Cribados knockout a nivel epigenomico basados en CRISPR-Cas9 en células quimioresistentes

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para generar células quimioresistentes utilizando un enfoque de escalada de dosis, seguido de un cribado basado en CRISPR/Cas9 utilizando una biblioteca de sgRNA enfocada dirigida a modificadores epigenéticos para identificar reguladores de la quimiorresistencia adquirida. El protocolo también proporciona múltiples puntos de optimización adaptados a modelos celulares quimioresistentes, proporcionando un marco sólido para investigadores que investigan mecanismos de resistencia.

Resumen

La resistencia a la quimioterapia sigue siendo un gran desafío en el tratamiento del cáncer, impulsado por la capacidad de las células cancerosas para adquirir propiedades adaptativas, reconfigurar las vías de señalización y alterar la estructura de la cromatina para evadir la citotoxicidad inducida por fármacos. Debido a que estos procesos dependen en gran medida de mecanismos epigenéticos que regulan la organización de la cromatina y la plasticidad transcripcional, los reguladores epigenéticos han surgido como contribuyentes clave a la resistencia a la quimioterapia. Para investigar la resistencia al paclitaxel, uno de los agentes quimioterapéuticos más utilizados en el cáncer de mama triple negativo (TNBC), empleamos una biblioteca knockout centrada en epigenoma (EPIKOL), una biblioteca basada en CRISPR-Cas9, diseñada para interrumpir sistemáticamente los genes implicados en la regulación de la cromatina. Se generaron líneas celulares quimioresistentes mediante un protocolo de escalada de dosis paso a paso que recapitula la adaptación clínicamente relevante de fármacos. Sin embargo, estas células resistentes presentan un fenotipo multirresistente a fármacos (MDR), lo que plantea desafíos significativos para la transducción viral eficiente y la selección de poblaciones celulares estables. En este estudio, describimos pasos metodológicos clave para lograr una transducción y selección lentiviral de alta eficiencia, permitiendo la aplicación exitosa de cribados EPIKOL CRISPR en modelos TNBC quimioresistentes. Siguiendo el protocolo descrito, se realizó un cribado CRISPR a nivel epigenomico en células TNBC quimioresistentes, e identificaron nuevos reguladores epigenéticos de la quimiorresistencia. Este protocolo proporciona un marco sólido para identificar reguladores epigenéticos que contribuyen a la resistencia adquirida al paclitaxel utilizando un enfoque de pérdida de función basado en CRISPR.

Introducción

El cáncer de mama triple negativo (TNBC) es un subtipo de cáncer de mama que representa entre el 12 y el 17% de todos los cánceres^{de mama.} Se caracteriza por la expresión deteriorada del receptor de estrógenos (RE), receptor de progesterona (PR) y receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-2 (HER2), lo que limita severamente la disponibilidad de opciones terapéuticas dirigidas y deja la quimioterapia convencional como la modalidad^{principal de tratamiento 2}. Los taxanos y antracilinas se utilizan comúnmente en el tratamiento TNBC; sin embargo, los pacientes suelen desarrollar resistencia ^2,3. La adquisición de quimiorresistencia es un proceso complejo y multidimensional que incluye adaptaciones genéticas, metabólicas, transcripcionales y^{epigenéticas 2,4}. Las alteraciones epigenéticas han surgido como reguladores centrales de la plasticidad celular, facilitando la reprogramación transcripcional dinámica que permite a las células cancerosas tolerar la toxicidad inducida por la^{quimioterapia 5}.

El taxol (paclitaxel) es un miembro de la clase de taxanos, que causa la muerte celular al afectar la dinámica de los microtúbulos y funciona como agente^{antimitótico 6}. Aunque los pacientes con TNBC responden inicialmente a los regímenes de quimioterapia que incluye Taxol, la resistencia suele desarrollarse con el^{tiempo 2}. La resistencia adquirida al Taxol se asocia comúnmente con la sobreexpresión de transportadores de casete que se unen a ATP (ABC), específicamente ABCB1 (MDR1, P-glicoproteína), que median el flujo de Taxol del fármaco, resultando en una disminución de la toxicidad intracelular^{de fármacos 7}. Dado que una amplia gama de agentes quimioterapéuticos son sustratos de estos transportadores ABC, su regulación alza limita el uso de otros fármacos quimioterapéuticos, provocando un fenotipo de resistencia multifármaco (MDR⁾⁸. La inhibición de los transportadores ABC ha demostrado ser en gran medida ineficaz como estrategia para superar la resistencia a múltiples fármacos en entornos clínicos, principalmente debido a su expresión ubicua y a sus roles esenciales en el transporte de una amplia gama de sustratos endógenos y^{exógenos 9}. Aunque el verapamilo, un inhibidor de ABCB1 de primera generación, demostró un beneficio clínico limitado o nulo y se asoció con una toxicidad significativa en los ensayos^clínicos10, sigue siendo una herramienta experimental valiosa para mejorar la eficiencia de selección en modelos in vitro de MDR.

El fenotipo MDR es un proceso dinámico y adaptativo que surge principalmente durante condiciones de^{estrés 2}. La expresión del transportador ABC está controlada predominantemente por mecanismos reguladores transcripcionales y epigenéticos, más que por eventos^{mutacionales 5,11}. La limitación de dirigirse directamente a los transportadores ABC pone de manifiesto la necesidad de identificar los reguladores aguas arriba de estas proteínas como una vulnerabilidad específica para las células resistentes. Por ello, la interrogación sistemática de factores epigenéticos se ha convertido en una estrategia importante para identificar nuevos reguladores de la resistencia a la quimioterapia y desarrollar terapias combinadas que actúen contra estas vulnerabilidades.

Los cribados funcionales de knockout basados en CRISPR-Cas9 permiten perturbaciones genómicas sesgadas y sistemáticas para estudiar los efectos de la pérdida génica en el cáncer a escala^{genómica 12}. Sin embargo, las bibliotecas CRISPR a nivel genómico ofrecen una representación limitada de ARN guía único (sgRNA) por gen, lo que reduce la sensibilidad en comparación con las bibliotecas^{enfocadas 13}. Es importante destacar que un cribado robusto no solo depende de la calidad de las perturbaciones, sino también de un modelo adecuado y un protocolo experimental optimizado. En este contexto, estudiar un proceso dinámico y complejo como la resistencia a los fármacos podría beneficiarse de una biblioteca enfocada con un protocolo^{personalizado 13}. En un trabajo anterior, generamos una biblioteca de knockout CRISPR-Cas9 centrada en el epigenoma para dirigirse a los reguladores^{de la cromatina 14}. En comparación con otras bibliotecas CRISPR centradas en epigenomas de acceso público, la biblioteca epigenética knockout (EPIKOL) contiene 779 genes, compuestos por lectores de cromatina, escritores, gomas de borrar y proteínas asociadas, cada uno dirigido a 10 sgARN, lo que permite aumentar la profundidad por gen y mejorar la robustez y reproducibilidad de las pantallas funcionales centradas en^{cromatina 14}. EPIKOL está disponible tanto en el sistema LentiGuide, en el que Cas9 se expresa desde un vector diferente, como en el sistema LentiCRISPR, que incluye Cas9, proporcionando flexibilidad según la línea celular. Alcanzar una cobertura suficiente de bibliotecas, definida como el número medio de células por sgRNA (por ejemplo, 500×–1000×), es más fácil para EPIKOL en comparación con las bibliotecas genómicas, lo que supone una ventaja al estudiar las líneas celulares quimioresistentes de crecimiento lento.

Aunque el cribado CRISPR ofrece un enfoque potente para examinar los mecanismos de quimiorresistencia, los flujos de trabajo estándar de cribado agrupado no están optimizados para células quimioresistentes con eflujo activo de fármacos. La puromicina, un antibiótico de selección comúnmente utilizado en sistemas CRISPR lentivirales, puede ser expulsada de las células resistentes por transportadores ABC, principalmente ABCB1, impidiendo la selección exitosa de células^{transducidas 15,16}. Esta limitación puede provocar poblaciones celulares heterogéneas, aumentar el ruido de fondo y, en última instancia, comprometer la calidad de los datos. Para abordar este desafío, optimizamos el paso de selección de puromicina inhibiendo transitoriamente el flujo de fármacos mediado por ABC con verapamilo, permitiendo así un enriquecimiento eficiente de células infectadas con sgRNA. Utilizando esta estrategia, identificamos el Bromodominio y el Dedo Que Contienen PHD 1 (BRPF1) como reguladores de la expresión de ABCB1 y la resistencia al taxol en TNBC¹⁷. La inhibición de BRPF1, ya sea genética o farmacológicamente, restauró la sensibilidad al Taxol en células resistentes, demostrando la utilidad de este protocolo optimizado para identificar objetivos accionables en la^{quimiorresistencia 17}.

Aquí, detallamos los pasos clave en el cribado CRISPR de selección negativa en modelos quimioresistentes, centrándonos específicamente en los desafíos técnicos que a menudo se pasan por alto en la mayoría de los protocolos de cribado por quimiorresistencia o CRISPR. El protocolo primero demuestra un método de escalada de dosis paso a paso para la generación de células quimiorresistentes y luego optimiza la administración viral y las condiciones de selección para superar el eflujo de fármacos mediado por el transportador ABC. En conjunto, estas optimizaciones aseguran un enriquecimiento eficiente de células sgRNA positivas durante los cribados CRISPR, eliminando efectivamente las células no transducidas, proporcionando así una estrategia robusta y eficiente para la transducción y selección en células TNBC quimioresistentes. Finalmente, el protocolo destaca los fundamentos para identificar los resultados de cribado CRISPR mediante secuenciación de próxima generación y análisis bioinformático.  En conjunto, este protocolo permite la implementación efectiva de la plataforma de cribado EPIKOL para identificar posibles objetivos terapéuticos que superen la resistencia 17,18,19.

