Asociación de la expresión de MPO con el microambiente inmunitario en el cáncer de mama: perspectivas a partir de análisis bioinformáticos y de células únicas

Qingrui Li; Fei Teng; Weijia Kong; Siyu Tong; Peilin Sha; Pengrui Wang

doi:10.3791/71189

Artículo de investigación

Asociación de la expresión de MPO con el microambiente inmunitario en el cáncer de mama: perspectivas a partir de análisis bioinformáticos y de células únicas

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DOI:

10.3791/71189

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14 de agosto de 2026

Qingrui Li^*¹ , Fei Teng^*² , Weijia Kong^*³^,⁴ , Siyu Tong⁵ , Peilin Sha² , Pengrui Wang²

¹Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, ²Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, ³China Academy of Chinese Medical Sciences, ⁴Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, ⁵College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta un flujo de trabajo reproducible de bioinformática y de célula individual para explorar las asociaciones entre la expresión de mieloperoxidasa (MPO) y las características inmunitarias/mieloides en el cáncer de mama. Dado que los análisis se basan en conjuntos de datos públicos y métodos in silico, los hallazgos se interpretan como exploratorios y generadores de hipótesis.

Resumen

El cáncer de mama sigue siendo una causa importante de mortalidad relacionada con el cáncer, y los flujos de trabajo computacionales exploratorios pueden ayudar a priorizar marcadores asociados al sistema inmunitario para investigaciones posteriores. En este estudio, utilizamos los datos transcriptómicos de ARN total del Atlas del Genoma del Cáncer de carcinoma mamario invasivo (TCGA-BRCA) y el conjunto de datos públicos de secuenciación de una sola célula GSE161529 para examinar las asociaciones entre la expresión de mieloperoxidasa (MPO), resultados clínicos, infiltración inmunitaria, metilación, anotaciones de reguladores upstream, patrones de expresión a nivel de célula individual, resultados de sensibilidad tras silenciamiento virtual, recuperación de interacciones fármaco-gen y anotaciones de absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad (ADMET). La expresión de MPO fue menor en los tejidos de cáncer de mama que en los tejidos adyacentes no tumorales. Una mayor expresión de MPO se asoció con un mayor intervalo libre de progresión, mientras que sus asociaciones con la supervivencia global y la supervivencia específica de la enfermedad no fueron estadísticamente significativas. El análisis de la curva característica de operación del receptor (ROC) sugirió una separación entre tumor y tejido normal dentro del conjunto de datos público analizado, aunque esto no debe interpretarse como una validación diagnóstica clínica. Los análisis de desconvolución inmunitaria y enriquecimiento indicaron que la expresión de MPO se asoció principalmente con características transcripcionales relacionadas con el sistema inmunitario y con linaje mieloide, más que con una regulación intrínseca del tumor del microambiente inmunitario. A resolución de célula individual, la señal de MPO fue escasa, detectándose únicamente 85 células positivas para MPO antes de la expansión del entorno basada en vecinos más cercanos (KNN). La señal detectable de MPO y las puntuaciones asociadas a MPO se interpretaron con cautela, ya que podrían verse influenciadas por la expresión escasa, la incertidumbre en la anotación de tipos celulares, eventos de dropout, dobletes o ARN ambiental. In silico la reducción virtual sugirió cambios transcripcionales candidatos relacionados con la inmunidad y la inflamación, pero estos resultados se consideraron exploratorios y requieren validación. La recuperación de interacciones fármaco-gen basada en la base de datos de interacciones fármaco-gen (DGIdb) y la anotación ADMET se utilizaron únicamente como anotaciones químicas preliminares y no se interpretaron como evidencia terapéutica. En conjunto, este estudio proporciona un flujo de trabajo in silico reproducible para generar hipótesis sobre características inmunitarias/mioides asociadas a MPO en el cáncer de mama, las cuales requieren validación en cohortes externas y confirmación experimental.

Introducción

El cáncer de mama es una neoplasia inmunorrelacionada altamente heterogénea¹. La progresión de la enfermedad, el riesgo de recurrencia y metástasis, y la respuesta al tratamiento están estrechamente asociados con la composición y el estado funcional del microambiente inmunitario tumoral (TIME, por sus siglas en inglés)². A pesar de la continua optimización de las estrategias de tratamiento integral, algunos pacientes aún experimentan progresión o recurrencia, lo que subraya la necesidad urgente de identificar biomarcadores moleculares que caractericen el estado del TIME y apoyen la estratificación de riesgos, al tiempo que se elucidan sus mecanismos subyacentes.

La mieloperoxidasa (MPO) es una peroxidasa que contiene hemo y que se expresa predominantemente en neutrófilos y, en menor medida, en monocitos y macrófagos. A través de la generación de ácido hipocloroso y otros oxidantes reactivos, la MPO contribuye a la defensa antimicrobiana, pero también puede promover lesión tisular oxidativa e inflamación crónica. En el cáncer, la importancia biológica de la MPO parece depender del contexto³. Por un lado, se ha implicado al estrés oxidativo mediado por MPO en la carcinogénesis y la progresión tumoral mediante daño al ADN, oxidación de lípidos y proteínas, señalización inflamatoria y remodelación del microambiente tumoral⁴^,⁵^,⁶. Por otro lado, la infiltración de células innatas inmunitarias o de linaje mieloide positivas para MPO se ha asociado con un pronóstico favorable o con actividad inmunitaria antitumoral en ciertos contextos tumorales⁷^,⁸^,⁹. Estos hallazgos aparentemente contradictorios sugieren que la importancia clínica y biológica de la MPO puede depender del tipo de tumor, la etapa de la enfermedad, la fuente celular de la MPO y la composición inmunitaria del microambiente tumoral. Sin embargo, el patrón de expresión y la relevancia pronóstica de la MPO en el cáncer de mama, particularmente a nivel de célula individual, aún no están completamente caracterizados.

El microambiente inmunitario del tumor (TIME) contiene compartimentos heterogéneos de linaje mieloide, linfoides, estromales y epiteliales¹⁰. La MPO se asocia clásicamente con neutrófilos y otras células de linaje mieloide, por lo que las señales relacionadas con la MPO en perfiles tumorales masivos pueden reflejar la composición de células inmunitarias más que la actividad intrínseca de las células tumorales¹⁰. En el cáncer de mama, la distribución de la señal de MPO en conjuntos de datos masivos y de célula única, su asociación con estimaciones de infiltración inmunitaria y los límites de reproducibilidad de análisis computacionales posteriores aún no están suficientemente caracterizados. Por lo tanto, este estudio trata a la MPO como un marcador asociado al sistema inmunitario para el desarrollo de un flujo de trabajo exploratorio, y no como un regulador causal demostrado del TIME ni como un objetivo terapéutico validado. En comparación con análisis diferenciales de expresión en una sola cohorte o estimaciones de infiltración inmunitaria en una sola plataforma, un flujo de trabajo integrado que combine transcriptómica masiva, desconvolución inmunitaria, anotación de metilación, mapeo de célula única y perturbación computacional puede ofrecer una visión exploratoria más amplia del contexto inmunitario asociado a genes. Este enfoque es útil para priorizar marcadores candidatos y generar hipótesis comprobables, especialmente cuando aún no están disponibles conjuntos de datos experimentales. Sin embargo, dicha integración computacional no puede por sí sola determinar la fuente celular, causalidad, actividad farmacológica o utilidad clínica. Con el avance de grandes cohortes públicas de cáncer y tecnologías transcriptómicas de célula única, los enfoques de bioinformática pueden utilizarse para explorar asociaciones entre la expresión génica, resultados clínicos, composición de células inmunitarias y estados transcripcionales a nivel poblacional y de célula única¹¹. Los métodos de perturbación computacional basados en redes reguladoras génicas de célula única pueden además proporcionar información generadora de hipótesis sobre la sensibilidad transcripcional asociada a genes¹²^,¹³. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo caracterizar el patrón de expresión, la asociación con la supervivencia, el contexto inmunitario/mieloide, el perfil de metilación, la distribución en célula única y el perfil exploratorio de perturbación computacional de la MPO en el cáncer de mama. El flujo de trabajo general se muestra en Figura 1.

