Se sintetizaron y evaluaron una serie de derivados de acetamida basados en triazol y oxadiazol como inhibidores de la urasa y la α-glucosidasa. El compuesto 8c mostró la mayor inhibición de la ureasa, mientras que 9e superó a la acarbosa frente a la α-glucosidasa. Los estudios de unión a BSA y in silico respaldaron sus propiedades similares a las de fármacos, identificando ambos compuestos como candidatos prometedores como líderes.
Artículo de investigación
Síntesis, evaluación biológica y estudios in silico de nuevas acetamidas basadas en triazol y oxadiazol como inhibidores de la urasica y la α-glucosidasa
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Resumen
Resumen
Este estudio investigó el potencial terapéutico de nuevos derivados de acetamida basados en 1,2,4-triazol y 1,3,4-oxadiazol como inhibidores de doble objetivo de la ureasa y la α-glucosidasa, dos enzimas implicadas en trastornos gastrointestinales y diabetes tipo 2, respectivamente. Se empleó un enfoque integrado que combinaba síntesis orgánica multipaso, evaluación biológica in vitro , acoplamiento molecular, predicción ADME in silico y análisis de teoría del funcional de la densidad (DFT) para identificar compuestos líderes potentes con propiedades farmacocinéticas favorables. Partiendo del ácido benzoico, se sintetizaron con éxito una serie de derivados de 1,2,4-triazol (8a–c) y 1,3,4-oxadiazol (9d–f) que contenían grupos sustituidos de acetamida. Todos los compuestos mostraron actividad inhibitoria contra ambas enzimas objetivo. El compuesto 8c fue el inhibidor de la ureasa más potente (IC₅₀ = 6,14 ± 1,06 μM), mientras que el compuesto 9e mostró la inhibición de la glucosidasa de α más fuerte (IC₅₀ = 27,29 ± 0,41 μM), superando al inhibidor de referencia acarbosa (IC₅₀ = 38,25 ± 0,12 μM). Los análisis computacionales respaldaron los hallazgos experimentales: las predicciones del ADME indicaron propiedades favorables similares a fármacos, y el acoplamiento molecular demostró fuertes interacciones de unión, con el compuesto 8a mostrando la mayor afinidad por la glucosidasa α (−7,165 kcal/mol) y el compuesto 9e mostrando la unión más fuerte a la ureasa (−7,30 kcal/mol). Los cálculos de DFT correlacionaron aún más la actividad biológica con propiedades electrónicas, revelando brechas energéticas relativamente pequeñas de HOMO–LUMO para los compuestos más activos, 8c (0,14831 a.u.) y 9e (0,14302 a.u.). En conjunto, estos hallazgos identifican los compuestos 8c y 9e como andamios prometedores para el desarrollo de inhibidores de próxima generación de la ureasa y la α-glucosidasa.
Introducción
Anteriormente se han reportado grupos heterocíclicos en muchos fármacos existentes, y los heterociclos representan una clase importante de inhibidores enzimáticos utilizados en el tratamiento de enfermedades metabólicas einfecciosas. Entre los heterociclos, los 1'3'4-oxadiazoles son uno de los andamios más estudiados en el descubrimiento de fármacos y se han reportado como agentes antivirales, antibacterianos, anticancerígenos, hipotensivos, neuroprotectores, anticonvulsivos yantituberculares 2, 3,4,5. De manera similar, los derivados de 1'2'4-triazol también han mostrado actividades anticonvulsivas, antibacterianas, antivirales, antituberculosas, antidiabéticas, antiinflamatorias, antiproliferativas, antioxidantes, antipalúdicas e inhibitorias de laureasa. 6,7. Los compuestos que contienen acetamida poseen un perfil farmacológico fuerte y se han utilizado como intermediarios sintéticos en la química heterocíclica, así como antidiabéticos, anticoagulantes y agentes quimiosensibilizantes, lo que los convierte en estructuras principales atractivas para el descubrimiento defármacos 8,9.
Se han dirigido esfuerzos significativos hacia el desarrollo de inhibidores multiobjetivo de la α-glucosidasa y la ureasa. La inhibición de la α-glucosidasa retrasa la digestión y la absorción de glucosa de carbohidratos, reduciendo así los niveles de glucosa en sangre postprandiales en pacientes con diabetes mellitus tipo 2. Los inhibidores actuales como la acarbosa son eficaces pero están asociados a efectos secundarios gastrointestinales, lo que genera la necesidad de inhibidores estructuralmentediversos 10,11. La ureasa descompone la urea en amoníaco y dióxido de carbono. La reacción permite que la bacteria Helicobacter pylori', que causa úlceras y hace que el huésped sea más susceptible al cáncer gástrico, sobreviva en el estómago y, por tanto, la ureasa es un objetivo importante en el desarrollo de fármacos antiúlceras. A El objetivo terapéutico es el desarrollo de nuevos inhibidores para ambas enzimas 9,12.
Sin embargo, a pesar de los estudios de investigación disponibles sobre andamios de 1'2'4-triazol y 1'3'4-oxadiazol, se han reportado muy pocos estudios relacionados con los derivados de acetamida de 1'2'4-triazol y 1'3'4-oxadiazol que contienen una mitad tioéter como inhibidores duales de α-glucosidasa yureasa. Su comportamiento de unión a proteínas y caracterización computacional también han recibido atención limitada en este contexto. En este contexto, Propusimos que fusionar el triazol o oxadiazol y los fragmentos sustituidos de acetamida en el mismo marco molecular daría lugar a un perfil inhibidor enzimático satisfactorio con propiedades fisicoquímicas aceptables.
Para probar esta hipótesis, se sintetizaron y evaluaron una serie de derivados de acetamida basados en 1,2,4-triazol (8a–c) y derivados de acetamida basados en 1,3,4-oxadiazol (9d–f) y evaluados por su actividad inhibitoria frente a α-glucosidasa y urasa. Se investigaron las interacciones de unión de los compuestos más activos (8a, 8c y 9e) con la albúmina sérica bovina (BSA) mediante espectroscopía de fluorescencia, determinación de constantes de unión y análisis termodinámico. Además, se realizaron cálculos de acoplamiento molecular, predicción ADME y teoría del funcional de la densidad (DFT) para investigar sus modos de unión, propiedades farmacocinéticas y características electrónicas.
Protocolo
Todos los reactivos eran de grado analítico y se usaban sin purificación adicional. El progreso de la reacción se monitorizó mediante cromatografía de capa fina (TLC) en gel de sílice utilizando n-hexano/acetato de etil (7:3–6:4, v/v), con manchas visualizadas bajo luz ultravioleta. Salvo que se indique lo contrario, todas las reacciones se realizaban bajo la atmósfera ambiente. Los compuestos sintetizados se caracterizaron mediante espectroscopía de infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR), RMN de 1H y RMN de 13C. Los espectros de RMN de 1H y 13C se registraron en CDCl₃ a 600 MHz y 150 MHz, respectivamente, y se reportaron desplazamientos químicos en ppm en relación con la señal residual del disolvente. La vía sintética se representa en la Figura 1. Los datos completos de caracterización fisicoquímica de todos los compuestos sintetizados se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.
Síntesis de benzoato de etil (1)
Se colocó ácido benzoico (50 g, 0,41 mol) en un matraz de fondo redondo de 500 mL, y se añadió etanol absoluto (150 mL). Se añadió ácido sulfúrico concentrado (6 mL) gota a gota como catalizador bajo agitación magnética continua. La mezcla de reacción se calentaba bajo reflujo a 78 °C durante 4–6 horas utilizando un condensador refrigerado por agua. El progreso de la reacción fue monitorizado por TLC. Al finalizar, la mezcla se enfriaba a temperatura ambiente y se neutralizaba con carbonato acuoso saturado de sodio hasta que el pH alcanzaba 7–8. La mezcla de reacción se transfirió a un embudo separador, y la capa orgánica se recogió, lavó con agua destilada y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Tras la filtración, se utilizó el benzoato de etil (1) directamente en la siguiente etapa sin necesidad de purificación adicional (Figura 1).
