Artículo de revisión
La terapia génica con virus adenoasociado (AAV) requiere Materiales Estándar de Referencia (RSMs) bien caracterizados para garantizar mediciones analíticas precisas y reproducibles dentro y entre laboratorios. Esta revisión examina la necesidad crítica de los RSM, evalúa los estándares comerciales y farmacopeicos disponibles, y proporciona estrategias prácticas para el desarrollo interno de RSM que avancen en terapias AAV seguras y eficaces.
El virus adeno-asociado (AAV) se ha convertido en un vector líder para la terapia génica in vivo, con ocho productos actualmente autorizados para su comercialización. A medida que el campo evoluciona rápidamente, la necesidad de métodos analíticos robustos para caracterizar atributos críticos de calidad (CQAs) —incluyendo el título de la cápside, el título del genoma, el contenido de la cápside (relación vacía/completa), la identidad y la pureza— sigue creciendo. Los Materiales Estándar de Referencia (RSM) desempeñan un papel fundamental al proporcionar lotes AAV bien caracterizados y estandarizados que sirven como referencias universales. Los RSM facilitan la validación de tecnologías analíticas emergentes, garantizan la precisión y reproducibilidad de los ensayos rutinarios y permiten la comparabilidad interlaboratorio. Sin embargo, el desarrollo de RSM AAV universales está fundamentalmente limitado por la compleja biología, la diversidad de serotipos, genomas vectoriales y variantes de cápsides diseñadas, lo que hace necesarias normas específicas de serotipo y aplicación. Los avances recientes, incluyendo la publicación de estándares farmacopédicos de referencia AAV8 caracterizados por múltiples métodos ortogonales, representan un avance significativo hacia la armonización de la medición. Esta revisión aborda la necesidad crítica de los RSM en la terapia génica AAV, evalúa los estándares farmacopeicos y comerciales actualmente disponibles, y describe estrategias prácticas para el desarrollo interno de RSM. Establecer RSMs AAV robustos y específicos para serotipo y protocolos operativos estándar (SOP) armonizados es esencial para avanzar en la terapia génica de AAV y garantizar la precisión, reproducibilidad y seguridad en la investigación, desarrollo y fabricación clínica.
La terapia génica ofrece una estrategia transformadora para tratar enfermedades genéticas y adquiridas mediante la entrega de material genético funcional a las células del paciente para corregir o regular la expresión génica. Entre ellos, los virus adenoasociados (AAVs) destacan por sus aplicaciones in vivo debido a su diversidad de tropismo tisular en diferentes serotipos y la expresión sostenida de transgenesepisómicos 1.
Los AAV son virus compactos (~25 nm de diámetro) de ADN del género Dependoparvovirus de la familia Parvoviridae . Estos virus no son patógenos y defectuosos en replicación, requiriendo virus auxiliares como adenovirus o virus del herpes simplex para sureplicación 2. El genoma AAV tiene dos genes, rep y cap, flanqueados por dos repeticiones palindrómicas de 145 pares de bases conocidas como repeticiones terminales invertidas (ITRs)3. Los vectores AAV recombinantes (rAAV) se generan reemplazando secuencias codificantes virales por casetes terapéuticos que contienen un promotor, transgén y elementos reguladores flanqueados por ITRs. Durante la producción, los genes rep y cap se administran en trans, facilitando la replicación y el empaquetado del casete terapéutico en cápsides virales y produciendo partículas no integradoras y deficientes en replicación que mantienen una capacidad de transducción robusta mientras previenen la replicación viralsalvaje 4. Ocho terapias génicas basadas en rAAV han recibido autorización de comercialización de la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) o de la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. (FDA), y los ensayos clínicos con AAV están en aumento. A enero de 2025, se habían registrado 343 ensayos clínicos de AAV a nivel mundial, lo que representa un aumento del 34% respecto a los 255 ensayos a mediados de 2022. Esta rápida expansión clínica intensifica la necesidad de un control de calidad riguroso para garantizar la seguridad delpaciente 6.