Protocolo

Todos los reactivos y equipos utilizados en este estudio se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Generación de líneas celulares de cáncer de mama triple negativas resistentes al taxol

1. Para determinar la sensibilidad de las células al fármaco, ajustar la densidad celular de SUM159PT células adherentes a 2 × 10^{3 células} por pozo en placas inferiores negras de 96 pozos con la mezcla de nutrientes F12 de Ham suplementada con suero fetal bovino (FBS) al 5%, 1% penicilina-estreptomicina, 5 μg/mL de insulina, 10 mM de HEPES y 1 μL/mL de hidrocortisona, e incubar las células durante 16 horas en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO₂.
2. Preparar el stock de Taxol disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO). Para tratar las células, prepara diluciones seriales de Taxol en medios de cultivo, que van desde 0,3 nM hasta 10 μM (por ejemplo, 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1μM, 10 μM), y usar DMSO solo como control del vehículo.
3. Trata las células con 200 μL de dosis crecientes de Taxol (preparadas en el paso 1.2) como triplicados y deja la placa en una incubadora de cultivo celular durante 72 horas a 37 °C con un 5% de CO_2.
4. Tras 72 horas de tratamiento farmacológico, se mide la viabilidad celular con un ensayo de cuantificación celular basado en luminiscencia con adenosina trifosfato (ATP). Utiliza un lector de microplacas para medir la luminiscencia y normalizar valores a los controles DMSO. Calcular los valores del 10% de concentración inhibitoria (IC10) e IC50 mediante regresión no lineal utilizando un modelo logístico dosis-respuesta de cuatro parámetros en un software estadístico adecuado.
5. Para empezar a generar células quimioresistentes, sembra 2 × 10 células^{de 5} SUM159PT por pozo en placas de 6 pozos. Incubar durante la noche a 37 °C con 5% de_CO2.
6. Al día siguiente, trate las células con valores de Taxol IC10 o IC50 en 2 mL de medio de cultivo durante 72 horas como concentraciones iniciales.
7. Si las células toleran la concentración actual del fármaco, divídelas en dos pozos. Mantener un pozo como control de respaldo en un medio fresco y sustituir el medio del segundo pozo por un medio que contenga el doble de la concentración anterior de Taxol.
   NOTA: Si las células necesitan recuperación debido a cambios morfológicos inducidos por el estrés, como proyecciones celulares anormales, redondeo y desprendimiento extensos, o una reducción notable de la proliferación, mantenlas en un medio libre de fármacos y espere hasta que las células estén sanas y confluentes. Luego repite los pasos empezando por el paso 1.7.
8. Mientras generan células resistentes, pasan células parentales con un medio que contenga DMSO como control. Ajusta el volumen de DMSO para que coincida con la cantidad de DMSO presente en el tratamiento correspondiente con Taxol.
9. Mide la viabilidad celular como en los pasos 1.2–1.4 cada 3–4 semanas y continúa con este procedimiento hasta obtener una diferencia significativa (p < 0,05 o 10–50 veces según el fármaco aplicado) entre los valores de IC50 de las líneas celulares parentales y resistentes. El procedimiento de incrementación de la dosis suele durar entre 6 y 9 meses, dependiendo del fármaco utilizado.
10. Una vez obtenidas células resistentes estables, mantenlas en la dosis de mantenimiento (última dosis aplicada) del fármaco mientras se cultiva para preservar el fenotipo resistente.
    NOTA: La generación de células quimioresistentes mediante el método de escalada de dosis es un proceso que requiere mucho tiempo, y su duración depende de varios factores, incluyendo la línea celular, la tasa de crecimiento intrínseco y el agente quimioterapéutico específico utilizado. Generalmente tarda entre 6 y 9 meses, dependiendo del nivel clínicamente relevante de resistencia. Un enfoque alternativo para determinar diferencias significativas en los niveles de resistencia es evaluar la concentración mínima de fármacos a la que sobreviven las células resistentes, pero las células parentales no.
11. Caracterización de células resistentes: Realizar secuenciación de ARN, western bloting, reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (qPCR) y ensayos de viabilidad celular mediante tratamiento farmacológico (por ejemplo, ensayo de formación de colonias) para caracterizar el fenotipo celular resistente. Asegúrate de reevaluar el fenotipo resistente tras varios pasajes para demostrar que el fenotipo elevado de IC50 es estable a lo largo del tiempo.

2. Producción de lentivirus

1. Día 0: Semillas HEK293T células como 4 × 10¹⁰ 6 por 100 mm de cultivo tisular con el Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina, para lograr una confluencia del 90% al día siguiente.
2. Día 1: Preparar mezclas de polietilenimina (PEI) y ADN en DMEM sin suero (-/-) por separado para cada virus. Utilice la Tabla 1 y la Tabla 2 para ajustar el volumen y las concentraciones de PEI y ADN según el rendimiento viral deseado.
   NOTA: El PEI se utiliza cuatro veces el total de μg de ADN (por ejemplo, en una placa de 100 mm, se usan 30 μL de PEI para un total de 7,5 μg de ADN). La producción de virus en antenas de 100 mm se sigue en este protocolo y el virus obtenido de 5–10 antenas de 100 mm permitirá realizar múltiples cribados. Para experimentos de validación o infecciones a pequeña escala, basta con un solo pozo de una placa de 6 pozos o una antena de 60 mm. Dado que el clorhidrato lineal de polietilenimina es un agente tóxico de transfección, asegúrate de que la confluencia celular sea del 90% en el momento de la transfección.
   1. Después de mezclar bien, añade la mezcla de ADN al tubo PEI. Mezcla bien y deja que los complejos PEI-ADN reposen 30 minutos a temperatura ambiente.
   2. Luego añade los 600 μL del complejo PEI-ADN a los HEK293T, gota a gota. Colocar las placas en la incubadora viral durante 16 horas a 37 °C con un 5% de_CO2.
3. Día 2: Sustituir el medio de células infectadas aspirando el PEI y el medio que contiene virus y añadiendo 8 mL de DMEM completo por cada plato de cultivo de tejido de 100 mm. Incuba las células para permitir la producción viral.
4. Día 3: Realizar la primera recolección de virus retirando suavemente los 8 mL de sobrenadante en un tubo centrífuga de tamaño adecuado y almacenarlo a 4 °C. Si hay varias placas para la producción viral, combina los sobrenacionantes. Luego añade 8 mL de DMEM fresco y completo a cada plato y devuelvo los platos a la incubadora del virus.
5. Día 4: Repite los pasos de recogida y combínalo con los sobrenacionantes del Día 3.
   1. Preparar una solución de polietilenglicol (PEG)-8000 al 50% (p/v) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para obtener una solución de 5× PEG. Autoclave para disolver y esterilizar.
   2. Centrifuga los supernadantes virales recogidos a 300 x g durante 5 minutos para pelletar las células residuales, y luego procede a la filtración.
   3. Filtrar 16 mL de sobrenadante viral usando un filtro de 0,45 μm (ya sea jeringuilla o filtro de vacío de 50 mL) en el tubo que contiene 4 mL de solución PEG para lograr una concentración final de 1× PEG y eliminar los restos y células restantes.
   4. Tapa el tubo y mezcla por inversión. Repite este paso para todas las preparaciones virales. Guárdalos durante la noche a 4 °C en la oscuridad, con una agitación suave opcional.
   5. Al día siguiente, deberían estar presentes precipitados visibles. Centrifuga los tubos a 1400 x g durante 20 minutos a 4 °C.
      NOTA: Los pellets virales precipitados por PEG pueden almacenarse a 4 °C hasta 5 días antes de la centrifugación; sin embargo, el título viral puede disminuir con una incubación prolongada.
   6. Tras la centrifugación, descarta cuidadosamente el sobrenadante, dejando un pequeño volumen (aproximadamente 100 μL) en el tubo para evitar alterar el perdigón.
   7. Centrifuga los tubos 5 minutos a 300 x g para recoger la mayor cantidad posible de líquido de los laterales del tubo. Luego descarta cuidadosamente el sobrenadante restante.
   8. Para concentrar el virus 100 veces, añade PBS a 1/100 del volumen inicial del sobrenadante viral al pellet y resuspende el pellet pipeteando (por ejemplo, si se empieza con 16 mL de sobrenadante viral, añade 120–140 μL de PBS al pellet para alcanzar un volumen final de 160 μL, teniendo en cuenta el volumen del pellet). Evita pipetear vigorosamente; Aliquot el virus.
      NOTA: El título esperado tras la concentración de PEG es de >1 × 10⁸ partículas infecciosas/mL (ip/mL) para el sistema LentiGuide y >1 × 10⁷ para el sistema LentiCRISPR. Títulos inferiores en un orden de magnitud pueden seguir siendo aceptables, pero deben verificarse en función de la infectividad de la línea celular objetivo y del volumen viral requerido.
   9. Si no se requiere concentración del virus, se alicuota el virus para minimizar los ciclos de congelación y descongelación. Almacena el virus concentrado o no concentrado a -80 °C. Lejía y platos de basura.
      NOTA: Para una descripción más detallada de la producción y manejo de lentivirales, se remite a los lectores a los protocolos^{establecidos 20}. Para problemas comunes encontrados durante la producción de lentivirus, consulte la Tabla Suplementaria 1.

