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Artículo de investigación
* These authors contributed equally
Utilizando un modelo murino inducido por dietas altas en grasas de enfermedad hepática esteatótica asociada a disfunción metabólica, este estudio evalúa los efectos de la suplementación con aceite de microalgas rico en ácido docosahexaenoico (DHA) y muestra que la intervención mejora los perfiles lipídicos hepáticos y está asociada con cambios en la composición de la microbiota intestinal.
Metabólicamente, la enfermedad hepática esteatótica disfuncional es un trastorno metabólico prevalente asociado con la disbiosis de la microbiota intestinal y el desequilibrio lipídico hepático. En este estudio, se estableció un modelo murino inducido por dietas ricas en grasas para evaluar los efectos de la suplementación con aceite de microalgas rico en DHA. Los ratones (n = 4 por grupo) fueron alimentados con una dieta alta en grasas durante 8 semanas y recibieron administración diaria oral de aceite de microalgas, probióticos o la combinación de aceite de microalgas rico en DHA y probióticos. Se evaluaron parámetros metabólicos, composición de la microbiota intestinal (secuenciación de ARNr 16S), vías funcionales microbianas y perfiles metabolómicos hepáticos. Los resultados mostraron que el aceite de microalgas rico en DHA mejoró la homeostasis lipídica, como se indica por la reducción de los niveles séricos de LDL-c y triglicéridos hepáticos, así como un aumento de la lipoproteína de alta densidad (HDL-c), y se asoció con el alivio de la lesión hepática y el estrés oxidativo. El análisis del microbioma reveló cambios selectivos en la composición microbiana intestinal, incluyendo el enriquecimiento de Lactobacillus y Bifidobacterium y la reducción de taxones asociados a la dieta rica en grasa como Clostridium y Ruminococcus. El perfilado funcional indicó alteraciones en las vías metabólicas microbianas, incluyendo el ciclo de recuperación de L-metionina y la degradación de la feniletilamina. El análisis integrado microbioma–metaboloma identificó además asociaciones entre taxones microbianos y metabolitos hepáticos implicados en el metabolismo de ácidos grasos, la renovación de ácidos biliares y las vías de aminoácidos. Estos hallazgos indican que la suplementación con aceite de microalgas rica en DHA está asociada con mejoras en el metabolismo lipídico hepático y la composición de la microbiota intestinal en este modelo, sin implicar un mecanismo causal directo.
La enfermedad hepática esteatótica asociada a disfunción metabólica (MASLD) es una condición global muy prevalente, que afecta aproximadamente al 32,4% de la poblaciónmundial 1. La MASLD se define por el exceso de grasa en el hígado, que contribuye a diversos problemas de salud asociados. El tracto digestivo humano contiene una comunidad microbiana sofisticada y equilibrada, que incluye bacterias, virus, hongos yparásitos 2. Debido a la interacción entre esta comunidad microbiana y el hígado, los probióticos se consideran un método prometedor para prevenir y tratar la MASLD modulando esta conexióncrítica 3. Investigaciones emergentes indican que los probióticos pueden tener un impacto positivo en la MASLD al modular el microbioma intestinal y reducir la inflamación. Específicamente, se demostró que administrar probióticos restaura el equilibrio de la microbiota intestinal y reduce la inflamaciónhepática 4. Además, se ha demostrado que ciertos probióticos, especialmente aquellos que podrían potenciar el metabolismo de los ácidos biliares, alivian la esteatosis hepática (hígado graso) y favorecen la salud metabólica general en personas con MASLD 5,6. Además, una sólida evidencia indicó que los pacientes con MASLD presentan cambios significativos en el entorno intestinal, una condición conocida comodisbiosis 7,8. Un hallazgo crucial fue la reducción de la diversidad alfa, lo que significa que el número y la variedad total de especies microbianas se reducen. Además, la microbiota intestinal de los pacientes con MASLD suele caracterizarse por la dominancia del filo bacteriano Firmicutes 9,10,11. Las personas con MASLD suelen llevar dietas pobres, que suelen incluir una alta ingesta de grasas saturadas y un bajo consumo de micronutrientesesenciales 12,13. Estos patrones alimentarios poco saludables, observados frecuentemente en poblaciones urbanas, se correlacionan con una proporción elevada de Firmicutes a Bacteroidetes en comparación con personas que viven en entornosrurales 14. Además, las dietas ricas en grasas se implicaron directamente en causar un desequilibrio intestinal más profundo. Específicamente, tanto la investigación en modelos animales como los estudios en pacientes con enfermedad hepática avanzada (MASLD) mostraron que la ingesta alta en grasa se relacionaba con la alteración del viromo intestinal. Estas alteraciones incluyeron un aumento en la actividad de los fagos líticos, que finalmente empeoró la disbiosis intestinalexistente 15,16.
