Evaluación de la eficiencia de la transducción y la orientación celular por péptidos penetrantes en células en el pulmón del ratón

Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo integrado para evaluar la eficiencia de la transducción y la especificidad celular de péptidos penetrantes en células, utilizando el péptido ciclado R11A (cR11A; KAPWHLSSQYSAT) como ejemplo. El flujo de trabajo combina FACS de fracción emparejada seguido de secuenciación de ARN unicelular, citometría de flujo en ratones reporteros AT2 e imágenes con pila z confocal para confirmar el compromiso del objetivo peptídico asociado a AT2.

Resumen

Los péptidos penetrantes celulares (CPPs) son péptidos cortos (5–30 aminoácidos) capaces de atravesar las membranas celulares y transportar cargas macromoleculares sin necesidad de reactivos de transfección. Sin embargo, definir la selectividad celular in vivo requiere validación a nivel de tipo celular. Se presenta un flujo de trabajo integrado para evaluar la eficiencia de transducción de un CPP ciclizado marcado con Cy5.5, cR11A, dentro de células epiteliales alveolares tipo II (AT2) tras la inyección intravenosa retroorbital en ratones. Los pulmones se extrajeron a los 15 o 60 minutos de la inyección y se analizaron utilizando lecturas complementarias, incluyendo la clasificación celular activada por fluorescencia por fracción emparejada (FACS) para aislar suspensiones unicelulares de pulmón Cy5.5⁺ y Cy5.5⁻, seguidas de secuenciación de ARN unicelular, citometría de flujo de células individuales pulmonares de Sftpc-CreERT2^(+/−); ratones reporteros ^{LSL-GFP(+/−)} AT2 para cuantificar eventos GFP⁺/Cy5.5⁺, e imágenes confocales de pila z de criosecciones pulmonares para confirmar la colocalización de cR11A-Cy5.5 con señal asociada a AT2. Este protocolo proporciona evidencia concordante de acoplamiento con tipos celulares utilizando múltiples lecturas complementarias y proporciona un marco reproducible para evaluar la segmentación específica de células de CPP, con modificaciones para diferentes órganos objetivo.

Introducción

Los péptidos penetrantes celulares (CPPs) son péptidos de 5 a 30 aminoácidos que pueden atravesar las membranas celulares y facilitar la entrega intracelular de cargas macromoleculares en una forma intacta y completamente funcional, sin necesidad de reactivos de^{transfección 1,2}. Trabajos previos utilizando metodologías combinatorias de exhibición de fagos in vitro y in vivo identificaron un péptido de 12 aminoácidos dirigido al corazón (APWHLSSQYSRT) que es absorbido específicamente por los cardiomiocitos en tan solo 5 min ^3,4. Para investigar su mecanismo de transducción, se realizó una gammagrafía alanina que llevó al descubrimiento de dos variantes, S7A y R11A (APWHLSSQYSAT), que inesperadamente exhibieron enriquecimiento pulmonar in vivo. y por ello se denominaron péptidos dirigidos al pulmón (LTPs⁾⁵. Además, la adición de lisina N-terminal y la ciclización de cabeza a cola generaron una versión cíclica de R11A (cR11A) con una estabilidad sérica significativamente mejorada y una absorción intracelular notablemente mejorada en comparación con su contraparte^{lineal 5}.

Las LTP tienen el potencial de administrar terapias con precisión a poblaciones epiteliales distales pulmonares, incluidas las células epiteliales alveolares tipo II (AT2). Estas células son fundamentales para mantener la homeostasis del surfactante y actúan como progenitoras de la regeneración^{alveolar 6}. Sin embargo, un gran desafío en el desarrollo de la LTP es la evaluación rigurosa de la selectividad celular in vivo. La biodistribución a nivel de órganos por sí sola no puede distinguir la verdadera transducción celular de la señal vascular, la retención extracelular o la eliminación fagocítica, por lo que debe complementarse con mediciones resueltas por células^{individuales 7}. Para abordar esta limitación, este flujo de trabajo integra asignación transcriptómica de célula única, citometría de flujo basada en reporteros e imagen con pila z confocal para generar evidencia a nivel celular de compromiso péptido más allá de las lecturas de fluorescencia o biodistribución a nivel de órgano ^8,9.