	1 pozo de placa de 6 pozos	Placa de 60 mm	Placa de 100 mm	Placa de 150 mm
PEI (stock 1 mg/mL) volumen	6 μL	9 μL	30 μL	60 μL
Volumen DMEM (-/-)	54 μL	100 μL	270 μL	540 μL

Tabla 1: Volúmenes requeridos PEI y DMEM para diferentes placas para la mezcla PEI.

	1 pozo de placa de 6 pozos	Placa de 60 mm	Placa de 100 mm	Placa de 150 mm
VSV-G	75 ng	150 ng	375 ng	750 ng
Gag-Pol	675 ng	1350 ng	3375 ng	6750 ng
Vector objetivo	750 ng	1500 ng	3750 ng	7500 ng
DMEM (-/-) ajusta el volumen final a	60 μL	100 μL	300 μL	600 μL

Tabla 2: Volúmenes de plásmidos y DMEM requeridos para diferentes placas para la mezcla de ADN.

3. Establecimiento de una selección optimizada de puromicina para células MDR

NOTA: En células quimioresistentes que presentan sobreexpresión de ABCB1, la selección de puromicina falla debido al flujo activo de puromicina mediado por ABCB1, lo que impide la selección efectiva de células infectadas con ARNsg. Para superar esta limitación, se coadministra verapamilo con puromicina para inhibir transitoriamente el flujo mediado por ABCB1, permitiendo la acumulación intracelular de puromicina y eliminando eficazmente las células no infectadas.

1. Determinar la concentración de verapamilo que bloquea el eflujo de fármacos mediado por ABCB1 sin afectar la viabilidad celular. Para ello, se utiliza el agente quimioterapéutico al que se ha adquirido resistencia (en este caso, Taxol) en combinación con dosis crecientes de verapamil.
   1. Semillas SUM159PT células resistentes al taxol y parentales a placas inferiores negras de 96 pozos a 2 × 10³ células por pozo en triplicado. Incubar las células durante la noche a 37 °C con 5% de_CO2.
   2. Tratar las células con diluciones en serie de verapamilo (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 y 80 μM) manteniendo una concentración constante del Taxol (por ejemplo, dosis de mantenimiento) en todas las condiciones.
   3. Tras 72 horas de tratamiento, evaluar la viabilidad celular con un ensayo de cuantificación celular basado en luminiscencia. Determinar la concentración de verapamilo que no reduce la viabilidad por sí sola (≥90%–95% en comparación con controles no tratados), sino que restaura la sensibilidad en células resistentes.
2. Para encontrar la concentración de puromicina que se usará en combinación con verapamil, semilla SUM159PT células resistentes al Taxol en una placa de 96 pozos a 2 × 10^{3 células}por pozo. Incubar la placa durante 16 horas a 37 °C con 5% de CO_2.
   1. Prepara diluciones seriadas de puromicina (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 y 40 μg/mL) en el medio que contiene la concentración de verapamilo previamente determinada y trate las células en consecuencia.
   2. Tras 72 horas, se mide la viabilidad celular con un ensayo de cuantificación de ATP basado en luminiscencia, y determina la concentración mínima de puromicina que elimina todas las células (≤5% de viabilidad) en presencia de verapamil. Esta concentración se utilizará para la selección durante el cribado CRISPR.
      NOTA: Estos pasos de optimización de la concentración de fármacos dependen de la línea celular y del contexto. Factores como la sensibilidad intrínseca al fármaco, los niveles de expresión del transportador ABC y la tasa de crecimiento pueden influir en las concentraciones efectivas. Por lo tanto, realiza esta optimización para cada nueva línea celular y modelo de resistencia. (Para referencia, se utiliza 5 μg/mL de puromicina en combinación con 20 μM de verapamilo para las células resistentes al Taxol empleadas en este^{estudio 17}). Para la resolución de problemas entre puromicina + verapamil, consulte la Tabla Suplementaria 1.

4. Cálculo de la titulación viral y la multiplicidad de infección (MOI)

1. Día -1: Semillas SUM159PT células resistentes al Taxol como 2 × 10⁵ en cada pozo de una placa de 6 pozos con la mezcla completa de nutrientes de Ham's F12.
2. Día 0: Realizar cuatro diluciones en serie del virus en la mezcla de nutrientes F12 de Ham que contiene sulfato de Protamina (PS) a 8 μg/mL. (Para virus concentrados, comienza con 1 μL y diluye diez veces en cada dilución como 1 > ^10-1 > ^10-2 > ^10-3. Para virus no concentrados, ajusta los volúmenes en consecuencia (por ejemplo, 100 μL > 10 μL > 1 μL > 0,1 μL).
   1. Asigna 1 mL de medio que contenga virus a cada uno de los cuatro pozos. Deja un pozo como control de selección de puromicina y otro también como control sin tratar.
3. Día 1: Sustituye el medio viral por 2 mL de medios frescos 16 horas después de la infección.
4. Día 2: Transfiere el contenido celular de cada pozo a un plato de cultivo celular de 100 mm con la mezcla de nutrientes F12 de Ham que contiene puromicina + verapamilo a concentraciones determinadas en el paso 3.2. Si las celdas no seleccionadas están sobreconfluentes, semilla una fracción definida (por ejemplo, 1/2), y esto se tendrá en cuenta al realizar los cálculos finales.
   NOTA: Reponer el medio con puromicina + verapamilo frescos, si es necesario, en los siguientes 3-4 días hasta que todas las células de la placa de control estén muertas.
5. Días 4–5: Cuando las células de la placa de control estén muertas, determina cuáles tienen suficientes células para contar. Tripsiniza las células, cuenta y determina el número total de células.
6. Después de contar las células viables, calcula la eficiencia de transducción y la multiplicidad de la infección (MOI) de la siguiente manera (utiliza la Tabla Suplementaria 2 como plantilla):
   1. Calcula la tasa de transducción (fracción de células infectadas) usando la fórmula siguiente
      
      
      _{N seleccionado}: Número total de células tras la selección de puromicina en los pozos infectados
      _{N control}: Número total de celdas en el pozo de control no transducido y no seleccionado
      p: Tasa de transducción (fracción de células infectadas).
      NOTA: Si solo se siembló una fracción de las células de control sin tratar, tenlo en cuenta al calcular N_Control
   2. Calcula el MOI. Durante la transducción lentiviral, los eventos de infección siguen una distribución de Poisson. Por lo tanto, la fracción de células infectadas con al menos un virus se define como:
      p =1- ^{e -MOI}
      Por tanto, calcula el MOI como:
      MOI = - ln(1-p)
   3. Calcula el título lentiviral (partícula infecciosa/mililitro, IP/mL) en función del número de células infectadas:
      Título (IP/mL) = (MOI x_{N iniciando})/ Volumen del virus
      _{N inicial}: número de células sembradas para infección
      Volumen del virus: volumen de virus añadido por pozo (en mL)
      NOTA: Calcule el título lentiviral para cada infección por separado y determine el título final tomando la media de los pozos que muestran la cantidad proporcional de virus y valores de título. Los pozos que muestren saturación o desviación de la escala proporcional deben excluirse de los cálculos de títulos.

5. Generación y/o validación de una línea celular estable que expresa Cas9

NOTA: Este paso es necesario al usar LentiGuide_EPIKOL. Si ya está disponible una línea Cas9-estable validada, o si se utiliza LentiCRISPR_v2_EPIKOL, proceda directamente a la Sección 6.

1. Producir lentivirus Cas9 utilizando el vector LentiCas9_blast tal como se describe en la sección 2.
2. Infecta células al día siguiente, apuntando a un MOI de 10. Calcular la cantidad del virus según el MOI previsto en la sección 4, utilizar la cantidad calculada de volumen viral y administrarla directamente a las células de la placa que contiene el medio de cultivo que contiene 8 μg/mL de sulfato de protamina (PS).
3. Sustituye el medio viral por un medio fresco 16 horas después de la infección
4. Al día siguiente, se aplica la selección de blasticidina administrando a las células el medio de cultivo que contiene la concentración previamente determinada de blasticidina (concentración final determinada por línea celular con un ensayo de viabilidad celular como se describe en la sección 3) hasta eliminar las células no infectadas (normalmente 6–7 días).
   NOTA: Si las células que expresan Cas9 se cultivan durante períodos prolongados antes del cribado, repita la selección de blasticidina para eliminar las células negativas a Cas9.
5. Validación de Cas9 (recomendada): Validar la actividad de Cas9 utilizando sgRNAs de control dirigidos a genes esenciales (las secuencias de sgRNA están disponibles en la biblioteca EPIKOL; véase la Tabla Suplementaria 3) o sistemas reporteros como la proteína fluorescente verde (GFP) para evaluar la eficiencia de eliminación y la cinética. Métodos de validación detallados pueden encontrarse en un estudio anterior¹⁹.