Los ácidos grasos poliinsaturados omega-3 (AGPA), comúnmente presentes en el aceite de pescado, podrían mejorar el metabolismo lipídico y regular la microbiota intestinal. El aceite de microalgas se ha convertido en una fuente prometedora y sostenible de PUFA omega-3. En concreto, el aceite de microalgas Schizochytrium es una fuente comercial prometedora porque contiene una alta concentración de ácido docosahexaenoico puro (DHA). Estudios previos de este grupo informaron que, en un modelo murino de obesidad inducida por dieta alta en grasas (HFD), la eficacia del aceite de microalgas para promover la pérdida de peso era comparable a la del aceite de pescado y el medicamento para la pérdida de peso Orlistat. De manera crítica, el aceite de microalgas mostró estos efectos en la pérdida de peso antes que el aceite de pescado o Orlistat17. Hallazgos previos también mostraron que el aceite de microalgas ejercía efectos distintos y beneficiosos sobre la microbiota intestinal en comparación con el aceite de pescado comercial y el Orlistat. Aunque el aceite de microalgas no alteró notablemente la diversidad bacteriana general, se asoció con una mayor abundancia de bacterias productoras beneficiosas de ácidos grasos de cadena corta (SCFA) y una reducción de taxones patógenos, incluido el género Desulfovibrio, asociado a la obesidad. Además, el aceite de microalgas restauró notablemente la capacidad metabólica de la microbiota intestinal, mejorando las vías relacionadas con los aminoácidos, las SCFAs y el metabolismo de los ácidos biliares, mientras que disminuyó de forma crucial la biosíntesis de lipopolisacáridos (LPS). Estas modulaciones probablemente fueron responsables de la mejora del metabolismo lipídico y de la mejora de la barrera mucosa del colon, lo que sugiere que el aceite de microalgas era un suplemento dietético superior para aliviar la obesidad17.
A pesar de los avances en la vinculación de la disbiosis de la microbiota intestinal con el desarrollo de la MASLD, las relaciones específicas entre la composición microbiana, las funciones metabólicas microbianas y el metabolismo lipídico hepático siguen siendo incompletamente comprendidas. En particular, los vínculos causales entre alteraciones en la microbiota y la progresión de la enfermedad siguen sin estar claros, y no se ha investigado sistemáticamente si las intervenciones dietéticas, como el aceite de microalgas rico en DHA, están asociadas con cambios coordinados en las comunidades microbianas intestinales y en los perfiles metabólicos del huésped. El aceite de microalgas rico en DHA es una fuente sostenible y eficiente de ácidos grasos omega-3, con un contenido de aceite de microalgas rico en DHA comparable al de los suplementos derivados de pescado. Estudios previos han sugerido que la suplementación con aceite de microalgas rica en DHA puede mejorar la esteatosis hepática y los parámetrosmetabólicos 18,19. Sin embargo, sus asociaciones con la composición de la microbiota intestinal y la función metabólica microbiana en el contexto de la MASLD siguen siendo poco claras.
Por ello, en este estudio, el presente estudio utilizó un modelo murino inducido por una dieta alta en grasas para evaluar los efectos de la suplementación con aceite de microalgas rico en DHA sobre parámetros metabólicos, composición de la microbiota intestinal y perfiles metabolómicos hepáticos. Se planteó la hipótesis de que la suplementación con aceite de microalgas rica en DHA estaría asociada con mejoras en el metabolismo lipídico hepático y alteraciones concurrentes en la composición de la microbiota intestinal y en las vías metabólicas microbianas.