El objetivo general de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo reproducible y multi-lectura para validar la eficiencia de transducción in vivo y la especificidad celular de cR11A marcado con Cy5.5 en el pulmón distal, con un enfoque en las células AT2 tras la inyección retroorbital. El protocolo define la identidad celular asociada a péptidos utilizando lecturas complementarias e independientes, incluyendo la clasificación celular activada por fluorescencia por fracción emparejada (FACS) (Cy5.5⁺ vs Cy5.5⁻) seguida de secuenciación de ARN unicelular para mapear poblaciones asociadas a péptidos, evaluación cuantitativa de captación en pulmones reporteros de AT2 mediante citometría de flujo, e imagen confocal z-stack de criosecciones pulmonares para confirmar la colocalización de cR11A-Cy5.5 con señal asociada a AT2. Este protocolo puede adaptarse fácilmente a otros LTP o vectores de administración y aplicarse a los sistemas pulmonares u otros órganos para evaluar la especificidad celular de las CPP en desarrollo. Es especialmente adecuado para aplicaciones que requieren validación a nivel celular de la dirección de CPP in vivo, en lugar de evaluar únicamente la acumulación a nivel orgánico.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron conforme a las directrices del Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) de la Clínica Mayo y fueron aprobados bajo el protocolo número A00006842-22-R25. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento animal y garantizar una manipulación ética en cumplimiento de las normativas nacionales e institucionales pertinentes. Las herramientas de investigación utilizadas para este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Animales

1. Utiliza ratones adultos mixtos C57BL/6J (6–8 semanas) obtenidos en The Jackson Laboratory (cepa #000664).
2. Para cuantificación específica de AT2, se utiliza Sftpc-CreERT2^(+/+) (Deformación Jax #028054) cruzada con ^LSL-GFP(+/+) (Deformación Jax #007906) para generar Sftpc-CreERT2^(+/−); Ratones reporteros LSL-GFP^(+/−) AT2.
3. Ratones domésticos en jaulas ventiladas individualmente. Asegúrese de que todos los protocolos de los animales estén aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal.
4. Realizar inducción de tamoxifeno en Sftpc-CreERT2^(+/−); Ratones ^{LSL-GFP(+/−).} Cuando los ratones tengan ≥6 semanas, administra 100 mg/kg de tamoxifeno disuelto en aceite de maíz mediante gavage oral durante tres dosis a lo largo de 7 días. Realizar experimentos al menos 2 semanas después de la dosis final para permitir la máxima eficiencia de recombinación.

2. Preparación de reactivos y equipos

1. Prepara anestesia (mezcla funcional ketamina/xilazina).
   1. Prepara una solución de trabajo de 5 mL: ketamina (1 mL de 50 mg/mL), xilazina (50 μL de 100 mg/mL) y solución salina estéril (3,95 mL).
   2. Administra 1 μL/g de peso corporal mediante .Inyección intraperitoneal (dosis final: 10 mg/kg de ketamina y 1 mg/kg de xilazina).
2. Prepara el péptido (cR11A-Cy5.5).
   1. Obtén CPPs en polvos liofilizados. Almacenar los polvos a −20 °C durante hasta 2 años o como soluciones de serie en DMSO a −80 °C durante hasta 6 meses en tubos protegidos de la luz. Evita los ciclos de congelación y deshielo y minimiza la exposición a la luz. Prepara una solución de 10 mM de cR11A-Cy5.5 en DMSO.
   2. Pesa el ratón, calcula la dosis y diluye el fondo a 1 mg/kg en agua sin nucleasas hasta un volumen final de 100 μL por ratón.
3. Prepara el buffer de digestión (fresco; mantenlo en hielo).
   1. Preparar un buffer digestivo que contenga 2 mg/mL de Dispasa II, 0,1 mg/mL de DNasa I, DMEM/F12 y 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina.
   2. Usa 3 mL por ratón.
4. Prepara un tampón de lavado enzimático de proteasa inespecífico (mantenlo en hielo).
   1. DMEM/F12 que contiene 0,05 mg/mL de DNasa I y 1% (v/v) penicilina-estreptomicina.
   2. Usa 10 mL por ratón.
5. Prepara un buffer de lisis de glóbulos rojos (mantenlo en hielo).
   1. Diluye el buffer de lisis del 10× a 1× con PBS.
   2. Usa 2 mL por muestra.
6. Prepara el buffer de perfusión.
   1. Usa DMEM/F12 bien frío (10 mL por ratón).
7. Prepara el buffer de lavado.
   1. Usa DMEM/F12 con un 2% de FBS.
8. Preenfriar las centrifugadoras a 4 °C.

