Evaluación de la rigidez intrínseca de la aorta murina usando miografía de pinos: un marco traslacional para interrogar la influencia del entorno circulante

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para evaluar la rigidez intrínseca de la pared aórtica (módulo elástico) mediante miografía de pinos y enfoques para examinar el posible papel del entorno circulante en la modulación de la rigidez intrínseca de la pared aórtica.

Resumen

El endurecimiento aórtico es un factor de riesgo independiente para enfermedades cardiovasculares y otras enfermedades crónicas, incluyendo el deterioro cognitivo, la disfunción renal, el deterioro visual y la reducción de la función glucosa-insulina. In vivo, la rigidez aórtica se evalúa comúnmente mediante técnicas basadas en tonometría o ultrasonido que visualizan las formas de onda arteriales o los segmentos arteriales longitudinales, respectivamente. Sin embargo, las mediciones in vivo están influenciadas por múltiples factores —como la presión arterial y la entrada autónoma— que limitan la comprensión mecanicista de cómo y por qué cambia la rigidez aórtica. Los modelos murinos preclínicos, que permiten la adquisición directa de tejido aórtico, ofrecen un marco experimental único para evaluar tanto la rigidez aórtica in vivo como las propiedades mecánicas intrínsecas de la aorta, libres de variables fisiológicas confusas. Estos modelos también permiten la interrogación directa del entorno circulante (es decir, la acumulación de moléculas bioactivas circulantes en el torrente sanguíneo) y su papel en la modulación de la rigidez aórtica a lo largo del espectro traslacional preclínico a clínico. Las alteraciones en el entorno circulante han surgido como un fundamento mecanicista clave del endurecimiento aórtico en numerosas afecciones —incluyendo el envejecimiento primario y el envejecimiento prematuro asociado al cáncer y con terapias contra el cáncer— tanto en estudios preclínicos como clínicos, así como en la mediación de los efectos de las intervenciones. Este artículo ofrece una guía paso a paso para evaluar: (1) la rigidez intrínseca de la aorta (módulo elástico) en modelos murinos preclínicos, y (2) la contribución del entorno circulante (y sus componentes) al endurecimiento aórtico utilizando biomuestras tanto preclínicas como clínicas.

Introducción

El endurecimiento aórtico es un factor de riesgo independiente para enfermedades cardiovasculares y otras enfermedades^{crónicas 1,2}. La evaluación de la rigidez aórtica in vivo puede carecer de resolución mecanicista, dado el proceso fisiológico integrador que regula la rigidez de la aorta in vivo (por ejemplo, presión arterial y entrada autónoma)². Por ello, la evaluación de la rigidez intrínseca aórtica (es decir, rigidez de la pared aórtica/módulo elástico) ex vivo mediante miografía por pinos permite la posibilidad de una evaluación directa de la rigidez aórtica independientemente de variables fisiológicas de confusión². Además, el uso de un enfoque experimental ex vivo permite interrogar posibles mecanismos moleculares que pueden mediar el endurecimiento de la pared aórtica. A diferencia de otros métodos establecidos para evaluar la rigidez arterial ex vivo, como la miografía por presión, el ensayo planar biaxial y los sistemas de miógrafo cíclico/pulsátil, que se basan en modelado de sistemas fisiológicos (por ejemplo, presión intraluminal y hemodinámica pulsátil), la miografía por pinos permite la evaluación directa de la rigidez de la pared aórtica mediante fuerza isométrica, bajo entornos altamente controlados que no requieren modelado in vivo.

El entorno circulante (es decir, la acumulación de moléculas bioactivas en el torrente sanguíneo), que entra en contacto directo y frecuente con la aorta, suele alterarse en contextos de endurecimiento aórtico (por ejemplo, envejecimiento cronológico/primario y envejecimiento prematuro, como en supervivientes de cáncer o modelos de supervivencia al cáncer)^3,4. Hemos establecido, utilizando biomuestras preclínicas (murinas) y clínicas (humanas) (plasma y suero), que el entorno circulante contribuye directamente al endurecimiento aórtico tanto en el envejecimiento^{primario 4} como en^{el envejecimiento prematuro 3}. Además, establecimos un marco experimental para determinar la(s) contribución(es) directa(s) de ciertos constituyentes dentro del entorno circulante en la mediación de su efecto sobre el endurecimiento aórtico ^3,5,6. Aquí, describimos y exponemos los enfoques experimentales paso a paso para evaluar la rigidez intrínseca aórtica y la contribución del entorno circulante (y sus componentes) al endurecimiento aórtico mediante miografía por pinos, y proporcionamos resultados representativos (con figuras y citas).