Protocolo

Adquisición desde la base de datos TCGA

Los datos de secuenciación de ARN y la información clínica para la cohorte de carcinoma invasivo de mama del Proyecto del Genoma del Cáncer (TCGA-BRCA) se obtuvieron del portal Genomic Data Commons¹⁴. Se extrajeron los datos de ARN-seq del flujo de trabajo STAR en formato de transcritos por millón (TPM), junto con las anotaciones clínicas emparejadas. Se excluyeron las muestras de ARN-seq que carecían de información clínica correspondiente. Para los análisis basados en la expresión, los valores de TPM se transformaron como log2(TPM + 1). La expresión de MPO se extrajo utilizando el símbolo génico MPO y el identificador génico Ensembl ENSG00000005381.8. Para los análisis que requerían agrupamiento en MPO-alto y MPO-bajo, solo se incluyeron muestras tumorales de TCGA-BRCA, excluyéndose las muestras normales adyacentes de la asignación de grupo. Las muestras tumorales se dividieron según el valor mediano de la expresión de MPO transformada a log2(TPM + 1) entre las muestras tumorales de TCGA-BRCA. Las muestras con expresión de MPO mayor o igual que la mediana se asignaron al grupo MPO-alto, mientras que las muestras por debajo de la mediana se asignaron al grupo MPO-bajo. Esta estrategia de agrupamiento basada en la mediana se utilizó para el análisis de supervivencia, el análisis de expresión diferencial, el análisis de enriquecimiento, el agrupamiento por metilación y las comparaciones de enriquecimiento de células inmunitarias, salvo que se indique lo contrario. Las características clínico-patológicas, incluyendo sexo, edad, etnia, estadio patológico T, grado histológico, subtipo PAM50, estadio patológico, estado del tumor y puntos finales de supervivencia, incluyendo supervivencia global (OS), intervalo libre de progresión (PFI) y supervivencia específica para la enfermedad (DSS), se analizaron utilizando la versión 4.2.1 de R.

Recuperación Pública de Imágenes de Inmunohistoquímica

Se utilizaron imágenes representativas de inmunohistoquímica de mieloperoxidasa (MPO) de tejido mamario normal adyacente y tejido de cáncer de mama como referencias cualitativas a nivel proteico. Estas imágenes no se incluyeron en análisis morfométricos cuantitativos ni estadísticos. Las áreas delimitadas indican regiones mostradas con mayor aumento. Las barras de escala indican 100 µm en las imágenes de 20× y 50 µm en las imágenes de 40×.

Análisis de correlación de expresión

Se utilizó el conjunto de datos TCGA-BRCA para examinar los genes que covarían con la expresión de MPO en el cáncer de mama. Se calcularon coeficientes de correlación de Pearson a nivel genómico entre MPO y los genes que codifican proteínas, y se seleccionaron los 30 genes con mayor correlación positiva y los 30 con mayor correlación negativa para su visualización. En los análisis de correlación que implicaron múltiples genes evaluados, los valores p nominales se ajustaron mediante el método de tasa de descubrimiento falso de Benjamini-Hochberg. La red de interacción proteína-proteína (PPI) asociada a MPO se construyó utilizando la herramienta de búsqueda para la recuperación de genes/proteínas interactuantes (base de datos STRING), conservándose para la visualización los pares de proteínas con puntuaciones de interacción superiores a 0,40¹⁵.

Análisis de enriquecimiento funcional

Los genes diferencialmente expresados (DEG) se identificaron comparando los grupos de tumores MPO-alto y MPO-bajo de TCGA-BRCA utilizando umbrales de |log2FC| > 1 y un valor p ajustado por Benjamini-Hochberg < 0,05. El análisis de enriquecimiento funcional de los DEG se realizó utilizando el paquete de R clusterProfiler versión 4.4.4, que incluyó análisis de procesos biológicos, componentes celulares y funciones moleculares de la ontología genética (GO), así como análisis de vías de la Enciclopedia de Kioto de genes y genomas (KEGG)¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰. Los términos GO y KEGG enriquecidos se consideraron significativos cuando el valor p ajustado fue < 0,05.

Se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) utilizando una lista previamente ordenada de genes basada en estadísticas de expresión diferencial entre los grupos con alto y bajo contenido de MPO. Se utilizó la colección de vías canónicas C2 de MSigDB c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt, correspondiente a MSigDB v2022.1.Hs y que contiene 3.050 conjuntos de genes²¹^,²². Los términos enriquecidos se consideraron significativos según un valor p ajustado por Benjamini–Hochberg < 0,05, un valor q de FDR < 0,25 y un |valor de enriquecimiento normalizado| > 1. Cuando fue aplicable, se calcularon las puntuaciones Z para los términos enriquecidos significativamente utilizando el paquete GOplot para la visualización.

Análisis del enriquecimiento de células inmunitarias en tumores

Los componentes inmunitarios y estromales en la cohorte TCGA-BRCA se evaluaron mediante el algoritmo ESTIMATE implementado en el paquete de R estimate versión 1.0.13. Se utilizaron como entrada datos de expresión transformados mediante log2(TPM + 1), y se calcularon la puntuación inmunitaria, la puntuación estromal y la puntuación ESTIMATE para cada muestra tumoral. Se empleó TIMER/TIMER2.0 para evaluar las asociaciones entre la expresión de MPO y los niveles estimados de infiltración de poblaciones principales de células inmunitarias en la cohorte TCGA-BRCA, incluyendo células B, células T CD8+, células T CD4+, macrófagos, neutrófilos y células dendríticas²³^,²⁴^,²⁵. Los resultados basados en TIMER se interpretaron como estimaciones de infiltración inmunitaria derivadas del recurso en línea correspondiente. Para el análisis de enriquecimiento de células inmunitarias en 24 tipos de células inmunitarias, se implementó un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes para una sola muestra (ssGSEA) utilizando el paquete de R GSVA versión 1.46.0²⁶. La matriz de firmas de células inmunitarias LM22 utilizada para la desconvolución basada en CIBERSORT de 22 tipos de células inmunitarias se proporciona en la Tabla Suplementaria 1. Las correlaciones entre la expresión de MPO y las puntuaciones de enriquecimiento de células inmunitarias se evaluaron mediante la correlación de rangos de Spearman. Las diferencias en las puntuaciones de enriquecimiento de células inmunitarias entre los grupos tumorales definidos por la mediana como MPO-alto y MPO-bajo se compararon utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. En los análisis que involucraron múltiples tipos de células inmunitarias, los valores p se ajustaron mediante el método de tasa de descubrimientos falsos de Benjamini–Hochberg.

Metilación del ADN del gen MPO

Los patrones de metilación del ADN dentro del locus MPO se evaluaron utilizando MethSurv. Los valores beta de metilación de los sitios CpG y las asociaciones con la supervivencia para TCGA-BRCA se obtuvieron de la plataforma MethSurv. Se visualizaron los sitios CpG relacionados con MPO seleccionados y se evaluaron sus asociaciones con los resultados de supervivencia mediante los análisis de supervivencia proporcionados por MethSurv²⁷. Para los análisis que involucraron múltiples sitios CpG, los valores p se ajustaron a través de los sitios CpG relacionados con MPO evaluados utilizando el método de tasa de descubrimiento falso de Benjamini-Hochberg. Estos análisis de metilación se interpretaron como anotaciones epigenéticas exploratorias.

Construcción de la red PPI y análisis de correlación de genes relacionados con neutrófilos

Para examinar la asociación entre MPO y la biología relacionada con los neutrófilos, se realizó un análisis de red sistemático. Se seleccionó un conjunto de genes que comprende mediadores establecidos de la activación de neutrófilos y procesos inflamatorios asociados, a partir de la literatura actual. La lista completa de genes relacionados con neutrófilos se proporciona en Tabla Suplementaria 2. Los símbolos de los genes se armonizaron con los símbolos oficiales, se eliminaron las entradas duplicadas y los genes disponibles se intersectaron con la matriz de expresión TCGA-BRCA antes del análisis STRING/PPI, la priorización de genes centrales (hub genes) y el análisis de correlación entre MPO y genes centrales. La red PPI entre estos genes se construyó utilizando la base de datos STRING (versión 11.5) con un umbral de confianza media para la puntuación de interacción (>0.40). Los genes centrales dentro de esta red se priorizaron algorítmicamente en función de la centralidad de grado, que cuantifica el número de interacciones directas por nodo. Los 20 genes principales con las puntuaciones de grado más altas se seleccionaron para el análisis de correlación posterior.

Posteriormente, se extrajeron los perfiles de expresión de estos genes centrales y de MPO a partir del conjunto de datos transcriptómicos TCGA-BRCA. La asociación entre MPO y cada gen central se evaluó estadísticamente mediante la correlación de rangos de Spearman. Para caracterizar los patrones de correlación entre los propios genes centrales, se calculó una matriz de correlación de Spearman por pares en todas las muestras tumorales. Estos análisis de correlación proporcionaron la base cuantitativa para las visualizaciones posteriores, incluyendo el gráfico de bastones de las correlaciones entre MPO y los genes centrales y el diagrama de acordes/mapa de calor que muestra los patrones de correlación entre los genes centrales.

Predicción de factores de transcripción y miARNs upstream que dirigen MPO

Se utilizó la base de datos KnockTF (https://bio.liclab.net/KnockTF/index.php)²⁸^,²⁹, la base de datos ChIP (http://chip-atlas.org/)³⁰^,³¹ y la base de datos GTRD³²^,³³ (https://gtrd.biouml.org/#!) para predecir los TFs diana de MPO. Además, se utilizó la base de datos TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_80/) para predecir los sitios potenciales de unión de miARN que dirigen a MPO. Los diagramas de Venn se generaron utilizando el sitio web MicroBioinformatics (https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html)³⁴.

