Protocolo para diferenciar células madre pluripotentes en células germinales primordiales similares

Resumen

Una guía paso a paso para generar células germinales primordiales similares a células germinales a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos de manera robusta, utilizando un método 2D basado en monocapa con superposición de extracto de membrana basal.

Resumen

El uso de diferenciación de células madre pluripotentes humanas in vitro ha ampliado significativamente la comprensión de los eventos de especificación de linaje que ocurren durante el desarrollo temprano in vivo, un periodo extremadamente difícil de investigar. Uno de los primeros linajes embrionarios especificados en el embrión humano es el linaje de células germinales, caracterizado por la inducción de las células germinales primordiales (PGCs). Los PGC son la única población fundadora de los gametos en etapas avanzadas de la vida, y su especificación es un primer paso fundamental hacia la fertilidad del organismo. Aquí se describe un protocolo robusto para generar células tipo PGC (PGCLC) a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs), comenzando con la evaluación inicial del estado pluripotente y las características celulares de las hiPSC para asegurar una diferenciación efectiva de las PGCLC. Para ello, se discuten los efectos de diferentes densidades celulares, recubrimientos de placas y hiPSCs utilizados para la diferenciación de PGCLC. Finalmente, se proporciona un flujo de trabajo para la caracterización y cuantificación de hPGCLC, utilizando inmunofluorescencia y citometría de flujo. El protocolo de diferenciación se centra en condiciones que son fáciles de establecer y probar en la mayoría de los laboratorios y que pueden ajustarse según sea necesario. Además, este protocolo es rápido, permitiendo determinar si los hiPSC son adecuados para la diferenciación de PGCLC. El protocolo tiene como objetivo promover la consistencia y compatibilidad en los resultados de hPGCLC entre diferentes líneas de hiPSC y plataformas de cultivo, asegurando rendimientos robustos que apoyen una caracterización fiable y una mayor optimización de los pasos posteriores de diferenciación hacia una gametogénesis in vitro exitosa en humanos.

Introducción

El desarrollo de la línea germinal humana es un proceso altamente coordinado que inicia temprano en el desarrollo embrionario y comienza con la especificación de las células germinales primordiales (PGCs), la población que finalmente da lugar a los ovocitos y las células^{espermáticas 1}. In vivo, la especificación de PGC ocurre poco después de la implantación ^2,3 en respuesta a señales inductivas de células^{vecinas 4,5}. El desarrollo de las PGC ha sido investigado extensamente en roedores, especialmente mediante estudios genéticos que han demostrado la implicación de vías de señalización, como BMP, WNT y^TGFβ 6,7,8,9. Tras la especificación, los PGC se someten a una reprogramación epigenética, caracterizada por la desmetilación del ADN a nivel genómico y la remodelación de la cromatina, para establecer posteriormente la identidad germinal^{específica por sexo} 10,11,12,13,14.

En mamíferos, la especificación PGC está impulsada por la interacción coordinada entre vías de señalización, y algunos aspectos están conservados evolutivamente en humanos, primates no humanos, cerdos y ratones, incluyendo la implicación de factores de pluripotencia como POU5F1 y NANOG 9,15,16,17,18 . A pesar de las características compartidas, las diferencias específicas de cada especie en los mecanismos de diferenciación PGC y en las redes reguladoras de genes limitan la traducción directa de modelos animales a humanos 9,19,20,21.

Para entender la gametogénesis en humanos, son necesarios estudios con material humano, pero siguen siendo complicados debido al acceso limitado a embriones humanos tempranos. Los avances continuos en los protocolos que permiten la diferenciación in vitro de células germinales primordiales humanas (hPGCLC) a partir de células madre pluripotentes humanas, como las células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs), han reducido la dependencia del tejido gonadial humano y han permitido el escalado y estudios^{genéticos 18,22}. La mayoría de las estrategias establecidas para la diferenciación de hPGCLC se basan en agregados tridimensionales (3D) o cuerpos^{embrionarios 18}. Utilizando estas plataformas, múltiples estudios han demostrado que las hPGCLC recapitulan características epigenéticas clave de las primeras PGC humanas, incluyendo programas de transcripción^{germinal 23,24} y reprogramación de metilación del ADN a nivel^{genómico 25}. En conjunto, estas plataformas in vitro han avanzado sustancialmente el conocimiento de la biología PGC humana, incluyendo el compromiso de linaje y el reinicio epigenético. Sin embargo, los protocolos de diferenciación hPGCLC basados en agregación siguen siendo un reto debido a que requieren mucho tiempo, y el rendimiento total de hPGCLC para caracterización epigenética robusta, ensayos de diferenciación adicionales o uso en aplicaciones experimentales de alto rendimiento sigue siendo bajo.

Recientemente, un método 2D basado en monocapa y libre de alimentadores, utilizando extracto de membrana basal diluido (BMEx) en combinación con bajos niveles de BMP4 para diferenciar hiPSCs en hPGCLCs, resultó relativamente fácil de escalar en placas de cultivo de tejidos y logró altas eficiencias (~55%) en una ventana de diferenciación corta (5 días⁾²⁶. En comparación con otros sistemas 2D que requerían un paso intermedio de cebado de Activina A antes de la inducción y utilizaban concentraciones más altas de BMP4 (40–50 ng/mL)^27,28, este enfoque BMEx no requería un paso previo a la inducción y utilizaba niveles más bajos de BMP4 (10 ng/mL), manteniendo a la vez una eficiencia comparable y una escalabilidad mejorada.