Protocolo

A lo largo de este estudio se utilizaron ratones machos de tipo salvaje C57BL/6J jóvenes adultos (4 meses de edad). El alojamiento y los procedimientos que involucran ratones experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) del Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado.

1. Preparación de solución fisiológica salina fría (CPSS)

1. Preparar la solución de caldo de Ringer Ca²⁺ en 1 L de_{diH 2O}y almacenarla a 4 °C (Tabla 1).
2. Añadir 13,9 g de MOPS en 100 mL de_{diH 2}O para preparar la solución de almacenamiento de tampón MOPS y almacenarla a 4 °C.
3. Añade 0,186 g de EDTA en 100 mL de_{diH 2}O para preparar la solución de EDTA de stock, pH a 8,0 y guárdalos a temperatura ambiente.
4. Prepara las soluciones de stock CPSS preparadas arriba y los productos químicos listados a continuación (Tabla 2). Reduce el volumen total a 2 L con_{diH 2}O, pH a 7,4 a 34 °C y filtra CPSS a través de un filtro ≤ 0,45 μm. Distribuir en tubos cónicos de 50 mL y almacenarlos a -20 °C.

2. Disección de la aorta del ratón (Figura 1, Figura 2 y Figura 3)

1. Anestesiar al ratón inhalando isoflurano (2,5%) y colocar al ratón en posición dorsal reclinada (Figura 1A-C).
2. Una vez que el ratón está bajo el plano quirúrgico de anestesia, se recoge sangre realizando una punción cardíaca y se completa el método de eutanasia secundaria mediante toracotomía bilateral (Figura 1B–C).
3. A continuación, retirar cuidadosamente la aorta desde el arco aórtico hasta la aorta abdominal (Figura 1D–F).
4. Coloque la aorta en CPSS y retire todo tejido adiposo conectivo y perivascular utilizando las tijeras de resorte Vannas de Fine Science Tools (2,5 mm) (Figuras 2A–E).
5. Corta cuidadosamente tres segmentos aórticos de 1 mm de ancho en la región torácica justo debajo del arco aórtico (Figura 3).
6. Colocar los dos segmentos aórticos de 1 mm en un tubo de 1,5 mL lleno de CPSS y almacenarlos a -80 °C hasta que experimentos de miografía de pasador por esfuerzo y deformación. Almacena el^{tercer segmento} adecuadamente para las mediciones histológicas posteriores que se describen a continuación.

3. Experimentos de miografía de pasadores por esfuerzo y deformación

NOTA: El Sistema de Miografía de Agujas se utilizará para realizar pruebas in vitro de rigidez aórtica (Figura 4 y Figura 5).