Análisis de una sola célula de MPO

El conjunto de datos específico GSE161529 proviene del Gene Expression Omnibus (GEO). El preprocesamiento de los datos comenzó con un filtrado a nivel celular para excluir células de baja calidad—aquellas que cumplían con alguno de los siguientes criterios: expresión de genes mitocondriales superior al 25 %, recuento total de identificadores moleculares únicos (UMI) inferior a 5000 o menos de 2500 genes detectados. Posteriormente, se corrigió la contaminación por ARN ambiental y los efectos técnicos por lotes³⁵. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para reducir la dimensionalidad y evaluar la similitud celular, seguido de UMAP para la agrupación y visualización de células. Luego, según los genes marcadores típicos de las células, los diferentes grupos se anotaron con tipos celulares¹¹. El conjunto de genes asociados a MPO utilizado para la puntuación de firmas a nivel de célula individual se proporciona en el Archivo Suplementario 1. Antes de la puntuación, los símbolos de los genes se armonizaron con los símbolos oficiales, se eliminaron las entradas duplicadas y se intersectaron los genes disponibles con la matriz de expresión de GSE161529. Se utilizaron AUCell, Seurat AddModuleScore y ssGSEA para calcular las puntuaciones asociadas a MPO en cada célula. Las puntuaciones obtenidas mediante los tres métodos se normalizaron mediante puntuación Z, se escalaron a un rango comparable y se integraron para generar una puntuación compuesta asociada a MPO destinada a análisis descriptivos posteriores. Se analizaron redes de interacción entre células para comparar los patrones inferidos de comunicación ligando–receptor que involucran células tumorales epiteliales estratificadas según la señal asociada a MPO y diversos tipos celulares compañeros. Estos resultados se interpretaron como patrones descriptivos de comunicación, y no como evidencia de que las células que expresan MPO median directamente la comunicación intercelular.

Supresión virtual a nivel de célula individual de MPO y análisis de enriquecimiento de vías mediante scTenifoldKnk

Se realizó un silenciamiento virtual a nivel de célula individual de MPO mediante la integración de Seurat y scTenifoldKnk. Tras un control de calidad estándar (200–6.000 genes por célula; fracción mitocondrial < 10%), los datos fueron normalizados mediante logaritmo, y se seleccionaron 2.000 genes altamente variables para la reducción de dimensionalidad y agrupamiento. Para enriquecer contextos relevantes para MPO, se conservaron las células que se ubicaron en el 50 % superior de un módulo génico de mieloide/neutrófilo. A partir de estas células, se definió un subconjunto vecino de MPO mediante la expansión desde semillas positivas para MPO utilizando k = 40 vecinos más cercanos en el espacio del PCA. Este subconjunto expandido no fue considerado como una población puramente positiva para MPO, y no se obtuvieron conclusiones sobre la proporción de tipos celulares a partir de este paso de expansión por KNN. Este subconjunto fue sometido a análisis de silenciamiento virtual mediante scTenifoldKnk, utilizando la unión de los genes altamente variables y MPO (expresado en ≥25 células) como conjunto génico. Se identificaron genes significativamente perturbados (FDR < 0,05, ajustado por BH). Los genes resultantes se analizaron posteriormente en cuanto al enriquecimiento funcional en Procesos Biológicos de GO y vías KEGG (q < 0,05).

Recuperación exploratoria de interacciones fármaco-gen y anotación ADMET

Se consultó DGIdb para obtener registros preliminares de interacciones fármaco-gen o químico-gen asociadas a MPO. Dado que las listas de interacciones derivadas de bases de datos pueden incluir entradas respaldadas por tipos heterogéneos de evidencia y pueden no corresponder directamente a agentes terapéuticos clínicamente accionables, los compuestos recuperados se consideraron anotaciones exploratorias en lugar de candidatos a tratamiento prioritarios. Posteriormente, se utilizaron SwissADME y ADMETlab para resumir las propiedades fisicoquímicas, farmacocinéticas y toxicológicas predichas. Estas anotaciones in silico se emplearon para proporcionar un contexto preliminar para la interpretación a nivel de compuesto y para destacar la necesidad de una mayor curación farmacológica, toxicológica y clínica antes de que pueda considerarse alguna relevancia terapéutica³⁶.

Resultados

Patrones de expresión de MPO y asociaciones exploratorias de supervivencia en el cáncer de mama

Para describir los patrones de expresión de MPO en conjuntos de datos de cáncer, analizamos datos de RNA-seq de MPO del conjunto de datos pan-cáncer de TCGA y observamos una expresión más baja de MPO en tejidos tumorales de carcinoma de urotelio de vejiga (BLCA), carcinoma invasivo de mama (BRCA), glioblastoma multiforme (GBM), carcinoma escamoso de cabeza y cuello (HNSC), carcinoma cromófobo renal (KICH), carcinoma hepatocelular (LIHC), adenocarcinoma de pulmón (LUAD), carcinoma escamoso de pulmón (LUSC), adenocarcinoma pancreático (PAAD), adenocarcinoma de próstata (PRAD) y carcinoma tiroideo (THCA), y una expresión más alta de MPO en adenocarcinoma de colon (COAD), carcinoma papilar de riñón (KIRP) y otros tejidos (Figura 2A). Luego evaluamos las asociaciones entre la expresión de MPO y los resultados clínicos en cada tipo de cáncer. En la cohorte TCGA-BRCA, tanto las comparaciones no apareadas como las apareadas mostraron una expresión más baja de MPO en el tejido tumoral que en el tejido normal/adyacente (Figura 2B,C). Tras estratificar las muestras tumorales de TCGA-BRCA utilizando el valor de corte mediano de expresión tumoral de MPO, el análisis de Kaplan-Meier mostró que los pacientes con mayor expresión de MPO tuvieron un intervalo libre de progresión más largo (Hazard Ratio (HR) = 0,67, p = 0,028) (Figura 2D). La supervivencia global (OS) (p = 0,296; Figura suplementaria 1A) y la supervivencia específica de la enfermedad (DSS) (p = 0,18; Figura suplementaria 1B) no fueron estadísticamente significativas. La curva ROC tumor frente a normal sugirió una separación entre los grupos de tejidos en este conjunto de datos (Figura 2E), pero este análisis no debe interpretarse como una validación diagnóstica clínica. Esta discriminación exploratoria puede estar influenciada por el origen de las muestras normales, efectos de lote, pureza tumoral y diferencias en la composición del tejido. La expresión de MPO también se asoció con la etapa patológica T (Figura 2F) y la distribución del subtipo PAM50 (Figura 2G). Se incluyeron imágenes representativas de inmunohistoquímica (IHC) de MPO de tejido mamario normal adyacente y tejido de cáncer de mama como referencias cualitativas a nivel proteico (Figura 2H). Las áreas enmarcadas indican las regiones mostradas con mayor aumento. Las imágenes generales a 20× incluyen barras de escala de 100 µm, mientras que las imágenes con mayor aumento a 40× incluyen barras de escala de 50 µm.

Correlación y análisis de enriquecimiento de MPO en la cohorte TCGA-BRCA cohort

El análisis de correlación de Pearson identificó los 30 genes principales correlacionados positivamente con MPO, que mostraron una regulación positiva coordinada a lo largo del gradiente de expresión de MPO (Figura 3A), mientras que los 30 genes principales correlacionados negativamente exhibieron un patrón de expresión inverso (Figura 3B). A nivel de vía, la expresión de MPO se asoció de manera significativa y positiva con múltiples puntuaciones de firmas relacionadas con tumores, incluyendo la firma de respuesta inflamatoria (r = 0.41; Figura 3C), los marcadores de transición epitelio-mesénquima (EMT) (r = 0.264; Figura 3D) y la puntuación del conjunto de genes relacionados con especies reactivas de oxígeno (ROS) (r = 0.415; Figura 3E), lo que sugiere que la expresión de MPO se asocia con estados transcripcionales inflamatorios/oxidativos y con estados de tipo mesenquimal en la cohorte TCGA-BRCA.

El agrupamiento no supervisado de genes asociados a MPO estratificó aún más los tumores en patrones de expresión que se alinearon con anotaciones clínicas, incluyendo el estadio patológico T y los subtipos intrínsecos PAM50 (Figura 3F). Para explorar la posible conectividad entre los genes asociados a MPO, construimos una red de interacción proteína-proteína (PPI) utilizando STRING, lo que reveló un módulo interconectado entre varios genes correlacionados con MPO (Figura 3G). En la red PPI, ESR1, FOXA1, XBP1, GATA3 y KRT18 presentaron alta conectividad dentro de este módulo derivado de la correlación. Estos resultados identifican genes que varían conjuntamente con la expresión de MPO, pero no establecen la patogénesis relacionada con MPO ni la direccionalidad. El análisis de expresión diferencial entre los grupos con alto y bajo nivel de MPO reveló diferencias transcriptómicas resumidas en el gráfico de volcan (Figura 3H). Se identificaron un total de 1.159 genes regulados positivamente y 854 genes regulados negativamente, proporcionando datos de entrada para análisis de enriquecimiento posteriores.