Aquí se ofrece una guía detallada y paso a paso del protocolo de diferenciación 2D de hPGCLC BMEx, comenzando con la evaluación inicial del mantenimiento de hiPSC, incluyendo pluripotencia y características celulares, seguida de la prueba de los efectos de diferentes recubrimientos de placas hiPSC y densidades celulares sobre la diferenciación de hPGCLC. También se describe la caracterización posterior mediante análisis de citometría de flujo e inmunofluorescencia. Se proporcionan puntos críticos de manejo y guías de solución de problemas para reducir desviaciones en el laboratorio, permitiendo a los investigadores reproducir consistentemente la diferenciación de hPGCLC en este formato 2D.

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices y regulaciones del Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC), el Biobanco y Biomateriales de la LUMC (TCBio) y el Centro HiPSC de la LUMC de Leiden (bajo la BB24.037). Todos los materiales y líneas macho de control (XY) hiPSC (M54 y M199) utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales. Todos los procedimientos de cultivo de tejidos se realizaron en una sala dedicada de bioseguridad de Nivel 2, equipada con una incubadora normóxica humidificada (37 °C, 5% CO₂), una centrífuga de mesa multipropósito (rotor de cubo oscilante) y un gabinete de bioseguridad de Clase II con estereomicroscopio.

PRECAUCIÓN: No todas las líneas de hiPSC pueden diferenciarse en hPGCLC^26,29. Sin embargo, si se utilizaron otros hiPSC para la diferenciación de PGCLC y se observaron PGCLCs, el método descrito aquí (Figura 1A) permitirá aumentar la producción de hPGCLC.

1. Recubrimiento de placas de cultivo de tejidos para cultivo hiPSC

Este protocolo describe el recubrimiento de placas de cultivo tisular con BMEx y vitronectina diluidas.

1. Recubrimiento de extracto de membrana basal (BMEx)
   1. Descongelar una alicuota de BMEx sobre hielo. Esto puede ser Geltrex, Cultrex o Matrigel.
   2. Diluye la alicota del extracto de membrana basal en DMEM/F12 en frío hasta una concentración final del 1% (v/v) y vuelve a suspender suavemente.
   3. Recubre el número deseado de pozos de una placa de 6 pozos con 1 mL de BMEx diluido por pozo.
   4. Incuba la placa recubierta durante al menos 30 minutos a 37 °C.
      NOTA: Las placas recubiertas pueden almacenarse a 2–8 °C durante hasta 1 semana. Al utilizar placas recubiertas almacenadas a 2–8 °C, incuba la placa al menos 10 minutos a 37 °C antes de volver a usarla.
2. Recubrimiento de vitronectina
   1. Descongela una alicuota de vitronectina a temperatura ambiente (RT) durante 10–15 minutos.
   2. Diluir la vitronectina hasta una concentración final de 5 μg/mL en DPBS sin calcio ni magnesio (DPBS -/-) y resuspender suavemente.
   3. Recubre el número de pozos deseados de una placa de 6 pozos con 1 mL de vitronectina diluida por pozo.
   4. Incuba la placa recubierta de 6 pozos durante 1 hora en RT.

2. Paso para el mantenimiento de hiPSCs

1. Preparar el medio de cultivo: medio de cultivo celular sin suero mTeSR Plus complementado con solución de prevención de contaminación por micoplasma (MycoZap (1:1000)).
2. Aspira el medio de cultivo de las células que están listas para ser pasadas.
3. Añade 0,5 mL de agente humano de selección y paso de PSC (ReLeSR) a cada pozo y aspira esto en 1 minuto. Asegúrate de que quede una capa muy fina sobre las células.
4. Incuba las células durante 6 minutos a 37 °C.
5. Golpea los lados de la placa de 6 pozos varias veces.
6. Desconecta cuidadosamente las células con un medio de cultivo de 1 mL pipeteando arriba y abajo con una pipeta p1000, y asegúrate de comprobar regularmente el tamaño de los fragmentos de la colonia para mantener su tamaño entre 50 y 200 μm.
7. Toma las placas prerecubiertas de 6 pozos y retira la solución de recubrimiento (Paso 1).
8. Añade 2 mL de medio de cultivo a cada pozo.
9. Transfiere el medio de cultivo que contiene los fragmentos de colonia de hiPSC desprendidos al nuevo pozo en la proporción deseada.
   NOTA: La proporción ideal para dividir fragmentos de colonia de hiPSC es de 1:6-1:50, permitiendo el paso cada 4–7 días.
10. Colocar la placa de cultivo celular junto con los fragmentos de colonia de hiPSCs pasados en una incubadora normóxica humidificada (37 °C, 5% CO₂).
11. Renova el medio de cultivo cada dos días con medio de cultivo de 2 mL hasta que los hiPSC estén listos para ser reutilizados.
    NOTA: Añade 4 mL de medio de cultivo en lugar de 2 mL a cada 6-pozo para evitar la necesidad de refrescar durante el fin de semana.
    PRECAUCIÓN: No se pasan hiPSC cuando la confluencia es demasiado baja, y descarten la cultura cuando la confluencia sea demasiado alta para mantener una cultura hiPSC saludable y evitar la diferenciación espontánea.

