRs conocidos para edición de ARN y DVRs novedosos.
2. (Opcional) Genera visualizaciones estándar ejecutando el script de análisis posterior. Abre una sesión R e introduce:
   Consola R:
   fuente("Post-analysis.R")
   El guion Post-analysis.R está incluido en https://github.com/junsun-hash/CADRES/.
3. Aparecerá un diálogo de selección de archivos; Elige {prefijo}_Result.txt. El guion produce seis figuras de PNG.
   NOTA: El diálogo de selección de archivos requiere una sesión R en el escritorio. En servidores headless, edita la variable input_file directamente (línea 10 de Post-analysis.R) y ejecuta Rscript Post-analysis.R.

Resultados

Para evaluar CADRES bajo condiciones experimentales realistas, utilizamos un sistema de APOBEC3B inducible (A3B) en 293 células T. Se introdujo en las células 293T un constructo lentiviral sensible a la doxiciclina que expresa A3B-GFP, y se seleccionaron integrantes estables con puromicina. La inducción con doxiciclina durante 72 horas produjo una expresión robusta de A3B-GFP, confirmada por fluorescencia de GFP y un aumento de los niveles de ARNm de A3B. Las muestras inducidas y no indu...

Discusión

El flujo de trabajo CADRES presentado aquí proporciona una estrategia calibrada e internamente consistente para detectar eventos diferenciales de edición de ARN con alta especificidad, especialmente la desaminación C>U catalizada por enzimas APOBEC. Varios pasos dentro del protocolo son fundamentales para su precisión. La secuenciación genómica y transcriptómica emparejada es esencial para distinguir ediciones genuinas de ARN de polimorfismos subyacentes de ADN, mientras que el procedimi...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BCFtools	Samtools project	N/A	Versión 1.21. Llamada de variantes y manipulación de VCF. URL: https://github.com/samtools/bcftools
Bedtools	Quinlan Lab	N/A	Versión 2.31.1. Operaciones aritméticas genómicas. URL: https://github.com/arq5x/bedtools2
Biopython	Proyecto Biopython	N/A	Versión 1.85. Herramientas Python para biología molecular. URL: https://www.biopython.org
BWA-MEM	GitHub (lh3/bwa)	N/A	Versión 0.7.18. Alineación de DNA-seq. URL: https://github.com/lh3/bwa
Código fuente CADRES	GitHub (junsun-hash/CADRES)	N/A	Versión 1.0.0. Scripts del pipeline CADRES. URL: https://github.com/junsun-hash/CADRES
Conda o Miniconda	Anaconda Inc.	N/A	Versión 23.1. Gestor de paquetes y entorno. URL: https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
dbSNP GRCh38 VCF	NCBI	N/A	Versión 155. Base de datos de variantes comunes de linaje germinal. URL: https://ftp.ncbi.nih.gov/snp/
GATK4	Broad Institute	N/A	Versión 4.3.0.0. Kit de herramientas de análisis genómico. URL: https://github.com/broadinstitute/gatk
Git	Software Freedom Conservancy	N/A	Versión 2.39. Sistema de control de versiones. URL: https://git-scm.com
gnomAD GRCh38 VCF	Broad Institute	N/A	Versión 3.1. Frecuencias de alelos poblacionales. URL: https://gnomad.broadinstitute.org
Archivo de anotación GTF	Ensembl	N/A	Versión 109. Anotac.ion génica para GRCh38. URL: https://www.ensembl.org
Genoma de referencia humano GRCh38	Ensembl/UCSC	N/A	Versión 109. Ensamblaje del genoma de referencia. URL: https://www.ensembl.org o https://hgdownload.soe.ucsc.edu
Estación de trabajo o servidor Linux	Varios	N/A	Ubuntu 20.04. Requerida arquitectura x86_64. URL: https://ubuntu.com
pblat	UCSC Genome Browser	N/A	Versión 2.5.1. Realineamiento paralelo BLAT. URL: https://github.com/ucscGenomeBrowser/kent
Picard	Broad Institute	N/A	Versión 2.20.8. Manipulación de datos NGS. URL: https://github.com/broadinstitute/picard
Python	Python Software Foundation	N/A	Versión 3.9.19. Lenguaje de programación. URL: https://www.python.org
R	R Foundation	N/A	Versión 4.5.2. Computación estadística. URL: https://www.r-project.org
Paquete R: forcats	CRAN	N/A	Versión 1.0.0. Manipulación de factores. URL: https://cran.r-project.org/package=forcats
Paquete R: ggplot2	CRAN	N/A	Versión 4.0.1. Visualización de datos. URL: https://cran.r-project.org/package=ggplot2
Paquete R: ggrepel	CRAN	N/A	Versión 0.9.5. Repulsión de etiquetas de texto. URL: https://cran.r-project.org/package=ggrepel
Paquete R: lme4	CRAN	N/A	Versión 1.1.35. Modelos lineales de efectos mixtos. URL: https://cran.r-project.org/package=lme4
Paquete R: readr	CRAN	N/A	Versión 2.1.5. Lectura rápida de archivos. URL: https://cran.r-project.org/package=readr
Paquete R: stringr	CRAN	N/A	Versión 1.6.0. Manipulación de cadenas. URL: https://cran.r-project.org/package=stringr
Referencia REDIportal	Universidad de Bolonia	N/A	Versión 2.0. Base de datos de sitios de edición de ARN A-a-I. URL: http://srv00.recas.ba.infn.it/atlas/
Anotación RefGene	UCSC Table Browser	N/A	Versión 109. Anotac.ion de estructura génica. URL: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables
Samtools	Samtools project	N/A	Versión 1.21. Manipulación de archivos BAM. URL: https://github.com/samtools/samtools
Alineador STAR	GitHub (alexdobin/STAR)	N/A	Versión 2.7.11b. Alineación de RNA-seq. URL: https://github.com/alexdobin/STAR