3. Administración retroorbital de cR11A-Cy5.5

1. Anestesiar al ratón usando la solución activa ketamina/xilazina. Confirma la anestesia adecuada por la ausencia de retirada de las extremidades en respuesta al pinchazo en el dedo del pie.
2. Inyectar 100 μL de cR11A-Cy5,5 (1 mg/kg) mediante inyección intravenosa retroorbital usando una jeringuilla de insulina.
3. Inicia el temporizador y mantén el ratón en una almohadilla térmica bajo la supervisión adecuada durante 15 o 60 minutos.

4. Extracción y perfusión pulmonar

1. Eutanasia al ratón según protocolos aprobados (por ejemplo, inhalación de CO₂ seguida de luxación cervical). Coloca al ratón en posición supina y rocía el tórax con un 70% de etanol.
2. Abre la cavidad torácica para exponer el corazón y los pulmones.
3. Haz una incisión en la aurícula derecha para permitir el drenaje durante la perfusión.
4. Inserta una aguja de 26 G unida a una jeringuilla de 10 mL que contiene DMEM/F12 helado en el ventrículo derecho. Mantén la incisión auricular derecha abierta durante toda la perfusión para permitir el drenaje.
5. Perfunda manualmente sin bomba de jeringuilla, inyectando lenta y de forma constante 10 mL de DMEM/F12 durante aproximadamente 1-2 minutos. Mantenga una presión baja durante la inyección y evite que se sobrehinche o se filtre visiblemente en la pared ventricular. Continúa hasta que los pulmones se pongan uniformemente pálidos.

5. Inflación pulmonar y digestión

1. Anula la tráquea con un catéter intravenoso de 20G y asegura con sutura de seda 3-0. Inculca 1 mL de buffer digestivo con una jeringuilla de 1 mL para inflar los pulmones.
2. Diseccionar los pulmones como una sola unidad intacta y transfiere inmediatamente a un plato preenfriado de 100 mm sobre hielo.
3. Separar los lóbulos pulmonares y transferirlos a un tubo cónico de 15 mL que contiene 2 mL de amortiguador de digestión en frío (un pulmón por tubo).
4. Incubar a 4 °C durante 20 horas sobre un balancín giratorio (10–15 rpm).
   NOTA: Consulte Janas PP. et ^al.10 para una metodología detallada.

6. Disociación tisular

1. Coloca un colador de celda de 100 μm sobre un tubo cónico de 50 mL y prehumedece con un tampón de lavado enzimático proteasa no específico de 1 mL.
2. Transfiere tejido pulmonar al colador y disocia suavemente usando un émbolo de jeringuilla estéril.
3. Enjuaga con un tampón de lavado enzimático proteasa inespecífico de 10 mL.
4. Centrifugar a 130 × g durante 15 minutos a 4 °C.
5. Resuspende el pellet en un tampón de lisis de 2 mL de 1× glóbulos rojos durante 90 s a temperatura ambiente.
6. Apagar la lisis con un tampón de lavado de 10 mL.
7. Filtra con un colador de 40 μm y enjuaga con buffer de lavado.
8. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
9. Resuspender las células en 500–1.000 μL PBS + 2% FBS (≥1 × 10⁶ celdas/mL).
10. Pasa a través de un tapón de filtro de 35 μm hacia un tubo FACS.
    NOTA: Consulte Konishi S. et ^al.11 para una metodología detallada.