3. diferenciación hPGCLC

1. Preparación antes de la diferenciación de hPGCLC (Día 0).
   1. Actualiza el medio de cultivo de los hiPSCs 1 hora antes de comenzar la diferenciación de hPGCLC.
   2. Prepara la solución de recubrimiento: solución de BMEx al 1% diluida v/v en DMEM/F12 en frío.
   3. Recubre el número deseado de pozos de una placa de 12 pozos con una solución de recubrimiento de 0,5 mL.
   4. Incuba la placa recubierta durante al menos 30 minutos a 37 °C antes de comenzar la diferenciación.
   5. Prepara el medio de placado: solución BMEx al 2% (v/v) en medio de cultivo en frío y complementa esto con un medio de recuperación post-descongelación (RevitaCell) (1:100).
      PRECAUCIÓN: Mantén el medio de emplatado sobre hielo durante la preparación y emplatado de los hiPSC.
2. Placado de hiPSCs para diferenciación de hPGCLC (Día 0).
   1. Retirar el medio de cultivo del 6-pozo que contiene los hiPSCs para usarlo en la diferenciación de hPGCLC. Empieza con hiPSCs de alta calidad con confluencia del 50–80%, sin signos de diferenciación espontánea.
   2. Añade 1 mL de solución de tripsina (Tripline) por pozo.
   3. Incuba los hiPSCs durante 5 minutos a 37 °C.
   4. Haz una suspensión de célula única resuspendiendo cuidadosamente las colonias de hiPSC 2–3 veces con una pipeta p1000.
   5. Comprueba con un microscopio invertido si se ha obtenido una suspensión de célula única. Si no, resuspende las colonias de hiPSC otras 1 o 2 veces con una pipeta p1000.
   6. Transfiere la suspensión de la celda hiPSC a un tubo de 15 mL.
   7. Añade 4 mL de DMEM-F12 medio al tubo de 15 mL.
   8. Centrifuga la suspensión de la celda hiPSC a 200 x g durante 5 minutos.
   9. Aspirar el sobrenadante y resuspender cuidadosamente las células hiPSC en un medio de chapado de 0,5–1,0 mL.
   10. Cuenta el número de hiPSCs usando un contador celular o un hemocitómetro y calcula el número de hiPSCs necesarios por pozo para la diferenciación de hPGCLC.
       NOTA: Como punto de partida, se puede utilizar una densidad de chapado de 40–80K celdas/^cm2 . Sin embargo, para cada línea celular y en cada número de paso, se recomienda optimizar la densidad de la chapa para lograr un rendimiento óptimo. Aquí, los hiPSC se placaron con una densidad de revanoplastia de 10K a 100K celdas/^cm2.
   11. Resuspende cuidadosamente el número requerido de hiPSCs en el volumen adecuado de medio de chapa (1 mL por pozo de una placa de 12 pozos) y asegura que se obtenga una suspensión de celda homogénea usando una pipeta p1000.
   12. Saca la placa recubierta de 12 pozos de la incubadora y retira la solución de recubrimiento.
   13. Añade 1 mL de la suspensión de celda a cada pozo de una placa de 12 pozos.
   14. Sacude cuidadosamente la placa para asegurarte de que las células estén distribuidas uniformemente en el pozo.
   15. Coloque la placa de 12 pozos en una incubadora normóxica humidificada (37 °C, 5% CO₂₎ durante 16–24 horas.
3. Diferenciación hPGCLC (Día 1–2)
   1. Preparar medio basal RB27: RPMI160 avanzado con B-27 (1:100), 1X sustituto de aminoácidos (Glutamax), 1X aminoácidos no esenciales de MEM y solución preventiva de contaminación por micoplasma (1:1000).
   2. Preparar medio de diferenciación: solución de BMEx al 2% (v/v) en medio basal frío RB27 y añadir BMP4 a una concentración final de 10 ng/mL. El extracto basal de membrana es necesario para inducir la lumenogénesis y activar la especificación PGCLC in vivo.
      PRECAUCIÓN: Mantén el medio de diferenciación sobre hielo o a 4 °C. El medio de diferenciación puede prepararse para los Días 1 y 2 del protocolo de diferenciación.
   3. El Día 1 (dentro de 16–24 horas después de emplatar los hiPSC), saca la placa de la incubadora y retira el medio de emplatado.
   4. Lava los pozos añadiendo 0,5 mL de medio basal RB27 por pozo.
   5. Aspira el medio basal RB27 y añade 1 mL de medio de diferenciación por pozo.
   6. Coloca la placa con las células de nuevo en la incubadora normóxica humidificada (37 °C, 5% CO₂).
   7. En el segundo día de la diferenciación, refresca las células con 1 mL de medio de diferenciación por pozo.
4. Diferenciación hPGCLC (Día 3–5)
   1. Preparar medio de conmutación: medio basal RB27 complementado con BMP4 (10 ng/mL), LIF (10 ng/mL), SCF (50 ng/mL) y EGF (50 ng/mL). El medio de cambio refleja el cambio in vivo de la especificación hPGC a la supervivencia y proliferación. BMEx se omite porque la lumenogénesis ya no es necesaria.
   2. En el día 3 y el día 4, refresca cada pozo con un medio de interruptor de 1 mL.
   3. En el día 5 de diferenciación, las hPGCLC pueden caracterizarse mediante inmunofluorescencia o citometría de flujo.