Garantizar que los productos rAAV sean seguros y eficaces para el uso humano requiere una caracterización exhaustiva de los atributos críticos de calidad (CQAs), incluyendo cantidad, potencia, pureza, identidad, seguridad y estabilidad. Sin embargo, la caracterización de AAV sigue siendo inherentemente desafiante debido a la complejidad estructural de estos vectores. Los AAVs son partículas icosaédricas compuestas por tres proteínas cápsides virales (VP1, VP2, VP3), ensambladas en una proporción aproximada de 1:1:10, y las variaciones en el ensamblaje proteico pueden afectar la eficiencia de latransducción 7. La carga útil terapéutica de ADN debe ser empaquetada en el cápside con alta fidelidad; las poblaciones de cápsides heterogéneas se generan inherentemente durante la producción de rAAV, consistiendo en cápsides que contienen un genoma completo (cápsides completas), un genoma parcial (cápsides parcialmente llenas) o sin material genético (cápsides vacías). A esta complejidad se suma que diferentes serotipos de VA presentan eficiencias de empaquetado, tropismos tisulares y perfiles inmunológicos distintos, lo que hace necesaria la elaboración de ensayos adaptados al serotipo. Más allá de estos desafíos biológicos, existe un problema crítico en cómo se realizan las mediciones. Diferentes laboratorios utilizan distintos ensayos, protocolos y enfoques de análisis de datos para medir la misma CQA. Como resultado, los valores reportados para muestras idénticas pueden variar en órdenes de magnitud entre los sitios8. Incluso dentro de un solo laboratorio, los cambios a lo largo del tiempo en los reactivos, instrumentos, operadores o entornos de análisis pueden provocar cambios en los resultados respecto al mismolote 9. Cuando las mediciones no son comparables, establecer asociaciones fiables entre las CQAs y los resultados preclínicos o clínicos se vuelve complicado, lo que complica la toma de decisionesregulatorias 10,11.
La estandarización pretende abordar este problema asegurando la comparabilidad de las medidas. En la analítica farmacéutica, la estandarización abarca dos aspectos clave: el uso de materiales estándar físicos de referencia (RSM) comunes y la adhesión a procedimientos operativos estándar detallados y armonizados (SOPs), asegurando que diferentes laboratorios midan de forma consistente el título, la identidad, la calidad, la potencia y la pureza12. Los RSM son muestras bien caracterizadas que actúan como referencias. Al validar ensayos contra el mismo RSM, los laboratorios anclan sus mediciones a un punto de referencia común. Esto reduce la variabilidad entre laboratorios y permite comparar de forma fiable los resultados de diferentes estudios, productos y centros de fabricación13. Además, también actúa como un control interno para monitorizar el rendimiento del ensayo y monitorizar la consistencia a lo largo deltiempo 14. Además, los procedimientos operativos estándar garantizan que los métodos analíticos se ejecuten de forma coherente entre laboratorios, minimizando la variabilidad derivada de diferencias en el pretratamiento de la muestra, instrumentación, estrategia de calibración, procesamiento de datos y prácticadel operador 8,9,12. Juntos, estos dos componentes forman la base de un sólido marco de estandarización analítica.
Esta revisión aborda sistemáticamente los aspectos clave de la estandarización en la analítica de AAV. Examinamos los tipos de RSMs y sus aplicaciones analíticas, evaluamos los RSM específicos de AAV actualmente disponibles para su idoneidad para su propósito, y proporcionamos orientación práctica consolidada para la producción, purificación, caracterización y almacenamiento interno de RSM. Además, identificamos los desafíos actuales en la fabricación y las limitaciones analíticas. Reconociendo que los RSM por sí solos no son suficientes, también discutimos los SOP armonizados como un componente complementario e igualmente importante de la estandarización. En conjunto, esta revisión está destinada a ser una referencia práctica para científicos analíticos, profesionales de la calidad y fabricantes que buscan avanzar en la armonización de la medición y apoyar la toma de decisiones regulatorias basadas en la ciencia en la terapia génica AAV.
