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Artículo de investigación
* These authors contributed equally
En pez cebra, la mollugina a dosis seguras (≤200 µg/mL) se asoció con una mejora en la regeneración de la cola, acompañada de cambios en la expresión génica relacionada con la apoptosis, marcadores inflamatorios, actividad de enzimas antioxidantes y marcadores asociados con macrófagos. Estos hallazgos sugieren que la mollugina podría modular la respuesta local a la lesión durante la regeneración de la cola en el pez cebra.
La mollugina es un compuesto natural de naftoquinona con actividades antiinflamatorias y antioxidantes descritas, aunque su papel en la regeneración tisular aún no se comprende completamente. En este estudio, se utilizó un modelo de amputación de la cola en pez cebra para investigar los efectos de la mollugina en la reparación de heridas y en las respuestas inmunitarias y redox asociadas. Los embriones de pez cebra fueron tratados con mollugina en concentraciones de 22 µg/mL, 66 µg/mL y 200 µg/mL tras la lesión de la cola. El tratamiento con mollugina se asoció con una mejora en la recuperación del área de la cola de manera dependiente de la dosis, acompañada por una reducción en la expresión de genes relacionados con la apoptosis y la supresión de mediadores proinflamatorios, incluyendo IL-1β, IL-6, TNF-α, TLR4 y NF-κB1. Paralelamente, la mollugina restauró las actividades de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa y catalasa. El análisis mediante imágenes de fluorescencia en peces cebra Tg(mpeg1:GFP) mostró un efecto dependiente del tiempo de la mollugina sobre la acumulación de macrófagos, sin una reducción evidente a las 24 h, pero con una disminución del área positiva para macrófagos a las 48 h en los grupos de 66 y 200 µg/mL en comparación con el grupo modelo lesionado. El análisis mediante qRT-PCR mostró además una expresión reducida del marcador asociado a M1, iNOS, y un aumento en la expresión del marcador asociado a M2, arginasa-1. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la mollugina podría favorecer la regeneración de la cola en el pez cebra en asociación con cambios en marcadores inflamatorios, de estrés oxidativo, relacionados con la apoptosis y asociados a macrófagos. Se necesitan estudios adicionales para definir los mecanismos celulares y moleculares subyacentes.
La regeneración de tejidos es un proceso fisiológico crítico mediante el cual los organismos reparan daños, e implica la regulación compleja de la proliferación celular, la diferenciación y el mantenimiento de la homeostasis del microambiente1. Entre los modelos de vertebrados, el pez cebra ha surgido como un sistema fundamental para estudiar los mecanismos de reparación de heridas debido a su notable capacidad regenerativa. En particular, la regeneración de la aleta caudal en el pez cebra comprende la coordinación espacio-temporal de múltiples eventos biológicos, incluyendo la regulación de la inflamación, el equilibrio de la respuesta oxidativa y el control de la apoptosis2,3. En los últimos años, las actividades farmacológicas de los productos naturales se han convertido en un punto focal en la investigación de la medicina regenerativa. Los compuestos naftoquinona, en particular, han sido ampliamente estudiados debido a sus diversos efectos biológicos4. La mollugina es un compuesto naftoquinona derivado de plantas de la familia Rubiaceae y ha demostrado actividades antiinflamatorias, antioxidantes y de regulación del ciclo celular en estudios previos5,6. Sin embargo, su mecanismo de acción en la regeneración de tejidos sigue siendo poco claro, y su posible papel en la modulación del microambiente inflamatorio y la polarización de las células inmunitarias requiere una investigación sistemática.
Tras una lesión, la inflamación se activa rápidamente y afecta directamente la reparación del tejido. Una señalización inflamatoria moderada es esencial para eliminar el tejido necrótico e iniciar el programa de regeneración, mientras que una cascada inflamatoria excesiva puede agravar el estrés oxidativo y conducir a la fibrosis tisular7. Las citocinas, incluyendo IL-1β, IL-6 y TNF-α, aumentan notablemente tras la lesión y se acompañan de la activación de la señalización TLR4/NF-κB, lo que lleva a respuestas inflamatorias amplificadas y remodelación del tejido8,9. La molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) y el ligando quimioquínico CC-2 (CCL-2) también se elevan tras la lesión y están asociados con un reclutamiento aumentado de neutrófilos y macrófagos hacia los tejidos dañados10. Notablemente, el desequilibrio oxidativo agrava aún más el daño tisular, y la reducción de las actividades de la superóxido dismutasa (SOD) y la catalasa (CAT) indica una capacidad antioxidante comprometida2,11.