4. Caracterización de hPGCLC mediante inmunofluorescencia y citometría de flujo

1. Caracterización por inmunofluorescencia.
   1. Preparar la solución de permeabilización: 0,3% Triton X-100 diluido en PBS.
   2. Preparar solución de lavado: 0,05% Tween 20 in PBS (PBST)
   3. Prepara solución bloqueante: albúmina sérica bovina al 1% (BSA) en PBST.
   4. Retirar el medio de conmutación de los pozos usados para la diferenciación hPGCLC.
   5. Lava las celdas con 1 mL por DPBS por pozo (-/-).
   6. Fijar las células con 1 mL por pozo y al 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS durante 15 minutos en RT.
   7. Lava las células 3 veces durante 5 minutos con PBS, usando 1 mL por pozo.
      NOTA: En este punto, las placas pueden almacenarse a 4 °C antes de iniciar la inmunofluorescencia.
   8. Permeabiliza las células con solución de permeabilización durante 15 minutos en RT, usando 1 mL por pozo.
   9. Lava las células 3 veces durante 5 minutos con solución de lavado, usando 1 mL por pozo.
   10. Bloquear las células con solución bloqueante durante 1 hora en RT, usando 1 mL por pozo.
   11. Preparar la solución primaria de anticuerpos: diluir los anticuerpos primarios de interés en la solución bloqueadora.
       NOTA: Aquí se utilizaron las siguientes dos combinaciones de anticuerpos para marcadores PGC: anti-SOX17 de cabra y anti-TFAP2C de conejo, y anti-SOX17 de cabra y anti-POU5F1 de ratón (Tabla de Materiales).
   12. Retirar la solución bloqueante, añadir 0,4 mL de solución primaria de anticuerpos por pozo e incubar durante la noche a 4 °C.
       NOTA: Es importante incluir controles negativos para evaluar la unión inespecífica de anticuerpos. Para ello, mantente una bien durante la noche en una solución bloqueadora, omitiendo los anticuerpos primarios, pero luego tiñe bien esa solución con la solución secundaria de anticuerpos.
   13. Al día siguiente, retira la solución primaria de anticuerpos y lava las células 3 veces durante 5 minutos con PBST.
   14. Preparar la solución secundaria de anticuerpos: diluir los anticuerpos secundarios de interés (Tabla de Materiales) y DAPI (1:500) en solución bloqueante.
       NOTA: La solución secundaria de anticuerpos es fotosensible y debe mantenerse a oscuras.
   15. Retira PBST y añade 0,4 mL de solución secundaria de anticuerpos por pozo durante 1 hora en RT en la oscuridad.
   16. Lava las células 3 veces durante 5 minutos con PBS, usando 1 mL por pozo.
   17. Haz imágenes de las células (lente objetivo 20x).
       NOTA: Las imágenes de inmunofluorescencia se obtuvieron usando un objetivo de 20x en el microscopio Airyscan, mientras que las imágenes de campo claro se capturaron usando un objetivo 4x y uno de 10x en el microscopio EVOS.
2. Caracterización mediante citometría de flujo
   1. Preparar el buffer FACS: 0,5% BSA en DPBS (-/-)
   2. Retira el medio de cambio de los pozos con los hPGCLC.
   3. Lava las células con 1 mL de DPBS (-/-).
   4. Añade 0,5 mL de Accutase precalentada por pozo y incuba durante 15 minutos a 37 °C. Para la disociación, se prefiere la Accutasa a la solución de tripsina porque las hPGCLC son muy sensibles a la disociación.
   5. Haz una suspensión de una sola celda resuspendiendo cuidadosamente las celdas 2–3 veces con un p1000.
   6. Comprueba con un microscopio invertido si se ha obtenido una suspensión de célula única. Si no, resuspende las células otras 1 o 2 veces con una pipeta p1000.
   7. Filtra la suspensión de la celda a través de un colador de 40 μm hasta un tubo de 15 mL.
   8. Lava el colador de 40 μm con un buffer FACS de 5 mL.
   9. Centrifuga la suspensión de celda a 300 x g durante 5 minutos.
   10. Quita el sobrenadante.
   11. Resuspende el pellet celular en un buffer FACS de 0,3 mL en un tubo de 1,5 mL.
       NOTA: Es opcional contar células usando un contador celular o un hemotómetro. Si se cuentan las celdas, se espera alrededor de 1 millón de celdas por pozo de una placa de 12 pozos.
   12. Preparar muestras de control adecuadas para la citometría de flujo (controles sin tinción y con una sola tinción). Para ello, transfiere entre 15 y 30 μL de la suspensión de la celda a tubos de 1,5 mL y se llena hasta 100 μL con un tampón FACS.
       NOTA: Para este estudio se prepararon 3 tinciones individuales: EPCAM-PEcy7 (1:200), ITGA6-BV421 (1:200) y 7AAD (1:200). Las soluciones que contienen los anticuerpos conjugados y el 7AAD son sensibles a la luz y deben mantenerse en la oscuridad.
   13. Añadir los anticuerpos conjugados de interés directamente a la suspensión celular para lograr una dilución adecuada. Aquí, se utilizaron juntos los siguientes anticuerpos conjugados para marcadores PGC: EPCAM-PEcy7 (1:200) e ITGA6-BV421 (1:200) (Tabla de Materiales).
   14. Incuba las células con los anticuerpos conjugados durante 30 minutos sobre hielo en la oscuridad.
   15. Añade 1 mL de tampón FACS a las muestras, controles sin teñir y controles de un solo anticuerpo, y centrifuga a 300 x g durante 5 minutos.
   16. Quita el sobrenadante.
   17. Resuspender las muestras en 0,5 mL y las muestras de control en 0,2 mL, del buffer FACS que contiene 1 mM de EDTA. Esto evita que las células se agrupen.
   18. Añade las muestras y controles a un tubo FACS de 5 mL con un tapón de filtro de celdas, y luego pásalos por el colador.
   19. Añadir 7AAD directamente a cada muestra varios minutos antes de medir en el citómetro de flujo.
   20. Mide muestras usando un Citómetro de Flujo. Aquí, se utilizó el analizador celular basado en fluorescencia para medir las muestras, los datos se recogieron con el software FACSDiva (v9.0) y el software FlowJo (v10.10.0) se utilizó para analizar los datos.
   21. Utiliza las muestras de control (no tintidas y controles de un solo anticuerpo) para establecer la estrategia de gating y realizar la compensación si es necesario.
   22. Haz un vórtice de las muestras antes de meterlas en la máquina.
   23. Extrae la población celular de todos los eventos estableciendo primero una puerta basada en el área [área de dispersión hacia adelante (FSC-A) y área de dispersión lateral (SSC-A)].
   24. De esta población celular, extrae células individuales basadas en tamaño [ancho de FSC (FSC-W) y altura de FSC (FSC-H)] y granularidad [SSC-W y SSC-H].
   25. Excluye las células muertas de análisis posteriores estableciendo una compuerta para células 7AAD-negativas.
   26. Utiliza la muestra para comprobar si las compuertas están correctamente ajustadas y ajústalas si es necesario.
   27. Analizar los marcadores de interés de esta población de células vivas. Aquí, las células gated que dieron positivo tanto para EPCAM como para ITGA6 correspondían a hPGCLCs.

