Preparación estandarizada del músculo liso duodenal aislado del conejo para la evaluación farmacológica in vitro de la actividad contráctil

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para estandarizar la preparación del músculo liso duodenal aislado de conejos para la evaluación farmacológica in vitro , utilizando un Sistema de Experimento de Músculo Liso Horizontal a Temperatura Constante para el registro en tiempo real de la actividad contráctil.

Resumen

La actividad contráctil coordinada del músculo liso gastrointestinal forma la base fisiológica para mantener funciones normales de digestión, absorción y transporte, con su disfunción estrechamente asociada a los trastornos de la motilidad. La técnica de perfusión de órganos aislados elimina interferencias complejas in vivo —como factores neurales, endocrinos y hemodinámicos— sirviendo como modelo clásico para estudios farmacológicos. Con este fin, este estudio detalla un protocolo escalonado para la preparación estandarizada del músculo duodenal liso aislado en conejo. El flujo de trabajo procedimental destaca los pasos críticos de preparación de soluciones, eutanasia del conejo, realización de una laparotomía aséptica precisa en el abdomen medio para una rápida excisión de tejidos, suspensión de las tiras de músculo liso y calibración de los transductores para el registro de tensiones en tiempo real. Basándonos en esta plataforma técnica, validamos aún más el método evaluando los efectos del Líquido Oral Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL) sobre contracciones espontáneas y contracciones tétánicas inducidas por acetilcolina/cloruro de bario. En conclusión, este protocolo proporciona un marco metodológico robusto y altamente reproducible, proporcionando una plataforma de cribado in vitro ampliamente aplicable para la evaluación farmacológica de agentes terapéuticos que actúan en la motilidad gastrointestinal.

Introducción

La actividad contráctil coordinada del músculo liso gastrointestinal sirve como base fisiológica para mantener funciones digestivas, absorbentes y de transporte^normales. Su disfunción está estrechamente asociada a varios trastornos clínicos comunes, incluyendo el síndrome de intestino^{irritable 2}, la dispepsia^{funcional 3} y los trastornos postoperatorios de motilidad^{gastrointestinal 4}. Esclarecer los mecanismos moleculares y farmacológicos que regulan la actividad del músculo liso es crucial para desarrollar nuevas terapias procinéticas o antiespasmódicas. En este campo de investigación, la técnica de perfusión de órganos aislados sirve como modelo clásico. Ofrece un valor práctico al eliminar interferencias complejas in vivo como factores neurales, endocrinos y hemodinámicos, permitiendo así una evaluación directa y precisa de los efectos de fármacos o sustancias activas sobre el tono muscular^{liso 5,6}.

Establecer protocolos estables y fiables para la preparación in vitro de tejidos y el registro de datos es esencial para obtener resultados reproducibles y de alta calidad. Los métodos experimentales existentes en el músculo intestinal in vitro requieren una mayor optimización y estandarización en varias áreas: manejo estandarizado de animales experimentales, técnicas quirúrgicas meticulosas para la extracción de tejidos, control ambiental consistente de los sistemas de perfusión y adquisición automatizada de datos junto con análisis estandarizados. Por ejemplo, la temperatura y los niveles de pH del fluido de perfusión, el daño mecánico durante la extracción de tejidos y la configuración de la precarga tisular pueden afectar significativamente la viabilidad tisular e introducir errores experimentales. Estos factores comprometen la fiabilidad de los resultados y dificultan la comparabilidad entre diferentes^{estudios 7,8}.

Por ello, este estudio pretende establecer y desarrollar un protocolo estandarizado para preparar muestras aisladas de músculo liso duodenal de conejos y realizar el registro en tiempo real de la tensión. Este protocolo describe sistemáticamente todo el proceso, desde la ética y bienestar animal experimental, la laparotomía aséptica y el aislamiento preciso de segmentos intestinales, hasta el logro del control ambiental, ajustes estandarizados de precarga de tensión y adquisición de datos de alta fidelidad mediante un sistema horizontal integrado de perfusión a temperatura constante y un sistema de adquisición fisiológica de señales multicanal. Basándonos en esta plataforma técnica estandarizada, aplicamos además métodos de dosificación acumulativa para evaluar cuantitativamente los efectos del Líquido Oral Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL), cumpliendo con los estándares de calidad de la Farmacopea China (edición 2025)⁹, sobre contracciones espontáneas y contracciones tétanicas inducidas por cloruro de acetilcolina y bario en músculo duodenal liso aislado. El Líquido Oral Huoxiang Zhengqi (HXZQ-OL), una forma de dosificación oral de la clásica fórmula de medicina tradicional china Huoxiang Zhengqi, se utiliza comúnmente en China para trastornos gastrointestinales, lo que proporciona la justificación para evaluar sus efectos directos en el músculo liso intestinal aislado. Este estudio no solo proporciona evidencia farmacológica experimental directa que esclarece los efectos regulatorios del músculo liso gastrointestinal de HXZQ-OL, sino que el protocolo experimental también sirve como un modelo metodológico estandarizado y reproducible para el cribado farmacológico y estudios in vitro de tejido del músculo liso gastrointestinal.