A continuación, analizamos la relevancia funcional de los genes diferencialmente expresados (DEG) entre los grupos con niveles altos y bajos de MPO utilizando el paquete clusterProfiler en R. El análisis de enriquecimiento de la Ontología Genética (GO) indicó que estos DEG estaban predominantemente implicados en procesos biológicos relacionados con la inmunidad, incluyendo la regulación de la señalización de receptores de superficie celular relacionada con la respuesta inmune y la inmunidad mediada por linfocitos, con enriquecimiento también observado en componentes celulares como el complejo del receptor de células T y funciones moleculares relacionadas con la actividad de activador de receptores (Figura 4A). De manera consistente, el análisis de vías KEGG destacó rutas asociadas a la inmunidad y la inflamación, incluyendo la interacción citocina–receptor de citocina, la señalización de quimioquinas, la señalización del receptor de células T, la citotoxicidad mediada por células asesinas naturales, la diferenciación de Th1/Th2 y Th17, la señalización de NF-κB, la inmunodeficiencia primaria y la red inmunitaria intestinal para la producción de IgA (Figura 4B).

Para integrar aún más la direccionalidad de la expresión con términos funcionales, se utilizó el gráfico GO para calcular puntuaciones Z a nivel de término basadas en los valores |log2FC| de los genes diferencialmente expresados (DEG), lo que nuevamente resaltó programas transcripcionales enriquecidos en inmunidad, tales como respuesta inmune humoral, inmunidad mediada por leucocitos/linfocitos, activación de la respuesta inmune y transducción de señales (Figura 4C). El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) basado en la lista clasificada de genes también mostró enriquecimiento de vías del sistema inmune, incluyendo el sistema inmune adaptativo, interacción citocina–receptor de citocina y desgranulación de neutrófilos (Figura 4D–G). Dado que MPO es un gen asociado a mieloide/neutrófilos, estos enriquecimientos se interpretan como evidencia de que las muestras con alto nivel de MPO exhiben señales transcripcionales inmunes/mieloides más fuertes, más que como evidencia de que MPO remodela por sí mismo el microambiente inmune.

Correlación entre la expresión de MPO y la infiltración de células inmunitarias en el cáncer de mama

Evaluamos la relación entre la expresión de MPO y las características del microambiente tumoral en la cohorte TCGA-BRCA. La aplicación del algoritmo ESTIMATE reveló correlaciones positivas significativas entre la expresión de MPO y la puntuación ESTIMATE (R = 0.347, p < 0.001), la puntuación inmunitaria (R = 0.361, p < 0.001) y la puntuación estromal (R = 0.232, p < 0.001) (Figura 5A). La distribución de estas puntuaciones en las muestras se muestra en la Figura 5B. El análisis utilizando el recurso TIMER/TIMER2.0 indicó que la expresión de MPO se asoció con niveles estimados de infiltración de poblaciones principales de células inmunitarias, incluyendo células B, células T CD8+, neutrófilos, células T CD4+, macrófagos y células dendríticas en la cohorte TCGA-BRCA (Figura 5C). Este patrón de asociación se evaluó además mediante puntuaciones de enriquecimiento de células inmunitarias basadas en ssGSEA para 24 tipos de células inmunitarias. Tras la corrección de la tasa de falsos descubrimientos de Benjamini–Hochberg, la expresión de MPO mostró asociaciones positivas con múltiples puntuaciones de enriquecimiento de células inmunitarias, incluyendo células T, células B, células citotóxicas, subconjuntos de células dendríticas, macrófagos, subconjuntos de células T helper, células T reguladoras, células T CD8+, células NK, mastocitos y neutrófilos (Figura 5D). Estos hallazgos se interpretan como asociaciones con la composición inmunitaria, más que como evidencia de que MPO controle directamente la infiltración de células inmunitarias. Se generó un mapa de calor para visualizar los patrones de enriquecimiento de células inmunitarias a nivel de muestra en la cohorte TCGA-BRCA (Figura 5E). Luego comparamos las puntuaciones de enriquecimiento de células inmunitarias estimadas por ssGSEA entre los grupos de tumores con expresión alta y baja de MPO definidos por la mediana. Varias puntuaciones de enriquecimiento de células inmunitarias difirieron entre ambos grupos, incluyendo células dendríticas activadas (aDC), células B, células T CD8+, células citotóxicas, neutrófilos, células T, Tregs, células Th1, células Th2, células Th17, células T γδ, células T foliculares helper (TFH), células con genes altamente variables (HVG), células T efectoras de memoria, células T centrales de memoria y células T helper (Figura 5F,G). Además, se realizó una desconvolución basada en CIBERSORT utilizando la matriz de firmas LM22 para estimar las fracciones relativas de 22 tipos de células inmunitarias, y los patrones resultantes de composición de células inmunitarias se muestran en la Figura 5H.

Análisis de metilación del ADN de MPO en la cohorte TCGA-BRCA

Utilizando el mismo valor de corte de expresión mediana de MPO en tumores, las muestras de TCGA-BRCA se agruparon en grupos de MPO-alto y MPO-bajo, y se visualizaron los patrones de metilación de ADN para cada grupo (Figura 6A). Algunos sitios CpG seleccionados dentro del locus MPO mostraron asociaciones con la supervivencia en el análisis MethSurv, incluyendo cg22331200, cg14619064 y cg11151395 (Figura 6B–G). Estos resultados relacionados con la metilación se interpretaron como anotaciones epigenéticas exploratorias y requieren validación independiente antes de que se puedan extraer conclusiones pronósticas o mecanicistas.

Asociación entre la expresión de MPO y las redes génicas relacionadas con neutrófilos en el cáncer de mama

Se utilizó la cohorte TCGA-BRCA para examinar la asociación entre la expresión de MPO y los genes relacionados con neutrófilos. Se construyó una red de interacción de proteínas (PPI) basada en STRING para los genes asociados con neutrófilos, y los genes centrales se priorizaron según la topología de la red (Figura 7A). Posteriormente, se evaluó la correlación de los 20 principales genes centrales con la expresión de MPO. Como se muestra en el gráfico de barras con puntos, MPO exhibió predominantemente correlaciones positivas con múltiples mediadores relacionados con neutrófilos, observándose asociaciones más fuertes para componentes de la señalización quimioquínica/inmune innata, como CCL5, CCL2 y TLR2, así como TLR4, CXCR4, TNF y MMP9 (Figura 7B).

Para caracterizar más a fondo el patrón de co-regulación entre estos genes centrales, visualizamos sus relaciones por pares mediante un diagrama de acordes y un mapa de calor de correlación, los cuales revelaron extensas correlaciones positivas entre genes a lo largo del módulo central, lo que es consistente con un programa transcripcional inflamatorio/asociado a neutrófilos coordinado (Figura 7C,D). En conjunto, estos resultados indican que una mayor expresión de MPO va acompañada de una expresión coordinada de una red génica relacionada con neutrófilos en el cáncer de mama.

Anotación de factores de transcripción candidatos para MPO

Para explorar factores de transcripción candidatos potencialmente asociados con MPO, se consultaron y cruzaron recursos públicos de factores de transcripción, incluyendo KnockTF, ChIP-Atlas y GTRD. Los factores de transcripción candidatos se resumieron además mediante análisis de priorización basado en redes y análisis de correlación. Un resumen gráfico se muestra en la Figura Suplementaria 2, y los resultados completos en formato tabular se proporcionan en el Archivo Suplementario 2. Dado que estas bases de datos integran evidencia procedente de contextos experimentales heterogéneos, la superposición entre bases de datos y el grado de red se utilizaron únicamente para la anotación y priorización de candidatos. Estos resultados no se interpretaron como evidencia funcional de una regulación transcripcional directa de MPO en el cáncer de mama. Por lo tanto, los factores candidatos, incluyendo MYC, se presentan como anotaciones exploratorias suplementarias y no como reguladores upstream validados.

Agrupamiento de células individuales y análisis descriptivo de la comunicación célula-célula estratificado por señal de MPO

Para anotar los tipos celulares, primero realizamos un análisis de expresión específico por grupo basado en marcadores canónicos para cada linaje. Se muestran los niveles promedio de expresión y el porcentaje de células que expresan estos genes clave en los grupos, lo que respalda la anotación posterior (Figura 8A). En consecuencia, los grupos celulares anotados se visualizan en un gráfico de proyección y aproximación de variedad uniforme (UMAP), en el que cada población se codifica por colores según su tipo identificado, incluyendo células dendríticas plasmocitoides, células endoteliales, células mioepiteliales, células epiteliales en división, células plasmáticas, células T citotóxicas, células tumorales epiteliales, células B, células T CD4 activadas, monocitos–macrófagos, fibroblastos y células T convencionales (Figura 8B). El mapa de calor muestra los niveles de expresión de genes seleccionados a través de los grupos celulares (C1-C8). Cada fila representa un gen y cada columna representa un grupo celular. El gradiente de color indica los niveles de expresión, siendo el rojo alta expresión y el azul baja expresión. El dendrograma izquierdo agrupa genes con patrones de expresión similares (Figura 8C). La puntuación asociada a MPO se calculó por célula utilizando el conjunto de genes asociados a MPO proporcionado en Archivo Suplementario 1. Se emplearon AUCell, Seurat AddModuleScore y análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de muestra individual (ssGSEA) para calcular las puntuaciones por célula. Las puntuaciones de los tres métodos se normalizaron mediante puntuación Z, se escalaron a un rango comparable y se integraron para obtener una puntuación compuesta asociada a MPO para el análisis descriptivo posterior (Figura 8D).