Resultados

La calidad y el estado estable de los hiPSC son importantes para una mayor diferenciación
los hiPSC se mantuvieron en placas de 6 pozos durante al menos 3 pasajes (en los diferentes recubrimientos) antes de los experimentos y análisis de diferenciación. Las hiPSCs se transmitieron cuando las colonias celulares alcanzaron una confluencia del 70–80% (Figura 1B), que es también la confluencia óptima de hiPSC para iniciar la diferenciación de hPGCLC. Las culturas sanas de hiPSC mostraron una morfología uniforme de colonias sin áreas oscuras o diferenciadas, visible en imágenes de campo claro (Figura 1B). Sin embargo, la calidad de los hiPSCs se vio afectada cuando las colonias celulares no se mantenían en su confluencia óptima o mostraban signos de diferenciación (Figura 1B). En confluencia baja, la hiPSC continuó proliferando y se necesitó más tiempo para la formación de colonias hasta que la confluencia fuera adecuada para experimentos de paso o diferenciación. En confluencia alta, los hiPSCs crecieron unos sobre otros, mientras que aparecieron regiones diferenciadas. El estado de pluripotencia de las hiPSCs se confirmó mediante la expresión de SOX2 o POU5F1, ambos factores de transcripción esenciales para mantener la pluripotencia y la autorrenovación en las^{hiPSCs 30}, y lo más importante, SOX2 no se expresa en las hPGCLCs³¹. Se utilizó tinción con faloidinas para evaluar la organización del citoesqueleto y la morfología de las colonias, indicativo de la calidad de las hiPSC. Cabe señalar que las diferencias en la morfología celular están asociadas con la reducción de SOX2 o POU5F1 (Figura 1B).

Efecto del sustrato de mantenimiento de hiPSC en la diferenciación de hPGCLC
Para evaluar si el mantenimiento de hiPSCs en diferentes sustratos de recubrimiento afectaba la diferenciación a hPGCLC, los hiPSCs se cultivaron sobre diferentes sustratos (Geltrex, Matrigel, Cultrex y vitronectina) (Figura 2). En todos los sustratos, los hiPSC mostraron niveles robustos y uniformes de SOX2 nuclear o POU5F1, indicativos de su estado pluripotente. Las colonias hiPSC mantenidas en Geltrex, Matrigel y Cultrex tenían una morfología comparable, incluyendo bordes bien definidos y formas irregulares de colonias, en comparación con las colonias redondas en vitronectina (Figura 2). Las hiPSCs que alcanzaron una confluencia del 70–80% se placaron a una densidad de 40K células/^cm2 y se diferenciaron en hPGCLCs en Geltrex²⁶. En el día 5, las imágenes de campo claro mostraron colonias características de hPGCLC en todas las condiciones (Figura 3). Además, se identificaron hPGCLC SOX17/TFAP2C/PDPN triple positivos o doblemente positivos SOX17/POUF51 en todas las condiciones (Figura 3). Esto sugería que el protocolo de diferenciación podría usarse con hiPSCs cultivados bajo diferentes condiciones.