Los macrófagos actúan como reguladores clave del microambiente inflamatorio, y su polarización funcional impacta significativamente el proceso regenerativo12. Los macrófagos M1 se asocian con la expresión de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y actividad inflamatoria, mientras que los macrófagos M2 expresan arginasa-1 (Arg-1) y están relacionados con la reparación del tejido13,14. La polarización de los macrófagos está influenciada por citocinas locales, estrés oxidativo y señales relacionadas con la apoptosis. En este contexto, la red reguladora apoptótica compuesta por proteínas de la familia de linfoma de células B-2 (Bcl-2) y la caspasa-3 no solo afecta la supervivencia celular en el sitio de lesión, sino que también modula indirectamente el comportamiento quimiotáctico de las células inmunitarias mediante la liberación de señales "encuéntrame"15. Por lo tanto, explorar estrategias de intervención que modulen simultáneamente las respuestas inflamatorias, el estrés oxidativo y la polarización de los macrófagos podría ayudar a mejorar la regeneración del tejido.
Los compuestos naturales han demostrado ventajas únicas en la modulación de estos procesos biológicos. Estudios recientes han confirmado que las sustancias naftoquinónicas, debido a sus estructuras conjugadas, poseen la capacidad de eliminar radicales libres; su núcleo benzoquinónico puede afectar las vías de señalización sensibles al estado redox mediante mecanismos de transferencia de electrones16,17. Se ha informado que la mollugina atenúa las respuestas inflamatorias en la colitis inducida por DSS, con una reducción en la producción de citoquinas proinflamatorias y una disminución de la expresión de TLR4 en los tejidos del colon18. También se ha demostrado que la mollugina inhibe la señalización TAK1-NF-κB/MAPK y activa la vía Keap1-Nrf2 en macrófagos6; sin embargo, su impacto en la polarización de macrófagos y en la red de apoptosis-antiapoptosis en un modelo de herida in vivo aún no ha sido esclarecido. Además, los efectos biológicos dependientes de la dosis de la mollugina y su papel regulador durante el proceso de regeneración permanecen por aclararse sistemáticamente.
El presente estudio investigó los efectos de la mollugina en un modelo de regeneración de la aleta caudal de pez cebra. Específicamente, examinamos el crecimiento de la cola, la expresión de genes relacionados con la apoptosis, la señalización inflamatoria, la actividad de enzimas antioxidantes y las respuestas asociadas con macrófagos tras el tratamiento con mollugina. Nuestros hallazgos sugieren que el tratamiento con mollugina se asocia con una mejora en la regeneración de la cola y con cambios en múltiples marcadores de respuesta a la lesión en este modelo de pez cebra.
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Todos los procedimientos con animales siguieron la Guía del Consejo Nacional de Investigación para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital General de Fuzhou (número de aprobación: 202408002).
Reproducción de pez cebra
Todos los experimentos se realizaron utilizando pez cebra (Danio rerio) mantenidos bajo condiciones de laboratorio estándar. Se utilizaron peces cebra de tipo silvestre AB para el ensayo de toxicidad y el ensayo de regeneración tras amputación de la cola. Los peces cebra Tg(mpeg1:GFP) se utilizaron específicamente para la obtención de imágenes de macrófagos. Tg(mpeg1:GFP) es una línea reportera de macrófagos en la que la expresión de GFP marca las células de la línea de macrófagos bajo el control del promotor mpeg1, expresado en macrófagos. Todas las líneas de pez cebra se mantuvieron a 28,5 °C bajo un ciclo luz/oscuridad de 14 h/10 h. Solo se utilizaron embriones morfológicamente normales para los experimentos. En todos los experimentos, los embriones se incubaron en tampón Danieau, preparado con reactivos de grado analítico, incluyendo NaCl, KCl, Ca(NO₃)₂·4H₂O, MgSO₄·7H₂O y HEPES ajustado a pH 7,2.