Síntesis de benzohidrazida (2)
El benzoato de etil (1; 0,41 mol) se disolvió en etanol absoluto (100 mL), y se añadió hidrato de hidrazina (80%, 25 mL, en exceso) bajo una agitación continua. La mezcla de reacción se calentaba bajo reflujo a 78 °C durante 4–5 horas bajo aire mediante un condensador refrigerado por agua. El progreso de la reacción fue monitorizado por TLC. Al finalizar, el precipitado cristalino blanco de benzohydrazida (2) se recogía por filtración, se lavaba con etanol frío, se secaba hasta un peso constante a temperatura ambiente y se utilizaba en etapas sintéticas posteriores (Figura 1).
Síntesis de 5-fenil-1,3,4-oxadiazol-2-tiol (3)
Se colocaron benzohidrazida (2; 10 g, 0,073 mol) e hidróxido de potasio (4,12 g, 0,073 mol) en un matraz de fondo redondo de 250 mL que contenía etanol (30 mL). La mezcla se calentó bajo reflujo a 78 °C durante 10 minutos usando un condensador refrigerado por agua. A continuación, se añadió disulfuro de carbono (CS₂; 5 mL, 0,083 mol), y el reflujo continuó durante 3–4 horas adicionales. El progreso de la reacción fue monitorizado por TLC. Al finalizar, la mezcla de reacción se transfería a agua destilada y se calentaba con una agitación continua. Se añadió ácido clorhídrico diluido gota a gota hasta que el pH alcanzó 5, lo que resultó en la precipitación del compuesto (3) (Figura 1). El precipitado se recogía por filtración, se lavaba a fondo con agua destilada fría, se secaba hasta un peso constante y se pesaba para determinar el rendimiento. El compuesto se caracterizó mediante espectroscopía FTIR, RMN de 1H y RMN de 13°C.
Síntesis de 4,5-difenil-4H-1,2,4-triazola-3-tiol(4)
La benzohidrazida (2; 5 g, 0,037 mol) y el fenilisotiocianato (4 mL, 0,037 mol) se colocaron en un matraz de fondo redondo de 100 mL equipado con un condensador refrigerado por agua. La mezcla de reacción se calentó bajo reflujo a 78 °C hasta que se completó la formación del intermedio tiosemicarbazida, como confirmó el TLC usando n-hexano/acetato de etil (7:3, v/v). Se añadió hidróxido potásico (2 g, 0,036 mol), disuelto en etanol (20 mL), y el reflujo continuó hasta la formación del compuesto (4), según confirmó TLC. La mezcla de reacción se transfirió a agua destilada, se calentó con agitación continua y se acidificó con ácido clorhídrico diluido a pH 5 para precipitar el compuesto (4) (Figura 1). El precipitado se recogía por filtración, se lavaba a fondo con agua destilada fría, se secaba hasta un peso constante y se caracterizaba mediante espectroscopía FTIR, RMN de 1H y RMN de 13°C.
Síntesis de intermediarios de bromoacetamida 7(a–f)
Cada derivado sustituido de anilina 5(a–f) (1 equiv.) se disolvió en cloroformo y se enfrió en un baño de hielo para mantener la temperatura de reacción entre 0 y 5 °C. Se añadió bromuro de bromoacetilo (6, ≥98%, 1 equivalente) gota a gota con una agitación continua. Durante la reacción, se añadió un 18% de solución acuosa de carbonato de sodio según fuera necesario para mantener el pH de la reacción entre 9 y 10 neutralizando el ácido bromhídrico generado. Tras completar la adición de bromuro de bromoacetilo, la mezcla de reacción se dejaba calentar hasta la temperatura ambiente y se removía hasta que el TLC confirmaba el consumo completo del material inicial. Los intermediarios resultantes de bromoacetamida 7(a–f) se recogieron por filtración, se lavaron con agua destilada fría, se secaron hasta obtener peso constante y se usaron directamente en el siguiente paso sintético sin purificación adicional (Figura 1).
Síntesis de derivados de acetamida basados en triazol 8(a–c)
El derivado de triazol (4; 0,5 g, 0,002 mol) se disolvió en N, N-dimetilformamida (10 mL) en un matraz de fondo redondeado de 50 mL. Se añadió el intermediario de bromoacetamida adecuado (7a, 7b o 7c; 0,002 mol, 1 equiv.) con agitación continua, seguido de hidruro de sodio (0,05 g, 0,002 mol) para promover la S-alquilación. La mezcla de reacción se removió a temperatura ambiente durante 24–48 horas, con el progreso de la reacción monitorizado por el TLC. Al finalizar, la mezcla de reacción se vertió en agua helada para inducir la precipitación. El precipitado se recogió por filtración, se lavó a fondo con agua fría, se secó y se caracterizó mediante espectroscopía FTIR, RMN de 1H y RMN de 13°C (Figura 1).
Síntesis de derivados de acetamida basados en oxadiazol 9(d–f)
El derivado de oxadiazol (3; 0,5 g, 0,002 mol) se disolvió en N, N-dimetilformamida (10 mL) en un matraz de fondo redondo de 50 mL. Se añadió el intermediario correspondiente de bromoacetamida, 7d, 7e o 7f (0,002 mol, 1 equiv.), seguido de hidruro de sodio (0,05 g, 0,002 mol) para facilitar la S-alquilación. La mezcla de reacción se removió a temperatura ambiente durante 24–48 horas, con el progreso monitorizado por TLC. Al finalizar, la mezcla se vertió en agua helada para precipitar el producto. El precipitado se recogió por filtración, se lavó a fondo con agua fría, se secó y se caracterizó mediante espectroscopía FTIR, RMN de 1H y RMN de 13°C (Figura 1).
Ensayo de inhibición de α-glucosidasa
La actividad inhibitoria de la α-glucosidasa se evaluó mezclando 50 μL de la solución de la muestra de prueba con 100 μL de solución de α-glucosidasa (0,35 U/mL) preparada en tampón de fosfato (pH 6,8). La mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante 10 minutos, luego se añadió 100 μL de 1,5 mM de p-nitrofenil-α-D-glucopiranósido como sustrato. Tras una incubación adicional a 37 °C durante 20 minutos, la reacción se terminó añadiendo 1 mL de 1 M carbonato de sodio (Na₂CO₃). La absorbancia se midió en 400nm 14. Se utilizó Acarbosa como control positivo. La mezcla de reacción sin el compuesto de prueba servía como control negativo, mientras que la mezcla de reacción sin enzima se usaba como blank.
Todos los experimentos se realizaron en triplicado y los resultados se expresan como la media ± desviación estándar (DS). El porcentaje de inhibición de la actividad de la α-glucosidasa se calculó utilizando la siguiente ecuación(1)14:
(1)
donde As representa la absorbancia de la solución de la muestra de prueba, Ab es la absorbancia del reactivo en blanco (sin α-glucosidasa), y A0 es la absorbancia del control negativo (sin la muestra). Los valores de IC50 se determinaron probando concentraciones de compuestos que iban de 3,125 a 100 μM. Se realizó un análisis de regresión no lineal utilizando software estándar de grafografía.