6. CRISPR a nivel epigenomico, eliminación de la biblioteca lentiviral, infección y cribado

NOTA: Para asegurar un mapeo preciso de genotipo a fenotipo, los cribados CRISPR agrupados requieren infección con bajo MOI y una cobertura suficiente de bibliotecas (típicamente 500×–1000), dependiendo de la rigurosidad experimental y el comportamiento de las líneas celulares. Para los principios generales de los flujos de trabajo de cribado CRISPR a nivel genómico agrupado, incluyendo el diseño de bibliotecas y la configuración experimental, véase los protocolos^21,22 publicados anteriormente. Para EPIKOL, se recomienda encarecidamente mantener una cobertura >500x durante todo el cribado, ya que bajar por debajo de este umbral aumenta el riesgo de caída estocástica de sgRNA, especialmente en el área de tratamiento farmacológico del cribado. Se requieren los siguientes cálculos para determinar el número inicial de células, la eficiencia de la transducción y el volumen viral necesarios para que la transducción de EPIKOL realice una infección de bajo MOI sin comprometer la complejidad de la biblioteca.

1. Día -1: Siembra un total de células calculado a continuación en recipientes de cultivo celular de 100 mm o 150 mm con un número adecuado de células por placa.
   1. Calcula el número de células infectadas con éxito para alcanzar la cobertura deseada de la biblioteca (usa la Tabla Suplementaria 2 como plantilla):
      _{N infectados} = (número de ARNsg) × (cobertura del objetivo)
   2. Calcular el número inicial de células por réplica para compensar la fracción de células no infectadas tras una infección de bajo MOI (0,3–0,4):
      _{N iniciando} = N_infectados/p
      donde p es la tasa de transducción (fracción de células infectadas) determinada en función de la distribución de Poisson (véase el paso 4.6).
      NOTA: Este ajuste garantiza que un número suficiente de células individuales infectadas con sgRNA estará presente en el grupo en caso de infección con un MOI bajo para alcanzar la cobertura deseada de la biblioteca.
2. Día 0 - Transducción
   1. Calcula el volumen viral requerido por réplica
      Volumen viral requerido = (_{N a partir} de × MOI) / (Título viral (ip/mL previamente determinado))
      NOTA: La eficiencia de transducción en el rango objetivo del MOI de 0,3–0,4 corresponde aproximadamente a
      26%–33% de células resistentes a la puromicina antes de la selección.
   2. Infectar células con el volumen viral calculado en el medio de cultivo completo que contiene 8 μg/mL de sulfato de protamina (PS). Reducir el volumen del medio para aumentar el contacto virus-célula durante la infección (por ejemplo, 8 mL en lugar de 10 mL para una placa de 100 mm)
   3. Prepara mezclas de infección independientes para cada réplica biológica.
      NOTA: Se recomiendan al menos dos réplicas biológicas; se prefieren tres. Las réplicas biológicas deben ser transducidas, seleccionadas y mantenidas por separado (incluyendo cambios de medio y paso) y no deben agruparse en ninguna etapa antes de la secuenciación.
3. Día 1 - Sustituir los medios virales por medios frescos tras 16 horas e incubar a 37 °C con 5% de CO₂
4. Día 2 - Selección de células transducidas: Aplicar la selección de puromicina en presencia de verapamilo (concentraciones determinadas en el paso 3.2) para enriquecer células infectadas con ARNsg en SUM159PT células resistentes al taxol. Continúa la selección hasta que todas las células de la placa de control no infectada sean eliminadas (normalmente ~3 días).
5. Día 5 - T₀ Muestreo de referencia: Tras completar la selección de puromicina + verapamilo, tripsiniza las células y recoge un pellet celular inicial de tiempo cero (T₀) de cada réplica biológica correspondiente al nivel de cobertura decidido durante la transducción. Dado que servirá como referencia para la distribución inicial de la biblioteca, recoge los pellets de celda tan pronto como se complete la selección, antes de que se produzca cualquier pérdida de celda. Siembra suficientes números de celda para mantener la cobertura en todo momento.
   NOTA: Tras la selección de puromicina + verapamil, el número de células transducidas supervivientes variará en función del tiempo de duplicación de la línea celular y de la eficiencia de transducción alcanzada. La población superviviente suele recuperarse hasta la densidad inicial de siembra al completar la selección y puede superarla en líneas celulares de crecimiento más rápido. Si el número de células supervivientes lo permite, recoge varios pellets T₀ y congela las muestras de reserva a -80 °C. Además, las células infectadas con EPIKOL pueden criopreservarse en nitrógeno líquido manteniendo la cobertura. Estas reservas pueden descongelarse en caso de fallo inesperado en el cribado o para futuros enfoques experimentales alternativos (por ejemplo, pruebas de tratamientos farmacológicos adicionales). Compruebe la eficiencia de la transducción utilizando una placa de control no infectada para confirmar que se ha alcanzado la eficiencia de transducción prevista (véase la sección 4). Si la eficiencia de transducción observada es mayor de lo esperado, se reinicia el experimento para asegurar que la transducción se realice con un bajo MOI, evitando la integración múltiple de sgRNA por célula.
6. Ejecución del cribado: Tras permitir la finalización de la edición genómica mediada por Cas9, durante la duración determinada en la sección 5, dividir las células en grupos de tratamiento.
   NOTA: Esto suele tardar entre 7 y 9 días tras la transducción, ya que la eficiencia máxima de eliminación se alcanza aproximadamente en el día 7²³ post-transducción. Para los objetivos epigenéticos, una ventana de 9 días también permite cambios en el nivel de cromatina antes del inicio de la selección del fármaco.
   1. Dividir las células en brazos experimentales manteniendo la cobertura: uno es el brazo de control, que es una condición base que recibe DMSO, y el otro es el brazo de tratamiento que recibe Taxol.
   2. Mantener las culturas para duplicaciones de población de 14–16. El nivel de duplicación de población (PDL) se calcula como:
      PDL =_{PDL s} + 3,322 (Log C_f – log_{C i})
      PDL_s = nivel inicial de duplicación de población
      C_i = número inicial de celda sembrado
      C_f = número total de celdas al final de un periodo de crecimiento
   3. En cada pasaje, monitoriza la viabilidad y la cinética del crecimiento y evita cuellos de botella manteniendo un número celular adecuado. Ajusta la intensidad del tratamiento si ocurre una muerte celular excesiva.
      NOTA: Procura recoger pellets de celda de respaldo en cada pasaje, semanalmente o en ciertos PDLs durante la pantalla. Estas muestras de respaldo pueden servir como puntos temporales alternativos para la secuenciación o como muestras de optimización para el proceso de extracción genómica del ADN. Criopreservar células periódicamente para evitar pérdidas celulares inesperadas.
7. Muestreo_final T: Al alcanzar el PDL deseado, recoge los pellets de punto temporal final (T_final) para cada réplica y condición manteniendo la cobertura de la biblioteca por pellet. Guarda los pellets a -80 °C hasta la extracción de ADNgDNA aguas abajo.
   NOTA: Intenta terminar el cribado en PDLs comparables entre brazos, incluso si la duración del cultivo varía según las condiciones.

7. Extracción de ADN genómico

1. Extraer ADN genómico (gDNA) utilizando un método validado (por ejemplo, MN NucleoSpin Tissue Kit), con pequeños ajustes en el protocolo para mejorar la eficiencia de la lisis de grandes pellets celulares agrupados.
   1. Sigue el protocolo de tejido en lugar del protocolo celular debido al gran tamaño de los pellets. Considera aumentar los volúmenes de reactivos y usar múltiples columnas de espín por pellet de celda (no superar 5 × 10^{6 celdas} por columna) si es necesario para asegurar una lisis eficiente.
      NOTA: Antes de la lisis, volver a suspender el pellet con una cantidad mínima de PBS (~50 μL) puede mejorar la eficiencia de la lisis. Una lisis incompleta del pellet puede obstruir la columna de spin, resultando en una reducción del rendimiento de ADN.
   2. Sigue las recomendaciones de elución de alto rendimiento y alta concentración. Elute gDNA en un volumen reducido de tampón de elución (aproximadamente 2/3 del volumen recomendado) por columna, especialmente si los pellets celulares se dividieron en varias columnas.
2. Mide la calidad y cantidad del ADNg (por ejemplo, Nanodrop).