7. Ordenamiento FACS por fracciones emparejadas

1. Realiza la clasificación usando un citómetro de flujo.
2. Utiliza pulmones inyectados con PBS como control negativo para definir la compuerta Cy5.5.
3. Aplica la barrera estándar: exclusión de residuos, singlets y celdas Cy5.5⁺.
4. Ordenar las poblaciones de Cy5.5⁺ y Cy5.5⁻ en tubos separados.

8. preparación de muestras de scRNA-seq

1. Guarda las muestras clasificadas en hielo.
2. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C y resuspender en un tampón de 500 μL.
3. Procede solo si la viabilidad es ≥80%.
4. Prepara las bibliotecas y la secuenciación según sea necesario.

9. Citometría de flujo en ratones reporteros AT2

1. Preparar suspensiones pulmonares de célula única según se describe en las Secciones 5–6.
2. Tinte con un tinte vivo/muerto que se pueda arreglar (1:1.000) durante 30 minutos (protege de la luz).
3. Lavar y centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
4. Filtra y guarda las muestras en hielo.
5. Obtener datos sobre un citómetro de flujo.
6. Realizar gating para identificar células, seleccionar singletes, excluir células muertas y definir poblaciones de GFP y Cy5.5.
   1. Cuantifica los eventos GFP⁺/Cy5.5⁺ como porcentaje de células GFP⁺.

10. Fijación y crioprotección

1. Infla los pulmones con 1 mL de PFA al 4% y asegura la tráquea.
2. Corrige con 10 mL de PFA al 4% durante la noche a 4 °C.
3. Lava con PBS (3×).
4. Incuba en un 15% de sacarosa durante la noche.
5. Transfiere al 30% de sacarosa durante ~48 horas.

11. Incrustación y criosección

1. Prepara los moldes criogénicos con OCT y posiciona los pulmones e incrusta en OCT.
2. Congela usando nitrógeno líquido. Guarda a ˗80 °C.
3. Sección a 10 μm tras la equilibración. Se seca al aire durante la noche.

12. Imagen y análisis

1. Lava las secciones con PBS (3×).
2. Monta con un medio DAPI.
3. Consigue pilas z confocales.
4. Utiliza la configuración de imagen adecuada.
5. Realizar reconstrucción 3D.
6. Cuantifica la colocalización usando umbrales consistentes.
   Métodos opcionales:
   Estos métodos opcionales no se incluyen en el flujo de trabajo representativo, pero pueden incorporarse para permitir el agotamiento o análisis de la población de células inmunitarias CD45⁺, que constituye una gran proporción de células^{pulmonares 12}.
   NOTA: Utiliza la depleción o exclusión de CD45⁺ cuando el análisis se centra en poblaciones pulmonares no inmunitarias, ya que estos pasos eliminan o separan las señales de captación de células inmunitarias y alteran la composición celular de la muestra. La tinción CD45 también puede utilizarse para analizar por separado la población de células inmunitarias CD45⁺.

13. Agotar la población celular CD45⁺

1. Tras la disociación tisular (Paso 6), utiliza un anticuerpo CD45 conjugado a una perla magnética (Miltenyi Biotech 130-052-301) o un anticuerpo CD45 conjugado a un fluoróforo compatible con Cy5.5, GFP y la tinción viva/muerta, por ejemplo CD45-BV605 (BioLegend #103140). Tinta durante 20 minutos a 4°C en la oscuridad.
2. Si realizas la reducción de perlas magnéticas CD45, sigue las instrucciones del fabricante para usar la columna de Agotamiento de Linaje (LD) (Miltenyi Biotech 130-042-901) y procede con la Separación de Células Magnéticas (MACS) (Miltenyi Biotech). Luego procede a la ordenación FACS por fracciones emparejadas (paso 7).
3. Si se realiza la depleción del CD45 usando un anticuerpo conjugado fluorescente, primero lava la suspensión celular con tampón de lavado para eliminar el exceso de anticuerpo. Luego procede al paso 7. Tras establecer compuertas para excluir dobletes y escombros (Paso 7.3), insertar una compuerta adicional para excluir la población CD45⁺ . Luego procede al paso 7.4.

