Un método basado en fluorescencia para visualizar la dinámica de gotas lipídicas y orgánulos durante la mitosis en células hepatomáticas

Resumen

Este protocolo permite la visualización reproducible de gotas lipídicas y la dinámica de orgánulos durante la mitosis utilizando células hepatomáticas sincronizadas.

Resumen

Las gotas lipídicas intracelulares (LDs) son ubicuas en varios tipos celulares. Los LD almacenan lípidos neutros como el triacilglicerol y el éster de colesteril y desempeñan papeles importantes en el metabolismo energético, la señalización y las respuestas al estrés. Aunque los LD son reconocidos como orgánulos intracelulares, su comportamiento durante la progresión del ciclo celular sigue siendo incierto. Durante la mitosis, varios orgánulos, incluidos los mitocondrios y el aparato de Golgi, sufren una extensa remodelación y posterior reensamblaje, lo que plantea la cuestión de si los LD también sufren cambios dependientes del ciclo celular. Dado que los LD pueden servir como fuentes de energía y centros de señalización, aclarar su dinámica durante la mitosis es de especial importancia. Para abordar esto, presentamos un protocolo que combina la sincronización del ciclo celular con la tinción fluorescente de LD en células hepatomáticas. Las células se sincronizan en el límite G2/M mediante un enfoque basado en inhibidores de la quinasa 1 dependiente de ciclina, se liberan en el ciclo celular y se recogen en puntos temporales específicos. Los LDs se etiquetan entonces con un tinte lipídico neutro y se visualizan mediante microscopía de fluorescencia. Este método proporciona un enfoque reproducible para examinar la redistribución del LD durante la mitosis y puede aplicarse ampliamente a estudios de biología de orgánulos, regulación metabólica y fisiología de células cancerosas.

Introducción

El ciclo celular es un evento altamente orquestado que garantiza la duplicación y segregación precisa del ADN^{cromosómico 1,2}, durante el cual los orgánulos intracelulares se reorganizan^{dinámicamente 3}. Consta de cuatro fases principales: G1, S, G2 y M ^1,2. Durante la mitosis, los cromosomas duplicados se alinean en el plano ecuatorial del huso bipolar y posteriormente se transfieren a dos células^{hijas 4}. Los orgánulos como las mitocondrias y el aparato de Golgi sufren una extensa remodelación durante la^mitosis 5,6,7,8. Estos orgánulos se fragmentaron en pequeñas vesículas antes de distribuirse a las dos células hijas, donde se reensamblan durante la progresión a través del ciclo celular³.

Las gotas lipídicas (LD) son orgánulos que contienen lípidos neutros y están compuestos por un núcleo de lípidos neutros rodeado por una monocapa de fosfolípidos. Están asociados a un conjunto diverso de proteínas y se encuentran ampliamente en muchos tipos de células, incluyendo las células^{proliferantes 9,10}. La composición de proteínas y lípidos de los LDs varía según el tipo de célula y^{tejido 11}. Entre estas proteínas, la familia de la perilipina (PLIN) ha sido ampliamente estudiada, y PLIN2 estabiliza las LDs en^{hepatocitos 12,13}. Además de la estabilización estructural, las proteínas de la familia PLIN han estado implicadas en la regulación de la dinámica de la LD e interacciones con otros componentes^{celulares 14}. Los LD funcionan no solo como depósitos de almacenamiento para el triacilglicerol y el éster de colesterilo, sino también como centros para el metabolismo energético¹⁵, las vías de^{señalización 16} y la adaptación al^{estrés 17}. En condiciones patológicas, como la esteatohepatitis asociada a disfunción metabólica (MASH, anteriormente conocida como NASH), la acumulación de disfunción lúctica aumenta notablemente en comparación con el control^{sano 18,19}, lo que pone de manifiesto su importancia en la biología de las enfermedades. Sin embargo, solo se ofreció una observación limitada de la localización espacial de las LDs en células en divisiones, a pesar de la extensa investigación sobre la dinámica de las mitocondrias, el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi durante la mitosis. Analizamos la localización de la LD durante la mitosis, utilizando el método presentado aquí. Anteriormente hemos informado que los LD exhibían patrones de distribución espacial distintos a los de otros orgánulos^{intracelulares 20}.

Aquí ofrecemos un protocolo detallado para investigar la distribución de LDs y otros orgánulos intracelulares durante la mitosis en células hepatomas. El método incluye sincronización del ciclo celular y tinción fluorescente, lo que permite la visualización reproducible de la dinámica de la LD durante la mitosis. Los resultados representativos demuestran que las LD muestran cambios dependientes del ciclo celular en la distribución espacial entre la interfase y la mitosis, facilitando un análisis comparativo de la localización de LD durante la división celular. Este enfoque puede aplicarse ampliamente para estudiar la localización, dinámica y regulación metabólica de los orgánulos tanto en contextos fisiológicos como patológicos.