Este análisis de interacción entre células comparó los patrones de comunicación de ligando-receptor inferidos entre grupos celulares estratificados por la señal asociada a MPO, incluyendo la red de interacciones, los mapas de calor de patrones de señalización, el gráfico de burbujas de señalización saliente y el gráfico de burbujas de señalización entrante (Figura 8E–H). Dado que la señal de MPO era escasa a nivel de célula individual y su distribución aparente entre los tipos celulares anotados podría verse afectada por eventos de ausencia de detección (dropout), ARN ambiental, dobletes e incertidumbre en la anotación, estas representaciones de comunicación deben interpretarse como resultados descriptivos del flujo de trabajo. No demuestran que las células que expresan MPO median o controlen la comunicación intercelular. Se observó señal detectable de MPO en un número limitado de células, incluyendo células tumorales epiteliales anotadas y monocitos-macrófagos (Figura 8I). Dado que MPO está clásicamente asociado a linajes neutrófilos/mioides, este patrón requiere validación en conjuntos de datos independientes de célula única o mediante métodos experimentales ortogonales.

Análisis de sensibilidad exploratorio de scTenifoldKnk basado en células escasas positivas para MPO

Se integraron múltiples muestras de 10x Genomics, seguido de normalización y selección de genes de alta variabilidad (HVG), reducción de dimensionalidad basada en PCA, construcción de un grafo de k vecinos más cercanos y agrupamiento Louvain. Los patrones canónicos de expresión de genes marcadores a través de los grupos se resumieron mediante un DotPlot, lo que apoyó la posterior anotación de tipos celulares (Figura 9A). La visualización UMAP mostró las poblaciones celulares anotadas a nivel individual en el conjunto de datos integrado (Figura 9B). Los marcadores canónicos de linaje (por ejemplo, EPCAM y KRT8/KRT18 para células epiteliales; PTPRC para células inmunitarias; MS4A1 para células B; LST1/S100A8/S100A9 para células mieloides; PECAM1 para células endoteliales; y COL1A1 para linajes de fibroblastos/músculo liso) mostraron patrones de expresión específicos de grupo, lo que respaldó la anotación de tipos celulares (Figura 9C). Gráficos de barras apiladas estratificados por muestra indicaron que cada muestra contenía múltiples grupos con variación entre lotes generalmente limitada (Figura 9D).

La expresión de MPO fue relativamente escasa en el conjunto de datos de célula individual, con solo 85 células positivas para MPO detectadas inicialmente (Figura 9E). Dado este número limitado, la expansión del entorno basada en KNN se utilizó únicamente para definir un subconjunto local de vecindad MPO para un análisis de sensibilidad exploratorio. Este subconjunto expandido no debe interpretarse como una población puramente positiva para MPO, ya que podría incluir células vecinas con expresión de MPO baja o indetectable. Dentro de este subconjunto de vecindad MPO, se realizó un silenciamiento virtual de MPO mediante scTenifoldKnk como análisis computacional de sensibilidad. El gráfico de volcan, el análisis de desplazamiento de la variedad, la visualización del alineamiento de la variedad, los resultados de enriquecimiento de GO/KEGG y los genes con mayor desplazamiento (Figura 9F-N) resaltaron programas transcripcionales candidatos relacionados con la presentación de antígenos, la activación de mieloides/linfocitos, la producción de citoquinas y las vías relacionadas con el fagosome. Estos resultados deben interpretarse como salidas exploratorias de sensibilidad transcripcional, y no como evidencia directa de que MPO regule mecanísticamente estas vías en el cáncer de mama. Serán necesarios conjuntos de datos independientes de célula individual y validación experimental ortogonal, como inmunohistoquímica, citometría de flujo, qPCR o ensayos funcionales, para respaldar estas observaciones.

Recuperación exploratoria de interacciones fármaco-gen y anotación ADMET

Como una extensión exploratoria del análisis centrado en MPO, se recuperó información sobre interacciones fármaco-gen de DGIdb. Un resumen gráfico se muestra en la Figura Suplementaria 3, y los resultados a nivel de compuestos se proporcionan en la Tabla Suplementaria 3. La consulta a DGIdb devolvió un conjunto heterogéneo de entradas químicas asociadas a MPO, incluyendo compuestos con plausibilidad clínica limitada o perfiles toxicológicos desfavorables. Por lo tanto, estos compuestos derivados de bases de datos no se consideraron candidatos terapéuticos para el cáncer de mama según el presente análisis. Se resumió información relacionada con ADMET para proporcionar una anotación preliminar de las propiedades fisicoquímicas, farmacocinéticas y toxicológicas predichas. La recuperación de compuestos basada en bases de datos y la anotación ADMET no equivalen a una priorización clínica de fármacos. Por consiguiente, estos resultados sirven únicamente como anotaciones químicas de nivel de cribado e ilustran la necesidad de un filtrado cuidadoso farmacológico, toxicológico y clínico antes de que cualquier compuesto pueda considerarse para investigación terapéutica. Los hallazgos principales de este estudio se centran en la asociación entre la expresión de MPO y características transcripcionales relacionadas con el sistema inmunitario y mieloide.

DISPONIBILIDAD DE LOS DATOS:

Los datos transcriptómicos y clínicos de TCGA-BRCA se obtuvieron del portal Genomic Data Commons (https://portal.gdc.cancer.gov; descargado el 26 de agosto de 2025; versión/liberación de datos 202208). El conjunto de datos de célula individual GSE161529 se obtuvo del Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161529). No se generaron nuevos datos de secuenciación en este estudio. Los scripts de análisis están disponibles públicamente en https://github.com/tengfeitcm/MPO.