1. Primero, precalentar las cámaras a 37 °C que contengan aproximadamente 6 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y descongelar segmentos aórticos congelados de 1 mm.
   NOTA: También se pueden usar soluciones fisiológicas alternativas de sales que estén adecuadamente oxigenadas y con pH controlado, como se describió^{anteriormente 7}.
2. Una vez obtenidos 37 °C, sigue el protocolo de calibración del fabricante.
   1. Coloca el puente de calibración en el miógrafo de modo que la barra de balance en T no toque el pasador conectado al transductor de fuerza de la cámara de miografía del pin.
   2. Asegúrate de que el pasador del transductor de fuerza no esté sujeto a ninguna fuerza. Cuando la fuerza relativa sea estable, coloca un peso de 2 g sobre el puente en T de modo que la barra de equilibrio en T aplique ahora ~2 g de fuerza sobre el pasador transductor de fuerza.
   3. Confirma que la lectura de fuerza está entre 9,71 y 9,91 mN. Si es así, la calibración está completa.
3. Determinar la lectura base del micrómetro y registrar el valor (es decir, la lectura inicial).
   1. Bajo un microscopio de disección, determina la distancia micrométrica de línea base a la que los dos pines paralelos están casi en contacto (Figura 4).
      NOTA: No permitas que los dos pines se toquen, ya que esto podría causar daños o alterar el transductor de fuerza dentro de la cámara del miógrafo.
4. Bajo un microscopio de disección, coloque un segmento aórtico de 1 mm sobre los dos pines y registre el ancho del segmento usando microcalibradores (Figura 6A). Luego conecta la unidad de recámara a la interfaz del sistema de miografía de pines.
   NOTA: Aumenta el ancho del pasador para ejercer tensión en el segmento de la aorta mientras montas la aorta y fijarla en los dos pasadores, lo que evita que el segmento de la aorta se desprenda.
5. Si se aplica tensión en la aorta y la cámara ha sido conectada y montada en el sistema de miografía de pines, devuelve el microposicionador a la "posición inicial" determinada en el paso 3.3 anterior.
6. Pre-estiramiento completo de la aorta.
   1. Estira la aorta aumentando la distancia entre los dos pines en 1 mm desde la posición inicial del microposicionador (Figura 6B).
   2. A continuación, relaja la aorta devolviendo los pines a la lectura inicial del microposicionador. Realiza esta secuencia de estiramiento-relajación tres veces (Figura 6A).
      NOTA: Tras la última secuencia de estiramiento-relajación, el microposicionador debería volver a la lectura inicial.
7. En la interfaz del sistema de miografía de pinos, lectura de fuerza cero para cada cámara en uso (Figura 7).
8. Inicia el experimento de tensión-deformación.
   1. Aumenta la lectura de fuerza a aproximadamente 1 mN ajustando el microposicionador (Figura 7).
   2. Tras una estabilización de fuerza de ~1 mN (3–5 s), registra la nueva lectura del microposicionador en la fuerza de ~1 mN y registra la primera lectura de fuerza.
   3. Aumenta el microposicionador en 50 μm (es decir, 5 clics/hashes) y permite que el segmento de la aorta se estire durante 3 minutos. Tras 3 minutos, fuerza de récord.
   4. Sigue aumentando el microposicionador 50 μm cada 3 minutos y registra la fuerza hasta alcanzar el "punto de cedencia".
      NOTA: El punto de cedencia es la mayor cantidad de fuerza generada antes de que ocurra un daño estructural irreversible en la aorta (es decir, un desgarro o rotura en la aorta, una caída significativa en la fuerza).
   5. Confirma el punto de fluencia estirando la aorta 50 μm adicionales después del punto de fluencia inicial. Asegúrate de que el valor de fuerza siga disminuyendo o esté ligeramente por encima del límite elástico. Si no se confirma el punto de cedencia, continúa con aumentos de 3 minutos hasta alcanzar el límite de adherencia.
   6. Una vez confirmado el punto de cedencia, los experimentos están completos. Comienza el análisis ahora.

4. Análisis de experimentos de miografía de pasadores de esfuerzo y deformación para determinar el módulo elástico de la región de colágeno y elastina

1. Utilizando las lecturas de fuerza obtenidas del miógrafo, genera una curva tensión-deformación usando las siguientes ecuaciones:
   Deformación (λ)=∆d/[d(i)]
   aquí d es el diámetro y d_i es el diámetro inicial y;
   Esfuerzo (t)=λL/[2(HD)]
   donde L es la carga unidimensional, H es el grosor del medio íntimo y D es la longitud del recipiente. Una vez generadas las curvas esfuerzo-deformación, úsalas para calcular las regiones de alta y baja fuerza como se describió^{anteriormente 8,9} (Figura 8).
2. Calcula la región de alta fuerza (región de colágeno) (Figura 8B).
   1. Determina el módulo elástico de la curva tensión-deformación como ajuste de la pendiente de la regresión lineal a los últimos cuatro puntos de la curva tensión-deformación. Para obtener la medición de alta fuerza a partir del gráfico tensión-deformación, sigue los pasos siguientes:
      1. Haz clic derecho en un punto de datos en el gráfico y selecciona Seleccionar datos > Añadir > Introduce el nombre de la serie: Módulo elástico.
      2. Valores de la Serie X: Selecciona 4 puntos de datos de los valores de deformación. Estos deben ser los 3 puntos a medida que la fuerza se acerca al "punto de cedencia". Asegúrate de incluir el punto de cedencia como el cuarto punto.
      3. Valores de la Serie Y: Selecciona 4 puntos de datos de los valores de esfuerzo. Estos deben ser los 3 puntos a medida que la fuerza se acerca al "punto de cedencia". Asegúrate de incluir el punto de cedencia como el cuarto punto.
      4. Haz clic en OK y añade Línea de Tendencia > Ecuación de Visualización > Lineal en el gráfico > Muestra el valor de R-cuadrado en el gráfico.
   2. La pendiente de la ecuación es el módulo elástico de alta fuerza. Asegúrese de que el valor R-cuadrado sea ≥ 0,99 para que el módulo elástico sea preciso.
3. Calcular la región de baja fuerza (región de elastina) (Figura 8C)
   1. Determina los límites de la región dominante en elastina (región de baja fuerza donde la curvatura es ~0) de la curva tensión-deformación ajustando una ecuación polinómica de séptimo orden a los datos (r² > 0,99) y luego calculando las raíces de la ecuación. Consideremos la primera raíz, el límite entre la región de muy baja fuerza y la región de elastina, y la segunda raíz, el límite entre la región de elastina y el inicio del compromiso de las fibras de colágeno.
   2. Luego se determina el módulo de elasticidad de la región de baja fuerza como la pendiente de una ecuación lineal ajustada a los datos de tensión-deformación entre las dos^{raíces 8,9}. Para obtener esto:
      1. Haz una hoja de cálculo que contenga columnas como se ilustra en la Tabla Suplementaria 1.
      2. Conviértelo en un documento "txt" y ábrelo en el script R del software de código R "Modulus of Elasticity".
      3. Para usar los datos, comprueba pendientes normales: el grafo^{de la} derivada 3 en la salida de R debe tener la forma de "M".
      4. En la pestaña de resultados , el valor numérico bajo la columna Pendiente es el módulo de elasticidad. Asegúrate de que el valor R-cuadrado sea mayor o igual a 0,99 para que el módulo de elasticidad sea preciso.
      5. Para obtener este valor en la hoja de cálculo, selecciona los valores de deformación (y sus valores de esfuerzo correspondientes) entre la primera y la segunda derivada obtenidas en la pestaña de resultados del código R .
      6. Sigue los pasos descritos en el paso 4.2 para obtener la ecuación y el valor de^R2 en el gráfico de la hoja de cálculo.