Efecto de la densidad celular inicial de hiPSC en la diferenciación de hPGCLC
Es importante comprobar la densidad óptima de siembra para una diferenciación óptima de hPGCLC (en Geltrex), ya que diferentes hiPSC tienen distintas tasas de proliferación. Además, en caso de que la eficiencia en la diferenciación de hPGCLC disminuya a medida que los hiPSC son continuamente transitados, se recomienda ajustar la densidad de la célula de siembra de hiPSC. Para evaluar el impacto de la densidad de células de siembra en la eficiencia de la diferenciación de hPGCLC, se sembraron hiPSCs a diferentes densidades, desde 10K hasta 100K células/^cm2 (Figura 4A). En el día 5, el porcentaje de hPGCLC fue evaluado mediante citometría de flujo utilizando dos anticuerpos conjugados diferentes para marcadores PGC humanos, EPCAM e integrina α6 (ITGA6)³². El análisis de citometría de flujo siguió una estrategia estándar de gating secuencial, mostrada para hiPSCs de M199 sembrados a 40K células/^cm2 (Figura 4B). En resumen, la población celular total (todos los eventos) fue controlada para excluir los residuos (área de partículas), luego se seleccionaron células individuales en función del tamaño (FSC) y la granularidad (SSC), y finalmente, se excluyeron las células muertas basándose en la tinción con 7AAD. Posteriormente, se estableció la puerta para cuantificar células que expresan EPCAM-cy7 e ITGA6-BV421 utilizando muestras teñidas y sin teñir (Figura 4B).

Comparando la eficiencia de diferenciación de hPGCLC usando diferentes densidades de células de siembra y usando hiPSC cultivados sobre diferentes sustratos se reveló una tendencia dependiente de la densidad (Figura 4C). A la densidad de siembra de 20–40K celdas/^cm2, los hiPSCs M54 y M199 mostraron la mayor proporción de hPGCLCs doblemente positivos en EPCAM+/ITGA6+, obtenida a partir de hiPSCs mantenidos con Geltrex y Cultrex. Curiosamente, las densidades más altas resultaron en una menor eficiencia de diferenciación. Los resultados de inmunofluorescencia utilizando marcadores PGC SOX17/TFAP2C/PDPN o SOX17/POUF51 en los hPGCLC validaron los resultados de la citometría de flujo (Figura 4D). Estos resultados sugirieron que ajustar la densidad de siembra a los hiPSC específicos es importante para obtener una eficiencia óptima de diferenciación. La combinación de inmunofluorescencia y citometría de flujo mejora la robustez del ensayo de diferenciación hPGCLC.

Figura 1: flujo de trabajo de diferenciación de hPGCLC y calidad de los hiPSC. (A) Esquema del flujo de trabajo utilizado en este estudio. Los hiPSCs se mantuvieron (en medio de cultivo) y alcanzaron una confluencia del 60–80% el día de la diferenciación (Día 0, D0). En D0, los hiPSCs se disociaron en células individuales y se placaron con la densidad de siembra deseada (en el medio de placaje). Al día siguiente, las células fueron tratadas con medio de diferenciación (D1–D3), seguido de medio de cambio (D3–D5). En D5, se utilizaron hPGCLC para inmunofluorescencia o citometría de flujo. (B) Imágenes de campo claro (fila superior - aumento 4x); inmunofluorescencia para SOX2, tinción con FALOIDINA y tinción DAPI (fila intermedia); y para POU5F1, tinción con FALOIDINA y tinción DAPI (fila inferior) que muestran hiPSCs con diferentes confluencias. Barras de escala = 50 μm. Los dibujos de la Figura 1A fueron creados por los autores utilizando herramientas básicas de dibujo en Adobe Illustrator; no se utilizó software ni herramientas de pago. Por tanto, no se requería ninguna licencia de derechos de autor. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Efecto de varios sustratos de recubrimiento durante el cultivo de hiPSC. Imágenes de campo claro (fila superior); inmunofluorescencia para SOX2, tinción con FALOIDINA y tinción DAPI (fila intermedia); y para POU5F1, tinción con FALOIDINA y tinción DAPI (fila inferior) que muestran hiPSCs cultivados sobre diferentes sustratos de recubrimiento. Barras de escala = 50 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Efecto de varios sustratos de recubrimiento durante el cultivo de hiPSC sobre la diferenciación de hPGCLC. Imágenes de campo claro (fila superior - aumento 10x); inmunofluorescencia para SOX17, TFAP2C, PDPN y tinción DAPI (fila central); y para la diferenciación de POU5F1, SOX17 y DAPI (fila inferior) de hPGCLC (usando Geltrex) en el día 5, partiendo de hiPSCs cultivados sobre diferentes sustratos de recubrimiento. La línea amarilla discontinua resalta regiones con hPGCLC. Barras de escala = 25μm (fila superior) y 50 μm (filas intermedia e inferior). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Efecto de la densidad de siembra de hiPSC en la diferenciación de hPGCLC. (A) Imágenes de campo claro en el Día 1 (D1) y D3 de diferenciación de hPGCLC usando diferentes densidades de siembra de hiPSC (40K celdas/^{cm 2}, 60K celdas/cm2, 80K celdas/^{cm 2}). Barras de escala = 250 μm. 4x de ampliación. (B) Gráficos representativos de citometría de flujo que muestran la estrategia de acceso para cuantificar el porcentaje de hPGCLCs EPCAM+/ITGA6+. Para ello, se usaron hiPSCs M199 (en Geltrex) con una densidad de siembra de 40K celdas/^cm2. (C) Gráfico de barras que muestra los porcentajes de hiPGCLCs EPCAM+/ITGA6+ en D5 al usar hiPSCs (M199 y M54) cultivados en diferentes recubrimientos y sembrados a diferentes densidades. (D) Inmunofluorescencia para SOX17, TFAP2C, PDPN y tinción DAPI (paneles izquierdos); y SOX17, POU5F1 y tinción DAPI (paneles derechos) en D5 de diferenciación de hPGCLC usando hiPSCs (M199 y M54, en Geltrex) sembrados en celdas de 40K y 80K/cm2. Barras de escala = 50 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