14. Analizar la población celular CD45⁺ durante la citometría de flujo

1. Después del paso 9.3, utiliza un anticuerpo CD45 conjugado a un fluoróforo compatible con Cy5.5, GFP y la tinción viva/muerta, por ejemplo CD45-BV605 (BioLegend #103140). Tinta durante 20 minutos a 4°C en la oscuridad.
2. Lava la suspensión celular con buffer de lavado para eliminar el exceso de anticuerpo. Luego procede al paso 9.4. Tras establecer compuertas para excluir dobletes y escombros (Paso 9.6), insertar una compuerta adicional para excluir a la población CD45⁺ antes de establecer las poblaciones ^GFP+ y Cy5.5^{+ 12}.

Resultados

La aplicación exitosa de este protocolo debería generar evidencia concordante a partir de tres lecturas complementarias: scRNA-seq de fracción emparejada, citometría de flujo basada en reporteros e imagen confocal de pila z (z-stack).

En el análisis de scRNA-seq de fracciones emparejadas, se recuperaron fracciones unicelulares pulmonares de Cy5,5⁻ y Cy5,5⁺ tras la administración sistémica de cR11A-Cy5.5 y se analizaron por separado. La visualización UMAP identificó las principales poblaciones celulares pulmonares, incluyendo compartimentos inmune, endotelial, epitelial y mesenquimalesa (Figuras 1A, B). Aunque las células inmunitarias representaban la población dominante en ambas fracciones clasificadas, la fracción Cy5,5⁺ mostró un enriquecimiento relativo de compartimentos no inmunes, incluidas las células epiteliales (Figura 1C). El análisis de subconjuntos epiteliales mostró una mayor representación de células AT2 en la fracción Cy5,5⁺ que en la fracción Cy5,5⁻, mientras que las células AT1 se mantuvieron bajas en ambas fracciones (Figura 1D). Estos resultados indican que el scRNA-seq de fracción emparejada puede identificar el enriquecimiento de células AT2 dentro de la fracción celular pulmonar cR11A-Cy5.5–positiva.

Se utilizó citometría de flujo para cuantificar la señal de cR11A-Cy5.5 dentro de células AT2 definidas por reporteros. La compuerta representativa incluyó la selección de celdas totales mediante FSC-A/SSC-A, dos compuertas singlete secuenciales, gating de células vivas y GFP final contra ella. Análisis Cy5.5 (Figuras 2A–E). En la muestra de control, los eventos GFP⁺/Cy5.5⁺ fueron mínimos, estableciendo el umbral de fluorescencia de fondo. Tras la administración de cR11A-Cy5.5, los eventos positivos de la respuesta a GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2 aumentaron al 7,99% a los 15 minutos y al 7,41% a los 60 minutos post-inyección en este conjunto representativo (Figura 2E). Estos resultados apoyan la señal detectable de cR11A-Cy5.5 en células reporteras positivas de AT2 in vivo.

La imagen confocal z-stack proporciona validación espacial de la fluorescencia asociada a péptidos en secciones de tejido pulmonar. Se incluyó un control no reportero para evaluar la fluorescencia de fondo y mostró señal mínima en los canales GFP y Cy5.5. En pulmones reporteros AT2 tratados con cR11A-Cy5.5, se detectó fluorescencia de Cy5.5 en proximidad a células reporteras positivas de GFP⁺ AT2, y el canal de colocalización generado por Imaris identificó solapamiento entre las señales de GFP y Cy5.5 (Figura 3A). El análisis representativo de colocalización de Imaris mostró una colocalización del 89,6% y 86,8% dentro del compartimento GFP⁺ AT2 a los 15 minutos y 60 minutos, respectivamente (Figura 3B).

Los resultados subóptimos pueden incluir alta fluorescencia de Cy5.5 de fondo en muestras control, pobre recuperación de células epiteliales, baja viabilidad celular o débil separación de eventos GFP⁺/Cy5.5⁺. Estos problemas suelen indicar perfusión incompleta, alteración excesiva de tejidos, compensación inadecuada o umbrales de imagen inconsistentes.