Protocolo

En este trabajo se utilizaron conejos blancos adultos sanos de Nueva Zelanda de ambos sexos (con un peso de 2,0 a 2,5 kg). Todos los procedimientos experimentales con animales se llevaron a cabo conforme a las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales de Laboratorio de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Nº de Aprobación: [2026070]). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento animal y reducir el número de animales utilizados. El diagrama del flujo de trabajo se ilustra en la Figura 1.

1. Preparación de la solución

NOTA: Todas las soluciones de trabajo, incluyendo la solución de tirodo, acetilcolina (ACh), cloruro de bario, atropina y verapamilo, deben prepararse frescas inmediatamente antes del experimento.

1. Prepara 1 L de solución de Tirodo disolviendo 137 mM de NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 1,0 mM MgCl₂, 12 mM NaHCO₃ y 5,6 mM D-glucosa. Antes de su uso, satura con una mezcla al 95% de O₂ / 5% de CO₂ durante 15–30 minutos, ajustando el pH a 7,3–7,4 (véase la Tabla de Materiales).
2. Prepara una solución de 1 mM ACh para la basura. Toma 20 μL y añade 20 mL de la solución de Tyrode. Mezcla bien para obtener una solución de 1 μM ACh.
3. Prepara una solución de 1 M de cloruro de bario (BaCl₂). Toma 20 μL y añade 20 mL de solución de Tyrode. Mezcla bien para obtener una solución de 1 mM de BaCl₂.
   NOTA: BaCl₂ es altamente tóxico e irritante. Al manipular, lleva equipo de protección individual en una campana extractora y desecha los residuos líquidos conforme a la normativa.
4. Prepara una solución de 10 mM de sulfato de atropina. Toma 20 μL y añade 20 mL de solución de Tyrode. Mezcle bien para obtener una solución de sulfato de atropina de 10 μM.
5. Prepara una solución de 1 mM de clorhidrato de verapamilo. Toma 2 μL y añade 20 mL de solución de Tyrode. Mezcle bien para obtener una solución de clorhidrato de verapamilo de 0,1 μM.
   NOTA: Las concentraciones de las soluciones preparadas se determinaron referenciando estudios previos ^6,10,11 y se optimizaron aún más a través de nuestros experimentos preliminares para asegurar condiciones óptimas en experimentos.