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Los detalles de todos los animales, dietas, reactivos, kits, instrumentos, software y proveedores de servicios utilizados en este protocolo se proporcionan en la Tabla de Materiales. Todos los estudios con animales se realizaron siguiendo las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y recibieron la aprobación del Comité de Animales Experimentales del Hospital Provincial de Shandong (aprobación ética nº 2022–007, aprobada el 24 de enero de 2022).
PRECAUCIÓN: La sangre animal, las muestras fecales y los tejidos deben manipularse como materiales potencialmente biopeligrosos. Todos los procedimientos que involucren animales vivos, muestras biológicas, objetos punzantes, disolventes orgánicos y reactivos de ensayo químico deben realizarse de acuerdo con las normativas institucionales de bioseguridad, cuidado animal y seguridad química. Los cadáveres animales, tejidos, materiales contaminados con sangre y muestras de heces deben recogerse en contenedores designados para residuos de bioriesgo y ser eliminados a través de la instalación institucional de animales o la oficina de bioseguridad. Las agujas, agujas de gavage, tubos capilares y otros objetos punzantes deben desecharse inmediatamente después de usarlos en recipientes aprobados para objetos punzantes. Los residuos orgánicos de disolventes, incluyendo metanol, acetonitrilo y soluciones que contienen ácido fórmico, deben recogerse en contenedores de residuos químicos etiquetados y eliminarse a través del programa institucional de residuos químicos peligrosos. Los residuos de ensayos bioquímicos y de estrés oxidativo deben recogerse y eliminarse de acuerdo con las fichas de seguridad del fabricante y las normas institucionales de seguridad química.
Animales experimentales
Los ratones machos C57BL/6J de seis semanas (n = 4 por grupo) se mantuvieron bajo condiciones específicas libres de patógenos (SPF) con un ciclo claro/oscuro de 12 horas a 22 ± 2 °C y humedad relativa del 50–60%. Los animales tenían acceso improvisado a comida y agua, con un máximo de cinco ratones alojados por jaula. A los ratones de control se les alimentó con una dieta estándar de chow compuesta en 70% carbohidratos, 20% proteínas y 10% grasas (kcal). Para establecer el modelo murino MASLD, se alimentó a los ratones con una dieta alta en grasas durante 8 semanas que contenía un 20% de carbohidratos, 20% de proteínas y 60% de grasas (kcal). Todas las dietas se almacenaban a 4 °C y se reponían dos veces por semana. Los ratones fueron asignados aleatoriamente a grupos experimentales mediante un generador de números aleatorios, y el tamaño de la muestra (n = 4 por grupo) se determinó basándose en estudios previos que usaban modelos similares inducidos por dietas altas en grasa y experimentos preliminares. Todos los tratamientos se administraron a la misma hora cada día para minimizar la variación circadiana.
El aceite de microalgas fue extraído y purificado por la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong, con una pureza de aproximadamente el 99%. El aceite de microalgas se almacenó a −30 °C protegido de la luz. Antes de la administración, el aceite se preparaba con un emulsionante y se mezclaba cuidadosamente para asegurar la homogeneidad. Concretamente, el aceite de microalgas rico en DHA fue emulsionado en carboximetilcelulosa sódica estéril al 0,5% que contiene 0,5% Tween-80 en solución salina normal. El aceite de microalgas y el vehículo emulsionante se mezclaron en una proporción de 1:9 (v/v) y se vórtizaron durante 2 minutos inmediatamente antes del ataque para obtener una suspensión uniforme. Los ratones del grupo tratado con aceite de microalgas recibían la preparación una vez al día mediante gavage oral usando una aguja estéril de alimentación a una dosis de 10 μL/g de peso corporal. El volumen del gavage se ajustaba diariamente según el peso corporal para asegurar la consistencia de la dosis. Los ratones del grupo de control recibieron un volumen equivalente de solución fisiológica normal estéril bajo las mismas condiciones. La solución salina utilizada fue una inyección de cloruro de sodio al 0,9%.