Figura 1: El scRNA-seq de fracción emparejada identifica el enriquecimiento del epitelio alveolar en la fracción pulmonar cR11A-Cy5.5–positiva. Las suspensiones monocelulares pulmonares se clasificaron en fracciones de Cy5.5⁻ y Cy5.5⁺ tras la inyección retroorbital de cR11A-Cy5.5, y cada fracción fue analizada mediante secuenciación de ARN unicelular. (A) Los gráficos UMAP muestran los grupos de tipos celulares en fracciones emparejadas de un ratón representativo. (B) La superposición UMAP muestra la distribución de las células Cy5.5⁻ y Cy5.5⁺. Las regiones circuladas en (A) y (B) indican el compartimento epitelial resaltado para el análisis de subconjuntos epiteliales. (C) Las poblaciones inmunitarias son muy prevalentes en ambas partes, representando más del 80% de cada una. En comparación con la fracción Cy5,5⁻, la fracción Cy5,5⁺ contiene una mayor proporción de poblaciones endoteliales, epiteliales y mesenquimales, lo que indica la captación de cR11A dentro de estas poblaciones. (D) Dentro de la población epitelial, las células AT2 están más representadas en la fracción Cy5.5⁺ que en la fracción Cy5.5⁻, mientras que las células AT1 permanecen bajas en ambas fracciones. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Validación por citometría de flujo de la captación de cR11A-Cy5.5 en pulmones reportadores de AT2. A ratones reporteros AT2 se les administró cR11A-Cy5.5 mediante inyección intravenosa retroorbital, y se extrajeron pulmones a los 15 o 60 minutos después de la inyección para la preparación unicelular. Se muestra una compuerta representativa para muestras tratadas con un control de vehículo PBS (Ctrl) y cR11A-Cy5.5: (A) las células fueron seleccionadas por FSC-A/SSC-A, (B, C) los singlets fueron controlados por exclusión de dobles por dispersión, (D) las células vivas identificadas por exclusión de colorante de viabilidad, y (E) GFP (reporte AT2) contra. Cy5.5 se utilizó para cuantificar eventos GFP⁺/Cy5.5⁺. En este conjunto de datos representativo, los eventos AT2 de GFP⁺/Cy5.5⁺ fueron aproximadamente del 8% tanto a los 15 minutos como a los 60 minutos posteriores a la administración de cR11A-Cy5.5. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Imagen confocal y análisis de colocalización de Imaris de la captación de cR11A-Cy5.5 en pulmones reporteros de AT2. (A) Se muestran campos representativos para un control no reportante (Ctrl) y un reportero AT2 tratado con cR11A-Cy5.5, extraídos a 15 o 60 minutos después de la inyección para criosección e imagen confocal z-stack. La señal GFP (verde) marca las células AT2, y la fluorescencia cR11A-Cy5.5 (rojo) indica señal asociada a péptidos. El panel "Coloc" muestra píxeles u objetos clasificados como colocalizados por Imaris (amarillo), y las imágenes fusionadas ilustran la superposición espacial entre ambos canales. El control no reportante se incluyó para evaluar la fluorescencia de fondo en los canales GFP y Cy5.5. (B) La cuantificación de la colocalización dentro del compartimento GFP⁺ AT2 muestra que el 89,6% y el 86,8% de la señal GFP se colocalizaron con cR11A-Cy5,5 a los 15 minutos y 60 minutos, respectivamente. Estos datos indican una superposición robusta con las celdas GFP⁺ AT2 en ambos momentos, lo que apoya el acoplamiento preferencial del compartimento AT2 in vivo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

Este protocolo identifica la dirección peptídica de poblaciones celulares específicas utilizando múltiples lecturas independientes que operan a resoluciones complementarias: mapeo a nivel de transcriptoma (scRNA-seq de fracción emparejada), medición cuantitativa basada en eventos (citometría de flujo reportero) y confirmación espacial (pilas z confocales). En conjunto, estos enfoques reducen ambigüedades comunes inherentes a los estudios basados en fluorescencia o biodistribución masiva a nivel de órgano, como la fluorescencia vascular confundente o la retención extracelular, así como la incapacidad de asignar señal asociada a péptidos a poblaciones celulares pulmonares^{específicas 7}.