Ensayo de inhibición de la ureasa
La actividad inhibitoria de la ureasa se determinó mediante un método modificado de Berthelot. La mezcla de reacción consistía en 300 μL de la solución de prueba de prueba, 200 μL de solución de urasa de haba de jack y 200 μL de 25 mM de urea. La mezcla se incubó en baño maria a 37 °C durante 30 minutos. Tras la incubación, se añadieron 500 μL de una solución desarrolladora de color que contenía 10 g/L de fenol y 50 g/L de nitroprusido sódico, seguidos de 500 μL de una segunda solución que contenía un 5% (v/v) de hipoclorito sódico y 5 g/L de hidróxido de sodio. La mezcla de reacción se incubaba durante 15–30 minutos adicionales para permitir el desarrollo del color.
La absorbancia de la solución se midió en 625 nm frente a un reactivoen blanco 15. La tiourea se utilizaba como control positivo, la mezcla de reacción sin el compuesto de prueba como control negativo, y la mezcla sin la enzima ureasa como blanco de cristal. Todos los experimentos se realizaron en triplicado (n = 3), y los resultados se expresan como valores medios ± desviación estándar (S.D.). El porcentaje de inhibición se calculó usando la siguiente fórmula matemática (2)15:
(2)
donde A0 es la absorbancia del control (sin inhibidor) y As es la absorbancia de la muestra de prueba (con inhibidor). Se realizaron gráficos y análisis de regresión no lineal para determinar los valores de IC50 utilizando software estándar de trazado de datos.
Ensayo de unión con BSA
Se investigaron las interacciones de unión entre la albúmina sérica bovina (BSA) y los compuestos sintetizados mediante espectroscopía de extinción por fluorescencia. Se preparó una solución de stock de BSA de 10 μM en un tampón de fosfato de 20 mM (pH 7,4). Para cada experimento de titulación, se mezcló 1,0 mL de la solución de BSA con 2,0 mL de tampón de fosfato en una cubetas de cuarzo. La solución se ajustó mediante adiciones sucesivas de 5 μL de alicuotas del compuesto de prueba (1,5 mM en metanol). Los espectros de emisión de fluorescencia se registraron en el rango de longitudes de onda de 300–400 nm tras la excitación a 295 nm, con la máxima emisión observada aproximadamente en 336 nm. Las mediciones de fluorescencia se realizaron utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia equipado con software estándar de adquisición de fluorescencia, con anchos de rendija de excitación y emisión establecidos en 10 nm y 2,5 nm, respectivamente. Para determinar los parámetros termodinámicos de la ligación, incluyendo la energía libre de Gibbs (ΔG), la entalpía (ΔH) y la entropía (ΔS), se repitieron los experimentos de titulación a 298, 308 y 313 K.
Para investigar el mecanismo de apagado por fluorescencia, los datos experimentales se analizaron utilizando la ecuación de Stern–Volmer (Ecuación 3)16:
(3)
donde F, 0 y F representan las intensidades de fluorescencia de la BSA en ausencia y presencia del apagador, respectivamente; Kq es la constante de la velocidad de apagado bimolecular; τ0 es la vida media de la BSA en ausencia de un apagador; KSV es la constante de temple de Stern-Volmer; y [Q] es la concentración del quencher. La constante de unión (Kb) y el número de sitios de unión (n) se determinaron posteriormente representando el doble logaritmo según la ecuación (4)16:
(4)
Además, el cambio estándar de energía libre de Gibbs (ΔG°), el cambio estándar de entalpía (ΔH°) y el cambio estándar de entropía (ΔS°) que rigen la interacción de unión se calcularon utilizando las relaciones de Van't Hoff y Gibbs-Helmholtz expresadas en las ecuaciones (5) y (6)17:
ΔG∘ = -RT ln Kb (5)
(6)
donde R es la constante universal del gas y T es la temperatura absoluta en Kelvin.
Acoplamiento molecular
Todo el modelado molecular y las simulaciones de acoplamiento se realizaron utilizando la Schrödinger Suite (interfaz Maestro), mientras que el acoplamiento se realizó mediante el módulo Glide. Las estructuras cristalinas de α-glucosidasa (PDB ID: 5NN8) y urasa (PDB ID: 4H9M) fueron extraídas del Banco de Datos de Proteínas RCSB. Las estructuras proteicas se prepararon utilizando el Asistente de Preparación de Proteínas eliminando ligandos cocristalizados, moléculas de agua y heteroátomos no esenciales, añadiendo residuos y bucles faltantes, asignando órdenes correctos de enlaces y añadiendo átomos de hidrógeno polar. Se asignaron protonaciones y estados tamoméricos a pH fisiológico (7,0 ± 2,0) utilizando el módulo Epik. Las estructuras proteicas preparadas fueron posteriormente sometidas a minimización de energía restringida con el campo de fuerzas OPLS para aliviar los choques estéricos.
Las estructuras bidimensionales de los compuestos 3, 4, 8(a–c) y 9(d–f), junto con los inhibidores de referencia acarbosa y tiourea, se prepararon utilizando el módulo LigPrep. Se optimizaron los órdenes de enlace, la estereoquímica y los estados de ionización en pH fisiológico, y las conformaciones tridimensionales resultantes de ligandos se minimizaron en energía usando el campo de fuerzas OPLS.
Las rejillas receptoras se generaron utilizando la herramienta de Generación de Rejillas de Receptores, con las cuadrículas centradas en los ligandos nativos cocristalizados para definir los sitios activos. Las dimensiones de la cuadrícula se establecieron a 25 × 25 × 25 Å para ambas proteínas. La cuadrícula de la urasala estaba centrada en x = −38,76, y = −44,14 y z = 66,88, mientras que la cuadrícula de α-glucosidasa estaba centrada en x = 21,14, y = −7,56 y z = 24,37.
Los cálculos de acoplamiento se realizaron utilizando el modo de extra-precisión (XP) de Glide con muestreo flexible de ligandos. Se generaron múltiples posturas de unión para cada ligando, y se seleccionó la pose con la puntuación de acoplamiento Glide más baja para su análisis posterior. El protocolo de acoplamiento se validó reacoplando los ligandos cocristalizados a sus respectivas rejillas receptoras. Los valores de desviación cuadrática media (RMSD) de ≤2,0 Å confirmaron la fiabilidad y reproducibilidad del protocolo de acoplamiento.
Las conformaciones de unión de los complejos acoplados se visualizaron usando PyMOL (versión 3.1)18. Las interacciones proteína-ligando, incluyendo enlaces de hidrógeno, contactos hidrofóbicos e interacciones electrostáticas, se analizaron utilizando el Visualizador19 de Discovery Studio.
Análisis de la teoría del funcional de la densidad (DFT)
Todos los cálculos de teoría funcional de la densidad (DFT) se realizaron usando Gaussian 09, y las geometrías moleculares optimizadas y los orbitales moleculares de frontera se visualizaron usando GaussView 5. Los derivados sintetizados de acetamida basados en triazol y oxadiazol, 8(a–c) y 9(d–f), fueron sometidos a optimización geométrica en la fase acuosa utilizando el funcional híbrido de tres parámetros Lee–Yang–Parr (B3LYP) de Becke junto con el conjunto de base 6-311+G(d,p) 20. Los efectos del disolvente se incorporaron utilizando el Modelo de Continuo Polarizable Similar al Conductor (CPCM)21. Posteriormente se realizaron cálculos de frecuencia vibracional al mismo nivel teórico para confirmar que todas las estructuras optimizadas correspondían a los verdaderos mínimos locales en la superficie de energía potencial, como indica la ausencia de frecuencias imaginarias.
Para comprender las transiciones electrónicas y la estabilidad cinética de los compuestos sintetizados, se calcularon las energías del orbital molecular más ocupado (EHOMO) y del orbital molecular más bajo desocupado (ELUMO). La brecha de energía orbital molecular frontera (ΔE = ELUMO - EHOMO) SE DETERMINÓ PARA CADA DERIVADA PARA EVALUAR SU REACTIVIDAD QUÍMICA Y ESTABILIDAD CINÉTICA, SIENDO UNA BRECHA DE ENERGÍA MENOR INDICAR UNA MAYOR REACTIVIDAD.