Diagrama de flujo del análisis multi-ómico, comunicación celular, expresión de MPO e integración de datos clínicos.
Figura 1: Diagrama de flujo del proceso de recopilación y análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Investigación sobre el cáncer de mama; gráficos de barras de expresión de MPO, curva de supervivencia, ROC, análisis de imágenes de histología.
Figura 2: Patrones de expresión de MPO y asociaciones exploratorias de supervivencia en el cáncer de mama. (A) Los niveles de expresión de MPO se analizaron en 33 tipos distintos de cáncer y sus tejidos normales adyacentes utilizando la base de datos TCGA. (B) Se seleccionaron muestras no apareadas del conjunto de datos TCGA-BRCA para analizar la expresión de ARNm de MPO en tejidos de cáncer de mama y tejidos normales. (C) Se seleccionaron muestras apareadas del conjunto de datos TCGA-BRCA para analizar la expresión de ARNm de MPO en tejidos de cáncer de mama y tejidos normales. (D) Análisis de Kaplan-Meier del intervalo libre de progresión (PFI) en pacientes estratificados según el punto de corte mediano de expresión tumoral de MPO en la cohorte TCGA-BRCA. (E) Curva ROC exploratoria para evaluar la discriminación entre tumor y tejido normal basada en la expresión de MPO en el conjunto de datos transcriptómicos públicos analizado. (F) Expresión de MPO en diferentes estadios patológicos T. (G) Expresión de MPO en los subtipos moleculares PAM50, con las etiquetas de los subtipos indicadas. (H) Imágenes representativas de inmunohistoquímica (IHC) de MPO en tejido mamario normal adyacente y tejido de cáncer de mama. Las áreas enmarcadas indican las regiones mostradas con mayor aumento. Las imágenes generales a 20× incluyen barras de escala de 100 µm, mientras que las imágenes de mayor aumento a 40× incluyen barras de escala de 50 µm. Estas imágenes se muestran como referencias cualitativas a nivel proteico y no se utilizaron para análisis morfométricos cuantitativos ni estadísticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráficos de análisis de expresión génica y diagrama de red, mapas de calor, gráficos de dispersión y gráficos de volcán.
Figura 3: Análisis de correlación y expresión diferencial asociada a MPO en el cáncer de mama. (A) Los 30 principales genes codificantes positivamente correlacionados con la expresión de MPO a nivel de ARNm, basados en los coeficientes de correlación de Pearson obtenidos de la base de datos TCGA. (B) Los 30 principales genes codificantes negativamente correlacionados con la expresión de MPO a nivel de ARNm, basados en los coeficientes de correlación de Pearson. (C) Gráficos de dispersión que ilustran las correlaciones de Spearman entre MPO y los genes sobreexpresados por la respuesta inflamatoria. (D) Gráficos de dispersión que ilustran las correlaciones de Spearman entre MPO y los genes sobreexpresados por los marcadores de transición epitelio-mesénquima (EMT). (E) Gráficos de dispersión que ilustran las correlaciones de Spearman entre MPO y los genes sobreexpresados por las especies reactivas de oxígeno (ROS). (F) Mapa de calor de los grupos de genes asociados a MPO basado en la significancia clínica (estadio T y PAM50). (G) Red de interacción de proteínas (PPI) predicha mediante la base de datos STRING para las proteínas asociadas a MPO. (H) Gráfico de volcán de los genes con expresión diferencial entre los grupos de tumores con niveles altos y bajos de MPO, definidos por la mediana, en la cohorte TCGA-BRCA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagramas de análisis de enriquecimiento genético con vías y categorías de ontología; gráficos de barras y gráficos lineales.
Figura 4: Análisis de enriquecimiento de MPO en cáncer de mama. (A) Análisis de enriquecimiento de Ontología Genética de los 2.013 genes con expresión diferencial entre los grupos con alto y bajo nivel de MPO. (B) Análisis de enriquecimiento de vías del Enciclopedia de Kyoto de Genes y Genomas (KEGG) de los 2.013 genes con expresión diferencial. (C) Visualización integrada del enriquecimiento de Ontología Genética que combina términos enriquecidos con la dirección de la expresión diferencial y los valores de |log2FC|. (D) Gráfico representativo de enriquecimiento GSEA para un conjunto de genes relacionados con la inmunidad asociado a MPO; en el panel se muestra el nombre del conjunto de genes, la puntuación de enriquecimiento normalizada y el valor q de FDR. (E) Gráfico representativo de enriquecimiento GSEA para un conjunto adicional de genes relacionados con la inmunidad asociado a MPO; en el panel se muestra el nombre del conjunto de genes, la puntuación de enriquecimiento normalizada y el valor q de FDR. (F) Gráfico representativo de enriquecimiento GSEA para un conjunto adicional de genes relacionados con la inmunidad asociado a MPO; en el panel se muestra el nombre del conjunto de genes, la puntuación de enriquecimiento normalizada y el valor q de FDR. (G) Gráfico representativo de enriquecimiento GSEA para un conjunto adicional de genes relacionados con la inmunidad asociado a MPO; en el panel se muestra el nombre del conjunto de genes, la puntuación de enriquecimiento normalizada y el valor q de FDR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráficos de análisis de expresión génica, papel de la MPO en la infiltración de células inmunitarias, correlación y visualización de datos.
Figura 5: Correlación entre el enriquecimiento de células inmunitarias y la expresión de MPO en el cáncer de mama. (A) Gráficos de dispersión que muestran las correlaciones entre la expresión de MPO y la puntuación ESTIMATE, la puntuación inmunitaria y la puntuación estromal. (B) Gráficos de caja que muestran las diferencias en la puntuación ESTIMATE, la puntuación inmunitaria y la puntuación estromal entre los grupos de tumores con MPO alta y baja definidos por la mediana. (C) Análisis basado en TIMER/TIMER2.0 que muestra las asociaciones entre la expresión de MPO y la infiltración estimada de principales poblaciones de células inmunitarias. (D) Gráfico de bastones (lollipop) que muestra las correlaciones de Spearman entre la expresión de MPO y las puntuaciones de enriquecimiento estimadas mediante ssGSEA para 24 tipos de células inmunitarias. Los valores p procedentes de múltiples correlaciones de células inmunitarias se ajustaron utilizando el método de tasa de falsos descubrimientos de Benjamini–Hochberg. (E) Mapa de calor que ilustra los patrones de enriquecimiento de células inmunitarias a nivel de muestra en la cohorte TCGA-BRCA. (F) Gráficos de caja que muestran el primer conjunto de diferencias en las puntuaciones de enriquecimiento de células inmunitarias estimadas mediante ssGSEA entre los grupos de tumores con MPO alta y baja definidos por la mediana; las comparaciones entre grupos se realizaron utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon con corrección de Benjamini–Hochberg. (G) Gráficos de caja que muestran el segundo conjunto de diferencias en las puntuaciones de enriquecimiento de células inmunitarias estimadas mediante ssGSEA entre los grupos de tumores con MPO alta y baja definidos por la mediana; las comparaciones entre grupos se realizaron utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon con corrección de Benjamini–Hochberg. (H) Gráfico de barras apiladas que muestra las fracciones de células inmunitarias estimadas mediante CIBERSORT basadas en la matriz de firma LM22 para 22 tipos de células inmunitarias en los grupos de tumores con MPO baja y alta definidos por la mediana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Mapa de calor de patrones de metilación del ADN y gráficos de análisis de supervivencia para el estudio de expresión génica.
Figura 6: Análisis de metilación del ADN del gen MPO en el cáncer de mama. (A) Mapa de calor que muestra los patrones de metilación de MPO en los grupos definidos por mediana como MPO-alto y MPO-bajo. (B) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que demuestra la significancia pronóstica de la metilación en el sitio cg27456487. (C) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que demuestra la significancia pronóstica de la metilación en el sitio cg02668773. (D) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que demuestra la significancia pronóstica de la metilación en el sitio cg07110356. (E) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que demuestra la significancia pronóstica de la metilación en el sitio cg11151395. (F) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que demuestra la significancia pronóstica de la metilación en el sitio cg14619064. (G) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier que demuestra la significancia pronóstica de la metilación en el sitio cg22331200. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis de red de expresión génica; diagrama, gráfico, resultados de correlación; datos de interacción de proteínas.
Figura 7: Análisis de las correlaciones entre MPO y genes relacionados con neutrófilos a nivel de ARNm utilizando la base de datos TCGA. (A) Visualización de la red de interacción de proteínas, que muestra las interacciones entre la proteína central y otras proteínas. (B) Análisis de correlación de los 20 principales genes relacionados con neutrófilos con MPO, que muestra los coeficientes de correlación y las distribuciones de valores P para diferentes genes. (C) Diagrama de acordes de las correlaciones entre los 20 principales genes relacionados con neutrófilos, representando visualmente la intensidad y dirección de las asociaciones génicas. (D) Mapa de calor de correlación de los 20 principales genes relacionados con neutrófilos, que muestra los coeficientes de correlación y los niveles de significancia mediante gradientes de color y marcadores estadísticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Agrupaciones celulares y análisis de expresión; gráficos, mapas de calor y diagrama de red; datos de secuenciación de ARN.
Figura 8: Agrupamiento a nivel de célula individual y análisis de comunicación célula-célula asociado a MPO en el conjunto de datos de cáncer de mama a nivel de célula individual. (A) DotPlot de genes marcadores canónicos en los grupos para la anotación de tipos celulares. (B) Visualización UMAP de las poblaciones celulares anotadas. (C) Mapa de calor de genes marcadores seleccionados en los grupos celulares. (D) DotPlot que resume las puntuaciones asociadas a MPO en los tipos celulares anotados, calculadas mediante AUCell, ssGSEA y Seurat AddModuleScore, basadas en el conjunto de genes proporcionado en Archivo Suplementario 1. (E) Red de interacción célula-célula que muestra la comunicación entre células tumorales epiteliales estratificadas por señal asociada a MPO y otros tipos celulares; el ancho de las aristas representa la intensidad de la interacción y el tamaño de los nodos refleja la actividad general de interacción. (F) Mapas de calor que muestran los patrones de señalización entrantes y salientes entre los tipos celulares. (G) Gráfico de burbujas de las vías de señalización salientes desde las células tumorales epiteliales estratificadas por señal asociada a MPO hacia otros tipos celulares. (H) Gráfico de burbujas de las vías de señalización entrantes desde otros tipos celulares hacia las células tumorales epiteliales estratificadas por señal asociada a MPO. (I) Distribución de la expresión de MPO en los tipos celulares anotados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagramas de agrupamiento UMAP, mapa de calor de expresión génica, gráficos de barras y gráfico de volcán para el análisis de datos.
Figura 9: Análisis del atlas de célula individual y análisis exploratorio de inhibición virtual de la salida de sensibilidad a MPO. (A) DotPlot que muestra la expresión de genes marcadores canónicos en los grupos de células individuales; el tamaño del punto representa el porcentaje de células que expresan cada marcador, y la intensidad del color representa el nivel promedio de expresión. (B) Visualización UMAP de las poblaciones de células individuales anotadas, donde cada color representa un tipo celular o grupo distinto. (C) Visualización UMAP de la expresión de genes marcadores clave, que muestra la distribución de expresión de los genes marcadores para los tipos celulares, incluidas las células mieloides. (D) Gráfico de barras apiladas de las proporciones de grupos celulares en las muestras. (E) Visualización UMAP de la expresión del gen MPO. (F) Gráfico de violín que muestra las métricas de control de calidad del secuenciamiento a nivel de célula individual. (G) Gráfico de agrupamiento de genes marcadores clave. (H) DotPlot de genes marcadores canónicos a nivel de grupo. (I) Gráfico de volcán de los genes modificados en el análisis de sensibilidad de inhibición virtual. (J) Gráfico de dispersión del desplazamiento frente a significancia. (K) Gráfico de flechas de alineación de variedades. (L) Análisis de enriquecimiento GO BP de los genes obtenidos en la salida de la inhibición virtual. (M) Análisis de enriquecimiento de vías KEGG de los genes obtenidos en la salida de la inhibición virtual. (N) Los 20 genes con mayor desplazamiento de la variedad tras excluir MPO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Análisis adicionales de supervivencia para MPO en la cohorte TCGA-BRCA. (A,B) Este archivo contiene análisis suplementarios de supervivencia de Kaplan-Meier para (A) supervivencia global y (B) supervivencia específica de la enfermedad, estratificados según el valor umbral de expresión mediana de MPO en el tumor. Estos análisis se proporcionan como análisis suplementarios de resultados complementarios a la Figura 2D y no fueron estadísticamente significativos en la cohorte actual.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Anotación exploratoria de factores de transcripción candidatos para MPO. (A) Diagrama de Venn que muestra la intersección de factores de transcripción candidatos procedentes de tres recursos públicos de factores de transcripción. (B) Resultado de la comparación de expresión de MYC. (C) Mapa térmico de correlación de factores de transcripción con etiquetas de filas y columnas. (D) Resultado de la correlación entre MPO y MYC. (E) Resultado del análisis de supervivencia de MYC. (F) Resultado de la curva ROC de MYC. Las salidas relacionadas con MYC se muestran únicamente como anotaciones suplementarias de factores de transcripción candidatos y no se utilizan para respaldar conclusiones mecanicistas sobre reguladores ascendentes.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3: Resultados exploratorios de recuperación de genes y fármacos desde DGIdb para MPO. Los nodos grises representan el gen MPO, los nodos naranjas representan entradas recuperadas de moléculas pequeñas y las líneas de conexión indican relaciones predichas entre fármacos y genes según la base de datos.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Matriz de firma de células inmunitarias LM22 utilizada para el análisis de desconvolución de células inmunitarias basado en CIBERSORT de 22 tipos de células inmunitarias. Los símbolos de los genes fueron armonizados, se eliminaron las entradas duplicadas y los genes disponibles se intersectaron con las matrices de expresión correspondientes de TCGA-BRCA o GSE161529 antes del análisis posterior.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Lista de genes relacionados con neutrófilos utilizada para el análisis de STRING/PPI, la priorización de genes centrales y el análisis de correlación entre MPO y genes centrales. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 3: Resultados exploratorios de recuperación de interacciones fármaco–gen mediante DGIdb y anotaciones ADMET para MPO. Este archivo contiene registros de interacciones químico-gen asociadas a MPO recuperados mediante DGIdb, así como anotaciones a nivel de compuesto predichas relacionadas con propiedades fisicoquímicas, farmacocinéticas y toxicológicas. Estos resultados se proporcionan únicamente como anotaciones químicas preliminares y no deben interpretarse como listas de candidatos terapéuticos. No establecen inhibición de MPO, interacción con el blanco, especificidad del ligando, selectividad, seguridad, eficacia terapéutica ni idoneidad clínica. Los valores en esta tabla representan parámetros fisicoquímicos predichos y características de tipo fármaco para los compuestos listados. El peso molecular se expresa en gramos por mol (g/mol). Los valores de aceptores e donadores de enlaces de hidrógeno indican el número predicho de aceptores y donadores de enlaces de hidrógeno, respectivamente. El coeficiente de partición octanol–agua de Moriguchi indica la lipofilicidad predicha. Las violaciones de Lipinski indican el número de criterios de la regla de cinco de Lipinski que no cumple cada compuesto. La puntuación de biodisponibilidad representa la puntuación predicha relacionada con la biodisponibilidad oral, y el área superficial topológica se refiere al área polar superficial topológica predicha.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo Suplementario 1: Lista de genes asociados a MPO utilizada para la puntuación de firmas en células individuales con AUCell, Seurat AddModuleScore y ssGSEA. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo Suplementario 2: Resultados exploratorios de anotación de factores de transcripción y miARN candidatos para MPO. Este archivo contiene resultados de anotación de factores de transcripción y miARN candidatos derivados de bases de datos, basados en recursos públicos, incluyendo KnockTF, ChIP-Atlas, GTRD y TargetScan. Estas anotaciones se proporcionan únicamente para la priorización exploratoria de candidatos y no deben interpretarse como evidencia funcional de regulación ascendente de MPO en el cáncer de mama.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este estudio presenta un conjunto de datos público exploratorio y un flujo de trabajo in silico para examinar las asociaciones entre la expresión de MPO y las características inmunitarias/mieloides en el cáncer de mama. Los análisis de TCGA-BRCA mostraron que la expresión de MPO era menor en los tejidos tumorales que en los tejidos adyacentes no tumorales, y que una mayor expresión de MPO se asoció con un intervalo libre de progresión más largo. Sin embargo, la supervivencia global y la supervivencia específica de la enfermedad no fueron estadísticamente significativas. Por lo tanto, la MPO no debe interpretarse como un biomarcador pronóstico sólido o establecido según las evidencias actuales. Estudios futuros deberían evaluar la MPO mediante modelos de regresión de Cox multivariable ajustados por variables clínico-patológicas establecidas, cohortes de validación independientes y análisis estratificados por subtipos.