Protocolo

1. Soluciones estándar necesarias para este protocolo

1. Preparar una solución de albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos (BSA) al 24% (p/v) disuelta en 150 mM de NaCl.
2. Preparar 10 mM de solución stock RO-3306 (un inhibidor selectivo de la quinasa dependiente de ciclina 1 (CDK1)) disuelta en DMSO bajo condiciones estériles.
   NOTA: Otras soluciones comúnmente utilizadas, como NaOH, NaCl y solución salina con fosfato tamponado (PBS), se prepararon según la práctica estándar de laboratorio. El PBS se preparó disolviendo 2,6 g de NaH₂PO₄·2H₂O, 29 g de Na₂HPO₄·12H₂O, 80 g de NaCl y 2,0 g de KCl en agua destilada y ajustando el volumen final a 1 L.

2. Preparación de ácido oleico conjugado con BSA

1. Coloca 90 mg de ácido oleico en un vaso de precipitados de 50 mL y añade 2 mL de etanol (99,5%) para disolverlo.
2. Añade 100 μL de 5 N NaOH a la solución y remueve hasta que estén completamente mezclados.
3. Evapora etanol bajo un chorro de gas nitrógeno.
4. Añade 10 mL de NaCl de 150 mM e incuba la mezcla a 60 °C durante 5 minutos.
5. Añade 12,5 mL de solución de stock de BSA refrigerada al 24% (p/v) de forma lenta y en gota a la solución de ácido oleico (2,4) y remueve suavemente la mezcla de forma continua durante 10 minutos para permitir una mezcla gradual y homogénea a temperatura ambiente.
6. Ajusta el pH a 7,4 y lleva el volumen final a 25 mL con 150 mM de NaCl. La concentración final de ácido oleico será de 12,8 mM.
7. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 μm en condiciones estériles y almacenar las alicuotas a 4 °C durante hasta 2 semanas o a -20 °C para un almacenamiento prolongado.

3. Sincronización de fronteras G2/M de celdas

1. Prepara los controles necesarios.
   1. Preparar células asincrónicas sin tratar sin tratamiento con RO-3306 como control basal.
   2. Para condiciones tratadas con ácido oleico, preparar las células tratadas solo con ácido oleico sin sincronización como control basal.
   3. Para la tinción por fluorescencia, realizar controles de tinción única para cada fluoróforo para verificar la especificidad de la señal y excluir la superposición espectral entre canales (Figura suplementaria 1).
   4. Adquiere imágenes utilizando ajustes de adquisición secuencial o configuraciones de filtros apropiadas para minimizar la superposición espectral y la diafonía de canales.
      NOTA: Estos controles son esenciales para distinguir los cambios dependientes del ciclo celular de la distribución basal de los orgánulos y para validar la especificidad de fluorescencia.
2. Mantener las células HuH7 en el medio modificado de Eagle de Dulbecco, suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina a 37 °C en una incubadora al 5% de CO₂.
3. Coloca las cubiertas de vidrio en una base de cultivo de 35 mm. Semilla 2 × 10⁵ células por recipiente de 35 mm en el medio descrito anteriormente e incuba las células durante la noche a 37 °C en una incubadora con 5% de CO₂.
4. Lava las células dos veces con PBS y luego incuba con un medio fresco que contiene 9 μM RO-3306 y 0,5 mM de ácido oleico.
5. Incubar las células durante 20 horas bajo condiciones estándar de cultivo.

4. Eliminación del reactivo RO-3306 de las células sincronizadas para entrar en la fase mitótica

1. Lava las células (paso 3.4) de tres a cinco veces con PBS.
2. Lava las células una vez con un medio de cultivo fresco.
3. Incubar células en un medio fresco durante 1 hora a 37 °C en una incubadora con 5% de CO₂ para permitir la entrada en la mitosis.
   NOTA: La eliminación de RO-3306 permite que las células sincronizadas entren en la fase mitótica desde el límite G2/M. Tras lavar el reactivo, una proporción considerable de células entra en fase mitótica en aproximadamente 1 hora, durante la cual se pueden identificar por el redondeo celular y la condensación cromosómica. El momento óptimo para observar una fase específica de la mitosis puede variar según el tipo celular y las condiciones del cultivo.