Varios pasos requieren una atención especial. La calidad de la perfusión afecta fuertemente a la fluorescencia de fondo y al rendimiento de clasificación posterior; la perfusión suficiente se caracteriza por una apariencia uniforme y blanco marfil de todos los lóbulos pulmonares, mientras que la perfusión incompleta puede elevar la señal de Cy5.5 en compartimentos no objetivo. Para la disociación tisular, se utiliza una digestión prolongada en frío (4 °C, 20 h) en lugar de condiciones digestivas típicas (37 °C, 1–2 horas) para preservar las poblaciones epiteliales y mejorar la recuperación de células frágiles, especialmente las células alveolares tipo I (AT1^{) 10}. Las células AT1 se pierden fácilmente durante el aislamiento porque su morfología grande y delgada las hace muy sensibles a la digestión mecánica. Más allá de las prácticas estándar de laboratorio, incluyendo digestión consistente, compensación, gating y umbral, el análisis de colocalización 3D ayuda a determinar si la señal peptídica se solapa con la señal reportera AT2 en lugar de depender únicamente de la superposición de fluorescencia^{bidimensional 13}.

Se puede considerar un paso de agotamiento celular inmunitario CD45⁺ antes de la cuantificación de la secuencia de ARNsc-seq o de la citometría de flujo. Las células inmunitarias constituyen una gran proporción de las poblaciones celulares pulmonares y pueden absorber CPPs como parte de una respuesta inmunitaria típica a partículas extrañas. Para cuantificar con mayor precisión la captación de CPP en poblaciones no inmunes, incluyendo compartimentos endoteliales, epiteliales y mesenquimales, la depleción celular CD45⁺ puede mejorar la sensibilidad. Esto puede lograrse mediante agotamiento basado en perlas antes de la clasificación o excluyendo las células CD45⁺ durante el análisis de citometría^{de flujo 12}. Sin embargo, esta modificación debe usarse selectivamente porque elimina la información de captación de células inmunitarias y altera la composición celular de la muestra analizada.

Deben considerarse varias limitaciones de este flujo de trabajo. La fluorescencia Cy5.5 identifica la señal asociada a péptidos, pero por sí sola no distingue el péptido internalizado de la señal adherida a la membrana o pericelular. El scRNA-seq de fracción pareada también se ve afectado por la disociación tisular, la recuperación celular, los umbrales de clasificación y la abundancia relativa de cada población celular pulmonar. Por lo tanto, poblaciones raras como las células basales o los ionocitos pueden estar infrarrepresentadas o pasar por alto. La citometría de flujo de ratón reportero proporciona una asignación de tipos celulares más fuerte, pero requiere una línea reportera adecuada o un panel de anticuerpos validado. Además, un control de vehículo utilizando ratones reporteros definiría mejor la colocalización de fondo dentro de las células GFP⁺ AT2 en ensayos de imagen. Por tanto, la interpretación debe basarse en evidencia concordante entre el scRNA-seq, la citometría de flujo e imagen confocal, en lugar de una lectura única.