La gametogénesis in vitro constituye una poderosa plataforma experimental para investigar el desarrollo de la línea germinal humana, la toxicidad reproductiva y la infertilidad bajo condiciones de cultivo controlado y en una base específica de cada paciente. Aunque se han reportado múltiples protocolos para diferenciar hPGCLC de^{hiPSCs 18}, el progreso en el campo se ha visto obstaculizado por la limitada disponibilidad de enfoques estandarizados, escalables y reproducibles en laboratorios. Estudios recientes han descrito enfoques simplificados y eficientes para la inducción de hPGCLC, incluyendo la diferenciación micropatronada^{basada en BMP4 27}, una plataforma monocapa 2D rápida que permite la generación de hPGCLC en 3,5 días²⁸, y un sistema de cultivo 3D que modela el desarrollo periimplantacional y la señalización paracrina de nicho³³. Aunque estos protocolos soportaban eficazmente la diferenciación hPGCLC, aún carecían de la capacidad de servir como plataformas de alto rendimiento. Para que los estudios basados en hPGCLC sean ampliamente aplicables, especialmente para cribados toxicológicos reproductivos, los protocolos deben ser sólidos, técnicamente accesibles y compatibles con ensayos cuantitativos posteriores. Aquí se presenta un análisis paso a paso del protocolo BMEx-diferenciación de hPGCLC, enfatizando parámetros técnicos críticos que determinan la reproducibilidad y el rendimiento.

Un determinante importante para una diferenciación exitosa es el estado inicial de pluripotencia de los hiPSC. El número de pasos, la salud celular, las características específicas de las líneas y las condiciones de cultivo previas a la diferenciación pueden influir en los resultados de diferenciación de hPGCLC. Inicialmente, durante el mantenimiento de hiPSC, la atención puede centrarse en el sustrato de recubrimiento, la densidad de la célula de siembra y el formato de placa de cultivo, que juntos definen la arquitectura de colonias y los entornos de señalización al inicio de la diferenciación de hPGCLC. El presente estudio demuestra el efecto del uso de hiPSCs cultivados en diferentes recubrimientos y diferentes densidades de siembra en la diferenciación de hPGCLCs (en Geltrex). Ambas líneas de hiPSC probadas aquí mostraron una eficiencia máxima de diferenciación con una densidad de siembra de 20.000–40.000 celdas/^cm2 . Esto subraya la necesidad de determinar las densidades óptimas de siembra al introducir nuevas líneas celulares, tras un paso prolongado o modificar diseños experimentales o formatos de placas de cultivo. Incluso cambios aparentemente menores en las relaciones superficie-volumen o en la cinética de crecimiento pueden necesitar optimización para preservar una alta eficiencia de diferenciación. Por ello, se recomienda que los usuarios realicen experimentos piloto a pequeña escala para determinar primero las condiciones óptimas para la diferenciación de hPGCLC.

A pesar de su robustez, el método presenta limitaciones que deben ser reconocidas. Aunque es compatible con múltiples recubrimientos y densidades, la eficiencia de diferenciación sigue siendo sensible a las propiedades intrínsecas de la hiPSC, incluyendo el estado epigenético y la historia del paso, que no son completamente controlables. Varios hiPSCs probados parecían incapaces de diferenciarse en^{hPGCLCs 26}. Lo más importante es que, a diferencia de la vitronectina, que es un producto completamente definido, BMEx es un producto de origen animal sujeto a variación de lote a lote, lo que puede afectar a la reproducibilidad. Aunque diferentes lotes de Matrigel, Cultrex y Geltrex ya se probaron previamente y obtuvieron resultados^{consistentes 26}, esto sigue siendo motivo de preocupación, y deben considerarse alternativas completamente definidas a BMEx para garantizar la reproducibilidad y transferibilidad futuras. Aquí se utilizaron dos líneas macho (XY) de hiPSC, pero este protocolo se ha probado tanto con las líneas femeninas (XX) como macho (XY)²⁶. Finalmente, aunque el protocolo dio lugar a las hPGCLC, que han demostrado ser transcripcionalmente similares a las hPGC y tener competencia para un desarrollo posterior^26,34, la maduración posterior en etapas germinales posteriores no se abordó aquí. Aunque se demostró escalabilidad para aplicaciones de tipo cribado, la adaptación basada en automatización y la validación interlaboratorio a través de un panel más amplio de líneas hiPSC fortalecerán aún más la utilidad traslacional.