5. Preparación de muestras de células mitóticas

1. Fija las células con un 4% de paraformaldehído en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: Las células mitóticas tienden a desprenderse del plato; Evita lavar antes de fijarte.
   NOTA: Para la tinción con PLIN3, las células se fijaron con una combinación de 2% de paraformaldehído y 2% de glutaraldehído.
2. Permeabiliza las células fijas con 0,1% (p/v) de Triton X-100 en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
3. Bloquear celdas con 1% (p/v) de BSA en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente.

6. Tinción de LDs y otros orgánulos celulares

1. Retira cuidadosamente las cortinas de vidrio del recipiente de cultivo usando pinzas finas y colócalas con el lado de la célula hacia arriba en una cámara humidificada para evitar que se sequen.
   NOTA: Realiza todos los pasos posteriores de tinción en un entorno humidificado y protegido de la luz para preservar las señales de fluorescencia.
2. Lava las células dos veces con PBS e incuba con anticuerpos primarios diluidos en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente.
3. Lava las células dos veces con PBS e incuba con anticuerpos secundarios diluidos en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente.
4. Lava las células dos veces con PBS y tiñe con un tinte fluorescente lipídico neutro durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Se seleccionaron tintes con propiedades espectrales distintas para permitir una imagen multicolor flexible y minimizar la superposición espectral con otros marcadores de orgánulos.
5. Lavar las células dos veces con PBS y teñir los núcleos con un colorante fluorescente que se une al ADN (DAPI: excitación, 350–410 nm; emisión, 420–450 nm) diluido 1:1.000 en PBS durante 5 minutos.
6. Lava las células dos veces con PBS y luego monta las cubiertas sobre portaobjetos de vidrio usando un medio antidescolorante para preservar la fluorescencia durante la imagen.
7. Sella los bordes de las cubiertas con esmalte transparente para evitar que se sequen y se muevan durante la imagen.
   NOTA: Dado que las señales fluorescentes se desvanecen gradualmente, adquiere imágenes en un plazo de 1 semana tras la tinción.

7. Observación de orgánulos intracelulares y su localización subcelular

1. Adquirir imágenes de fluorescencia utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio para filtrar rápidamente varias células y seleccionar células representativas de interfase y mitóticas, utilizando baja intensidad de excitación y ajustes de adquisición rápida para minimizar el fotoblanqueamiento.
2. Adquirir imágenes de las células seleccionadas con la magnificación adecuada para el análisis de tinción por fluorescencia.
   NOTA: Las células interfásicas suelen mostrar un núcleo único intacto situado en el centro del citoplasma. En contraste, las células mitóticas presentan cromosomas condensados alineados en el plano ecuatorial del huso bipolar. Estas características morfológicas pueden servir como criterios visuales para distinguir células interfásicas y mitóticas.
3. Visualizar los LDs y la morfología nuclear usando conjuntos de filtros adecuados para tintes fluorescentes lipídicos neutros y un colorante fluorescente que se une al ADN mediante la microscopía de fluorescencia de campo amplio.
   NOTA: Seleccione los conjuntos de filtros según las especificaciones del sistema de microscopio utilizado.
4. Para una validación de mayor resolución, adquiere imágenes de fluorescencia usando microscopía confocal equipada con una lente objetivo de alta apertura numérica (por ejemplo, 60×, NA ≥1,2). Detectar señales de fluorescencia para colorantes fluorescentes lipídicos neutros y un colorante fluorescente que se une al ADN utilizando láseres de excitación y ajustes adecuados del filtro de emisión. Procesa imágenes utilizando software de adquisición y análisis de imágenes comúnmente disponible.
   NOTA: Dependiendo del sistema de microscopio, pueden utilizarse objetivos de inmersión en agua o en aceite. La elección del medio de inmersión debe seguir las recomendaciones del fabricante y el propósito experimental. La microscopía de fluorescencia de campo amplio es adecuada para la observación rutinaria y comparación de la distribución de la LD entre células interfásicas y mitóticas, mientras que la microscopía confocal se recomienda cuando se requiere una mayor resolución espacial.

8. Cuantificación del número y tamaño de los LD

1. Adquirir imágenes de fluorescencia de las células bajo idénticos ajustes de imagen para todas las condiciones.
2. Abre las imágenes adquiridas usando un software de análisis de imágenes.
3. Establecer umbrales apropiados para identificar los LDs y realizar análisis de partículas para cuantificar el número y el área de gotas lipídicas.
   NOTA: Los parámetros de imagen deben mantenerse constantes en todas las condiciones para garantizar una comparación precisa del número de LD y la zona.