Además, se calcularon descriptores de reactividad química global —incluyendo dureza química (η), blandez (S), potencial químico (μ), electronegatividad (X) e índice de electrofilitía (w)— a partir de las energías orbitales de frontera utilizando las siguientes ecuaciones operativasestándar 22:
(7)
(8)
(9)
(10)
Las propiedades electrónicas calculadas y los descriptores globales se compararon sistemáticamente a lo largo de la serie para establecer relaciones estructura-actividad (SAR) que reflejen sus perfiles observados de α-glucosidasa y inhibitoria de la ureasa.
Además, se generaron y visualizaron mapas de potencial electrostático molecular (MESP) usando VESTA para mapear la distribución de carga a través de los marcos moleculares optimizados. Las superficies MESP permitieron identificar regiones electrófilas (deficiencia de electrones, favorecimiento del ataque nucleofílico) y nucleofílicas (ricas en electrones, favorecidas por el ataque electrofílico). Esta distribución de potencial electrostático se correlacionó finalmente con las interacciones específicas de unión no covalente, como los enlaces de hidrógeno y los contactos electrostáticos, observadas en las simulaciones de acoplamiento molecular.
Análisis de ADME
Para evaluar la similitud con fármacos y las propiedades biofarmacéuticas de los derivados sintetizados de acetamida basados en triazol y oxadiazol 8(a–c) y 9(d–f), se realizó un análisis in silico de absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME). Las representaciones simplificadas del sistema de entrada molecular de entrada de línea (SMILES) de todos los compuestos sintetizados, junto con los inhibidores de referencia acarbosa y tiourea, se generaron utilizando un paquete de software de modelado molecular y se enviaron al servidor webSwissADME 23.
Los parámetros físico-químicos calculados incluían el peso molecular (MW), la lipofilicidad (logP), el área superficial polar topológica (TPSA), el número de donantes de enlaces de hidrógeno (HBD), el número de aceptores de enlaces de hidrógeno (HBA) y el número de enlaces rotatorios (RB).
Se evaluaron las propiedades farmacocinéticas prediciendo la absorción gastrointestinal (GI) y la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BBB). Además, los compuestos fueron evaluados para cumplir con la regla de los cinco de Lipinski y otros criterios establecidos de semejanza con fármacos para estimar su biodisponibilidad oral. Finalmente, se calculó la puntuación de accesibilidad sintética (SA) para cada compuesto en una escala que iba de 1 (fácil de sintetizar) a 10 (muy difícil de sintetizar). Se compararon los perfiles de ADME y semejanza de fármacos predicho de los compuestos sintetizados con los de los inhibidores de referencia para evaluar su potencial como candidatos principales para el desarrollo de fármacos.
Resultados
Química y caracterización de compuestos sintetizados
Los derivados de acetamida basados en triazol y oxadiazol objetivo se sintetizaron según la vía sintética mostrada en la Figura 1. Los compuestos deseados se obtuvieron en rendimientos de buenos a excelentes (69%–87%) como sólidos cristalinos blancos a amarillos. Su pureza fue confirmada mediante TLC, determinación del punto de fusión y análisis espectroscópicos. En la Figura 2 se muestran espectros representativos de RMN que confirman los grupos funcionales característicos de los compuestos sintetizados. Los espectros exhibieron las bandas de absorción esperadas correspondientes a los grupos funcionales amida carbonilo (C=O), N–H, C=N, C–S y aromáticos C–H, lo que apoya la síntesis exitosa de los derivados objetivo.
Los espectros representativos de RMN de la H1 se presentan en la Figura 3. Los espectros mostraron resonancias características para el protón amida NH, protones aromáticos, enlazante de metileno y sustituyentes de metilo, que eran consistentes con las estructuras propuestas. Los espectros representativos de RMN de 13°C se muestran en la Figura 4. Las resonancias de carbono observadas confirmaron la presencia de carbonilo, aromático, metileno y carbonocarbono esperados para los derivados sintetizados. Los compuestos representativos incluían 8a (rendimiento del 87%), 8c (rendimiento aproximadamente entre el 80% y el 85%) y 9e (rendimiento del 69%). Los datos completos de caracterización fisicoquímica y los espectros de RMN para todos los compuestos sintetizados se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.
Inhibición de α-glucosidasa
Las actividades inhibitorias de la α-glucosidasa de los compuestos sintetizados se resumen en la Tabla 1. Todos los compuestos inhibían α-glucosidasa en distintos grados. El compuesto 9e mostró la mayor actividad inhibitoria, con un valor IC50 de 27,29 ± 0,41 μM, seguido por el compuesto 8a (33,15 ± 0,07 μM) y el compuesto 8c (40,93 ± 0,59 μM). Los compuestos 8b, 9d y 9f mostraron una inhibición comparativamente más débil, con valores de IC50 de 108,19 ± 0,18 μM, 108,10 ± 0,03 μM y 94,44 ± 0,25 μM, respectivamente. El compuesto 9e mostró una mayor potencia inhibitoria que el inhibidor de referencia acarbosa (IC50 = 38,25 ± 0,12 μM), mientras que el compuesto 8a mostró una actividad comparable. Los perfiles de inhibición dependientes de la concentración se presentan en la Figura 5.
Potencial de inhibición de la ureasa
Las actividades inhibitorias de la ureasa de los compuestos sintetizados se resumen en la Tabla 1. El compuesto 8c mostró la mayor inhibición de la ureasa, con un valor de IC50 de 6,14 ± 1,06 μM, seguido por los compuestos 9e (8,14 ± 0,71 μM) y 8a (12,25 ± 0,42 μM). Estos compuestos demostraron una mayor actividad inhibitoria que el inhibidor de referencia tiourea (IC50 = 21,25 ± 0,15 μM). Los compuestos 8b, 9d y 9f fueron menos activos, con valores de IC50 que oscilaban entre 82,15 y 103,05 μM. Las curvas de inhibición correspondientes dependientes de la concentración se muestran en la Figura 5.
Enlazamiento BSA
Los parámetros de temple por fluorescencia se resumen en la Tabla 2. Para los compuestos 8a y 9e, la constante de Stern–Volmer (Ksv) aumentaba con el aumento de la temperatura, mientras que la constante de temple (Kq) superaba el límite máximo controlado por difusión (2 ×10 10 M⁻1 s⁻1), indicando un mecanismo de temple estático y dinámico mixto. En contraste, el compuesto 8c mostró valores decrecientes de Ksv con el aumento de la temperatura, manteniendo los valores de Kq por encima del límite controlado por difusión, lo que indica un temple predominantemente estático. El análisis termodinámico mostró valores negativos de ΔH y ΔS para el compuesto 8a, lo que sugiere que predominaban los enlaces de hidrógeno e las interacciones de van der Waals durante la unión. Los valores positivos de ΔH y ΔS obtenidos para los compuestos 8c y 9e indicaron que las interacciones hidrofóbicas fueron la principal fuerza motriz. El análisis de afinidad de unión realizado a 298 K demostró que el compuesto 8a exhibió la constante de unión más alta (Kb = 3,92 × 105 M⁻1), seguido por el compuesto 8c (1,54 × 104 M⁻1) y el compuesto 9e (6,78 × 101M⁻1). Los espectros de fluorescencia y los gráficos de Stern–Volmer se presentan en las Figuras 6, Figura 7, Figura 8, Figura 9, Figura 10 y Figura 11.
Análisis de acoplamiento
Los resultados del acoplamiento molecular se resumen en la Tabla 3. El protocolo de acoplamiento se validó reacoplando los ligandos cocristalizados en sus respectivos sitios de unión, lo que obtuvo valores RMSD ≤2,0 Å, confirmando así la fiabilidad del protocolo de acoplamiento (Figura suplementaria 1).