2. Preparación in vitro de muestras de músculo limo duodenal de conejo

1. Eutanasia de conejos
   1. Asegura al conejo en el dispositivo de sujeción (Figuras 2A, B y Figura 3A). Realizar la eutanasia administrando una sobredosis de pentobarbital sódico (120 mg/kg) a través de la vena auricular en conejos (Figura 2C y Figura 3B).
      NOTA: La muerte completa debe confirmarse con los siguientes criterios: pupilas dilatadas, ausencia de reflejo lumínico pupilar, cesación de la respiración y el latido cardíaco, y pérdida del reflejo plantar.
2. Preparación y desinfección del sitio quirúrgico
   1. Asegura el conejo en posición supina sobre la mesa de operaciones (Figura 2D y Figura 3C). Con tijeras quirúrgicas (Figura 2E) o una afeitadora eléctrica, elimina completamente todo el vello abdominal para exponer la piel en la zona quirúrgica designada (Figura 3D).
   2. Usando pinzas de esponja (Figura 2E), sujeta una bola de algodón empapada en yodo (Figura 2F,G). Comenzando en el centro de la incisión quirúrgica planificada, aplicar la solución antiséptica en un patrón concéntrico y circular desde dentro hacia fuera (Figura 3E).
      NOTA: La zona de desinfección debe extenderse más allá de los bordes de la incisión para asegurar una cobertura completa de toda la piel del campo quirúrgico. Después de la desinfección, espera al menos 3 minutos para que el antiséptico se seque de forma natural en la superficie de la piel.
   3. Colocar una cortina estéril (Figura 2H) sobre la zona abdominal desinfectada para exponer el campo quirúrgico (Figura 3F).
3. Posición e incisión de la incisión abdominal
   1. Utilizando un bisturí (cuchilla #23) (Figura 2E), realiza una incisión longitudinal de 8 cm a lo largo de la línea media del abdomen desde debajo del proceso xifoides hasta por encima de la sínfisis pubiana.
   2. Disecciona la piel y el tejido subcutáneo capa por capa. Siguiendo la línea alba, disecciona la vaina anterior del músculo recto abdominal, las fibras musculares y el peritoneo capa por capa para entrar en la cavidad abdominal (Figura 3G).
   3. NOTA: Durante el procedimiento, evite dañar órganos abdominales mientras se asegura la hemostasia para evitar la contaminación sanguínea del campo quirúrgico y los órganos abdominales.
4. Separación duodenal
   1. Abre la cavidad abdominal a lo largo de la incisión (Figura 3H). Retrae suavemente los lóbulos hepáticos cefálicos usando gasa salina húmeda (Figura 2I) para exponer completamente el estómago y el duodeno (Figura 3I).
   2. Selecciona el segmento inicial del duodeno (porción bulbar o parte superior descendente) situado a 2–3 cm del pilor como lugar de extracción de tejido.
   3. NOTA: Evita la tracción directa o el pinzamiento del segmento intestinal objetivo siempre que sea posible para minimizar lesiones mecánicas. En su lugar, utiliza pinzas romas para sujetar suavemente el mesenterio adyacente, o usa bastoncillos de algodón humedecidos con solución salina para manipular y posicionar delicadamente el tejido.
   4. Utilizando tijeras oftálmicas estériles (Figura 2E), se reseca rápida y con precisión un segmento de 1–2 cm (Figura 2J) del tubo duodenal (Figura 3J,K).
   5. Transfiera inmediatamente el segmento intestinal extirpado a un recipiente de cultivo (Figura 2K) que contiene solución de tirodo preenfriada (4 °C) perfundida continuamente con un gas mezclado (95% O₂ / 5% CO₂).
5. Recorte de segmentos intestinales, limpieza y almacenamiento temporal
   1. Utilizando pinzas oftálmicas (Figura 2E), disecciona suavemente el mesenterio y el tejido adiposo circundante adherido a la pared intestinal.
   2. Utilizando una jeringuilla llena de solución fría de Tyrode (equipada con una aguja de punta roma) (Figura 2L), inyecta suavemente la solución de enema en la cavidad intestinal. Enjuaga lentamente el interior de la cavidad intestinal 2–3 veces para limpiar bien su contenido.
   3. Colocar los segmentos intestinales limpios en una solución fresca y oxigenada de Tyrode para almacenamiento temporal hasta experimentos posteriores.

3. Arranque del sistema experimental de músculo liso horizontal a temperatura constante e infusión de solución

1. Añadir la solución de Tyrode al plato de precalentamiento del Sistema Experimental de Músculo Liso, Horizontal a Temperatura Constante, DSQG-1 (Figura 4B; véase la Tabla de Materiales).
2. Enciende la corriente del sistema, toca el panel de operación para ajustar la temperatura del baño a 37 °C y comienza el precalentamiento (Figura 4C).
3. Pulsa el botón de Infusión , y el sistema dispensará automáticamente 20 mL de solución de Tyrode en el tanque del baño.
4. Pulsa el botón de Drenaje para drenar completamente el líquido en el contenedor de recogida de residuos.
5. Pulsa el botón Enjuagar y el sistema completará automáticamente el proceso de primero drenar el contenido y luego rellenar con líquido.
6. Pulsa el botón de Detener para terminar inmediatamente todos los procesos de infusión, drenaje y enjuague en curso.
7. Pulsa el botón de Inflado para introducir continuamente el gas mezclado (95% O₂ / 5% CO₂) en el baño. Ajusta el caudal de gas a escala 5 para asegurar la posterior oxigenación experimental del tejido.
   NOTA: La escala 5 indica un caudal de gas de 100 mL/min. Caudales de gas excesivamente altos pueden causar un aumento de la turbulencia de la solución, afectando la estabilidad de las grabaciones de tensión.