8. Preparación de la biblioteca de secuenciación EPIKOL a partir de ADN genómico

1. Utiliza un gabinete dedicado para PCR para realizar todos los pasos de la PCR de la biblioteca y así evitar la contaminación por plásmidos durante las PCR de ADNG, ya que las plantillas de plásmidos se amplifican de forma más eficiente que el ADN genómico y pueden distorsionar la distribución del ARNsg.
   1. Limpia el espacio de trabajo, las micropipetas y las rejillas con 10% de lejía y 70% de etanol, respectivamente.
   2. Alicuota todos los reactivos (especialmente cebadores) en volúmenes de un solo uso antes de su uso para reducir el riesgo de contaminación cruzada y ciclos de congelación-descongelación.
   3. Guarda los reactivos a -20 °C y mantenlos en hielo durante la preparación de la PCR.
2. Optimizar el volumen inicial de entrada de gDNA apuntando a una cobertura de 200×–500× por sgRNA para mantener la complejidad adecuada de la biblioteca. Ejemplo: Para la biblioteca EPIKOL, los gDNA se extraen preferiblemente de pellets celulares recogidos con una cobertura de 1000×, y una cobertura final de 250× se utiliza para la amplificación de gDNA.
   1. Calcula la entrada de ADN G necesaria para la cobertura deseada de la siguiente manera.
      Cantidad de gDNA = (Número de sgRNAs) × cobertura × (66 páginas de ADN/núcleo)
      Ejemplo: 8000 gRNA × (cobertura de 250×) × (6,6 pg ADN/núcleo) = 13,2 μg gDNA/muestra deben amplificarse.
   2. Realizar una prueba de PCR utilizando condiciones de reacción externas e internas en las Tablas 3, Tabla 4, Tabla 5 y Tabla 6 con cantidades crecientes de ADN G por reacción (por ejemplo, 1 μg, 3 μg, 6 μg) para determinar la cantidad óptima de ADNg por tubo.
      NOTA: Una entrada insuficiente de gDNA o un ciclo excesivo de PCR pueden introducir sesgo de amplificación y distorsionar la cobertura del sgRNA.
   3. Haz un gel de agarosa al 2% para analizar productos internos de PCR. Asegúrese de observar una banda brillante a aproximadamente 350 puntos base.
   4. En función de la cantidad óptima de gDNA por tubo, determinar el número total de reacciones PCR necesarias por muestra para lograr la cobertura deseada de la biblioteca, evitando cantidades excesivas de gDNA por reacción individual.
      NOTA: Si se requieren 13,2 μg de ADN G total y 3,3 μg de ADNg por reacción proporcionan una amplificación óptima, prepare cuatro reacciones PCR paralelas con 3,3 μg de ADNg en un volumen de reacción de 100 μL. En este contexto, el volumen de ADNG no debe superar el 10% del volumen de reacción para evitar la inhibición por PCR debido a la entrada excesiva de plantillas.
3. Amplificar casetes de sgRNA a partir de la plantilla de ADNgD (PCR Primera/Externa)
   1. Amplifica las regiones genómicas que contienen el casete de sgRNA lentiviral integrado de forma estable utilizando los cebadores listados en la Tabla Suplementaria 2. Realiza reacciones PCR con la cantidad de ADN g determinada en el paso 8.2 (véase la Tabla 3) utilizando las condiciones de reacción PCR en la Tabla 4. Prepara un tubo de control PCR sin ADN plantilla para comprobar posibles contaminaciones y mantén los tubos en hielo en todo momento.
   2. Añade finalmente la ADN polimerasa, mezcla bien con picado o pipeteo, y centrifuga brevemente los tubos de PCR antes de meterlos en el ciclador térmico. Realiza el arranque en caliente para evitar amplificación inespecífica.
   3. Al completar la PCR externa, agrupar todas las reacciones de PCR en un tubo microcentrífuga. No se requiere limpieza por PCR ni visualización de gel tras una PCR externa. Utiliza el producto de PCR agrupado directamente como plantilla en la segunda PCR (interna). Guarda los productos de PCR a -20 °C.

Reactivo	Volumen por reacción
dNTP (10 mM cada uno)	2 μL
Polimerasa de fuso	1 μL
Amortiguador GC de 6'	20 μL
Cebador hacia adelante (10 μM)	5 μL
Cebador inverso (10 μM)	5 μL
gDNA	X μL
Agua libre de nucleasas	hasta 100 μL (67–X μL)
Total	100 μL

Tabla 3: Reactivos necesarios para la primera PCR/externa.

Número de ciclo	Desnaturalización	Recocido	Ampliación
1	95 °C, 3 min
2–19	95 °C, 25 s	65 °C, 20 s	72 °C 15 s
20			72 °C 3 min

Tabla 4: Condiciones de PCR para la primera PCR/externa.

4. Realizar codificación de barras de índice (PCR Segunda/Interna) y extracción de gel
   1. Durante la segunda PCR (interna), se utiliza cebador de índice inverso para codificar las muestras; por lo tanto, utiliza diferentes cebadores de índice para cada muestra.
      NOTA: Para bibliotecas generadas usando la columna vertebral pLentiCrispr v2 , utilice cebadores de índice inverso que terminen en bases CT, etiquetadas como lenticrisprv2_rev(índice X) (véase la Tabla Suplementaria 2).
   2. Para las bibliotecas generadas usando la columna vertebral pLentiGuide , utiliza índices que terminan en bases GT y que se etiquetan como rev_index_X en la Tabla Suplementaria 2.
   3. Prepara una mezcla de cebadores escalonados hacia adelante combinando 2 μL de cada uno de los nueve cebadores escalonados (stock 100 μM) y añadiendo 162 μL de agua sin nucleasas a un tubo microcentrífuga estéril. La concentración final de la mezcla de cebador será de 10 μM.
   4. Utiliza el producto externo de PCR agrupado como entrada y realiza dos reacciones internas de PCR en paralelo de 100 μL por muestra utilizando las instrucciones de la Tabla 5 y la Tabla 6. Prepara una reacción de control por PCR utilizando el control 'Sin ADN plantilla' de una PCR externa (paso 7.3) como entrada para monitorizar la posible contaminación.
   5. Añade la ADN polimerasa por último, mezcla bien con picado o pipeteo, centrifuga brevemente los tubos de PCR antes de meterlos en el ciclador térmico. Realiza el arranque en caliente para evitar amplificaciones inespecíficas.
   6. Combina y realiza reacciones internas de PCR en gel de agarosa al 2% para separar el amplicón objetivo.
      NOTA: No se deben detectar bandas en los controles PCR sin plantilla. Debe observarse una banda distinta alrededor de 337 pb para LentiCrispr_V2 y 357 pb para las bibliotecas LentiGuide. También puede estar presente una banda superior no específica de aproximadamente 500 pb, que debe excluirse del procesamiento posterior.
   7. Carga 12 μL (10 μL de producto PCR + 2 μL de colorante de carga) de producto interno de PCR para visualizar las bandas, carga el resto del producto PCR en pozos fusionados o adyacentes designados para la extracción en gel. Minimiza el grosor de la agarosa para maximizar la recuperación del ADN. Evita sobreexponer los carriles de extracción del gel mientras visualizas para minimizar el daño en el ADN inducido por los rayos UV durante la excisión del gel.
   8. Purifica los productos de PCR a partir de gel de agarosa usando un kit específico de extracción de gel (por ejemplo, NucleoSpin Gel y PCR Clean-up) siguiendo las instrucciones del fabricante. Mide la concentración de ADN usando un espectrofotómetro. Guarda los productos de PCR a -20 °C.
      NOTA: Se requiere una concentración mínima de >20 ng/μL tras la extracción del gel para una secuenciación adecuada. Si el rendimiento requerido no se lograba ni siquiera con tres reacciones internas de PCR paralelas, aislar nuevo gDNA y repetir el proceso.

Reactivo	Volumen por reacción
dNTP (10 mM cada uno)	2 μL
Polimerasa de fuso	1 μL
Amortiguador GC de 6'	20 μL
Cebador de mezcla de escalonamiento hacia adelante (10 μM)	5 μL
Cebador de índice inverso (10 μM)	5 μL
PCR externa	5 μL
Agua libre de nucleasas	62 μL
Total	100 μL

Tabla 5: Reactivos necesarios para la segunda PCR/interna.

Número de ciclo	Desnaturalización	Recocido	Ampliación
1	95 °C, 3 min
2–25	95 °C, 25 s	65 °C, 20 s	72 °C 15 s
26			72 °C 3 min

Tabla 6: Condiciones de PCR para la segunda PCR/interna.

9. Secuenciación

1. Determina el número requerido de lecturas mapeadas en función de la cobertura de la biblioteca que se define al inicio de la pantalla. Suponiendo una eficiencia de mapeo del 60%–70%, solicita un mayor número total de lecturas para compensar la pérdida de lectura. Para una cobertura del 1000× de la biblioteca EPIKOL, se requieren ~8 millones de lecturas mapeadas, lo que corresponde a un total de 10–12 millones de lecturas.
2. Realizar el control de calidad de las bibliotecas de secuenciación usando Tapestation o Bioanalyzer antes de la secuenciación para confirmar el tamaño e integridad de la biblioteca.
3. Agrupar bibliotecas de secuenciación de diferentes muestras antes de secuenciar, ya que están codificadas de forma única con cebadores de índice.
4. Confirma los requisitos de estructura de lectura (orientación R1/R2) y de desmultiplexación con la función de secuenciación. Se sugiere la secuenciación emparejada de 2× 150 pb en Illumina HiSeq, Novaseq o una plataforma de secuenciación compatible con Illumina. Considera solicitar al menos un 5% de spik-in PhiX para mejorar la diversidad de secuenciación.

10. Visión general del análisis de secuenciación para EPIKOL

1. Utiliza la canalización de análisis MAGeCK para analizar archivos FASTQ de extremo^{emparejado 24}. Organiza cada réplica biológica como un archivo de entrada individual.
2. Utiliza el archivo de entrada sgRNA de EPIKOL compatible con MAGeCK como biblioteca de referencia (proporcionada en la Tabla Suplementaria 4) y aplica la función de recuento para cuantificar las lecturas de sgRNA de archivos FASTQ individuales para crear archivos de conteo en bruto para cada réplica y condición.
   1. Normalice cada archivo de recuento usando la normalización de lecturas por millón (RPM) para comprobar la calidad y distribución de cada muestra visualizando los gráficos normalizados de recuento de^{sgRNA 14}.
3. Realiza una segunda función de -count para fusionar los conteos en un solo archivo usando la normalización de mediana con los ajustes por defecto.
4. Ejecuta la función -test para identificar cambios a nivel génico usando archivos de recuento en bruto fusionados. Para evaluar el rendimiento en el cribado,_{compara las muestras} finales de T con las muestras de T₀ y comprueba la distribución de los sgRNAs de control no dirigidos y los de la dirección génica esencial.
   NOTA: Es fundamental evaluar el agotamiento de genes de control positivo en cada brazo de cribado para evaluar el rendimiento del cribado. Se espera que observe variabilidad biológica entre réplicas en el brazo de cribado tratado con fármacos, ya que la exposición a fármacos puede causar diferencias estocásticas en la respuesta celular. Esta variabilidad es inherente a los cribados de quimiorresistencia y no indica necesariamente mala calidad del cribado. Por lo tanto, durante el hit-calling, deben analizarse al menos tres repeticiones biológicas juntas, y los hits deben determinarse como los genes que tienen al menos 6 sgRNAs efectivos de un total de 10.
5. Para identificar cambios inducidos por fármacos en la abundancia de sgRNA y los efectos a nivel génico, comparar las muestras tratadas con T_final y Taxol_{con T final} DMSO, utilizando el grupo DMSO como control.
6. Aplicar un corte de tasa de falso descubrimiento (FDR) de FDR < 0,05 para identificar genes agotados en el grupo de tratamiento y así revelar los genes que contribuyen a la aptitud o resistencia de las células resistentes al Taxol.