En comparación con el análisis convencional de expresión diferencial de una sola cohorte o la estimación de infiltración inmunitaria en una sola plataforma, este flujo de trabajo centrado en MPO integra transcriptómica masiva, enriquecimiento inmunitario, anotación de metilación, mapeo a nivel de célula individual y perturbación virtual para ofrecer una visión exploratoria más amplia de las características inmunitarias/mieloides asociadas a MPO. Sin embargo, este flujo de trabajo sigue siendo complementario, y no un sustituto, de la validación en cohortes externas, la validación espacial o a nivel proteico, y los ensayos experimentales de perturbación.

Los resultados de infiltración inmunitaria y enriquecimiento deben interpretarse como un contexto inmunitario asociado a MPO, y no como una remodelación inmunitaria impulsada por MPO. La MPO se expresa predominantemente en neutrófilos y otras células de linaje mieloide³⁷. Por lo tanto, las correlaciones positivas entre la expresión de MPO y las puntuaciones ESTIMATE, las puntuaciones inmunitarias, las puntuaciones de enriquecimiento de células inmunitarias, los genes relacionados con neutrófilos, las vías de citoquinas, las firmas de presentación de antígenos o las vías de desgranulación de neutrófilos son biológicamente plausibles y podrían reflejar en gran medida diferencias en la abundancia de células inmunitarias/mieloides dentro de muestras tumorales totales. Esta interpretación es coherente con estudios previos que muestran que la infiltración de neutrófilos positivos para MPO se asocia con un pronóstico favorable en el cáncer de mama, y que se ha implicado a la MPO en la función de las células dendríticas y en la inflamación tisular mediada por linfocitos T³⁸^,³⁹. Los datos de ARN-seq en muestras totales no pueden determinar si la MPO tiene una actividad intrínseca en las células tumorales o si la señal observada refleja principalmente células inmunitarias infiltradas. Serían necesarios conjuntos de datos independientes de célula individual, perfiles espaciales, inmunohistoquímica, citometría de flujo o modelos experimentales basados en perturbaciones para aclarar el origen celular y la función.

El análisis de célula individual proporciona información descriptiva adicional, pero sigue limitado por la detección escasa de MPO. Inicialmente se detectaron solo 85 células positivas para MPO antes de la expansión del entorno basada en KNN. Aunque la expansión KNN permitió un análisis de sensibilidad de las células en el entorno transcripcional local de las células positivas para MPO, este procedimiento podría incluir células que no expresan directamente MPO. Por consiguiente, la salida de silenciamiento virtual scTenifoldKnk debe interpretarse como un análisis computacional exploratorio de sensibilidad, más que como evidencia de regulación de vías mediada por MPO⁴⁰. Será necesario validar estos hallazgos en conjuntos de datos independientes de cáncer de mama a nivel de célula individual y mediante ensayos experimentales ortogonales antes de poder extraer conclusiones mecanicistas.

El análisis del factor de transcripción también debe interpretarse con cautela. La superposición de las predicciones de KnockTF, GTRD y ChIP-Atlas, seguida de la priorización basada en grado, puede proponer factores de transcripción candidatos, pero no puede establecer una regulación transcripcional funcional de MPO en el cáncer de mama. Por lo tanto, MYC y otros factores candidatos se conservaron únicamente como anotaciones exploratorias. Dado que la actividad del factor de transcripción es altamente dependiente del contexto y puede variar según el subtipo tumoral, la composición celular, la plataforma del ensayo y la estrategia de preprocesamiento, sería necesaria una validación específica del contexto antes de asignar a cualquier factor candidato un papel regulador upstream. Dicha validación debería incluir ChIP-qPCR o ChIP-seq, ensayos de promotor reportero y la perturbación del factor de transcripción seguida de la medición de la expresión de MPO.