5. Evaluación del diámetro aórtico y el grosor de la pared

1. Coloque el último segmento aórtico de 1 mm en un criomóldo relleno con compuesto de temperatura óptima de corte (OCT). Orientar el anillo con el lumen plano y centrado en la parte inferior del molde, con el eje luminal perpendicular a la superficie de corte para obtener secciones transversales.
2. Prepara un recipiente de 2-metilbutano enfriado en nitrógeno líquido y luego sumerge el criomold en 2-metilbutano frío hasta que el OCT se vuelva opaco y blanco.
3. Guarda el criomold a -80 °C hasta que se seccione. Ajusta la temperatura del criostato a la temperatura de corte OCT adecuada (≈-20 °C) y luego monta el bloque congelado sobre el soporte de la muestra.
4. Una vez fijado al soporte, recorta cuidadosamente el bloque manteniendo el grosor en 7 μm hasta que aparezca tejido.
5. Etiqueta una lámina con el ID del ratón y corta 4–5 secciones transversales del tejido aórtico con un grosor de 7 μm.
6. Para transferir el tejido cortado a las láminas, coloca todas las secciones cortadas en la etapa criostata (también llamada etapa de cuchillo) antes de colocar la lámina etiquetada directamente sobre ellas.
7. Una vez completada la transferencia, se desliza al aire secado.
8. Secciones de imagen con aumento de 10x en un microscopio de campo claro. Guarda las imágenes en formato JPG/TIFF con una barra de escala en la parte inferior de la imagen.
9. Para análisis, abre ImageJ, ve a Archivo > Abrir y selecciona la imagen aórtica.
10. Una vez que la imagen aórtica esté activa, haz zoom en la barra de escala usando el icono Control + + y luego usa la herramienta de línea para medir la longitud de la barra de escala. Para rellenar el resultado, pulsa Control + M. La medida calculada bajo la longitud es la medida de la barra de la báscula.
11. Para calibrar el software, ve a Analizar > Ajustar Escala. Para la distancia en píxeles, introduce la longitud de la línea calculada por ImageJ en el paso 8. Para la distancia conocida , introduzca la longitud real de la barra de la escala y, bajo unidades , escriba la unidad de medida (μm, mm, cm, etc.).
12. Marca la casilla global para calibrar automáticamente todas las imágenes posteriores. Observa si la barra de escala en las otras imágenes difiere o si ImageJ está cerrada; si es así, se requiere recalibración.
13. Para el grosor de la pared, utiliza la herramienta de línea recta y traza una línea perpendicular desde el borde luminal hasta el exterior adventicial. Pulsa Control + M para rellenar automáticamente la longitud en la pestaña de resultados .
14. Repite el paso 5.13 para realizar mediciones en 6 posiciones espaciadas uniformemente alrededor de la circunferencia de la aorta y registrar cada valor.
15. Para calcular el grosor medio por aorta de ratón, se promedian todos los espesores obtenidos de 4–5 muestras del mismo ratón.
16. Para medir el diámetro luminal, selecciona la herramienta de polígonos y traza el borde luminal interior en sentido horario. Registra el perímetro (μm) pulsando Control + M.
17. Repite el trazado en sentido antihorario, empezando desde otro punto. Asegúrate de que los dos valores de circunferencia estén cerca y promedialos para ese anillo aórtico.
18. Repite el paso 5.16 para las 4–5 muestras aórticas del mismo ratón y promedia todos los valores de circunferencia.
19. Para calcular el diámetro, utiliza la ecuación: Diámetro (μm) = Perímetro/3,14.