Resultados

Para estudiar reguladores epigenéticos de la quimiorresistencia en TNBC, el protocolo general que utiliza la línea celular SUM159PT se muestra en la Figura 1. En primer lugar, los valores de IC₁₀ e_{IC 50} de Taxol en SUM159PT células se determinaron tratando las células con concentraciones crecientes de Taxol (Figura 2A). Se utilizó un método de escalada de dosis paso a paso para generar células de SUM159PT resistentes al Taxol. Tras varios meses, un cambio en los valores de IC50 ilustra el establecimiento exitoso de un fenotipo resistente utilizando este protocolo en comparación con las células control que se pasaron en paralelo sin exposición al Taxol (Figura 2B).

Figura 1: Esquema del cribado EPIKOL en células SUM159PT resistentes al Taxol. Flujo de trabajo global del cribado EPIKOL en las células SUM159PT resistentes al Taxol generadas. La figura fue creada con BioRender.com Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Una vez establecidas las células resistentes, se realizaron varios experimentos para caracterizar sus cambios fenotípicos y moleculares. Las capacidades de proliferación de las células resistentes bajo tratamiento con Taxol se evaluaron mediante un ensayo de formación de colonias en comparación con las células parentales. Como se ve en la Figura 2C, D, las células resistentes mantienen su capacidad proliferativa bajo el tratamiento con Taxol, mientras que las células parentales no pueden sobrevivir. Este ensayo es uno de los pasos importantes en la caracterización de células resistentes y demuestra cómo se puede evaluar la capacidad proliferativa bajo tratamiento farmacológico entre células parentales y resistentes.

Como parte de la caracterización de células resistentes, se realizó secuenciación de ARN en células parentales y resistentes para analizar los cambios transcriptómicos asociados a la quimiorresistencia (Figura 2E). Entre los genes más regulados al alza en células resistentes estaba ABCB1, seguido por un par de otros transportadores ABC, incluyendo ABCB4 y ABCA5. La regulación al alza de la expresión de ABCB1 fue validada mediante la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (qPCR), y esto ilustra cómo los cambios en la expresión génica candidata pueden validarse usando qPCR (Figura 2F).

Figura 2: Generación de células resistentes y su caracterización. (A) Esquema que muestra la generación de células de SUM159PT resistentes al Taxol mediante el método de escalada de dosis. (B) Curva de respuesta a la dosis que muestra la diferencia entre los valores de IC50 de células parentales y células resistentes generadas. IC50 parental = 6 nM y IC50 resistente al taxol = 355,4 nM. (C) Ensayo de formación de colonias en presencia de Taxol. (D) Cuantificación de las áreas de colonia en (C.) Análisis bidireccional de varianza (ANOVA) con la prueba post hoc de Tukey se aplicó usando Prism 8 (software GraphPad). Los niveles de significancia se establecieron como *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. (E) Gráficos volcánicos que muestran genes diferencialmente expresados en células de Taxol-Res en comparación con células parentales, con un corte de LFC>2 y p<0,001. (F) validación qPCR de la expresión de ARNm ABCB1 en células parentales y Taxol-Res. valores P determinados por la prueba t de Student bilateral en comparación con el grupo de control; **P < 0,01. El Panel A se creó con BioRender.com. La figura del Panel E ha sido modificada con permiso de Yedier-Bayram et ^al.17. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tras mostrar sobreexpresión de ABCB1 y otros transportadores ABC en células resistentes al Taxol y considerando el amplio espectro de sustratos de ABCB1, se evaluó la presencia del fenotipo MDR. Con este fin, las células resistentes al taxol fueron tratadas con múltiples fármacos que son sustratos conocidos del transportador ABCB1 y que presentan diferentes mecanismos de acción, y se evaluó su sensibilidad al fármaco (Figura 3A,B). En línea con el perfil de expresión observado del transportador ABC, las células resistentes al taxol también mostraron resistencia a la Doxorubicina y la Vincristina, lo que confirma la presencia del perfil MDR e ilustra cómo el fenotipo de resistencia multifármaco puede evaluarse funcionalmente.

El fenotipo MDR es un reto para el enfoque de cribado basado en CRISPR, EPIKOL, dado que la biblioteca requiere selección de puromicina para enriquecer las células transducidas. Dado que la puromicina puede ser expulsada de las células por el flujo de fármacos mediado por ABCB1, la selección de puromicina puede no ser eficiente en células resistentes (Figura 3C). Por lo tanto, las células no transducidas pueden sobrevivir a la selección, confundiendo los resultados del cribado.

Para abordar esta limitación, se optimizó el proceso de selección de células quimioresistentes con perfil MDR antes del cribado EPIKOL. El verapamilo, un inhibidor de ABCB1 de primera generación, se utilizó para bloquear el eflujo de fármacos mediado por transportador ABC, permitiendo así la acumulación intracelular de agentes quimioterapéuticos o puromicina (Figura 3D). Aunque el verapamilo por sí solo no afectó la viabilidad celular, restauró la sensibilidad del fármaco cuando se combinó con agentes quimioterapéuticos (Figura 3E,F). De manera similar, las curvas de eliminación de puromicina combinadas con dosis no tóxicas de verapamilo demostraron que la inhibición de ABCB1 restaura la sensibilidad a la puromicina (Figura 3G,H). Esto asegura que las células que sobreviven a la selección sean aquellas que se transducen con éxito, en lugar de que aquellas que escapen de la selección debido al eflujo de fármacos impulsado por ABCB1. Establecer un flujo de trabajo de selección eficaz en células quimioresistentes es crucial para obtener resultados fiables en el cribado EPIKOL.

Figura 3: Fenotipo de resistencia a múltiples fármacos y efecto del verapamilo en las células resistentes. Curvas de respuesta a la dosis que muestran la diferencia entre los valores de IC50 de células parentales y células resistentes generadas con (A) Doxorrubicina, (B) Vincristina, (C) Puromicina. (D) Esquema que muestra la selección de células de SUM159PT resistentes al Taxol con y sin verapamilo. La figura fue creada con BioRender.com. (E) Ensayo de viabilidad celular con células Taxol-Res para determinar la concentración óptima de verapamilo con Taxol. (F) El verapamilo resensibiliza las células resistentes al Taxol al Taxol. (G) El verapamilo no altera la respuesta de las células parentales a la puromicina. (H) El verapamilo restaura la sensibilidad a la puromicina en las células Taxol-Res. Los paneles A, B y F han sido reutilizados con permiso de Yedier-Bayram et ^al.17. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Para encontrar nuevos reguladores de la quimiorresistencia en el TNBC, se realizó un cribado EPIKOL con células de SUM159PT resistentes al Taxol, como se ilustra en la Figura 4A. Dado que las células resistentes crecen más lentamente que las células^{parentales 17}, se monitorizaron los niveles de duplicación poblacional a lo largo del cribado tanto en grupos tratados con Taxol como en DMSO para determinar el tiempo necesario para alcanzar 16 duplicaciones poblacionales (Figura 4B). En consecuencia, el cribado EPIKOL para el grupo tratado con DMSO se completó aproximadamente en el día 35, mientras que el grupo tratado con Taxol fue cultivado durante 15 días adicionales para alcanzar el mismo nivel de duplicación poblacional.

Tras la secuenciación, se utilizó la cadena de análisis MAGeCK para combinar el efecto de los sgRNAs dirigidos al mismo gen y así revelar los cambios a nivel génico tras la eliminación²⁴. La biblioteca EPIKOL incluye sgRNAs que apuntan a genes esenciales como controles positivos; el primer paso de control de calidad fue evaluar si estos sgRNAs estaban agotados como se esperaba. Los diagramas en cascada ilustran los cambios en el plegamiento Log2 de genes esenciales a través de diferentes comparaciones (Figuras 4C–E). Cuando se compararon las muestras finales de condiciones tratadas con DMSO o Taxol con el momento inicial, casi todos los genes esenciales se agotaron al ser eliminados, lo que indica un rendimiento efectivo en el cribado (Figura 4C,D). Sin embargo, esta disminución no se observa claramente cuando se comparan las dos muestras finales (tratadas con DMSO y tratadas con Taxol), como se esperaba, ya que se requieren genes esenciales para la supervivencia celular en ambas condiciones (Figura 4E).