La recuperación de interacciones fármaco-gen y la anotación ADMET también deben interpretarse con cautela. DGIdb puede devolver asociaciones químico-gen heterogéneas, incluyendo compuestos que no son ligandos selectivos para MPO y que podrían tener plausibilidad clínica limitada o propiedades toxicológicas desfavorables³⁶. Las predicciones ADMET proporcionan anotaciones químicas preliminares, pero no establecen interacción con el blanco, potencia, selectividad, seguridad ni eficacia terapéutica⁴¹. Por lo tanto, los resultados actuales a nivel de compuesto no deben utilizarse para inferir potencial terapéutico. Una evaluación traslacional significativa requeriría un conjunto curado de inhibidores o sondas de MPO farmacológicamente relevantes, comparación con compuestos establecidos que actúen sobre MPO y validación mediante ensayos bioquímicos, celulares y farmacológicos. También debe considerarse el papel dependiente del contexto y potencialmente dual de MPO en el cáncer al interpretar hallazgos relacionados con fármacos. MPO puede contribuir a procesos que promueven el tumor mediante estrés oxidativo, generación de oxidantes reactivos, daño al ADN, inflamación crónica y remodelación del microambiente tumoral. Al mismo tiempo, la expresión de MPO en conjuntos de datos tumorales agregados puede reflejar la infiltración por neutrófilos u otras células inmunitarias mieloides, que en algunos contextos podrían asociarse con un microambiente inmunológicamente activo y resultados clínicos más favorables³⁹^,⁴². Por lo tanto, la interpretación biológica de MPO depende del tipo de tumor, la fuente celular, la etapa de la enfermedad y la composición de células inmunitarias.

Los hallazgos sobre metilación del ADN en el locus MPO también se consideraron exploratorios. Algunos sitios CpG seleccionados mostraron asociaciones con la supervivencia en el análisis MethSurv, pero estos resultados requieren validación independiente antes de que se puedan extraer conclusiones pronósticas o mecanicistas. La regulación epigenética de MPO podría interactuar con la unión de factores de transcripción y la regulación a nivel de cromatina, pero dichas interacciones permanecen especulativas sin datos funcionales de cromatina o de perturbación⁴³.

Las implicaciones clínicas de la expresión de MPO deben interpretarse con cautela. Los resultados actuales no establecen a MPO como un biomarcador clínicamente accionable ni como un marcador que pueda guiar actualmente las decisiones de inmunoterapia en el cáncer de mama. Más bien, MPO podría reflejar un contexto inmunitario relacionado con los mieloides/neutrófilos dentro del microambiente tumoral. En estudios futuros, la expresión de MPO podría evaluarse junto con marcadores establecidos relacionados con inmunoterapia, incluyendo linfocitos infiltrantes del tumor, expresión de PD-L1, expresión génica de puntos de control inmunitarios, subtipo molecular y firmas inmunitarias validadas. Dichos análisis deberían incluir cohortes independientes, modelos multivariables y conjuntos de datos de respuesta al tratamiento antes de que MPO pueda considerarse para la estratificación de pacientes o la toma de decisiones en inmunoterapia.

Varios pasos del flujo de trabajo son fundamentales para la reproducibilidad, incluyendo el preprocesamiento consistente de los datos de TCGA-BRCA, la agrupación basada en la mediana solo en tumores MPO-alto/MPO-bajo, umbrales estadísticos predefinidos y corrección por pruebas múltiples, algoritmos y conjuntos de firmas para el enriquecimiento de células inmunitarias, control de calidad y anotación de células individuales, expansión del entorno basada en KNN para MPO y el manejo exploratorio de los resultados de silenciamiento virtual y de DGIdb/ADMET. Los cambios en estos parámetros pueden afectar los resultados y su interpretación posteriores; por lo tanto, deben informarse y reproducirse cuidadosamente. Para la resolución de problemas, las salidas inconsistentes deben abordarse verificando la fuente de las muestras, la normalización de la expresión, el umbral de agrupación, la corrección por pruebas múltiples, los conjuntos de firmas de células inmunitarias, el control de calidad y la anotación de células individuales, la definición del entorno KNN, los umbrales de silenciamiento virtual, los cortes de enriquecimiento y los registros heterogéneos de compuestos en DGIdb/ADMET.

Se deben reconocer varias limitaciones de este estudio. En primer lugar, este estudio se basó en análisis retrospectivos de bases de datos públicas utilizando TCGA-BRCA y datos individuales de células disponibles públicamente, por lo que podría verse afectado por la heterogeneidad de la cohorte, diferencias en el origen de las muestras, efectos de lote, anotaciones clínicas incompletas y diferencias en la composición tumoral. En segundo lugar, los hallazgos actuales se derivan principalmente de asociaciones transcriptómicas y análisis in silico, y carecen de validación experimental directa. Por lo tanto, las asociaciones observadas entre la expresión de MPO, características inmunitarias/mieloides, anotaciones de metilación, candidatos de factores de transcripción y resultados de silenciamiento virtual no deben interpretarse como mecanismos causales. En tercer lugar, la detección de MPO en el conjunto de datos de célula individual fue escasa, con solo 85 células positivas para MPO detectadas antes de la expansión del entorno basada en KNN. El subconjunto expandido del entorno de MPO puede incluir células con expresión baja o indetectable de MPO y no debe considerarse una población pura de células positivas para MPO. En cuarto lugar, dado que MPO está predominantemente asociada con neutrófilos y otras células de linaje mieloide, las señales relacionadas con MPO en los datos de ARN-seq masivo podrían estar confundidas por la abundancia de células inmunitarias, la pureza tumoral y la composición celular, en lugar de reflejar una actividad intrínseca de las células tumorales. Por último, la recuperación de interacciones fármaco-gen basada en DGIdb y la anotación ADMET fueron únicamente anotaciones químicas exploratorias. Estos resultados no establecen la inhibición de MPO, la interacción con el blanco, la selectividad, la seguridad, la eficacia terapéutica ni la idoneidad clínica. Se requieren estudios futuros que utilicen cohortes independientes, validación espacial o a nivel proteico y experimentos funcionales para confirmar la relevancia biológica y clínica de estos hallazgos.

En resumen, los análisis actuales de conjuntos de datos públicos respaldan una asociación entre la expresión de MPO y características transcripcionales inmunitarias/mieloides en el cáncer de mama, siendo una mayor expresión de MPO asociada con un intervalo libre de progresión más largo en la cohorte analizada. Los hallazgos siguen siendo exploratorios y generadores de hipótesis. No se establece que MPO regule causalmente el microentorno inmunitario tumoral, que MYC regule funcionalmente a MPO, ni que los compuestos recuperados tengan relevancia terapéutica. Las principales contribuciones de este estudio son un flujo de trabajo computacional reproducible y un conjunto de hipótesis comprobables que requieren validación en cohortes externas y confirmación experimental.

Divulgaciones

Los autores no declaran conflictos de intereses en este trabajo. Una herramienta de edición basada en inteligencia artificial se utilizó únicamente para ayudar en el perfeccionamiento y la legibilidad del idioma inglés durante la revisión del manuscrito. La herramienta no se utilizó para el diseño del estudio, el análisis de datos, la generación de figuras, la interpretación de resultados, la selección de referencias ni para formular conclusiones científicas. Todos los análisis, resultados, interpretaciones, referencias y el texto final fueron cuidadosamente verificados, revisados y aprobados por los autores, quienes asumen toda la responsabilidad sobre el contenido del manuscrito.

Agradecimientos

Los autores agradecen sinceramente el apoyo financiero del Fondo de Investigación Científica del Hospital del Centro Aeroespacial (YN202530).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CellChat	Paquete R/Código abierto	https://github.com/sqjin/CellChat	Análisis de comunicación entre células
ChIP-Atlas	Base de datos pública	https://chip-atlas.org/	Búsqueda de dianas de factores de transcripción; actualización de 2021
clusterProfiler	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	Análisis de enriquecimiento GO/KEGG; v4.4.4
Cytoscape	Consortium Cytoscape	https://cytoscape.org/	Visualización y análisis de topología de redes
DGIdb	Universidad de Washington/Base de datos pública	https://www.dgidb.org/	Recuperación de interacciones fármaco-gen
GDC/TCGA-BRCA	Instituto Nacional del Cáncer	https://portal.gdc.cancer.gov/	Fuente de datos transcriptómicos masivos y clínicos
Gene Expression Omnibus: GSE161529	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/	Fuente de conjunto de datos de célula única
GSEA/MSigDB	Instituto Broad	https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb	Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes y referencia de conjuntos de genes; Versión 3.0
GSVA	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/GSVA/	Puntuación relacionada con variación de conjuntos de genes/ssGSEA; Versión 1.46.0
GTRD	Base de datos pública	http://gtrd.biouml.org/	Búsqueda de dianas de factores de transcripción; 2021
KnockTF	Base de datos pública	http://www.licpathway.net/KnockTF/index.html	Recurso de perturbación de factores de transcripción; Versión 2.0
R	Foundation R para la Computación Estadística	https://www.r-project.org/	Entorno de computación estadística
scTenifoldKnk	Paquete R/Código abierto	https://github.com/cailab-tamu/scTenifoldKnk	Análisis de silenciamiento virtual
Seurat	Paquete R/Código abierto	https://satijalab.org/seurat/	Preprocesamiento y agrupamiento de células individuales
STRING	ELIXIR/Base de datos pública	https://string-db.org/	Análisis de interacción proteína-proteína; v11
SwissADME	Instituto SIB Suizo de Bioinformática	http://www.swissadme.ch/	Evaluación de perfil farmacológico; lanzamiento de 2017/herramienta web
TIMER	Recurso web público	https://timer.cistrome.org/	Análisis de infiltración inmune; TIMER2.0
UCSC Xena o portal TCGA vinculado	UCSC	https://xenabrowser.net/	Acceso y validación exploratoria de datos

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