Este flujo de trabajo es modular y puede adaptarse a fluoróforos alternativos, líneas de ratones reporteros, regímenes de dosificación o puntos de tiempo de cosecha. Para estudios que desarrollen CPPs adicionales específicas de células u órganos, el diseño de scRNA-seq de fracción emparejada puede aplicarse con modificaciones a otros órganos (por ejemplo, hígado, riñón o cerebro). Este protocolo proporciona un enfoque eficiente para comparar poblaciones asociadas a péptidos dentro de un solo órgano del mismo animal, mejorando así la interpretabilidad y reduciendo la variabilidad entre animales. Las aplicaciones futuras incluyen el cribado de CPPs adicionales, la prueba de conjugados CPP–carga, la comparación de diseños de péptidos lineales y cíclicos, y la aplicación del flujo de trabajo a modelos de enfermedades en los que se altera la arquitectura tisular o la abundancia de células objetivo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anti-mouse CD45-BV605 antibody	BioLegend	103140	Utilizado para la identificación o exclusión de células CD45+
C57BL/6J ratones	The Jackson Laboratory	Strain #000664	Ratones salvajes utilizados para experimentos
CD45 MicroBeads, ratón	Miltenyi Biotec	130-052-301	Utilizado para la depleción magnética de células CD45+
Contador de células	Invitrogen	Countess 3; AMQAX2000	Conteo automatizado de células
Incubadora de CO2	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i; TSH160IDS	Incubación celular
Microscopio confocal	Zeiss	LSM 980; 1872-551	Utilizado para la adquisición de imágenes z-stack
péptido cR11A-Cy5.5	Mayo Clinic Proteomics Core	Síntesis personalizada; no hay número de catálogo	CPP fluorescentemente marcado utilizado para la entrega in vivo
Criostatos	Leica Biosystems	Leica CM1950	Utilizado para la sección de tejidos
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	Enzima utilizada para la digestión de tejido pulmonar
DMEM/F12	Gibco	11330-032	Tampon de disociación y lavado celular
DNase I	Roche	10104159001	Reduce la agrupación celular mediada por ADN
Ordenador FACS	BD Biosciences	BD FACSAria II, sistema de 4 láseres	Utilizado para la clasificación de células Cy5.5+ y Cy5.5-
FBS	Gibco	A52567-01	Añadido a los tampones para mejorar la viabilidad celular
Software FlowJo	FlowJo	Versión 10.10.0	Análisis de datos de citometría de flujo
Software GraphPad Prism	GraphPad Software	Versión 10	Análisis estadístico y trazado
Software Imaris	Oxford Instruments	Versión 9.9.1	Visualización 3D y análisis de colocalización
Agitador orbital incubado	Thermo Scientific	Solaris; 01-258-086	Utilizado para la digestión de tejidos
Ketamina	WestWard (Hikma)	NDC 0143-9508-01
Columnas LD	Miltenyi Biotec	130-042-901	Utilizado para la separación magnética de células (MACS)
Columnas LD	Miltenyi Biotec	130-042-901
Kit de tinción de células muertas amarillas fijables vivas/muertas	Invitrogen	L34968	Utilizado para la tinción de viabilidad en citometría de flujo
Kit de tinción de células muertas amarillas fijables vivas/muertas	Invitrogen	L34968
Ratones reporteros LSL-GFP	The Jackson Laboratory	Strain #007906	Línea reportera de GFP inducible por Cre
Ratones reporteros LSL-GFP	The Jackson Laboratory	Strain #007906
Microcentrifugadora	Eppendorf	EPP-5427R	Centrifugación de muestras
Microcentrifugadora	Eppendorf	EPP-5427R
Medio de montaje con DAPI	Abcam	AB104139	Contratinción nuclear para imagen
Medio de montaje con DAPI	Abcam	AB104139
Agua libre de nucleasas	Qiagen	175034992
Agujero de gavage oral	Braintree Scientific	N-PK 020
PBS	Gibco	10010-023	Tampon de lavado general
PBS	Gibco	10010-023
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140-122	Previene la contaminación bacteriana
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140-122
Centrífuga refrigerada	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R	Pelletización celular a temperatura controlada
Centrífuga refrigerada	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R
Salina	Baxter	2F7124
Ratones Sftpc-CreERT2	The Jackson Laboratory	Strain #028054	Línea Cre inducible específica de AT2
Ratones Sftpc-CreERT2	The Jackson Laboratory	Strain #028054
Ratones reporteros AT2 Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−)	Crianza interna	Generado cruzando ratones Sftpc-CreERT2(+/+) con ratones LSL-GFP(+/+)	Utilizado para la marcación GFP específica de AT2
Ratones reporteros AT2 Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−)	Crianza interna	Generado cruzando ratones Sftpc-CreERT2(+/+) con ratones LSL-GFP(+/+)
Sutura de seda	Look	SP117
Servicio de secuenciación de ARN de célula única	Mayo Clinic Genome Analysis Core	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services	Preparación de bibliotecas y secuenciación
Servicio de secuenciación de ARN de célula única	Mayo Clinic Genome Analysis Core	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services
Tamoxifeno	Sigma-Aldrich	T5648
Incubadora de baño de agua	Fisherbrand	Isotemp GPD 28	Incubación a temperatura controlada
Incubadora de baño de agua	Fisherbrand	Isotemp GPD 28
Xilazina (Rompun)	Dechra	NADA #047-956