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Una única dosis intravenosa de brucella atenuada productora de indol en ratones NOD: evaluación del inicio de la diabetes tipo 1 y remodelación inmunitaria en islotes

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DOI:

10.3791/71193

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26 de mayo de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A'M University Health Science Center, 2Department of Veterinary Pathobiology, College of Veterinary Medicine ' Biomedical Sciences, Texas A'M University, 3Bond Life Sciences Center, The University of Missouri

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la administración intravenosa de una cepa atenuada de Brucella melitensis productora de indol a ratones NOD/ShiLtJ, seguida de monitorización longitudinal de la diabetes, histología pancreática y secuenciación opcional de proteómica espacial de alto plexo y secuenciación de ARN unicelular para evaluar la reprogramación inmunitaria en islotes.

Resumen

La diabetes tipo 1 (DT1) resulta de la destrucción autoinmune de las células β pancreáticas, y las terapias actuales no logran restaurar una tolerancia inmunitaria duradera. Las bacterias metabólicamente modificadas que producen metabolitos inmunomoduladores representan una estrategia terapéutica prometedora de dosis única. Aquí, este artículo presenta un protocolo integral en el que se utiliza una única administración intravenosa de una cepa atenuada de Brucella melitensis productora de indol, BmΔvjbR::tnaA, para evaluar los efectos sobre el inicio de la diabetes autoinmune en ratones prediabéticos NOD/ShiLtJ.

El protocolo comienza preparando BmΔvjbR::tnaA a partir de stocks de glicerol congelados, cultivándolo en medio selectivo hasta la fase media logarítmica y calculando las unidades formadoras de colonias basándose en la densidad óptica. Las ratones NOD hembras, de <5 semanas, son sujetadas sin anestesia y inyectadas por vía intravenosa mediante vena lateral caudal con una dosis bacteriana definida en suero salino protegido con fosfato, mientras se mantienen en almohadillas térmicas. La glucosa en sangre se monitoriza dos veces por semana tras un ayuno de 2 horas durante 70–105 días, definiéndose la diabetes como glucosa ≥250 mg/dL en dos lecturas consecutivas. En los extremos experimentales, el páncreas extraído se fija en formalina amortiguada en neutral durante 72 horas, se incrusta en parafina y se secciona para la tinción de hematoxilina y eosina, inmunohistoquímica de insulina y cuantificación total del área de islotes. Se presentan secciones incrustadas en parafina fijadas en formalina para proteómica espacial con un panel de anticuerpos de 25 marcadores para visualizar poblaciones inmunes reguladoras y efectoras. Finalmente, el tejido pancreático fresco se somete a aislamiento unicelular, preparación de bibliotecas 3′, secuenciación y análisis bioinformático basados en Seurat para perfilar cambios transcripcionales en poblaciones inmunitarias y estromales.

Este protocolo integrado permite la administración reproducible de terapia bacteriana de dosis única y la caracterización multimodal de la remodelación inmunitaria de islotes, proporcionando un marco para probar microbios metabolitos modificados por metabolitos en modelos autoinmunes y diseccionar mecanismos inmunitarios específicos de tejidos a resolución unicelular.

Introducción

La diabetes tipo 1 (T1D) es una enfermedad autoinmune crónica caracterizada por la destrucción mediada por el sistema inmunitario de las células pancreáticas β productoras de insulina, lo que conduce a una dependencia de insulina de por vida y a un mayor riesgo de complicacionesvasculares 1. El ratón NOD/ShiLtJ recapitula características clave de la diabetes autoinmune humana, incluyendo la insulitis espontánea y la progresión hacia la diabetes abierta, y se utiliza ampliamente como modelo preclínico para estudios mecanicistas yterapéuticos 1,2,3. Las terapias actuales para la DT1 —incluidos fármacos inmunosupresores, anticuerpos monoclonales y terapias adoptivas de células T regulatorias (Treg)— pueden ralentizar transitoriamente la progresión de la enfermedad, pero a menudo no logran restaurar duradamente la tolerancia inmunitaria ni mantener la preservación sostenida de la masa β celular 1,2,4,5,6,7,8,9,10, 11.