En comparación con las estrategias de diferenciación hPGCLC existentes, este protocolo ofrece varias ventajas. A diferencia de enfoques altamente especializados o restringidos por matrices, acomoda sustratos de mantenimiento de hiPSC y formatos de placas de cultivo comúnmente utilizados, reduciendo así barreras técnicas. El énfasis en la optimización de densidad y el control de calidad en etapas tempranas mejora aún más la reproducibilidad, un desafío persistente en el campo de la gametogénesis in vitro .

El marco metodológico descrito aquí es especialmente relevante para la toxicología reproductiva, la modelización de la infertilidad y la biología del desarrollo. Su compatibilidad con formatos escalables permite el cribado compuesto de rendimiento medio a alto, mientras que su reproducibilidad favorece comparaciones cruzadas y esfuerzos colaborativos de consorcios. De forma más amplia, la estandarización sistemática de los protocolos de inducción de hPGCLC en laboratorios, comparando caracterización y objetivos^{funcionales 18,35}, será esencial para avanzar en la gametogénesis in vitro hacia plataformas predictivas relevantes para humanos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
7AAD Viability Staining Solution	BioLegend	420403	Dilution 1:200
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
Advanced RPMI 1640 Medium	Gibco	12633012
Alexa Flour 488 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A21202	Dilution 1:500
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A21207	Dilution 1:500
Alexa Flour 647 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A21447	Dilution 1:500
Alexa Fluor Phalloidin 594	Invitrogen	A12381	Dilution 1:400
Alexa Fluor Phalloidin 647	Invitrogen	A30107	Dilution 1:400
Antibody anti-CD49f (ITGA6), Brilliant Violet 421	Biolegend	313624	Dilution 1:200
Antibody anti-CD326 (EPCAM1), PE/Cyanine7	Biolegend	324222	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX2, rabbit polyclonal	Merck	ab5603	Dilution 1:200
Antibody anti-SOX17, goat polyclonal	R&D Systems	AF1924	Dilution 1:500
Antibody anti-OCT3/4 (POU5F1), mouse monoclonal	Santa Cruz Biotechnology	SC-5279	Dilution 1:200
Antibody anti-Podoplanin (PDPN), mouse monoclonal	Abcam	ab256561	Dilution 1:200
Antibody anti-AP-2γ (TFAP2C), rabbit polyclonal	Cell Signaling Technology	2320S	Dilution 1:300
B-27 Supplement, serum free	Gibco	17504044	Diltuion 1:100
BD FACSCanto	BD Biosciences		Equipment for flow cytometry
BD FACSDiva software version 9.0	BD Biosciences		Software
Bovine Serum Albumin (BSA), fractie V	Roche	10735086001	Dissolve in PBST
CELLSTAR 12 Well Cell Culture Plate	Greiner	665180
CELLSTAR 15 mL Tube	Greiner	188271
CELLSTAR 6 Well Cell Culture Plate	Greiner	657160
Corning 40 µm Cell Strainers	Corning	431750
Cultrex Stem Cell Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	R&D systems	3434-101-02	Dilute to in cold DMEM-F12
DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindole)	Invitrogen	D3571	Dilution 1:500
DMEM:F12, GlutaMAX supplement	Gibco	31331028
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EVOS M5000	Invitrogen		Equipment for imaging
EVOS M5000 software version 1.3.660.548	Invitrogen		Software
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	Dilute to in cold DMEM-F12
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Dilution 1:100
hiPSCs M54	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0054iCTRL03	hiPSCs can be distributed upon request with MTA
hiPSCs M199	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0199iCTRL01	hiPSCs can be distributed upon request with MTA
LUNA-II Automated Cell Counter	Logos Biosystems		Equipment for cell counting
LUNA-II software version 2.3.5	Logos Biosystems		Software
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free	Corning	354277	Dilute to in cold DMEM-F12
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050	Dilution 1:100
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2011	Dilution 1:1000
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	1040051000	Dissolve to 8% PFA in water first; and dilute to 4% (1:1) with 0.2 M phosphate buffer
PIPETMAN P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector	Gilson	F144059M
PIPETMAN P200, 20–200 µL, Metal Ejector	Gilson	F144058M
PIPETMAN P10, 1–10 µL, Metal Ejector	Gilson	F144055M
Recombinant Human BMP4, CF	R&D Systems	314-BP-050	Stock concentration of 100 µg/mL in 4 mM HCL containing 0.1% BSA
Recombinant Human EGF, CF	R&D Systems	236-EG-200	Stock concentration of 50 µg/mL in PBS
Recombinant human LIF	Gibco	300-05	Stock concentration of 100 µg/mL in 0.1% BSA
Recombinant Human SCF, CF	R&D Systems	11010-SC-100	Stock concentration of 100 µg/mL in PBS
ReLeSR	STEMCELL Technologies	5872
RevitaCell Supplement	Gibco	A26445-01