El tratamiento probiótico consistió en una formulación compuesta que contenía Lactobacillus plantarum (DY-1), Lactobacillus acidophilus (KDB-03), Lactobacillus casei (KDB-LC) y Bacillus coagulans (GIM 1,645). Las cuatro cepas se mezclaron con una proporción igualitaria de celdas viables de 1:1:1:1. Cada cepa aportó 2,5 × 10UFC/mL a la formulación final, dando una concentración bacteriana total de 1 × 108 UFC/mL. La mezcla probiótica fue sintetizada por la Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong y no está disponible comercialmente. El tratamiento probiótico consistió en un caldo de fermentación probiótico compuesto que contenía Lactobacillus plantarum DY-1, Lactobacillus acidophilus KDB-03, Lactobacillus casei KDB-LC y Bacillus coagulans GIM 1.645. La concentración bacteriana de la formulación fue de 1 × 108 UFC/mL. El caldo probiótico de fermentación se almacenaba a 4 °C antes de su uso. Los ratones del grupo tratado con probióticos recibieron la formulación probiótica una vez al día mediante gavage oral a una dosis de 0,01 mL/g de peso corporal durante todo el periodo experimental.
Las cepas individuales se cultivaron en condiciones adecuadas y se cosecharon en la fase de crecimiento de la troncaria media (OD₆₀₀ ≈ 0,6), y luego se combinaron en la proporción indicada. Se centrifugaron cultivos bacterianos para eliminar el sobrenadante y los pellets se resuspendieron en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). La suspensión bacteriana recién preparada se mantuvo en hielo antes de su administración para preservar su viabilidad. La concentración bacteriana final se ajustó a 1 ×10 8 UFC/mL antes de la administración. Los ratones del grupo probiótico recibieron la formulación por gavage oral a una dosis de 0,01 mL/g de peso corporal una vez al día durante todo el periodo experimental. No se aplicó ningún tratamiento previo con antibióticos antes de la administración de probióticos. Para reducir el sesgo experimental, la evaluación de resultados fue realizada por investigadores ciegos cuando era aplicable. La MASLD fue confirmada mediante análisis bioquímicos sanguíneos.
Análisis de sangre
Al final del periodo experimental, los ratones ayunaron durante la noche (12 h) con acceso libre al agua antes de la medición de glucosa y la recogida terminal de sangre. Los ratones fueron profundamente anestesiados con isoflurano utilizando un vaporizador anestésico hasta que se confirmó la pérdida del reflejo pedal. Se recogieron muestras terminales de sangre por hemorragia retroorbital. Tras la extracción de sangre, los ratones fueron sacrificados por luxación cervical bajo anestesia profunda, y la muerte se confirmó por la suspensión de la respiración y el latido cardíaco. La sangre se dejó coagular a temperatura ambiente y luego centrifugó a 3.000 × g durante 10 minutos para obtener el suero. Las muestras de suero se alocaron y almacenaron a −80 °C hasta el análisis. Se midieron la glucosa sérica, el colesterol total (TC), los triglicéridos (TG), el colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-c), el colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL-c), la aspartato aminotransferasa (AST) y la alanina aminotransferasa (ALT) utilizando un analizador bioquímico automático, siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos parámetros se cuantificaron mediante ensayos colorimétricos enzimáticos con kits de reactivos estándar integrados en el sistema analizador. Todos los parámetros bioquímicos se normalizaron al volumen sérico y se expresaron en las unidades especificadas por el fabricante.
Ensayos de estrés oxidativo
Se midieron biomarcadores de estrés oxidativo utilizando kits, incluyendo los de malondialdehído, superóxido dismutasa y catalasa. Los ensayos se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, los tejidos hepáticos se homogeneizaron en un tampón helado y se centrifugaron para obtener sobrenadantes para su análisis. Los niveles de malondialdehído (MDA) se determinaron mediante un ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS); la actividad de la superóxida dismutasa (SOD) se midió por su capacidad para inhibir reacciones mediadas por superóxido; y la actividad de la catalasa (CAT) se cuantificó monitorizando la tasa de descomposición del peróxido de hidrógeno. Las mediciones se realizaron utilizando un lector de microplacas y los valores se calcularon usando curvas estándar o las fórmulas proporcionadas en los kits. Los marcadores de estrés oxidativo se normalizaron al peso del tejido hepático y se expresaron según las especificaciones del fabricante.