Dirigirse a Tregs y otras poblaciones reguladoras es un foco principal de las terapias emergentes de T1D, incluyendo infusiones policlonales autólogas de Treg, Tregs específicos de antígenos modificados y regímenes basados enIL-2 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11 . Sin embargo, un microambiente proinflamatorio dentro de los islotes pancreáticos puede socavar la eficacia de estos enfoques, lo que pone de manifiesto la necesidad de reprogramar localmente las redes inmunitarias residentes enel tejido 2,7. Los metabolitos de triptófano derivados de microbianos, especialmente el indol y compuestos relacionados, pueden modular tanto la inmunidad innata como la adaptativa promoviendo la diferenciación reguladora de las células T, induciendo la polarización antiinflamatoria de los macrófagos y suprimiendo las respuestas Th1712,13. Por tanto, las terapias microbianas vivas y las bacterias metabólicamente modificadas representan una estrategia prometedora para administrar metabolitos inmunomoduladores in situ y remodelar la inmunidadtisular 12,13,14,15,16,17,18.

Anteriormente desarrollamos una cepa metabólicamente modificada de Brucella melitensis, BmΔvjbR::tnaA, que produce indol de forma constitutiva y controla la artritis autoinmune expandiendo los Tregs y remodelando los microambientesinflamatorios 14,15,16. Las cepas atenuadas de Brucella como BmΔvjbR han sido ampliamente caracterizadas como plataformas vacunales y pueden ser modificadas genéticamente para transportar cargas útilesinmunoreguladoras 14,15,16.

Aquí presentamos un protocolo detallado para evaluar una dosis intravenosa única de BmΔvjbR:tnaA en el modelo NOD/ShiLtJ, incluyendo preparación bacteriana, administración intravenosa estandarizada, monitorización de la diabetes y análisis multimodal del tejido pancreático mediante histología, proteómica espacial de alto plexo y RNA-seq unicelular. Este flujo de trabajo proporciona un marco práctico para probar microbios modificados por metabolitos como inmunoterapias de dosis única en autoinmunidad específica de órganos. Un análisis previo de dosis-respuesta demostró seguridad y tolerabilidad hasta 1 × 1010 UFC de la cepa atenuada.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de estricta conformidad con las directrices éticas y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad Texas A&M (Número de protocolo: 2021-0123).

1. Preparación y caracterización de BmΔvjbR::tnaA

  1. Antecedentes y almacenamiento de cepas bacterianas
    NOTA: BmΔvjbR::tnaA se deriva de Brucella melitensis 16M con deleción del regulador de virulencia vjbR e inserción del gen Escherichia coli tnaA para la producción constitutiva de indol, como se describióanteriormente 14,15,16.
    1. Mantener las reservas de glicerol a −80 °C con un 20% de glicerol.
  2. Cultivo bacteriano en agar selectivo
    1. Recuperar un stock de glicerol congelado de almacenamiento a −80 °C. Haz una franja de 10–20 μL sobre placas de agar de soja tríptico (TSA) suplementadas con cloranfenicol (25–30 μg/mL).
    2. Incubar placas a 37 °C bajo condiciones ambientales de CO₂ durante 48–72 horas hasta que se vean las colonias individuales (2–3 mm de diámetro).
      PRECAUCIÓN: El trabajo con cepas de Brucella requiere instalaciones adecuadas de nivel de bioseguridad (mínimo BSL2). Sigue los protocolos de bioseguridad institucional y las aprobaciones requeridas.
  3. Preparación de cultivo líquido
    1. Elige una matrícula TSA nueva (≤1 semana). Elige 2–3 colonias aisladas usando un lazo estéril.
    2. Inocular en 10 mL de caldo de soja triptístico (TSB) suplementado con cloranfenicol (25–30 μg/mL) en un tubo estéril de 15 mL. Incubar a 37 °C con agitación a 250 rpm bajo condiciones ambientales de CO₂.
      NOTA: Para ampliar la escala, utiliza un matraz Erlenmeyer con deflector de 250 mL.
  4. Monitorización del crecimiento y cosecha
    1. Apaga el espectrofotómetro usando TSB estéril suplementado con cloranfenicol.
    2. Mide OD₆₀₀ cada 2–3 horas.
    3. Continúa la incubación hasta que OD₆₀₀ alcance 2,0 ± 0,2 (aproximadamente 18–24 horas).
      PASO CRÍTICO: Cosecha en OD₆₀₀ = 2,0 ± 0,2 para una concentración bacteriana y viabilidad constantes.
      NOTA: Bajo estas condiciones, OD₆₀₀ ≈ 2.0 corresponde a la fase logarítmica de medio a tardío.
  5. Estimación de la CFU
    1. Estima la concentración bacteriana usando la relación:
      OD₆₀₀ = 1 corresponde a 5 × 109 UFC/mL.
      NOTA: Un cultivo de 10 mL en OD₆₀₀ = 2,0 contiene aproximadamente 1 × 1011 UFC.
    2. OPCIONAL: Preparar diluciones en serie de 10 veces (10⁻6 a 10⁻9) en PBS estéril. Placa 100 μL en TSA suplementada con cloranfenicol. Incubar a 37 °C durante 48–72 horas. Cuenta las colonias para confirmar la CFU.
  6. Cosecha y concentración bacteriana
    1. Transfiere el cultivo de 10 mL a un tubo cónico estéril de 15 mL.
    2. Centrifugar a 3.000–4.000 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    3. Aspira cuidadosamente y descarta el sobrenadante sin alterar el pellet.
  7. Resuspensión para inyección
    1. Añade 1 mL de solución fisiológica estéril y libre de endotoxinas de 1× fosfato tamponado (PBS, pH 7,4) al pellet bacteriano. Resuspende suavemente pipeteando 10–15 veces hasta lograr una suspensión homogénea sin grumos visibles.
      NOTA: La concentración final es aproximadamente 1 × 1011 UFC/mL.
  8. Almacenamiento y uso
    1. Mantén la suspensión bacteriana sobre hielo dentro de un tubo cerrado. Usa la suspensión para inyecciones intravenosas dentro de las 4 horas posteriores a la preparación.
      NOTA: No congeles ni almacenes durante la noche, ya que la viabilidad bacteriana disminuye.
      PUNTO DE PAUSA: Las bacterias pueden permanecer en hielo hasta 4 horas; Se recomienda el uso el mismo día.