Basándose en la actividad biológica y las puntuaciones de acoplamiento, se seleccionaron los compuestos 8a, 8c y 9e para un análisis detallado de interacción. Las poses representativas de acoplamiento dentro del sitio activo de α-glucosidasa se presentan en la Figura 12A–D. El compuesto 8a mostró la puntuación de acoplamiento más alta (−7,165 kcal/mol), seguido por los compuestos 8c (−6,80 kcal/mol) y 9e. Estos compuestos establecieron interacciones de enlace hidrógeno con residuos catalíticos clave, incluyendo D282, D404, D616, R600, S523 y H674.
Las poses representativas de acoplamiento dentro del sitio activo de la urease se muestran en la Figura 12E–H. El compuesto 8c estableció enlaces de hidrógeno con A636, Q635 y R439, mientras que el compuesto 9e formó una extensa red de enlaces de hidrógeno que involucraba a E493, D494, H593, R609 y A636. El compuesto 8a también demostró interacciones favorables con residuos del sitio catalítico. En general, el análisis de acoplamiento respaldó los resultados experimentales de inhibición.
Estudios sobre la DFT
Los descriptores cuánticos químicos calculados se resumen en la Tabla 4. Las distribuciones orbitales moleculares fronterizas y los mapas de potencial electrostático molecular de los compuestos de referencia se presentan en la Figura 13, mientras que los análisis correspondientes para los compuestos sintetizados se muestran en las Figuras 14 y 15.
Entre los compuestos sintetizados, 9e presentó la menor brecha de energía HOMO–LUMO (0,14302 u.a.), seguida de 8c (0,14831 a.u.) y 8a (0,15788 a.u.). Los mapas de potencial electrostático molecular identificaron regiones ricas y deficientes en electrones que pueden contribuir a las interacciones intermoleculares. Los descriptores de reactividad global calculados, incluyendo potencial de ionización, afinidad electrónica, electronegatividad, potencial químico, dureza, suavidad e índice de electrofilicidade, se enumeran en la Tabla 4. Los compuestos de la serie 9 mostraron brechas HOMO–LUMO más bajas y una mayor electrofilicidade que los derivados correspondientes de la serie 8.
Análisis de ADME
Las propiedades farmacocinéticas previstas se resumen en la Tabla 5. Todos los compuestos sintetizados cumplían los principales criterios de similitud con fármacos. Los derivados de la serie 9 no mostraron violaciones de Lipinski, mientras que cada compuesto de la serie 8 presentaba una violación. Se predijo que todos los compuestos poseían una alta absorción gastrointestinal, sin permeabilidad hematoencefálica y con conteos aceptables de enlaces de hidrógeno por parte de donantes y aceptadores. Se predijo consistentemente que las puntuaciones de biodisponibilidad fueran de 0,55. Las puntuaciones de accesibilidad sintética oscilaron entre 5,70 y 6,39, lo que indica una complejidad sintética moderada.
DISPONIBILIDAD DE DATOS:
Los conjuntos de datos y materiales de apoyo generados durante este estudio han sido depositados en el repositorio Zenodo y están disponibles públicamente en https://doi.org/10.5281/zenodo.21238952.
Figura 1: Vía sintética para la preparación de derivados de acetamida basados en triazol y oxadiazol. Esquema de reacción que ilustra la síntesis de compuestos intermedios y finales 8(a–c) y 9(d–f). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 2: Espectros RMN del compuesto 8a. (A) espectroRMN 1 H del compuesto 8a. (B) espectro RMN 13C del compuesto 8a. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 3: Espectros de RMN del compuesto 8c. (A) 1H espectro RMN del compuesto 8c. (B) 13C espectro RMN del compuesto 8c. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 4: Espectros de RMN del compuesto 9e. (A) EspectroRMN 1 H del compuesto 9e. (B) Espectro RMN 13C del compuesto 9e. Haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 5: Actividades inhibitorias de los compuestos sintetizados contra la α-glucosidasa y la ureasa. (A) Porcentaje de inhibición de α-glucosidasa y ureasa por los compuestos 3, 4, 8(a–c) y 9(d–f) en comparación con los inhibidores de referencia acarbosa y tiourea, respectivamente. (B) IC50 valores de los mismos compuestos frente a α-glucosidasa y ureasa. Los datos se presentan como media ± DE (n = 3). Se determinó significación estadística respecto al inhibidor de referencia correspondiente (p < 0,05, p < 0,01, p < 0,001, p < 0,0001; ns = no significativo). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 6: Análisis de temple por fluorescencia de la albúmina sérica bovina (BSA) mediante el compuesto 8a. (A) Espectros de emisión de fluorescencia de BSA (3,33 × 10⁻6 M) tras la adición incremental del compuesto 8a a 298 K. (B) Gráficos de Stern–Volmer obtenidos en 298, 308 y 313 K. (C) Gráfico doble logarítmico de log[(F₀ − F)/F] frente a log Q. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 7: Análisis de temple por fluorescencia de albúmina sérica bovina (BSA) mediante el compuesto 8b. (A) Espectros de emisión de fluorescencia de BSA (3,33 × 10⁻6 M) tras la adición incremental del compuesto 8b a 298 K. (B) Gráficos de Stern–Volmer obtenidos en 298, 308 y 313 K. (C) Gráfico doble logarítmico de log[(F₀ − F)/F] frente a log Q. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 8: Análisis de temple por fluorescencia de la albúmina sérica bovina (BSA) mediante el compuesto 8c. (A) Espectros de emisión de fluorescencia de BSA (3,33 × 10⁻6 M) tras la adición incremental del compuesto 8c a 298 K. (B) Gráficos de Stern–Volmer obtenidos a 298, 308 y 313 K. (C) Gráfico doble logarítmico de log[(F₀ − F)/F] frente a log Q. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 9: Análisis de enfriamiento por fluorescencia de albúmina sérica bovina (BSA) por compuesto 9d. (A) Espectros de emisión de fluorescencia de BSA (3,33 × 10⁻6 M) tras la adición incremental del compuesto 9d a 298 K. (B) Gráficos de Stern–Volmer obtenidos en 298, 308 y 313 K. (C) Gráfico doble logarítmico de log[(F₀ − F)/F] frente a log Q. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 10: Análisis de temple por fluorescencia de albúmina sérica bovina (BSA) mediante el compuesto 9e. (A) Espectros de emisión de fluorescencia de BSA (3,33 × 10⁻6 M) tras la adición incremental del compuesto 9e a 298 K. (B) Gráficos de Stern–Volmer obtenidos a 298, 308 y 313 K. (C) Gráfico doble logarítmico de log[(F₀ − F)/F] frente a log Q. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 11: Análisis de temple por fluorescencia de albúmina sérica bovina (BSA) mediante compuesto 9f. (A) Espectros de emisión de fluorescencia de BSA (3,33 × 10⁻6 M) tras la adición incremental del compuesto 9f a 298 K. (B) Gráficos de Stern–Volmer obtenidos a 298, 308 y 313 K. (C) Gráfico doble logarítmico de log[(F₀ − F)/F] frente a log Q. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 12: Modos de unión de los inhibidores de referencia y compuestos sintetizados seleccionados dentro de los sitios activos α-glucosidasa y urease. (A) Posición de unión de la acarbosa dentro del sitio activo α-glucosidasa. (B) Pose de unión del compuesto 8a. (C) Postura de unión del compuesto 8c. (D) Postura de unión del compuesto 9e. (E) Postura de unión de tiourea dentro del sitio activo de urease. (F) Postura de unión del compuesto 8a. (G) Postura de unión del compuesto 8c. (H) Postura de unión del compuesto 9e. Los enlaces de hidrógeno se representan mediante líneas amarillas discontinuas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 13: Orbitales moleculares de frontera y mapas de potencial electrostático molecular (MEP) de los inhibidores de referencia. (A) Acarbosa. (B) Tiourea. Se muestran las superficies del orbital molecular ocupado más alto (HOMO), el orbital molecular no ocupado más bajo (LUMO) y el MEP. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 14: Orbitales moleculares de frontera y mapas de potencial electrostático molecular (MEP) de las derivadas triazólicas. (A) Compuesto 8a. (B) Compuesto 8b. (C) Compuesto 8c. Las superficies HOMO, LUMO y MEP se muestran para cada compuesto. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 15: Orbitales moleculares de frontera y mapas de potencial electrostático molecular (MEP) de los derivados del oxadiazol. (A) Compuesto 9d. (B) Compuesto 9e. (C) Compuesto 9f. Las superficies HOMO, LUMO y MEP se muestran para cada compuesto. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
| Códigos | Ureasa | α-Glucosidasa | ||
| Inhibición (%) a 0,5 mM | IC50 (μM) | Inhibición (%) a 0,5 mM | IC50 (μM) | |
| 3 | 67,54 ± 1,03 | 41,51 ± 0,01 | 63,09 ± 0,25 | 79,12 ± 0,43 |
| 4 | 62,51 ± 0,42 | 45,14 ± 0,14 | 65,26 ± 0,55 | 70,28 ± 0,42 |
| 8a | 95.22 ± 1.55 | 12.25 ± 0.42 | 95.01 ± 0.57 | 33.15±0.07 |
| 8b | 62,64 ± 1,01 | 82.15 ±1.48 | 38.02 ± 1.71 | 108.19 ± 0.18 |
| 8c | 99,39 ± 0,27 | 06.14 ± 1.06 | 90,51 ± 0,01 | 40,93 ± 0,59 |
| 9d | 47.51 ± 1.01 | 103,05 ± 0,54 | 39.08 ± 0.25 | 108,10 ± 0,03 |
| 9e | 98,57 ± 0,04 | 08.14 ± 0.71 | 91,55 ± 0,34 | 27.29 ± 0.41 |
| 9f | 58.07 ± 1.68 | 85,15 ± 0,12 | 43,15 ± 0,42 | 94,44 ± 0,25 |
| Tiourea | 96,24 ± 0,16 | 21.25 ± 0.15 | - | - |
| Acarbosa | - | - | 92,23 ± 0,14 | 38,25 ± 0,12 |
Tabla 1: Actividades inhibitorias de los compuestos sintetizados contra la α-glucosidasa y la ureasa. Valores de IC50 e inhibición porcentaje de compuestos 8(a–c) y 9(d–f) en comparación con los inhibidores de referencia acarbosa y tiourea. Los datos se presentan como media ± DE (n = 3). Abreviaturas: IC50 = concentración inhibitoria media máxima; DE = desviación estándar.
| Compuesto | 298K | 308K | 313K | ||||||
| N | Kb (M-1) | ΔG | ΔH | ΔS (J/mol. K) | N | Kb (M-1) | N | Kb (M-1) | |
| (kJ/mol) | (kJ/mol) | ||||||||
| 8a | 1.28 | 3,92 x105 | -32.55 | -218.28 | -623.24 | 1.12 | 6.49 x104 | 0.85 | 4.33 x103 |
| 8b | 1.31 | 6,49 x105 | -34.24 | -306.6 | -913.96 | 1.1 | 6,95 x104 | 0.66 | 1.07 x103 |
| 9d | 1.47 | 2,41 x106 | -36.32 | -204.1 | -563.01 | 1.17 | 1.44 x105 | 1.04 | 4,84 x104 |
| 9e | 0.62 | 6,78 x101 | -10.32 | 243.16 | 850.61 | 0.81 | 1.32 x103 | 0.91 | 7,93 x103 |
| 9f | 1.11 | 4,69 x104 | -26.35 | 178.13 | 686.21 | 1.26 | 2,99 x105 | 1.41 | 1,67 x106 |
| 8c | 0.91 | 1,54 x104 | -23.98 | 341.31 | 1225.82 | 1.36 | 1.53 x105 | 1.6 | 1.10 x107 |
Tabla 2: Constantes de unión y parámetros termodinámicos para las interacciones de compuestos seleccionados con la albúmina sérica bovina (BSA). Constante de unión (Kb), número de sitios de unión (n), constante de temple de Stern–Volmer (Ksv), constante de tasa de apagado bimolecular (Kq), energía libre de Gibbs (ΔG), cambio de entalpía (ΔH) y cambio de entropía (ΔS) para compuestos 8a, 8c y 9e determinados en 298, 308 y 313 K. Abreviaturas: BSA = albúmina sérica bovina; Kb = constante de enlace; n = número de sitios de unión; Ksv = constante de temple de Stern–Volmer; Kq = constante de velocidad de temple bimolecular; ΔG = energía libre de Gibbs; ΔH = cambio de entalpía; ΔS = cambio de entropía.
| Compuestos | Alfa Glucosidasa (kcal/mol) | Ureasa (kcal/mol) |
| Acarbosa | −6,90 | - |
| Tiourea | - | −5,80 |
| 3 | −4,35 | −4,50 |
| 4 | −4.10 | −4,30 |
| 8a | −7,165 | −7,624 |
| 8b | −5,20 | −5,45 |
| 8c | −6,80 | −7.10 |
| 9d | −5,10 | −5,35 |
| 9e | −6,70 | −7,30 |
| 9f | −5,00 | −5,25 |
Tabla 3: Puntuaciones de acoplamiento molecular de los compuestos sintetizados frente a α-glucosidasa y ureasa. Puntuaciones de acoplamiento (kcal/mol) de compuestos 8(a–c) y 9(d–f), junto con los inhibidores de referencia acarbosa y tiourea, contra α-glucosidasa y ureasa. Abreviaturas: kcal/mol = kilocalorías por mol.
| Ligando | Momento dipolar (Debye) | HOMO | LUMO | Energía | Ionización | Afinidad electrónica (eV) | Electro- negatividad χ (eV) | Electro- potencial químico μ (eV) | Dureza η (eV) | Suavidad | Electro- Filitía |
| (a.u.) | (a.u.) | Brecha (ΔEBrecha) | Potencial (eV) | S (eV) | ω (eV) | ||||||
| Acarbosa | 8.1124 | -0.1597 | -0.0336 | 0.12612 | 4.345 | 0.913 | 2.629 | -2.629 | 1.716 | 0.291 | 2.015 |
| Tiourea | 7.619 | -0.2193 | -0.0179 | 0.20135 | 5.967 | 0.488 | 3.228 | -3.228 | 2.739 | 0.182 | 1.903 |
| 8a | 8.8025 | -0.2044 | -0.0466 | 0.15788 | 5.566 | 1.266 | 3.416 | -3.416 | 2.15 | 0.233 | 2.71 |
| 8b | 8.2451 | -0.2033 | -0.0467 | 0.15659 | 5.534 | 1.27 | 3.402 | -3.402 | 2.132 | 0.234 | 2.72 |
| 8c | 8.319 | -0.2039 | -0.0555 | 0.14831 | 5.55 | 1.511 | 3.53 | -3.53 | 2.02 | 0.247 | 3.08 |
| 9d | 3.8264 | -0.2065 | -0.0621 | 0.14432 | 5.619 | 1.691 | 3.655 | -3.655 | 1.964 | 0.255 | 3.4 |
| 9e | 4.0969 | -0.2052 | -0.0621 | 0.14302 | 5.584 | 1.691 | 3.637 | -3.637 | 1.947 | 0.257 | 3.4 |
| 9f | 4.298 | -0.2059 | -0.0627 | 0.14324 | 5.604 | 1.704 | 3.654 | -3.654 | 1.95 | 0.256 | 3.42 |
Tabla 4: Descriptores de la teoría del funcional de la densidad (DFT) de los compuestos sintetizados. Cálculos de descriptores químicos cuánticos de los compuestos 8(a–c) y 9(d–f), junto con los compuestos de referencia acarbosa y tiourea, incluyendo energías HOMO y LUMO, brecha de energía HOMO–LUMO (ΔE), potencial de ionización (IP), afinidad electrónica (EA), electronegatividad (χ), potencial químico (μ), dureza química (η), blandez química (S), momento dipolar (D) e índice de electrofiliidad (ω). Abreviaturas: DFT = teoría del funcional de la densidad; HOMO = orbital molecular más ocupado; LUMO = orbital molecular más bajo desocupado; ΔE = brecha energética HOMO–LUMO; IP = potencial de ionización; EA = afinidad electrónica; χ = electronegatividad; μ = potencial químico; η = dureza química; S = suavidad química; D = momento dipolar; ω = índice de electrofilitía.