Secuenciación de ARNr16S y análisis del microbioma
Las muestras fecales se recogían al final del periodo experimental directamente de ratones individuales en condiciones estériles, se congelaban inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaban a −80 °C hasta la extracción de ADN. El ADN microbiano se extrajo utilizando un kit comercial según el protocolo del fabricante. La región V3–V4 del gen bacteriano 16S rRNA se amplificó utilizando cebadores 341F/806R. La amplificación por PCR se realizó en un sistema de reacción de 25 μL que contenía ADN plantilla, 2x mezcla maestra PCR y 0,2 μM de cada cebador. El programa de amplificación consistía en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 minutos, seguida de 25 ciclos de 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 45 s, con una extensión final a 72 °C durante 10 minutos. Las bibliotecas Amplicon se construyeron y secuenciaron en una plataforma Illumina MiSeq usando una estrategia de extremo emparejado de 2 × 250 bp por un proveedor comercial de servicios de secuenciación. La calidad de la biblioteca se evaluó antes de la secuenciación y las bibliotecas agrupadas se cargaron a la densidad de clúster recomendada por el fabricante. Las lecturas de baja calidad con bases ambiguas, longitud insuficiente o una puntuación media de calidad inferior a Q20 fueron eliminadas antes del análisis posterior.
Las lecturas de secuenciación en bruto se procesaron usando QIIME 2 versión 2019.420. En resumen, las lecturas de extremo emparejado se desmultiplexaron, filtraron la calidad, eliminaron ruido, se fusionaron y se filtraron quimeras usando DADA2 con parámetros predeterminados, salvo que se especificara lo contrario. Se conservaron variantes de secuencia de amplicones (ASVs) no individuales para el análisis posterior. La asignación taxonómica se realizó utilizando la versión 13_8 de la base de datos Greengenes implementada en QIIME221. Dadas las limitaciones inherentes de resolución de la secuenciación del gen 16S rRNA, especialmente al utilizar la base de datos Greengenes, las anotaciones taxonómicas se interpretaron exclusivamente a nivel de género. La clasificación a nivel de especie no se consideró fiable y, por tanto, no se utilizó en análisis posteriores, comparaciones estadísticas ni interpretaciones biológicas. Todas las características microbianas se colapsaron al nivel de género antes de la visualización y el análisis.
Se utilizaron métricas de diversidad alfa (Chao1, especies observadas, Shannon, Simpson, PD de Faith y uniforme de Pielou). Se realizaron comparaciones estadísticas de la diversidad alfa entre grupos utilizando pruebas no paramétricas apropiadas (por ejemplo, prueba de Kruskal–Wallis). La distancia de Jaccard y la disimilitud de Bray-Curtis se utilizaron como métricas de diversidad beta. Se utilizaron gráficos de Análisis de Coordenadas Principales (PCoA), escalado multidimensional no métrico (NMDS) y análisis discriminante lineal tamaño del efecto (LEfSe) para ilustrar cambios en las comunidades microbiomáticas, con un umbral de puntuación LDA de 2,0. Se utilizó el análisis multivariante permutacional de la varianza (PERMANOVA) para evaluar la significación estadística en la diversidad beta. La visualización de datos y los análisis estadísticos se realizaron utilizando la plataforma GenesCloud (https://www.genescloud.cn).
Los perfiles funcionales microbianos se infirieron a partir de datos de secuenciación de 16S rRNA en lugar de medirse directamente mediante secuenciación metagenómica o transcriptómica rápida. Basándose en la tabla de abundancia de vías normalizadas o grupos funcionales, las unidades funcionales predichas se mapearon a bases de datos de uso común, incluyendo KEGG, MetaCyc y COG. La abundancia de vías KEGG se resumió según sus categorías funcionales jerárquicas, utilizando clasificaciones de vías de nivel 2 para comparación posterior. La abundancia media de cada categoría de vías se calculó usando el software R.