2. Adquisición, alojamiento y preparación de ratones NOD/ShiLtJ

  1. Obtén ratones hembras NOD/ShiLtJ. Aclimatar ratones al menos 7 días antes de la experimentación.
    NOTA: Utiliza ratones hembras debido a una incidencia de diabetes más alta y más constante.
  2. Los ratones domésticos viven en jaulas ventiladas individualmente bajo condiciones específicas libres de patógenos. Mantén hasta cinco ratones por jaula.
  3. Proporciona ropa de cama, enriquecimiento ambiental, comida y agua ad libitum. Mantener la temperatura entre 20 y 24 °C, humedad entre el 40 y el 60 % y un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad.
  4. Utiliza ratones menores de 5 semanas. Registrar el peso corporal base.
  5. Asigna aleatoriamente a los ratones a nivel de jaula en grupos de tratamiento y control. Asigna identificadores únicos (etiqueta de oreja o tatuaje en la cola) a cada ratón.
    NOTA: Mantén un registro maestro de todos los ratones y las tareas en grupo.
  6. Traslada las jaulas a la sala de procedimientos al menos 30 minutos antes de la inyección. Coloca las jaulas sobre almohadillas eléctricas ajustadas a 37–40 °C para favorecer la dilatación de las venas caudales.

3. Administración intravenosa a través de la vena lateral de la cola

  1. Utilizando técnica estéril, extraer 100 μL de la suspensión bacteriana en jeringuillas estériles de insulina (29G–30G). Etiqueta cada jeringuilla con el ID correspondiente del ratón.
  2. Prepara jeringuillas de control que contengan 100 μL de PBS estéril.
    NOTA: Prepara las jeringuillas inmediatamente antes de la inyección.
  3. Coloca a cada ratón en un sujetador de contención, permitiendo el acceso a la cola.
    NOTA: No uses anestesia para inyecciones en las venas caudales.
  4. Limpia la cola con etanol al 70% y deja secar al aire.
  5. Visualiza las venas laterales de la cola bajo una iluminación adecuada.
    CONSEJO: Calienta la cola si no se ven venas.
  6. Sujeta el tercio distal de la cola con una tensión suave. Inserta la aguja con bisel hacia arriba en un ángulo poco profundo (10–15°) en la veta lateral.
  7. Inyecta 100 μL lentamente durante 5–10 s. Retira la aguja y aplica una presión suave con gasa estéril.
    PASO CRÍTICO: Confirmar la inyección intravenosa exitosa por ausencia de resistencia, hinchazón o blanqueamiento.
  8. Devuelve el ratón a su jaula en una almohadilla térmica. Observa durante 5–10 minutos por si hay signos de malestar. Registra cualquier evento adverso.
  9. Realiza inyecciones en todos los ratones en orden aleatorio dentro de una ventana de 2 horas.