6. Módulo elástico aórtico mediado por el medio circulante

NOTA: Para determinar si factores circulantes o compuestos específicos alteran la rigidez intrínseca de la aorta, los anillos aórticos torácicos de ratones naïves de intervención pueden incubarse ex vivo bajo condiciones estándar de cultivo definidas (37 °C, 5% CO₂, 20%_O2, humidificado) (Figura 9).

1. Diseca la aorta torácica y corta dos segmentos anulares de 1 mm por condición. Retira todo el tejido adiposo perivascular.
2. En una placa de 96 pozos, incubar los anillos aórticos en medios estándar, que consisten en DMEM + 1% penicilina-estreptomicina.
3. Añade tratamiento experimental a los medios. Para plasma o suero (se puede usar plasma/suero sin tratar para esto), utiliza el 10% del volumen total del medio. Utiliza plasma o suero preclínico y clínico^{(humano) 3,4,6} (Figura 9).
4. Para establecer el papel causal de un factor circulante que se ha demostrado diferente entre grupos de estudio, se repite la exposición plasma/sérico mientras se corrige simultáneamente la diferencia observada en la concentración entre grupos (es decir, se normaliza la concentración del factor de interés), se determina el efecto directo del factor de interés en una concentración que representa la diferencia media de grupo, o bloquear la señalización del factor que se cree responsable de mediar el efecto del entorno circulante.
   NOTA: Estos dos últimos enfoques se ejecutaron previamente, respectivamente, con Trimetilamina-N-óxido (TMAO)⁵ y con bloqueo del receptor para productos finales de glicación^{avanzada 3}.
5. Por esclarecer el papel del exceso de estrés oxidativo relacionado con superóxidos o mitocondrias-
   el estrés oxidativo específico relacionado con superóxidos en este sistema modelo, se utilizan las siguientes concentraciones respectivas al incubar anillos de aorta: TEMPOL: 1 μM ^5,10 y MitoQ: 1 μM⁶.
6. Tras 48–72 horas de incubación, carga los anillos aórticos en la miógrafa de pinos y sigue los pasos indicados anteriormente.

Resultados

Endurecimiento aórtico relacionado con la edad

Para la rigidez mecánica intrínseca, se registra y se utiliza la fuerza correspondiente a cada intervalo de estiramiento para los cálculos. En los cálculos discutidos anteriormente, se generarán curvas esfuerzo-deformación y se calculará el módulo elástico para la 1) región de colágeno y/o 2) región de elastina de estas curvas, como se describió arriba y mostró originalmente por Gioscia-Ryan et

Discusión

El uso de la miografía por pins para la evaluación de la rigidez intrínseca aórtica ex vivo ofrece la oportunidad de evaluar la rigidez intrínseca aórtica independientemente de variables fisiológicas in vivo que puedan confundir, como la presión arterial y la entrada autónoma². Además, este enfoque experimental ex vivo ofrece la oportunidad de detectar posibles mecanismos moleculares que puedan estar detrás de las diferencias en la rigid...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-metilbutano	Fisher Scientific	AA19387AP
BSA	Fisher Bioreagents	BP1600
Cloruro de calcio dihidrato	Sigma-Aldrich	C7902
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
D-(+)-Glucosa (Dextrosa)	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Fisher Scientific	MT10017CV
EDTA (A.C.S.)	Fisher Chemical	E478
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Sulfato de magnesio heptahidrato	Sigma-Aldrich	M2773
MitoQ	Cayman Chemical	845959-50-4
Fosfato monosódico	Sigma-Aldrich	S5011
MOPS (sal de sodio)	Sigma-Aldrich	M9024
Sistema de miografía de múltiples pines	Danish Myo Technology (DMT)	620M
NaCl	Fisher Chemical	S271
Penicilina-estreptomicina	Fisher Scientific	15-140-148
Anticuerpo RAGE	R&D System	AF1145
Piruvato sódico	Sigma-Aldrich	P2256
TEMPOL	Sigma-Aldrich	2226-96-2
Compuesto Tissue-tek OCT	Sakura	4583
Trimetalamina N-óxido (TMAO)	Sigma Aldrich	317594