Preparación del fármaco y determinación de la seguridad
Se disolvieron 40 mg de mollugina en 1 mL de DMSO para obtener un stock de 40 mg/mL. Primero, el stock se diluyó 1:10 en tampón de Danieau hasta 4 mg/mL, seguido de una dilución adicional a 22, 66 y 200 µg/mL para los tratamientos. Para determinar la concentración segura máxima, embriones de la cepa AB a 48 horas post-fecundación (hpf) fueron descorionados y desinfectados con hipoclorito de sodio al 0,003 % antes de distribuirlos en placas de 6 pocillos (n=20, tres pocillos por grupo). Los embriones se incubaron con mollugina (22 µg/mL, 66 µg/mL, 200 µg/mL, 240 µg/mL, 280 µg/mL, 320 µg/mL o 360 µg/mL) en medio E3 durante 48 h a 28,5 °C. La supervivencia se monitoreó mediante un microscopio estereoscópico, y la concentración más alta con una viabilidad embrionaria ≥90 % se estableció como el límite superior seguro para experimentos posteriores.
Construcción del modelo de amputación y regeneración de la cola
Para los estudios de regeneración, embriones silvestres AB de 48 hpf fueron anestesiados con tricaina al 0,03 % preparada en medio embrionario y colocados en posición lateral bajo un estereomicroscopio. Antes de la amputación de la cola, los embriones se mantuvieron en tampón de Danieau. Se realizó una amputación transversal estandarizada de la cola bajo guía estereomicroscópica. La línea de amputación se ubicó inmediatamente posterior al extremo de la notocorda, utilizando el extremo posterior de la notocorda como referencia anatómica. Se eliminó el pliegue de la aleta caudal distal a esta referencia mediante un microescalpelo para asegurar un nivel de lesión consistente entre los especímenes. Inmediatamente después de la amputación (0 h), se obtuvieron imágenes con un microscopio estereofluorescente. Tras la amputación, los embriones se transfirieron al medio de tratamiento correspondiente basado en E3 para el ensayo de regeneración. Las soluciones trabajo de mollugina se prepararon diluyendo la solución stock de mollugina en medio E3 hasta concentraciones finales de 22, 66 y 200 µg/mL. La mollugina se administró mediante exposición por inmersión durante el período de regeneración. Para igualar la exposición al vehículo, el grupo control sin lesión y el grupo modelo lesionado se mantuvieron en medio E3 que contenía DMSO al 0,5 %, correspondiente a la concentración final de DMSO en el grupo de mollugina de 200 µg/mL. Los embriones se mantuvieron en placas de 6 pocillos a 28,5 °C durante 2 días, con renovación diaria del medio de tratamiento correspondiente basado en E3. La regeneración se documentó mediante imágenes a las 24 y 48 h posteriores a la amputación, tanto con luz blanca como en condiciones de fluorescencia, para evaluar el crecimiento de la cola y la distribución de macrófagos. Las mediciones de las imágenes se realizaron con ImageJ.
Para la cuantificación de la regeneración, el área de la cola recuperada se midió como un área absoluta en µm2 y no se normalizó respecto al tamaño del embrión ni al tamaño original de la cola. Para minimizar la variabilidad, todos los embriones se amputaron en el mismo punto de referencia anatómico inmediatamente posterior al extremo del notocordio, y se utilizó el mismo punto de referencia para definir la región de medición en todos los grupos. Las regiones de interés se delimitaron manualmente en ImageJ según el contorno de la cola, y el análisis fue realizado por un investigador cegado respecto a los grupos de tratamiento. Para la cuantificación del área positiva para macrófagos, se analizaron en ImageJ imágenes de fluorescencia GFP de embriones Tg(mpeg1:GFP). La región de lesión/regeneración de la cola se definió manualmente como la región de interés utilizando el mismo punto de referencia anatómico empleado para la medición del área de la cola. Las imágenes se convirtieron a escala de grises de 8 bits y se restó la fluorescencia de fondo utilizando los mismos ajustes de corrección de fondo para todas las imágenes dentro del mismo experimento. Luego se aplicó uniformemente un umbral fijo de fluorescencia a todas las imágenes dentro de cada experimento para identificar las señales asociadas a macrófagos GFP-positivos. El área positiva para macrófagos se calculó como el área GFP positiva respecto al umbral dentro de la ROI definida. Las mediciones se basaron en el área positiva para fluorescencia, y no en la intensidad de fluorescencia ni en el recuento manual de células. Todos los análisis de imágenes fueron realizados por un investigador cegado respecto a los grupos de tratamiento.