4. Monitorización de la glucosa en sangre y definición de diabetes

  1. Comienza el control de glucosa 7 días después de la inyección. Mide la glucosa en sangre dos veces por semana hasta el final del estudio.
  2. Retira la comida 2 horas antes de la medición manteniendo el acceso al agua.
  3. Sujeta al ratón. Limpia la punta de la cola con etanol al 70%.
  4. Corta la cola con una lanceta o aguja estéril. Descarta la primera gota de sangre. Recoge la segunda gota en una tira reactiva del glucómetro. Registra los valores de glucosa en sangre junto con la identificación y la fecha del ratón.
    NOTA: Usa un nuevo sitio si la punta de la cola se marca con cicatrices.
  5. Define la diabetes como glucosa en sangre ≥ 250 mg/dL en dos mediciones consecutivas separadas por al menos 24 horas.
  6. Eutanasiar ratones que presenten signos graves de la enfermedad según las directrices institucionales.

5. Cosecha, fijación y procesamiento del páncreas

  1. Eutanasia ratones según protocolos aprobados. Disecciona y recoge cuidadosamente el páncreas, incluyendo todos los lóbulos.
  2. Coloque el páncreas en formalina neutral amortiguada al 10% con una relación mínimo de 10:1 entre fijador y volumen tisular. Arregla para 72 h a temperatura ambiente.
    PRECAUCIÓN: Manipula el formol en una campana extractora química con el EPI adecuado.
  3. Transfiere los tejidos al etanol al 70% después de la fijación.
  4. Enviar tejidos fijos a una instalación de histologia para incrustación de parafina, seccionamiento a 5 μm de espesor en portaobjetos cargados positivamente, tinción de hematoxilina y eosina, e inmunohistoquímica de insulina.
    NOTA: Solicite secciones sin teñir si se planifican análisis adicionales aguas abajo.

6. Evaluación histológica y cuantificación del área de islotes

  1. Obtén imágenes de portaobjetos completos usando un escáner de portaobjetos o microscopio.
  2. Imágenes abiertas en el software de referencia. Anota manualmente islotes usando las herramientas adecuadas.
  3. Mide el área de los islotes usando herramientas de anotación.
  4. Medición de exportación para análisis.
    NOTA: El área total de los islotes incluye células endocrinas y infiltrantes.

7. Diversos análisis aguas abajo

  1. Calcula el área media de los islotes por ratón. Compara grupos utilizando pruebas estadísticas adecuadas.
  2. Opcional: Análisis de proteómica espacial (véase Tabla Suplementaria S1)
    1. Prepara secciones FFPE en diapositivas cargadas positivamente. Envía muestras a un proveedor de servicios de proteómica espacial. Proporciona las especificaciones del panel de anticuerpos.
  3. Opcional: secuenciación de ARN unicelular (véase la Tabla Suplementaria S2)
    1. Cosecha páncreas y colócalos en medio frío.
    2. Enviar muestras a una instalación central de genómica para aislamiento de células individuales y preparación de bibliotecas.
    3. Procesar los datos de secuenciación utilizando pipelines apropiados (por ejemplo, Cell Ranger, Seurat).
    4. Depositar los datos de secuenciación en un repositorio público antes de la publicación.

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Resultados

Aunque el protocolo más amplio descrito en este manuscrito ha sido optimizado desde entonces para un régimen preventivo de dosis única, estos resultados piloto se presentan aquí únicamente para ilustrar las lecturas histológicas y glucémicas esperadas que se pueden lograr con este flujo de trabajo.

El contexto general de la enfermedad y el contraste entre el páncreas diabético sano y el tipo 1 se ilustran esquemáticamente en la Figura 1A