4. Conectar sistemas de grabación y procesamiento fisiológico multicanal con operación por software

1. Conecte el cable de datos del transductor del Sistema Experimental de Músculo Liso, Horizontal a Temperatura Constante, al Canal 1 del Sistema Multicanal de Registro y Procesamiento Fisiológico (Figura 4D).
2. Enciende la fuente de alimentación externa del Sistema de Registro y Procesamiento Fisiológico Multicanal y enciende el ordenador. Haz doble clic en el icono RM6240XC Sistema Multicanal de Grabación y Procesamiento Fisiológico en el escritorio para iniciar el sistema experimental de software (véase la Tabla de Materiales).
3. En la barra de menú, selecciona Experimento | Digestión | Características fisiológicas del músculo liso intestinal para cargar el módulo experimental correspondiente.
4. Ajusta los siguientes parámetros: modo canal a Tensión, frecuencia de muestreo a 400 Hz, sensibilidad a 1,5 g, constante de tiempo a CC y frecuencia de filtro a 30Hz.
5. Haz clic en el botón Start en la esquina superior derecha de la interfaz de software para comenzar la adquisición y visualización de señales en tiempo real. Haz clic en el botón Grabar para mostrar simultáneamente el osciloscopio y guardar la señal adquirida en el disco duro en tiempo real.
6. En la barra de menú, selecciona Experimento | Ajuste rápido de la señal de tensión al nivel base.
   NOTA: Si la señal se desvía de la línea base en más de una unidad de coordenadas verticales, ajusta manualmente el punto cero del transductor de tensión usando un destornillador.
7. En la barra de menú, selecciona Experimento | Método de visualización de datos en tiempo real | Placa flotante. En el cuadro de diálogo que aparece, elige Medición Normal en Tiempo Real Rápido paramostrar datos de tensión en tiempo real del músculo intestinal en la ventana flotante.

5. Ajuste de suspensión y precarga de tensión de la tira muscular duodenal

1. Ajusta el espacio delantero-trasero de los ganchos de tejido girando el pomo horizontal del tornillo según la longitud de la tira muscular duodenal, asegurándote de que coincida con la longitud de la tira.
2. Mantener el segmento intestinal en su configuración cilíndrica natural y alinear la línea de visión con la abertura circular transversal de la luz intestinal.
3. Utilizando pinzas oftálmicas, retrae suavemente la abertura intestinal para mantener la patabilidad.
4. Inserta suavemente la punta del gancho de tejido en la luz intestinal.
5. A una distancia de 2–3 mm del margen intestinal, perfora la pared intestinal superior de capa única desde dentro hacia fuera usando la punta del gancho de tejido.
   NOTA: El gancho de tejido debe penetrar la capa muscular para asegurar un anclaje seguro, evitando la fijación superficial solo a la capa serosa, para evitar cortes mecánicos y desgarros de la pared intestinal por parte del gancho al aplicar la precarga.
6. El otro lado de la pared intestinal es idéntico al primero. Tras identificar el punto paralelo correspondiente, penetrar solo la pared intestinal de capa única en ese punto (Figura 3L).
7. Gira de nuevo la perilla horizontal del tornillo para ajustar el espacio entre los ganchos, asegurando que la tira muscular duodenal permanezca naturalmente relajada.
8. Aplicar tensión gradualmente ajustando el ajustador fino unidimensional hasta que la tensión media de la tira muscular duodenal se estabilice en 0,8 ± 0,1 g (Figura 4A).
   NOTA: Inspecciona visualmente toda la longitud del intestino para asegurarte de que permanece recto y cilíndrico, libre de torsiones, rotaciones o pliegues en espiral. Si no es así, reduce inmediatamente la tensión y reajusta el punto de montaje en un extremo.
9. Antes de comenzar el experimento, equilibra la tira muscular duodenal en la cámara de perfusión durante 60 minutos. Durante este periodo de equilibrio, se sustituye la solución de Tirodo por un nuevo tampón cada 15–20 minutos hasta que su ritmo contráctil espontáneo se estabilice.
   NOTA: El periodo de equilibrio de 60 minutos se consideró completo solo cuando los segmentos intestinales aislados mostraron actividad contráctil espontánea estable durante al menos 15 minutos consecutivos. Los criterios objetivos para la estabilización se definieron cuantitativamente de la siguiente manera: (1) deriva de tensión en reposo de < ±5%, (2) varianza en la amplitud media contráctil del < ±10% a lo largo de intervalos consecutivos de 5 minutos, y (3) fluctuación de frecuencia de < ± 1 ciclo/minuto.
10. Registrar la curva de actividad de contracción espontánea de la tira muscular duodenal como datos de referencia para experimentos posteriores.