Extracción de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
Tras completar el ensayo de regeneración, se recolectaron y agruparon embriones de cada condición experimental (al menos 20 embriones por grupo) para el análisis de ARN. Para cada condición, una réplica biológica consistió en una muestra agrupada que contenía al menos 20 embriones del mismo grupo experimental. Se prepararon tres réplicas biológicas agrupadas e independientes para cada condición, las cuales se utilizaron para el análisis estadístico. El ARN total se aisló tras homogenización mecánica en un reactivo de extracción de ARN basado en fenol/guanidina. La calidad y concentración del ARN se evaluaron espectrofotométricamente mediante la medición de las relaciones A260/A280. La síntesis de ADN complementario (cDNA) se realizó utilizando un kit comercial de transcripción inversa. La amplificación por PCR se llevó a cabo con reactivos SYBR Green. Las condiciones de ciclado de la qRT-PCR fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 s, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 5 s y hibridación/elongación a 60 °C durante 30 s. Se midieron los niveles de expresión de genes relacionados con apoptosis (caspasa-3 y Bcl-2), inflamación (TNF-α, IL-1β, IL-6, NF-κB1, TLR4, CCL2 e ICAM1) y fenotipo de macrófagos (iNOS y arginasa-1). La β-actina sirvió como gen de referencia. Los cambios relativos en la expresión génica se determinaron mediante el método 2−ΔΔCt. La información de los cebadores se lista en Tabla 1.
Ensayos de actividad para SOD y CAT
Los niveles de SOD y CAT se utilizaron para evaluar el estado antioxidante tras la lesión de la cola. A las 48 h posteriores a la amputación, se recolectaron los peces cebra de cada grupo y se homogenizaron en PBS frío. Tras la centrifugación, los extractos clarificados se utilizaron para la medición de SOD y CAT mediante kits comerciales de ensayo de actividad. La actividad de SOD se midió usando un kit de ensayo basado en WST-1, según las instrucciones del fabricante. Las muestras se cargaron en placas de ensayo de 96 pocillos junto con los patrones, y la absorbancia se leyó en un lector de microplacas. Las actividades enzimáticas se obtuvieron a partir de las curvas patrón. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Análisis estadístico
Los datos se muestran como media ± EE de al menos tres experimentos independientes. Para el ensayo de toxicidad, cada experimento independiente consistió en un lote de embriones, con 20 embriones por grupo y pozos por triplicado. Para la imagen de regeneración y la imagen de macrófagos en pez cebra Tg(mpeg1:GFP), se utilizaron embriones individuales como unidades de medición, y se analizaron 10 embriones por grupo. Para el análisis de qRT-PCR, una réplica biológica consistió en una muestra agrupada que contenía al menos 20 embriones del mismo grupo experimental, y se analizaron tres réplicas biológicas agrupadas e independientes por condición. Para el análisis de actividad de SOD y CAT, se analizaron cinco réplicas biológicas agrupadas e independientes por condición. Las diferencias entre grupos se analizaron mediante ANOVA de un factor con la prueba post hoc de Tukey. Los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism. Las diferencias con p < 0,05 se consideraron significativas.
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Determinación de la toxicidad y dosis segura
Para investigar los efectos de la mollugina, primero realizamos pruebas de toxicidad. Los resultados indicaron que la mortalidad de embriones de pez cebra se mantuvo baja a concentraciones de hasta 200 µg/mL, mientras que se observó un aumento de la mortalidad a concentraciones superiores a 200 µg/mL (Tabla 2). Por lo tanto, se determinó que la dosis segura más alta era de 200 µg/mL, mientras que las dosis baja y media se establecieron en ...
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En este trabajo, examinamos los efectos de la Mollugina en la regeneración de la cola del pez cebra. Dentro del rango de dosis ensayado, el tratamiento con Mollugina se asoció con una mejor recuperación del área de la cola tras la lesión, junto con cambios en la expresión de genes relacionados con la apoptosis, marcadores inflamatorios, actividad de enzimas antioxidantes y marcadores asociados con macrófagos.