Análisis metabolómico no dirigido de muestras de hígado
Los tejidos hepáticos se extirparon rápidamente inmediatamente después de la confirmación de la muerte, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a −80 °C antes del análisis. Aproximadamente 50 mg de tejido hepático congelado se homogeneizaron en metanol:agua helada (4:1, v/v) suplementados con estándares internos. La proporción de tejido respecto al disolvente de extracción fue de 1:10 (p/v). Las muestras se vórtizcan durante 1 minuto, se sonicaron sobre hielo durante 10 minutos y luego se incubaron a −20 °C durante 30 minutos para mejorar la precipitación de proteínas. Los homogeneados se mezclaron minuciosamente, se sometieron a sonicación sobre hielo y se centrifugaron a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se recogieron cuidadosamente, se evaporaron bajo un flujo de nitrógeno suave y se reconstituyeron en metanol al 50% para su posterior análisis.
Las muestras de control de calidad (QC) se generaron agrupando volúmenes iguales de cada muestra y se analizaron de forma intermitente durante la ejecución para evaluar la estabilidad y reproducibilidad analíticas. El análisis metabolómico no dirigido se realizó utilizando un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplado a espectrometría de masas de alta resolución, operado por un proveedor comercial de servicios. Los metabolitos se separaron en una columna de C18 en fase inversa utilizando un sistema de disolventes binarios compuesto por agua con 0,1% de ácido fórmico y acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico. El volumen de inyección era de 2 μL, la temperatura de la columna se mantenía en 40 °C y el caudal se fijaba en 0,30 mL/min. Se utilizó un programa de elución por gradiente para lograr una separación amplia de metabolitos. La detección por espectrometría de masas se realizó tanto en modos de ionización por electrospray positivo como negativo en un rango m/z de 70–1.000 para lograr una amplia cobertura de metabolitos. El voltaje de pulverización iónica se ajustó a 3,5 kV en modo positivo y −2,5 kV en modo negativo. La temperatura capilar se mantuvo en 320 °C, y los datos se adquirieron en modo de escaneo completo con adquisición de EM/EM dependiente de datos para la anotación de metabolitos. Los datos en bruto se procesaban utilizando un software dedicado de metabolómica (MassLynx v4.1) para la detección, alineación y normalización de características. La identificación de metabolitos se realizó basándose en masas precisas, tiempo de retención y patrones de fragmentación de EM/EM, comparándola con bases de datos públicas, incluyendo la Human Metabolome Database (HMDB) y la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (v2023), cuando correspondía.
Análisis multivariante y de vías
Los datos procesados de metabolómica fueron sometidos a análisis estadísticos multivariantes, incluyendo análisis de componentes principales (PCA) y análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA), para visualizar diferencias metabólicas entre los grupos experimentales. Se identificaron metabolitos diferenciales basándose en una combinación de importancia variable en las puntuaciones de proyección (VIP) (>1,0) y significación estadística (p < 0,05). Los metabolitos identificados se mapearon además en vías metabólicas mediante análisis de enriquecimiento de vías KEGG para dilucidar procesos biológicos asociados a la suplementación con aceite de microalgas rica en DHA.
Análisis estadístico
Los datos se presentaron como media ± SEM y se analizaron mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. La significación estadística se definió como p < 0,05. El análisis de enriquecimiento de metabolitos hepáticos se realizó utilizando R (versión 4.4.1). Se analizaron las asociaciones por pares entre géneros microbianos y metabolitos hepáticos utilizando correlaciones de rango de Spearman. Solo correlaciones significativas (tasa de falsos descubrimientos, FDR < 0,05) con |ρ| ≥ 0,6 se incluyeron en los análisis integrativos de red. El procesamiento de datos de microbioma y metabolómica se llevó a cabo como se describió anteriormente, incluyendo el uso de la plataforma GenesCloud y procedimientos de control de calidad.
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El aceite de microalgas rico en DHA mejora el metabolismo lipídico, la lesión hepática y el estrés oxidativo hepático en ratones MASLD inducidos por HFD
Para evaluar el efecto de los suplementos dietéticos sobre la homeostasis de glucosa y lípidos, se evaluaron parámetros bioquímicos en cinco grupos: comida regular (RC), dieta alta en grasas (HFD), suplementada con aceite de microalgas rica en DHA, suplementada con probióticos y ratones combin...