Una visualización alternativa de los resultados de pantalla es el gráfico volcán, que muestra los cambios de pliegue Log2 junto con la significación estadística (el valor p o valores FDR). En el cribado EPIKOL realizado en células resistentes al Taxol, se identificaron varios genes de control positivos como significativamente agotados, lo que apoya aún más la fiabilidad del cribado, ya que el agotamiento de sgRNAs dirigidos a genes de control positivo ilustra un control de calidad típico de un cribado exitoso (Figura 4F). Además de los controles génicos esenciales, la biblioteca EPIKOL incluye ARNe-sg de control positivo específicos para contexto que apuntan a varios genes transportadores ABC. Como era de esperar, los recuentos normalizados de sgRNAs ABCB1 en diferentes grupos pusieron de manifiesto el agotamiento significativo de sgRNAs dirigidos a ABCB1, específicamente en el grupo tratado con Taxol (Figura 4G). En conjunto, esto demuestra cómo los cambios a nivel de ARNsgs pueden interpretarse para identificar genes candidatos asociados a la respuesta a fármacos.

Figura 4: El cribado EPIKOL da resultados a células resistentes al Taxol y gráficos de ejemplo. (A) Esquema del protocolo de pantalla EPIKOL. (B) Nivel de duplicación de población (PDL) de las células Taxol-Res. (C–E) Gráficos en cascada que muestran resultados del cribado con EPIKOL en células Taxol-Res, destacando genes esenciales, grupo tratado con DMSO comparado con el punto temporal inicial en el panel C, grupo tratado con Taxol comparado con el punto temporal inicial en panel D, grupo tratado con Taxol comparado con el grupo tratado con DMSO en el panel E. (F) Gráfico volcánico mostrando Log2Fold cambios de genes en muestras tratadas con Taxol en comparación con el momento inicial. Los genes que tienen p<0,05 fueron coloreados y etiquetados. Esta cifra ha sido modificada respecto a una publicación^{anterior 17}. (G) Lecturas por millón (rpm) de 10 diferentes grafos de ABCB1 sgRNA de EPIKOL. El Panel A se creó con BioRender.com. El Panel E ha sido reutilizado con permiso de Yedier-Bayram et ^al.17. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla suplementaria 1: Tabla de resolución de problemas.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Cálculo de Título Viral y MOI.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 3: lista de sgRNA de la biblioteca EPIKOL.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 4: Primers utilizados en la preparación de la biblioteca de secuenciación EPIKOL. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Los enfoques de cribado agrupado basados en CRISPR-Cas9 están bien establecidos en diferentes contextos celulares. Sin embargo, el cribado en células quimiorresistentes presenta desafíos claros y requiere optimización adicional. Dado que las células quimiorresistentes sirven como modelos valiosos para estudiar las vulnerabilidades de tumores quimiopresistibles, es importante abordar estas limitaciones en las estrategias de cribado para identificar de forma fiable reguladores genéticos o epigenéticos de la quimiorresistencia.

La generación de líneas celulares quimioresistentes puede ser engorrosa y depende en gran medida del agente quimioterapéutico utilizado. Aunque las células pueden adaptarse fácilmente a ciertos fármacos, pueden ser muy susceptibles a otros²⁵. Por ello, es importante determinar los valores específicos de la línea celular de IC50 antes del protocolo de generación de líneas celulares resistentes. En casos en los que las células no toleran la exposición al fármaco a nivel de IC50 en varios conductos, es posible comenzar con una concentración de fármaco más baja (por ejemplo, IC10-20) (véase la sección 1 del Protocolo⁾¹⁷. Dado que la adquisición de resistencia es un evento estocástico, varios pozos/placas de células pueden tratarse al mismo tiempo para aumentar la probabilidad de obtener células resistentes. Es fundamental caracterizar de forma exhaustiva la población celular resistente a fármacos obtenida para describir los cambios transcripcionales y fenotípicos durante el procedimiento de escalada de dosis en comparación con su estado ingenuo. Se pueden emplear enfoques de perfilado global como RNA-seq para identificar genes expresados diferencialmente en relación con la línea parental. Funcionalmente, la resistencia adquirida a fármacos debe validarse mediante ensayos de viabilidad y proliferación celular para demostrar que las células resistentes mantienen la supervivencia bajo condiciones de tratamiento farmacológico citotóxicas para las células parentales. Además, se deben medir los posibles cambios en su capacidad proliferativa y tasa de crecimiento en comparación con la línea celular parental para calcular sus respectivas PDL. Dado que se sabe que la resistencia adquirida al Taxol está mediada, al menos en parte, por el eflujo de fármacos mediado por ABC, la expresión de transportadores clave del ABC (por ejemplo, ABCB1) debe evaluarse a nivel de ARNm y proteínas mediante qPCR y Western bloting, y puede complementarse con datos transcriptómicos. En función del perfil de expresión del transportador ABC, se debe considerar la presencia del fenotipo MDR y evaluar la resistencia a otros agentes quimioterapéuticos. En nuestro estudio anterior, caracterizamos las líneas celulares resistentes al Taxol e identificamos ABCB1 como uno de los genes más regulados al alza, y razonábamos que la resistencia multifármaco mediada por ABCB1 puede causar fallo en la selección^{de puromicina 17}. Por lo tanto, tras la generación de células resistentes, la expresión de los transportadores ABC y el fenotipo MDR deben evaluarse antes de cualquier procedimiento de transfección.

El método de escalada de dosis ofrece ventajas frente a los protocolos de exposición a fármacos en dosis altas, ya que las células pueden ser criopreservadas en cada paso antes de aumentar la dosis, proporcionando flexibilidad y protegiendo contra la pérdida de cultivos. Además, la escalada gradual de la dosis permite la adquisición de fenotipos de resistencia a lo largo del tiempo, facilitando la evolución adaptativa; en contraste con el tratamiento agudo de dosis altas, que resulta en la selección de subpoblaciones resistentes preexistentes. Su progresión paso a paso permite a los investigadores elegir deliberadamente el nivel de resistencia deseado para detener la selección y evaluar las propiedades del fenotipo resultante. Además, los pasos intermedios de la escalada de dosis podrían aprovecharse para estudiar los mecanismos de resistencia adquirida en un proceso temporal. Según la cuestión biológica subyacente, se podrían obtener diferentes niveles de resistencia para estudiar tanto los mecanismos adaptativos tempranos con niveles de resistencia más bajos como fenotipos de resistencia estables y completamente estables en células más resistentes. Además, los umbrales de resistencia clínicamente relevantes varían sustancialmente en función del fármaco, la línea celular y la tasa intrínseca de proliferación; por lo tanto, el calendario de aumento de la dosis puede variar en consecuencia (en nuestro caso, la generación de células resistentes al Taxol requirió aproximadamente 6 meses). En consonancia con esta lógica, establecimos dos niveles diferentes de resistencia con células SUM159PT en nuestro estudio anterior y comparamos sus características distintivas y^{comparadas 17}. Por ello, recomendamos que los investigadores definan el rango de IC50 objetivo del fármaco de interés según su relevancia clínica y biológica.

Está bien establecido que la retirada de la presión del fármaco puede provocar la pérdida de quimiorresistencia, ya que las células pueden reconfigurar su epigenoma y^{transcriptoma 25}. Por esta razón, se sugiere evaluar la estabilidad del fenotipo de resistencia durante varios meses. Si las células tienden a volver a un estado sensible tras la retirada del fármaco, las células resistentes pueden cultivarse en presencia de la dosis de mantenimiento, típicamente correspondiente a la concentración final utilizada durante la generación de resistencia, para preservar su fenotipo de resistencia. Aunque los modelos de líneas celulares quimioresistentes in vitro son prácticos, reproducibles y ampliamente utilizados para estudiar quimioresistencia adquirida, pueden no reflejar completamente la heterogeneidad fenotípica observada en tumores de pacientes y carecer del microambiente tumoral, las interacciones inmunitarias y la heterogeneidad^{espacial 3,4,25}. Además, el paso prolongado durante la generación de resistencia puede causar alteraciones genéticas y epigenéticas que divergen de las observadas en muestras de pacientes, limitando potencialmente la relevancia traslacional de los hitos identificados. Por lo tanto, los genes y mecanismos candidatos identificados mediante este protocolo deberían validarse aún más en sistemas experimentales clínicamente relevantes, como modelos de cocultivo, organoides derivados del paciente o estudios in vivo. EPIKOL ofrece ventajas por su naturaleza enfocada si se quieren realizar cribas complementarios en estos modelos, donde el número máximo de celdas que se pueden obtener es inherentemente limitado.

Las células quimiorresistentes suelen crecer más lentamente que sus homólogas parentales, lo que puede suponer un reto práctico para cribados genómicos que requieren grandes poblaciones celulares para mantener la cobertura de bibliotecas. Bibliotecas focalizadas como EPIKOL ofrecen una ventaja para realizar un cribado con menos material de partida y proporcionando una mayor profundidad de sgRNA por gen, mejorando así la sensibilidad y la reproducibilidad dentro del espacio objetivo definido. Sin embargo, por diseño, EPIKOL solo captura los mecanismos de resistencia epigenética y no cubre a los contribuyentes no epigenéticos a la quimiorresistencia. Por tanto, la elección de la biblioteca debe guiarse por experimentos previos y la cuestión biológica específica. Los usuarios de estas bibliotecas deben ser conscientes de las limitaciones de las bibliotecas enfocadas e interpretar los resultados dentro del ámbito de la biblioteca.