| Compuesto | JA | RB | HBA | HBD | TPSA (Ų) | iLOGP | LogP de consenso | Absorción gastrointestinal | Permeabilidad BBB | Violaciones de Lipinski | Puntuación de biodisponibilidad | Puntuación de SA |
| 8a | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.86 | 4.41 | 4.71 | Alto | No | 1 | 0.55 | 6.32 |
| 8b | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.06 | 4.41 | 4.62 | Alto | No | 1 | 0.55 | 6.34 |
| 8c | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.26 | 4.41 | 4.11 | Alto | No | 1 | 0.55 | 6.39 |
| 9d | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.95 | 3.08 | 2.75 | Alto | No | 0 | 0.55 | 5.71 |
| 9e | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.82 | 3.08 | 2.27 | Alto | No | 0 | 0.55 | 5.7 |
| 9f | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.85 | 3.08 | 2.77 | Alto | No | 0 | 0.55 | 5.73 |
Tabla 5: Propiedades predichas de absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) de los compuestos sintetizados. Se generaron propiedades fisicoquímicas, farmacocinéticas y de similitud con fármacos predechas de los compuestos 8(a–c) y 9(d–f) utilizando el servidor web SwissADME. Abreviaturas: ADME = absorción, distribución, metabolismo y excreción; MW = peso molecular; LogP = octanol/coeficiente de partición de agua; TPSA = área superficial polar topológica; RB = bonos rotatorios; HBA = aceptor de enlaces de hidrógeno; HBD = donador de enlace de hidrógeno; GI = gastrointestinal; BBB = barrera hematoencefálica; SA = accesibilidad sintética.
Figura suplementaria 1: Validación de acoplamiento mediante reacoplamiento de ligandos nativos. (A) Superposición del ligando cocristalizado (pose de referencia) y acarbosa reacoplada dentro del sitio activo de α-glucosidasa (PDB ID: 5NN8), demostrando una estrecha alineación de conformaciones de unión. (B) Postura de unión de la tiourea dentro del sitio activo de la urease (PDB ID: 4H9M), utilizada para la validación de acoplamiento del sistema de urease, mostrando la preservación de interacciones clave dentro del bolsillo catalítico. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo suplementario 1: Datos de caracterización fisicoquímica y espectros completos de RMN de 1H y 13C de los compuestos 3, 4, 8(a–c) y 9(d–f).Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
Este estudio sintetizó una serie de derivados de acetamida basados en triazol y oxadiazol y evaluó sus propiedades estructurales, biológicas, computacionales y farmacocinéticas. La caracterización espectroscópica mediante HRMS, análisis elemental, RMN de 1H y RMN de 13C confirmó la síntesis exitosa de las moléculas objetivo. Los desplazamientos químicos observados, los patrones de acoplamiento y las resonancias de carbono fueron consistentes con las estructuras propuestas. Las señales características de amida NH, resonancias de metileno, distribuciones de protones aromáticos y señales de carbono cuaternarias confirmaron aún más la incorporación exitosa de las partes acetamida sustituidas tanto en los andamios triazol como oxadiazol. Los rendimientos sintéticos generalmente altos obtenidos para estos derivados demuestran la eficiencia de la vía sintética y sugieren que estos marcos heterocíclicos son susceptibles de modificaciones estructurales adicionales.
Se observó una clara influencia del patrón sustituyente en la actividad inhibitoria de la ureasa. El compuesto 8c, que contenía un sustituyente 2,6-dimetilo, mostró la mayor actividad inhibitoria de la urasa, seguido por los compuestos 8a (2,3-dimetilo) y 9e (2,5-dimetilo), identificando estas moléculas como candidatos prometedores al liderazgo. Se observó una tendencia similar contra α-glucosidasa, con el compuesto 9e mostrando la inhibición más fuerte, mientras que los compuestos 8a y 8c también mostraron una actividad considerable. Dado que los compuestos 8a y 8c solo difieren en las posiciones de los sustituyentes metilo en el anillo aromático, mientras que el compuesto 9e difiere tanto en el patrón de sustitución como en el andamiaje heterocíclico, estos hallazgos sugieren que tanto el patrón de sustitución metilica como la arquitectura de andamiaje contribuyen a la actividad biológica dentro de esta serie. La alta actividad del compuesto 8c puede reflejar una orientación más favorable dentro del sitio activo enzimático, mientras que la fuerte actividad del compuesto 9e sugiere una contribución adicional del andamiaje de oxadiazol junto con el patrón de sustitución 2,5-dimetil. Estas observaciones son coherentes con informes previos que indican que los efectos estéricos derivados de la sustitución fenilológica pueden influir en la unión en el sitio activo en inhibidores enzimáticos basados en triazol yoxadiazol 24,25,26,27. No obstante, establecer una relación estructura–actividad definitiva requerirá la evaluación de una serie mayor de derivadas regioisoméricas.
El análisis de las interacciones entre los compuestos más activos y la albúmina sérica bovina (BSA) mediante el temple por fluorescencia y el análisis termodinámico demostró que los compuestos 8a y 9e seguían un mecanismo mixto de temple estático/dinámico, mientras que el compuesto 8c presentaba predominantemente un temple estático. Los parámetros termodinámicos indicaron que la unión del compuesto 8a estaba impulsada principalmente por enlaces de hidrógeno y interacciones de van der Waals, mientras que las interacciones hidrofóbicas predominaban en la unión de compuestos 8c y 9e. El compuesto 8a mostró la mayor afinidad por la BSA, con una constante de unión de 3,92 × 105 M⁻1 y una energía libre de Gibbs negativa favorable. Estos hallazgos indican una formación estable del complejo proteína-ligando y sugieren el potencial de transporte mediado por albúmina bajo condiciones fisiológicas.
Los hallazgos experimentales fueron reforzados por estudios de acoplamiento molecular, que demostraron que los compuestos 8a, 8c y 9e adoptaron conformaciones favorables de unión dentro de los sitios activos tanto de α-glucosidasa como de urease. Estos compuestos formaron enlaces de hidrógeno con residuos clave, incluyendo D282, A284, D404, R600, D616 y H674 en α-glucosidasa y A636, Q635, R439 y A440 en la ureasa. Interacciones similares se han reportado previamente para inhibidores enzimáticos estructuralmenterelacionados 28,29. La mayor discrepancia entre la puntuación de acoplamiento y la actividad experimental se observó para el compuesto 8a, que mostró la puntuación de acoplamiento más favorable contra α-glucosidasa (−7,165 kcal/mol), mientras que el compuesto 9e mostró la mayor potencia inhibitoria in vitro (IC50 = 27,29 μM). Esta diferencia no es sorprendente porque las puntuaciones de acoplamiento estiman la unión de ligandos dentro de una estructura proteica relativamente rígida y no tienen en cuenta factores como la solubilidad del ligando, la flexibilidad conformacional, la desupación, la dinámica de proteínas u otros efectos de la fase de solución que influyen en los valores de IC50 determinados experimentalmente. En consecuencia, las diferencias entre la afinidad de unión predicha y la actividad biológica medida representan una limitación reconocida del acoplamiento molecular más que una contradicción entre los resultados computacionales y experimentales. En general, los datos de acoplamiento e inhibición enzimática identifican de forma consistente los compuestos 8a, 8c y 9e como los derivados más prometedores de esta serie.