El pez cebra, como modelo destacado para estudios de regeneración, exhibe regeneració...
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Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
El presente estudio fue patrocinado por la Comisión de Salud de la Provincia de Fujian, China (Concesión n.º 2022QNA085).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de cultivo celular de 6 pocillos | Corning | 3516 | |
| Kit de ensayo de catalasa (CAT) | Instituto de Bioingeniería Nanjing Jiancheng | A007-1-1 | |
| Cloroformo | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Lector de microplacas CMax Plus | Molecular Devices | iD3s | |
| Tampón de Danieau’s – Ca(NO3)2·4H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Concentración final en el tampón de Danieau’s: 0,6 mM. |
| Tampón de Danieau’s – HEPES | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Concentración final en el tampón de Danieau’s: 5 mM; pH ajustado a 7,2. |
| Tampón de Danieau’s – KCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Concentración final en el tampón de Danieau’s: 0,7 mM. |
| Tampón de Danieau’s – MgSO4·7H2O | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Concentración final en el tampón de Danieau’s: 0,4 mM. |
| Tampón de Danieau’s – NaCl | Guangzhou Pharmaceutical Holdings Ltd., China | N/A | Concentración final en el tampón de Danieau’s: 58 mM. |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Medio embrionario E3 | Preparado en laboratorio (fórmula estándar) | N/A | Fórmula estándar. |
| Primer específicos para qPCR (tnfα, il1β, il6, nfkb1, tlr4, ccl2, icam1, inos, arginasa-1, caspasa-3, bcl2, β-actina) | Sangon Biotech | N/A | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU. | N/A | Versión 8.0. |
| Software ImageJ | Institutos Nacionales de Salud (NIH) | N/A | Versión 1.52n. |
| Molugina (≥98 %, HPLC) | Sigma-Aldrich | SMB00431 | Compuesto activo de Rubia cordifolia, disuelto en DMSO a 40 mg/mL y diluido a 22, 66 y 200 µg/mL en medio E3. |
| Homogeneizador de tejidos motorizado | IKA, T10 basic ULTRA-TURRAX (o equivalente) | N/A | |
| NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | Novoprotein | abs60077 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7,4 |
| Sistema de PCR en tiempo real (Archimed X4) | Sansure Biotech Inc. | Archimed X4 | |
| Microcentrífuga refrigerada | SCILOGEX | CF1524R | |
| Puntas libres de RNasa | Sangon Biotech | F603222-0010 | |
| RNAiso Plus | Takara Bio Inc. | 9109 | Reactivo de extracción de ARN basado en fenol/guanidina. |
| Tubos de microcentrífuga libres de RNasa, 1,5 mL | Axygen / Eppendorf | N/A | |
| Microscopio estereoscópico de fluorescencia SMZ800N | Nikon | SMZ800N | Microscopio estereoscópico de fluorescencia utilizado para obtener imágenes de larvas Tg(mpeg1:GFP) y cuantificar la agregación de macrófagos. |
| Solución de hipoclorito de sodio | McLean, EE. UU. | N/A | Solución de trabajo al 0,003 %. |
| Mezcla SYBR Green qPCR Mix (2× SYBR qPCR Mix) | Novoprotein | E096 | |
| Microscopio estereoscópico SZX16 | Olympus | SZX16 | Utilizado para observaciones morfológicas, evaluación de toxicidad y amputación de la aleta caudal de larvas. |
| Kit de ensayo de superóxido dismutasa total (T-SOD) | Instituto de Bioingeniería Nanjing Jiancheng | A001-3 | |
| Pececillos cebra transgénicos Tg (mpeg1:GFP) | Anburui, Fujian, China (o colonia interna) | N/A | Línea reportera de macrófagos. |
| Tricaina metanosulfonato (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | Solución de trabajo al 0,03 %. |
| Agua destilada ultrapura libre de DNasa/RNasa | Invitrogen | 10977023 | |
| Pececillos cebra silvestres, cepa CZ98 (Danio rerio) | Anburui, Fujian, China | N/A | Se obtuvieron embriones fertilizados y larvas a partir de reproductores adultos. |
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