1. RSM: definiciones y necesidad
Los RSM se organizan jerárquicamente, con dos tipos principales: RSM primarios y secundarios. Según la Guía ISO 30, un estándar primario se define como un "estándar designado o ampliamente reconocido como poseedor de las mayores cualidades metrológicas y cuyo valor es aceptado sin referencia a otros estándares de la misma magnitud, dentro de un contexto especificado". Por ejemplo, los RSM de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP), Farmacopea Europea (Ph. Eur), Farmacópea Británica (BP), etc., que han sido ampliamente caracterizados mediante estudios multilaboratorio, califican como RSM primaria. Posteriormente, los fabricantes individuales utilizan estos RSM primarios para calibrar y calificar sus propios materiales de referencia de trabajo propietarios, que sirven como RSMs secundarios para pruebas rutinarias de controlde calidad 12,15. Por ello, la ISO define un RSM secundario como un "estándar cuyo valor se asigna mediante la comparación con un estándar primario de la misma cantidad". Este enfoque jerárquico garantiza la trazabilidad: las mediciones internas se remontan a estándares primarios, que a su vez se caracterizan mediante métodos analíticos de última generación16. El uso de RSMs proporciona referencias comunes que permiten a los fabricantes calibrar y validar sus métodos analíticos hasta el mismo punto de referencia, lo que conduce a mediciones más precisas. Por ello, las autoridades reguladoras fomentan el uso de RSMs primarios para calibrar los RSM internos y validar métodos de prueba, mejorando la consistencia en toda la fabricación deAAV 17,18. Esto permite la estandarización entre diversas técnicas analíticas, lo que conduce a una mejor comparación de los resultados de caracterización de rAAV entre laboratorios y diferentesproductos 17,19. La mejor comparabilidad mejora la comprensión de los riesgos de seguridad potencialmente asociados a dosis elevadas o impurezas relacionadas con el producto, como cápsides vacías y parcialmente llenas. En última instancia, estos conocimientos pueden informar la formulación de políticas regulatorias basadas en la ciencia, como un umbral mínimo de cápsides completas, análogo al criterio del ≥70% de células viables para terapias celulares somáticas, contribuyendo así a productos de terapia génica más seguros yfiables 13,20,21.
Para rAAV, varias CQAs ilustran claramente la necesidad de estandarización. El título del genoma del vector determina directamente la dosis del paciente; Títulos inexactos corren el riesgo de subdosis o sobredosis. La PCR cuantitativa (qPCR) y la PCR digital (dPCR) se utilizan ampliamente para medir el título, pero los resultados pueden diferir para la misma muestra si se utilizan diferentes calibrantes o protocolos de curva estándarinternos 11. El contenido de cápsides (la proporción de cápsides llenas, parcialmente llenas y vacías) es otra CAQ crítica, ya que las cápsides vacías y parcialmente llenas pueden contribuir a la inmunogenicidad o reducir la eficacia6. Se utilizan más de diez técnicas diferentes para medir el contenido de la cápside, incluyendo ultracentrifugación analítica (AUC), cromatografía de exclusión por tamaño acoplada a dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS), fotometría de masas (MP), espectrometría de masas por detección de carga (CDMS), microscopía electrónica (EM), cromatografía de intercambio aniónico (AEX), enfoque isoeléctrico capilar (cIEF), espectroscopía ultravioleta-visible (UV/Vis), etc. Además, el contenido de cápsides suele estimarse indirectamente utilizando la proporción entre el título del genoma del vector y el título de la partícula viral, determinada por qPCR o dPCR y ELISA, respectivamente (PCR/ELISA)22. Cada técnica mide diferentes propiedades físicas y puede informar de distintos valores de contenido de la cápside para las mismas muestras. Un estudio interlaboratorio reciente del NIST que comparó UV/Vis, AUC, SEC-MALS y PCR/ELISA demostró una variabilidad significativa entre métodos e interlaboratorios, con PCR/ELISA mostrando una reproducibilidad particularmente baja y AUC mostrando una divergencia significativa entre laboratorios a pesar de ser ampliamente considerado un métodode referencia 8. Estos hallazgos indican que reducir la variabilidad en la analítica de la AAV requiere tanto RSMs compartidos como flujos de trabajo analíticos armonizados, como se discute en la Sección 5.