Resultados

Sincronización de células hepatomáticas en el límite G2/M usando RO-3306

Para investigar la dinámica de los orgánulos intracelulares durante la mitosis, se utilizó RO-3306, un inhibidor selectivo de CDK1, para sincronizar las células en el límite G2/^{M 20,21}. Cuando las células fueron tratadas con el inhibidor CDK1 durante 20 horas seguidas de una hora adicional en un medio fresco, más del 50% de las células estaban sin...

Discusión

La redistribución observada de los LDs durante la mitosis sugiere que su posición no es aleatoria, sino que está en coordinación con la reorganización del citoesqueleto y la progresión del ciclo celular. En particular, la exclusión de los LDs de la región del huso puede reflejar restricciones espaciales impuestas por el ensamblaje mitótico del huso o por mecanismos de transporte activo que mantienen la segregación de orgánulos durante la división celular. En este estudio, presentamos un ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.25% Trypsin/EDTA	Wako	201-16945	Disociación celular
Placa de cultivo de 10 cm	Corning	430167	Cultivo celular
Placa de cultivo de tejido de 35 mm	IWAKI	3000-035	Cultivo celular
Placa de cultivo de tejido de 6 cm	IWAKI	3010-060	Cultivo celular
Anticuerpo anti-PLIN2 (ADRP)	Proteintech	15294-1-AP	Marcador de gotas de lípidos
Anticuerpo anti-PLIN3 (TIP47)	Proteintech	10694-1-AP	Marcador de gotas de lípidos
Anticuerpo anti-α-tubulina	Sigma-Aldrich	T6199	Marcador del huso mitótico
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Tinción de lípidos neutrales
Filtro de tapón de botella (0.22 μm)	NEST	WNB343001	Filtración estéril de solución de OA–BSA
Álbumina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A8022	Reactivo de bloqueo
Esmalte de uñas transparente	Disponible en el comercio	No aplicable	Sellado de cubreobjetos
Microscopio confocal	Olympus	FV1200	Imágenes de alta resolución
DAPI	Dojindo	340-07971	Tinción nuclear
D-PBS (–)	Wako	049-29793	Cultivo celular
Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)	Wako	041-30081	Medio de cultivo celular
Etanol (99.5%)	Wako	057-00456	Solvente para ácido oleico
BSA libre de ácidos grasos	Sigma-Aldrich	A7030	Proteína portadora para ácido oleico
Suero fetal bovino	Gibco	10270-106	Suplemento de medio
Anticuerpos secundarios fluorescentes (conjugados con Alexa Fluor)	Disponible en el comercio	No aplicable	Anticuerpos secundarios específicos de especie para inmunofluorescencia
Software FV10-ASW	Olympus	No aplicable	Adquisición y procesamiento de imágenes
Cubreobjetos de vidrio (φ15 mm)	Matsunami	2-176-03	Sembrado celular para microscopía
Diapositivas de microscopio de vidrio	Matsunami	SFF-001	Diapositivas de vidrio para montaje de cubreobjetos
Glutaraldehído (solución al 25%)	Wako	073-00536	Fijación alternativa para PLIN3
Células HuH7	JCRB Cell Bank	JCRB0403	Línea celular de hepatoma humano
Tinción de lípidos neutrales LipidTOX Red	Invitrogen	H34476	Tinción alternativa de gotas de lípidos
Gas nitrógeno (N2)	Disponible en el comercio	No aplicable	Evaporación de etanol
Ácido oleico	Sigma-Aldrich	O1383	Para la preparación de conjugados de ácido oleico–BSA
Paraformaldehído, 4% en PBS	Nacalai Tesque	09154-85	Fijación
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140-122	Antibióticos
Solución salina fosfatada (×10)	No aplicable	No aplicable	Puede sustituirse por cualquier proveedor
RO-3306	Sigma-Aldrich	SML0569	Inhibidor de CDK1 para sincronización G2/M
Sustente de montaje anti-apagón SlowFade Diamond	Invitrogen	S36963	Medio de montaje
Cloro de sodio (NaCl)	Wako	191-01665	Preparación de NaCl 150 mM
Hidroxido sódico (NaOH)	Wako	080-01061	Usado para saponificación del ácido oleico
Diapositivas de análisis celular Tali	Thermo	T10794	Usado para análisis del ciclo celular
Citómetro basado en imágenes Tali	Thermo	No aplicable	Usado para análisis del ciclo celular
Tritón X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Permeabilización celular
Microscopio de fluorescencia de campo amplio	KEYENCE	BZ-9000	Pantalla rápida de células en mitosis