6. Adquisición de datos experimentales

1. Para experimentos en curso, en la barra de menú, selecciona Herramientas | Vista dividida para realizar análisis estadísticos en tiempo real de datos capturados en forma de onda.
2. Para archivos de datos almacenados, haz clic en el botón Abrir en la barra de herramientas, selecciona un archivo de datos guardado con la extensión .lsd y carga los registros históricos del experimento.
3. Haz clic en el icono de Medir en la barra de herramientas, selecciona modo Región . Mueve el cursor del ratón sobre el área de la forma de onda, mantén pulsado el botón izquierdo para seleccionar dos puntos cualesquiera, y el sistema mostrará un panel de datos que muestra el valor medio de tensión dentro de ese segmento.
4. Haz clic en el icono de Medida en la barra de herramientas, selecciona modo Periodo . Usando el botón izquierdo del ratón, haz clic en cinco picos de onda distintos consecutivos (puntos de pico) a lo largo de la forma de onda. Haz clic derecho con el ratón y el panel de datos calculará y mostrará la frecuencia de contracción (en bpm) (Figura suplementaria S1).

Resultados

Este protocolo experimental describe el método estandarizado de preparación para tiras musculares duodenales aisladas de conejo y el proceso de registrar en tiempo real sus cambios dinámicos de tensión y frecuencia utilizando un sistema de perfusión de órganos aislados. Siguiendo este protocolo, HXZQ-OL se añadió secuencialmente mediante dosificación acumulada en un baño de solución de tirodo de 20 mL, logrando concentraciones volúmicas finales de 10, 20, 30, 40 y 50 μL/mL en el baño. Siguiendo los estándares de la Farma...

Discusión

Las técnicas aisladas de perfusión de órganos y registro de tensiones representan métodos clásicos para estudiar la fisiología del músculo liso y la farmacología. Sus hallazgos tienen una importancia significativa para esclarecer los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a los trastornos de motilidad gastrointestinal, las enfermedades vasculares y la disfunción^uterina 12,13,14,15.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.5-10 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101004
10 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-10
10 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043804
100 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-043807
100-1000 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101014
1250 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-1250
20 mL Volumetric flask	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-010105
200 µL Pipette tips	LABSELECT	T-001-200
50 mL Conical centrifuge tube	LABSELECT	CT-002-50A
5-50 µL Pipette	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101006
Acetylcholine chloride	Supelco	PHR1546
All-in-One Lab Computer	Lenovo	R5-3500U
Atropine sulfate	Macklin	A822893
Barium chloride	Sigma-Aldrich	342920
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	499609
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
Freezing point osmometer	Shanghai Precision Instruments Co., Ltd.	BS100
Horizontal Constant-Temperature Smooth Muscle Experiment System	Chengdu Instrument Factory	DSQG-1
Huoxiang Zhengqi Oral Liquid	Taiji Group Co., Ltd.	Z50020409
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Multi-Channel Physiological Recording and Processing System	Chengdu Instrument Factory	RM6240XC
New Zealand White rabbits	Pizhou Dongfang Breeding Co., Ltd. (License No.: SCXK[Su]2022-0004)	either sex (weighing 2.0–2.5 kg)
pH meter	Shanghai Leici	PHS-25
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Povidone-iodine	H&H Medical Co., Ltd.	3180132
Precision balance (0.1 mg)	Sartorius	BCE64i
Saline solution	H&H Medical Co., Ltd.	100014438029
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium dihydrogen phosphate	Supelco	1063700250
Sodium Pentobarbital	Sigma-Aldrich	P3761
Verapamil Hydrochloride	Macklin	V820460
Vortex mixer	Kylin-Bell	XW-80A