Una barrera importante en el cribado CRISPR de modelos quimioresistentes es la aparición del fenotipo MDR impulsado por la regulación alcista del transportador^{ABC 9,10}. Diferentes transportadores ABC median el flujo de distintos sustratos. Una vez generada una línea celular resistente a fármacos, es importante evaluar si la resistencia se extiende a otros agentes quimioterapéuticos. La resistencia a la puromicina es causada principalmente por la sobreexpresión de ABCB1, y esto afecta al proceso de selección de los enfoques de cribado CRISPR agrupados, ya que la mayoría de estas bibliotecas llevan casetes de selección de puromicina para el enriquecimiento de células transducidas. Aquí, utilizamos verapamilo, un inhibidor de ABCB1 de primera generación, para facilitar la acumulación intracelular de puromicina y eliminar selectivamente las células resistentes no transducidas que de otro modo escaparían a la selección debido al eflujo de fármacos mediado por ABCB1. Dado que el verapamilo se une a ABCB1 de forma reversible, la función de ABCB1 se restaura en cuestión de horas tras la retirada del verapamil. Por lo tanto, el verapamilo no confiere una vulnerabilidad adicional a las células resistentes durante la fase de tratamiento farmacológico posterior del cribado. Sin embargo, hay que reconocer varias limitaciones del verapamil. Dado que el verapamilo es un inhibidor de los canales de calcio y otros transportadores, puede influir en la fisiología celular más allá de la inhibición de^{ABCB1 10}. Además, la concentración efectiva de verapamilo varía entre líneas celulares y modelos MDR dependiendo del nivel de expresión de ABCB1 y la actividad de otros transportadores. Por lo tanto, la concentración de verapamilo debe optimizarse para cada línea celular, y se podría considerar una nueva generación de inhibidores de ABCB1 más específicos para ABCB1 si los efectos fuera del objetivo son una preocupación. Como otro paso crítico, el título viral debería realizarse en la propia célula resistente en lugar de en las contrapartes parentales, ya que la infectividad y la selectabilidad suelen diferir en las células resistentes.

Otra consideración importante es determinar la duración adecuada del cribado, ya que las células quimioresistentes suelen crecer más lentamente que sus homólogos parentales^{emparejados (26}). Para tener en cuenta esta diferencia, utilizamos cálculos de nivel de duplicación poblacional (sección 6 del protocolo) para evaluar cuándo los grupos de control y tratamiento alcanzaron el umbral deseado de PDL. Por tanto, los cribados pueden terminarse en días diferentes, permitiendo duplicaciones comparables de población y facilitando una interpretación más segura de los efectos del ARNsg en el grupo de tratamiento.

Las PCR de preparación de bibliotecas son considerablemente importantes para la precisión de la identificación de impactos aguas abajo. El sesgo introducido por una baja entrada de gDNA y el aumento de los ciclos de PCR puede conducir a la amplificación de ciertas secuencias de sgRNA, causando enriquecimientos o deplecciones falsamente positivas. Para mitigar esto, recomendamos utilizar la máxima cantidad posible de gDNA, respetar los números de ciclo PCR que ofrece este protocolo y ejecutar reacciones paralelas para agrupar antes de la secuenciación. Cuando sea posible, la cobertura bibliotecaria no debe caer por debajo de los umbrales recomendados (>300× de cobertura) para garantizar una detección fiable de sgRNAs agotados en lugar de una caída estocástica de sgRNAs de baja abundancia debido a la baja cobertura.

Tras la secuenciación, utilizamos el marco de análisis MAGeCK y realizamos varios análisis posteriores de control de calidad e interpretación de datos^{en los pasos 24}. En primer lugar, se utilizó el análisis de componentes principales (PCA) para evaluar la distribución y reproducibilidad de réplicas biológicas (datos no mostrados, resultado MAGeCK). Se espera el agrupamiento replicado en PCA dentro de cada brazo; Sin embargo, una mayor variabilidad en el brazo tratado con fármaco es una característica común de los cribados de quimiorresistencia, ya que el fármaco puede inducir cambios estocásticos. Si los controles positivo y negativo se comportan como se espera en cada brazo, esta variabilidad no impide la identificación de aciertos verdaderos-positivos. A continuación, se aplicó la normalización de lecturas por millón (RPM) del conteo de sgRNA en los momentos iniciales y finales para evaluar si los sgRNAs dirigidos a genes esenciales estaban agotados como^{se esperaba 14}. Posteriormente, se utilizó la normalización mediana para agregar efectos a nivel de ARNsg, permitiendo la identificación de agotamientos a nivel^{génico 24}. Las puntuaciones de agotamiento a nivel de gen se visualizaron utilizando gráficos en cascada, que clasifican los genes desde los más agotados hasta los más enriquidos. Las alteraciones en el número de copias y la poliploidía derivadas de la exposición prolongada a medicamentos pueden confundir los resultados de cribado mediante un corte de Cas9 ineficiente^{o excesivo 27}. Aunque EPIKOL se dirige a reguladores de cromatina que generalmente no están sujetos a amplificaciones impulsadas por Taxol, recomendamos evaluar el estado de ploidía y los cambios en el número de copias en las células resistentes antes del cribado. Si se sospecha que hay cambios en el número de copias, se pueden aplicar herramientas de corrección computacional como CRISPRcleanR o CERES durante el análisis MAGeCK.

En cribados que involucran dos grupos experimentales, grupo control y grupo de tratamiento, se requieren diferentes comparaciones para interpretar correctamente el rendimiento del cribado y las dependencias^{biológicas 17}. Las comparaciones iniciales y finales son adecuadas para evaluar el rendimiento en el cribado, incluyendo el comportamiento esperado de genes esenciales y controles no dirigidos. La comparación del punto final del grupo control (DMSO) con el punto temporal inicial permite identificar los genes necesarios para el crecimiento y la aptitud de las células resistentes en ausencia de presión del fármaco. En contraste, la comparación de dos muestras finales, la tratada con fármaco (Taxol) y la control (DMSO), revela los genes específicos que eran necesarios para la resistencia al fármaco en lugar de la aptitud general. Cabe señalar que la comparación directa de las dos muestras finales conduce a una distribución sesgada de controles génicos esenciales, ya que son necesarios para la supervivencia en ambos grupos. Un método alternativo de visualización podría ser el gráfico de Volcano, que muestra los cambios de pliegue log2 junto con valores de significación, permitiendo identificar genes significativamente agotados. Una vez identificados los genes candidatos, los recuentos normalizados de sgRNA y los gráficos de visualización son útiles para decidir los sgRNAs con mejor rendimiento para ensayos de validación posteriores. Para el cribado EPIKOL, recomendamos priorizar genes candidatos apoyados por el comportamiento concordante de al menos 6 de cada 10 sgRNAs, ya que esto proporciona mayor confianza en los efectos a nivel génico.

Aquí, ofrecemos un protocolo optimizado para realizar cribado con EPIKOL en líneas celulares resistentes al Taxol que han aumentado la regulación de ABCB1 y han exhibido fenotipo MDR. Este protocolo es aplicable en términos generales a cualquier modelo quimioresistente que muestre resistencia cruzada a puromicina u otros antibióticos de selección, permitiendo así el cribado CRISPR en estas células. La orientación práctica para los desafíos técnicos más comunes que se encuentran en todos los pasos del protocolo se proporciona en la Tabla Suplementaria 1.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
100 mm plate	Corning	353003	Cultivo celular
45 µm filter	Sigma-Aldrich	SLHVM33RS	Cultivo celular
6 well plate	Corning	3506	Cultivo celular
96-well black clear bottom plates	Sigma-Aldrich	CLS356259	Para CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay
Blasticidin	Thermo Fisher	A1113903	Para selección
CellTiter-Glo luminescent cell viability assay	CellTiter-Glo, Promega	G7570	Para CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay
DMEM	Gibco		Cultivo celular
DMSO	PanReac AppliChem	A3672,0050	Cultivo celular
FBS	Gibco	16140071	Cultivo celular
Ham’s F12 nutrient mix	Gibco	11765054	Cultivo celular
HEK293T cells			Donaciones amables de Robert Weinberg (MIT, Boston, USA).
HEPES	Thermo Fisher	15630080	Cultivo celular
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001-1G	Cultivo celular
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278-5ML	Cultivo celular
LentiCas9-blast	Addgene	#52962	Para la generación de línea celular estable de Cas9
LentiGuide-Puro	Addgene	#52963	Backbone para clonación de gRNA
MN NucleoSpin tissue kit	Macherey-Nagel	740952.5	Para la extracción de ADN genómico
PBS	Gibco	10010023	Cultivo celular
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Cultivo celular
pLentiCRISPR v2	Addgene	#52961	Backbone para clonación de gRNA
Polyethylene glycol (PEG)-8000	Sigma-Aldrich	P2139-500G	Para la concentración de lentivirus
Polyethylenimine, linear (PEI)	Sigma-Aldrich	765090-1G	Para la producción de lentivirus
Protamine sulfate (PS)	Sigma-Aldrich	P4380-25G	Para la infección por lentivirus
psPAX2	Addgene	# 12260	Para la producción de lentivirus
Puromycin	Thermo Fisher	A1113803	Para selección
SUM159PT adherent cells			Donaciones amables de Robert Weinberg (MIT, Boston, USA).
Taxol	Paclitaxel, Sigma	PHR1803-200MG	Para la generación y mantenimiento de células res
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054	Cultivo celular
Verapamil	Selleck Chemicals	S4202	Para selección
VSV-G	Addgene	# 8454	Para la producción de lentivirus