Las propiedades electrónicas de los compuestos más activos fueron investigadas más a fondo mediante análisis de orbitales moleculares de frontera (FMO) y potencial electrostático molecular (MEP). Los compuestos con brechas energéticas HOMO–LUMO más bajas generalmente mostraron mayor reactividad electrónica, consistente con estudios previos de DFT sobre derivados estructuralmente relacionados a base de triazol yoxadiazol 30. Entre los compuestos sintetizados, 8a, 8c y 9e mostraron brechas de energía relativamente pequeñas entre HOMO–LUMO, lo que indica características favorables de transferencia electrónica. Sus mapas MEP revelaron regiones distintas ricas y deficientes en electrones, con los compuestos 8c y 9e mostrando regiones nucleofílicas particularmente pronunciadas que pueden contribuir a sus favorables interacciones enzimáticas y actividades biológicas. Los descriptores de reactividad global apoyaron aún más los hallazgos experimentales y computacionales. El compuesto 9e mostró una combinación favorable de potencial de ionización, afinidad electrónica, suavidad e índice de electrofilicidade, mientras que los compuestos 8a y 8c mostraron valores de suavidad comparativamente altos, consistentes con sus fuertes actividades inhibitorias. La mayor electrofilicidade y suavidad observadas en la serie 9, especialmente en el compuesto 9e, pueden contribuir a interacciones más fuertes con los residuos catalíticos y a una mayor actividad biológica.
In silico El perfil ADME de compuestos 8(a–c) y 9(d–f) predijo características farmacocinéticas favorables, incluyendo alta absorción gastrointestinal, semejanza aceptable con fármacos y biodisponibilidad oral satisfactoria. No se identificaron grandes responsabilidades de ADME dentro de los parámetros evaluados. En conjunto, los datos biológicos in vitro , el análisis de unión a BSA, el acoplamiento molecular, los cálculos de DFT y las predicciones in silico de ADME apoyan la investigación continua de estos derivados de acetamida basados en triazol y oxadiazol como inhibidores duales de la urasa y la α-glucosidasa.
En conjunto, estos hallazgos identifican los compuestos 8a, 8c y 9e como candidatos prometedores para desarrollar derivados de acetamidas basados en triazol y oxadiazol dirigidos a la ureasa y α-glucosidasa. Los datos combinados espectroscópicos, biológicos, de unión a BSA, acoplamiento molecular, DFT y ADME proporcionan una base sólida para futuros estudios. Las investigaciones adicionales deberían incluir simulaciones de dinámica molecular para evaluar la estabilidad proteína-ligando a lo largo del tiempo, estudios cinéticos enzimáticos para determinar el mecanismo de inhibición y extensión del análisis de unión a la BSA a los derivados restantes. Finalmente, serán necesarios estudios in vivo para validar los prometedores hallazgos in vitro e in silico y para evaluar más a fondo el potencial terapéutico de esta serie de compuestos.
Divulgaciones
El autor declara que no existe conflicto de intereses
Agradecimientos
El autor expresa su agradecimiento a la Facultad de Farmacia Clínica de la Universidad Al Baha, Arabia Saudí.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1-Naphthylamine | Merck | 106148 | Amina aromática utilizada para la preparación de análogos sustituidos |
| 2,5-Dimethylaniline | Sigma-Aldrich | D146706 | Amina aromática utilizada para la síntesis de derivados sustituidos |
| 3,4-Dimethylaniline | Alfa Aesar | A15416 | Amina aromática utilizada para la preparación de análogos estructurales |
| Benzoic Acid | Sigma-Aldrich | 242381 | Material de partida para la síntesis del intermedio benzohidrazida |
| Bromoacetyl Bromide | Sigma-Aldrich | B17601 | Reactivo electrófilo utilizado en la síntesis de intermedios de bromoacetamida |
| Carbon Disulfide | Sigma-Aldrich | 289116 | Reactivo clave para la ciclización al sistema de anillo oxadiazol |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Disolvente utilizado en procesos de extracción y purificación |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056 | Disolvente polar aprótico utilizado en reacciones de derivatización y sustitución |
| Diphenylamine | Sigma-Aldrich | D23802 | Amina aromática utilizada en la síntesis de compuestos derivados |
| Epik (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Utilizado para generar estados de ionización del ligando a pH 7.0; RRID: N/A |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Disolvente de reacción para la esterificación y formación de hidrazida |
| Ethyl Acetate | Sigma-Aldrich | 270989 | Componente polar de fase móvil en análisis TLC y extracción |
| Gaussian 09, Revision D.01 (Gaussian 09W) | Gaussian, Inc. | N/A (software) | Software utilizado para cálculos de DFT (HOMO-LUMO, MESP, descriptores de reactividad global); RRID:SCR_014897 |
| GaussView 5 | Gaussian, Inc., Wallingford, CT, USA | N/A (software) | Utilizado para la visualización de estructuras optimizadas y energías orbitales; RRID: N/A |
| Glide (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Software de acoplamiento utilizado para la generación de cuadrícula de receptores y acoplamiento molecular extra-precisón (XP); RRID:SCR_000187 |
| GraphPad Prism, version 9 | GraphPad Software, Boston, MA, USA | N/A (software) | Utilizado para análisis de regresión de IC50 y evaluación estadística de datos de inhibición enzimática; RRID:SCR_002798 |
| Hydrazine | Sigma-Aldrich | 225819 | Reactivo utilizado para la conversión de éster a benzohidrazida |
| L(+)-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Reactivo utilizado en estudios de evaluación biológica |
| LigPrep (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Utilizado para la optimización de estructura del ligando y generación de conformeros 3D; RRID:SCR_016746 |
| Lithium Hydride | Sigma-Aldrich | 201049 | Catalizador utilizado para la activación del grupo tiol en reacciones de sustitución |
| Maestro (v13.2, Schrödinger Release 2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Paquete de modelado molecular utilizado para la preparación y visualización de estructuras de proteínas/ligandos; RRID:SCR_016748 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Disolvente utilizado en preparaciones de purificación y ensayos biológicos |
| n-Hexane | Merck | 104391 | Componente de fase móvil no polar en análisis TLC |
| OPLS-2005 / OPLS-AA | Schrödinger, LLC | N/A (campo de fuerza) | Campo de fuerza utilizado para la minimización de energía de estructuras de proteínas y ligandos; RRID: N/A |
| Phenyl Isothiocyanate | Merck | 807028 | Reactivo utilizado en la síntesis de derivados de triazol |
| Protein Preparation Wizard (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (software) | Utilizado para el refinamiento de la estructura del receptor antes del acoplamiento; RRID:SCR_016749 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | Base utilizada para el ajuste de pH y neutralización de reacciones |
| Sulfuric Acid | BDH | 10276 | Catalizador ácido utilizado en la etapa de esterificación bajo condiciones de reflujo |
| Trimethylamine | Riedel-de Haen | 22129 | Base orgánica utilizada durante la síntesis de derivados sustituidos |
| VESTA, version 3.5.8 | Momma & Izumi (desarrolladores); distribuido libremente | N/A (software) | Utilizado para la visualización del potencial electrostático molecular (MESP) y mapas de superficie HOMO-LUMO; RRID: N/A |
Referencias
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