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En los últimos años, varios estudios han investigado cambios en el microbioma vinculados a la MASLD. Sin embargo, la mayoría de estos estudios se han centrado en comparar a individuos sanos con pacientes con MASLD o en examinar diferentes grados deesteatosis 24. Por lo tanto, todavía hay poca evidencia que detalle los cambios específicos en la microbiota intestinal asociados con la fibrosis hepática en la MASLD, aunque la fibrosis es el factor más crítico para pre...
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Los autores no tienen nada que revelar.
Esta investigación fue financiada por el Ministerio de Ciencia y Tecnología ("Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China" nº 2021YFA0702100, 2022YFE0132200) y el Sistema Moderno de Industria de Tecnología Agrícola de la provincia de Shandong, China (Número de subvención: SDAIT-26).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2x PCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japón | RR902A | Utilizado para amplificación por PCR de ARNr16S |
| Acetonitrilo | Merck, Alemania | 100030 | Disolvente utilizado para la fase móvil UHPLC |
| Vaporizador de anestesia | Ciencias de la Vida RWD | R580 | Se usa para administrar anestesia de isoflurano a ratones |
| Analizador bioquímico automático | Instituto de Ingeniería Biológica Jian Cheng, Nankín, China | A110-1 y A111-1 | Mide parámetros séricos (glucosa, TC, TG, LDL-C, HDL-C, AST, ALT) y los niveles de lípidos hepáticos |
| Bacillus coagulans (GIM 1.645) | Centro de Recogida de Cultivos Microbianos de Guangdong, China | GIM 1.645 | Cepa componente de la formulación probiótica |
| Carboximetilcelulosa sódica (CMC-Na) | Sigma-Aldrich, EE. UU. | C4888 | Utilizado como componente emulsionante para la preparación de aceite de microalgas rico en DHA |
| Kit de ensayo de catalasa (CAT) | Nanjing Construction Ltd. | A007-1-1 | Detecta la actividad de la CAT (un indicador de capacidad antioxidante) en el tejido hepático |
| Paquete de software DADA2 | Equipo de Desarrollo de DADA2 | Incluido en QIIME 2 v2019.4 | Utilizado para la eliminación de ruido y filtrado quimera de lecturas de secuenciación |
| Aceite de microalgas rico en DHA (derivado de Schizochytrium sp.) | - | - | Rico en ácido docosahexaenoico (DHA); administrada diariamente por Gavage a las 10 y micro; L/g como intervención experimental |
| Animales experimentales (ratones machos C57BL/6J) | Beijing Vital River Laboratorio Animal Technology Co. | - | 6 semanas de edad, n = 4 por grupo; Utilizado para establecer el modelo MASLD mediante alimentación con HFD |
| Ácido fórmico | Sigma-Aldrich, EE. UU. | F0507 | Aditivo de fase móvil para análisis metabolómico |
| Base de datos Greengenes | Greengenes | Versión 13_8 | Utilizado para asignación taxonómica microbiana |
| Dieta alta en grasas (HFD) | Research Diets Inc., EE. UU. | D12492 | Compuesto por 20% de carbohidratos, 20% de proteínas y 60% de grasas (kcal); alimentado durante 8 semanas para inducir MASLD |
| Espectrómetro de masas de alta resolución | Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | P Exactive Orbitrap | Utilizado para la detección de metabolitos en modos de iones positivos y negativos |
| Base de Datos de Metaboloma Humano (HMDB) | Universidad de Alberta, Canadá | Lanzamiento de 2024 | Base de datos pública de anotación de metabolitos |
| Plataforma Illumina MiSeq | Illumina, Inc., EE. UU. | Sistema MiSeq | Usado para el final emparejado 2 y veces; Secuenciación a 250 pb |
| Isoflurano | Merck, Alemania | PHR2874 | Usado para anestesia inhalada en ratones |
| Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) | Laboratorios Kanehisa, Japón | Versión 2023 | Base de datos utilizada para el enriquecimiento de vías y la anotación de metabolitos |
| Lactobacillus acidophilus (KDB-03) | Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong, China | - | Cepa componente de la formulación probiótica |