2. paisaje de RSM rAAV
Los esfuerzos para establecer RSMs para AAV han dado lugar a dos fuentes que proporcionan RSMs AAV primarios. Entre las fuentes farmacopéicas, la USP es actualmente el único proveedor de RSM primario de AAV. Más allá de los USP, los RSM AAV primarios también están disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC). También está disponible una gama creciente de RSMs secundarios comerciales para múltiples serotipos, reflejando los esfuerzos continuos de la comunidad para abordar la falta de estandarización inherente a la caracterización de los AAV. La Tabla 1 resume los materiales actualmente disponibles para el RSM de AAV y sus características clave.
3. Estrategias de fabricación de RSM:
Producir RSM AAV de alta pureza presenta desafíos inherentes. Lograr preparaciones de cápside 100% vacías se complica por el hecho de que las cápsides "vacías" pueden contener material genético residual. De manera similar, obtener preparaciones puras de cápsides completas resulta difícil porque las cápsidas vacías y parcialmente llenas comparten características físicas similares y se co-purifican con las cápsidas completas durante los procesosde separación 10. A pesar de estos desafíos, los avances significativos en la tecnología de producción permiten ahora el enriquecimiento de poblaciones de cápsides predominantemente llenas o mayormente vacías. La siguiente sección ofrece una visión completa de las tecnologías actuales de producción y separación, así como de los métodos de caracterización y condiciones de formulación que pueden emplearse para producir, caracterizar y almacenar los RSM AAV.
4. Caracterización analítica: Definición del estándar
Una vez producido, purificado y formulado el RSM, se realiza una caracterización analítica exhaustiva. Este paso garantiza la calidad del RSM y su aplicabilidad como referencia en diferentes métodos analíticos. Emplear técnicas analíticas ortogonales para evaluar los mismos atributos de calidad es especialmente importante para garantizar la robustez y, por tanto, se recomienda encarecidamente. Los atributos clave de calidad específicamente para AAV RSM pueden dividirse en tres categorías: título, identidad y pureza, según se enumera en la Tabla 2.
5. Procedimientos estándar estándar armonizados como segundo pilar de la estandarización analítica de la AAV
Más allá de la disponibilidad de RSMs bien caracterizados, una estandarización significativa en la analítica de AAV también requiere procedimientos estándar estándar armonizados y suficientemente detallados. Incluso cuando se aplica el mismo método analítico, los resultados pueden diferir sustancialmente entre laboratorios debido a diferencias en el pretratamiento de la muestra, ajustes instrumentales, estrategia de calibración, procesamiento de datos e interpretación, factores que han demostrado contribuir a la variabilidad interlaboratorio independientemente de la plataforma analíticaen sí 8,9.
Esto se ilustra en un estudio colaborativo entre el NIST, el Instituto Nacional para la Innovación en la Fabricación de Biofármacos (NIIMBL) y USP, en el que seis laboratorios evaluaron las mismas muestras de AAV5 y AAV8 para el contenido de cápsides utilizando cuatro métodos. Los métodos ópticos, incluyendo SEC-MALS y UV/Vis, mostraron la mayor concordancia interlaboratorio, mientras que PCR-ELISA mostró baja reproducibilidad y se consideró inadecuado para uso cuantitativo sin mayor armonización. A pesar de ser ampliamente considerado un método de referencia de referencia, el SV-AUC mostró una mayor variabilidad interlaboratorial que el SEC-MALS, y los esfuerzos de seguimiento para desarrollar procedimientos estandarizados del SV-AUC han sido identificados como un siguiente pasoimportante 8,81.
Una conclusión similar ha surgido para la determinación del título genómico mediante dPCR, donde el pretratamiento de la muestra, la estrategia de extracción, la plataforma del instrumento, las condiciones de dilución, el momento de la lisis de la cápside y la historia de congelación-deshielo pueden afectar los valores reportados. Es importante destacar que se demostró que un control procedimental más estricto reduce sustancialmente la variabilidad, subrayando aún más el valor de las SOParmonizadas 9.