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Discusión

Una limitación crítica de los resultados representativos aquí presentados es que los datos proporcionados para ilustrar los criterios analíticos (Figura 3) se derivaron de una cohorte piloto temprana utilizando un esquema de dos dosis. Dado que este protocolo se ha refinado a un régimen preventivo de dosis única, se requieren futuros estudios a mayor escala que utilicen el protocolo optimizado de dosis única descrito aquí para establecer la eficacia estadíst...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud R01CA273002 y R21AI167793 a J.S. y P.D.F., y por un Premio Nacional de Investigación Institucional de los NIH (T32) que apoyaba a K.D. Agradecemos al Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Texas A&M por su apoyo institucional. Agradecemos al Dr. Yava Jones-Hall por las evaluaciones histopatológicas a ciegas, al laboratorio Song por el apoyo técnico de pilotos y animales, al Espacio de Trabajo de Genómica Molecular del Instituto Texas A&M para las Ciencias del Genoma y la Sociedad (TIGSS) por la preparación y secuenciación de bibliotecas de secuenciación de ARN unicelular, el Núcleo de Bioinformática TIGSS para análisis e interpretación de datos, y a Akoya Biosciences por los servicios de proteómica espacial. Agradecemos el apoyo del Instituto de Bioinformática (TBC) del Instituto Texas A&M para las Ciencias del Genoma y la Sociedad (TIGSS) por su ayuda.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Formalina Neutral Bufferizada al 10% (NBF)VWR10790-714
Controlador de cromo 10x GenomicsEspacio de trabajo de Genómica Molecular de TIGSS, Texas A & Universidad M
70% etanolVWR89125-164
Portaobjetos adhesivos para microscopio FFPELeica Biosystems3800084E
Panel de anticuerpos FFPE de ratón Akoya (~25 marcadores)Akoya Biosciences[ID panel/panel personalizado]
Bioanalizador o TapeStation con kits de ADN HSEspacio de trabajo de Genómica Molecular de TIGSS, Texas A & M/ Agilent
BmΔ Cepa bacteriana vjbR::tnaAMaterial de laboratorio (Song/de Figueiredo labs)
Pipeline Cell RangerGenómica 10xv7.1
CloranfenicolProductos de Investigación Internacional56-75-7
Kit Chromium Next GEM Single Cell 3'Genómica 10x mediante núcleo TIGSS
Colagenasa de Clostridium histolyticumMillipore SigmaC7657-100MG
Tinte nuclear DAPIAkoya Biosciences[Servicio proporcionado]
Embedding FFPE, H& Tinción con E, IHC de insulina y escaneo de portaobjetosLaboratorio de Histología VMBS, Texas A & Universidad Mhttps://vetmed.tamu.edu/vmbs-histology-lab/
Tiras reactivas de glucosaEKF Diagnostics / Fisher Scientific22-022-649
Tiras reactivas de glucosa (alternativas)Ascensia Diabetes CareTiras de prueba CONTOUR NEXT
Glicerol (a granel, 500 mL)Millipore SigmaG7893-500ML
Glicerol (estéril, 100 mL)Sigma Aldrich (G Biosciences)G5516-100ml
GraphPad Prism (o paquete de supervivencia R)GraphPad Software / Rv10.2
Glucómetro de manoAscensia Diabetes CareCONTORNO NEXT EZ
Secuenciador Illumina NextSeq 2000Espacio de trabajo de Genómica Molecular de TIGSS, Texas A & Universidad M
Jeringuillas de insulina, 29 y guion; 30 G (U-100)VWR10002-702
Lancetas para pruebas de diabetesBecton, Dickinson y Compañía (BD)366594
Grado de investigación Liberase TLMillipore Sigma5401020001
Almohadillas térmicas de baja temperaturaCiencia de la conductaRWD-69025
Kit de aislamiento de núcleos/células MiltenyiEspacio de trabajo de Genómica Molecular de TIGSS, Texas A & M/ Miltenyi Biotec
Almohadilla térmica para ratón (alternativa)Kent ScientificRightTemp
Restricciones para ratonesBraintree ScientificTV-RED 150-STD
Ratones NOD/ShiLtJ (hembras, 5 semanas)El Laboratorio JacksonCepa #001976
Kit de celda de flujo P2 XLEAP de 100 ciclosIllumina vía núcleo TIGSS
Adquisición de datos y servicio de control de calidad de PhenoCyclerAkoya Biosciences
Reactivos PhenoCycler y flujo de trabajo de imagenAkoya Biosciences[Servicio proporcionado]
Sistema FenoCiclador-FusiónAkoya Biosciences
Solución salina con fosfato tamponado (PBS), 1xThermo Fisher10010023
Inhibidor de RNasa ProtectorMillipore Sigma3335402001
Fluorómetro de Qubit y kit de análisis HS de dsDNAEspacio de trabajo de Genómica Molecular de TIGSS, Texas A & M/ Thermo Fisher
QuPathCódigo abiertov0.4.3
Software RProyecto Rv4.0+
Seurat (paquete R)Satija Lab / CRANv4.3
StarDistCódigo abiertov0.8.3
Agar de soja de triptona (TSA)VWRCA90002-706

Referencias

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