| Lactobacillus casei (KDB-LC) | Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong, China | - | Cepa componente de la formulación probiótica |
| Lactobacillus plantarum (DY-1) | Academia de Ciencias Agrícolas de Shandong, China | - | Cepa componente de la formulación probiótica |
| Nitrógeno líquido | Air Liquide | - | Utilizado para la congelación rápida y conservación de muestras fecales e hepáticas |
| Kit de ensayo de malondialdehído (MDA) | Nanjing Construction Ltd. | A003-1 | Detecta MDA (un marcador de peroxidación lipídica/daño oxidativo) en tejido hepático |
| Software MassLynx | Waters Corporation, EE. UU. | Versión 4.1 | Utilizado para metabolómica de procesamiento de datos en bruto, extracción de características y normalización |
| Metanol | Merck, Alemania | 106035 | Disolvente utilizado para la extracción de metabolitos |
| Plataforma de análisis de datos del microbioma | Genescloud | V1 | Plataforma online: https://www.genescloud.cn/home; utilizado para análisis de visualización del microbioma por PCoA, NMDS, LEfSe y otros análisis de visualización del microbioma |
| Kit de ADN de suelo OMEGA | Omega Bio-Tek, Norcross, GA, EE. UU.) | (M5635-02) | Aislamiento de ADN |
| OTUs referencian secuencias | Genescloud | Referenciado de McDonald et al. 2012; Utilizado para la asignación taxonomía de variantes de secuencia de amplicones (ASVs) | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | 10010023 | Utilizado para la resuspensión de pellets bacterianos |
| Cebador 341F/806R | Tsingke Biotechnology Co., Ltd., China | - | Utilizado para amplificar el 16S rRNA V3 y ndash; Región V4. 341F: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′; 806R: 5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′ |
| Probióticos | - | - | Cepas específicas no mencionadas explícitamente; Usado como intervención comparativa (principalmente mejora la homeostasis de la glucosa) |
| Software QIIME 2 | - | 2019.4 | Utilizado para análisis bioinformático del microbioma (procesamiento ASV, cálculo de diversidad alfa/beta) |
| Software R | - | 4.4.1 | Utilizado para el análisis de enriquecimiento de metabolitos hepáticos y el análisis de correlación de Spearman de asociaciones microbiano-metabolitos |
| Centrífuga refrigerada | Eppendorf, Alemania | 5810R | Utilizado para centrifugación de muestras en suero y metabolómica |
| Columna C18 de fase inversa | Waters Corporation, EE. UU. | 186002350 | Utilizado para la separación cromatográfica de metabolitos |
| Solución salina | Shijiazhuang Nº 4 Farmacéutico | 2211112304 | Administrado diariamente por gavage al grupo de control (en lugar de tratamiento con aceite de microalgas) |
| Dieta estándar de chow | Keao Xieli Feed Ltd., China | 1016706714625204224 | Compuesto por 70% de carbohidratos, 20% de proteínas y 10% de grasas (kcal); alimentado al grupo de control (RC) |
| Aguja de alimentación estéril | Instech Laboratories, EE. UU. | FTP-20-38 | Utilizado para la administración oral de gavage |
| Kit de ensayo de superóxido dismutasa (SOD) | Nanjing Construction Ltd. | A001-3 | Detecta la actividad de la DOP (un indicador de capacidad antioxidante) en el tejido hepático |
| Preadolescente-80 | Sigma-Aldrich, EE. UU. | P4780 | Utilizado como componente emulsionante para la preparación de aceite de microalgas rico en DHA |
| Homogeneizador ultrasónico | Scientz Biotechnology, China | JY92-IIN | Utilizado para la sonicación del tejido hepático durante la extracción de metabolitos |
| Metabolómica hepática no dirigida | Metabo-Profile Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | Código del proyecto: P035Y23A13_SFMU_MJWang_SH | |
| Mezclador de vórtice | Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | Mezclador de vórtices LP | Utilizado para la homogeneización y emulsificación de muestras |
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