Por tanto, los RSM y los SOP deben considerarse pilares complementarios de la estandarización analítica de la AAV. Los RSM proporcionan el ancla de medición necesaria para la trazabilidad y calibración, mientras que los SOP reducen la variabilidad de procedimientos y ayudan a garantizar que los valores asignados se reproduzcan de forma consistente entre analistas, instrumentos y laboratorios.
La terapia génica rAAV avanza más rápido que la capacidad del campo para caracterizar de forma consistente atributos de calidad. Esta revisión demuestra que la principal barrera para la caracterización comparable de AAV no es la falta de herramientas analíticas, sino la ausencia de anclajes de medición compartidos y flujos de trabajo armonizados. Los RSM abordan este desafío transformando mediciones dependientes del método en valores rastreables y comparables. Los RSM permiten la validación de métodos, mejoran la reproducibilidad entre laboratorios y proporcionan controles continuos para detectar la deriva del ensayo. Sin embargo, la producción de RSM AAV de alta calidad sigue siendo técnicamente exigente debido a la dificultad de obtener poblaciones puras de cápsidas vacías y completas, la necesidad de una caracterización ortogonal completa y la necesidad de estabilidad a largo plazo bajo condiciones de almacenamiento definidas. Los avances recientes en tecnologías de fabricación y purificación han permitido la producción de preparaciones predominantemente vacías y completas de la cápside, que pueden utilizarse para generar RSMs internos, y las ofertas actuales de organismos farmacopeiales (USP), consorcios colaborativos (ATCC) y proveedores comerciales representan un avance significativo. Sin embargo, el desarrollo de RSM AAV universales está fundamentalmente limitado por la diversidad de serotipos, genomas vectoriales y, cada vez más, variantes de cápsides diseñadas. A diferencia de los anticuerpos monoclonales, la heterogeneidad del AAV exige RSM específicos de serotipo y aplicación. Esta complejidad se amplifica aún más por las cápsides híbridas y/o diseñadas, que requieren que los desarrolladores mantengan RSMs primarios internos propietarios, fragmentando así el panorama de medición. Además, otros atributos de calidad como modificaciones posttraduccionales (PTM) han sido destacados como posibles CQA y carecen de RSMs bien caracterizados para los PTM, creando una brecha crítica en la comprensión de este atributo vectorial. Más allá de la disponibilidad de RSM, los procedimientos estándar de operaciones estándar (SOP) armonizados son igualmente críticos. El campo se beneficiaría de métodos compendiales—protocolos estandarizados y detallados publicados por organismos farmacopéicos—que garanticen que todos los laboratorios ejecuten pruebas consistentes y controladas para las CQAs de AAV. Los documentos de orientación escritos que detallen las mejores prácticas para métodos de uso común reducirían aún más la variación entre laboratorios y armonizarían los flujos de trabajo analíticos. Al establecer RSMs de medición de AAV rastreables e implementar prácticas de caracterización consistentes y precisas, la comunidad puede fortalecer la base científica que vincula las CQAs con la seguridad y eficacia, apoyar la toma de decisiones regulatorias con confianza y, en última instancia, ofrecer terapias génicas más seguras y fiables a los pacientes.
Tabla 1: RSMs rAAV actualmente disponibles y sus características
Esta tabla resume los materiales de referencia estándar rAAV disponibles y sus características clave. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Conjunto recomendado de métodos analíticos para la caracterización interna de RSM
Esta tabla resume los métodos analíticos recomendados para la caracterización interna de RSM. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.
Los autores declaran que no hay conflictos de interés
Este proyecto ha recibido financiación del Programa Marco de la Unión Europea para la Investigación e Innovación, Horizon Europe, bajo el Acuerdo de Subvención Nº 101119880. Este proyecto fue financiado por la subvención "Flandes Resiliencia" del Gobierno flamenco, procedente del "Mecanismo Europeo de Recuperación y Resiliencia" (RRF) (VV021/13).
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