Inmunolocalización tridimensional en meiocitos de maíz

Resumen

Este protocolo de inmunolocalización en los meiocitos de maíz macho mantiene la integridad tridimensional de las células durante la meiosis. Permite el seguimiento dinámico de la localización intracelular de hasta tres anticuerpos independientes en material preservado fijado con paraformaldehído, además de DAPI, que tiñe el ADN.

Resumen

Durante la profase meiótica I, la configuración física de los cromosomas varía mucho entre las etapas de desarrollo; afortunadamente, estas configuraciones específicas permiten la identificación adecuada de cada una de estas etapas meioticas clásicas, conocidas respectivamente como leptoteno (por ejemplo, los 'hilos delgados'), cigoteno (por ejemplo, los 'hilos acoplados'), paquiteno (por ejemplo, los 'hilos gruesos'), diploteno (por ejemplo, los 'hilos dobles') y diacinesis (por ejemplo, el 'movimiento de repulsión'). El análisis visual de varios fenómenos citogenéticos que ocurren durante la profase I, como la recombinación, el apareamiento y la sinapsis, requiere técnicas de inmunolocalización altamente fiables. A diferencia de las técnicas tradicionales de dispersión y aplastamiento que suprimen toda la información subcelular y subnuclear, el procedimiento de conservación 3D descrito aquí permite la preservación de proteínas meióticas clave en sus sitios nativos de localización subcelular (citoplásmico, nuclear y subnuclear: eucromatina, heterocromatina y nucleolar). Así, este protocolo describe cómo fijar eficientemente anteras meióticas, diseccionar y liberar meiocitos de las anteras, y realizar la inmunolocalización simultánea de tres proteínas clave en los meiocitos masculinos del maíz.

Introducción

La meiosis es un proceso clave que regula la transmisión de rasgos en plantas y cultivos modelo; Por ello, métodos de microscopía simples que permiten una visualización consistente y fiel de la localización de proteínas facilitan la comprensión de cómo estos rasgos podrían transmitirse de forma más eficiente. Desafortunadamente, la visualización de la localización de proteínas dentro de los meiocitos ha variado mucho dependiendo de la técnica utilizada ^1,2. Por tanto, el objetivo del protocolo es proporcionar un método sencillo y reproducible que elimine artefactos durante la observación de meiocitos. Por ejemplo, desde hace tiempo se reconoce que la observación de cromosomas meióticos es un proceso delicado que se facilita aplastando las células mediante simples aplastamientos o mediante técnicas de dispersión aún más ^{disruptivas 3,4,5}. En Arabidopsis thaliana, los investigadores suelen emplear métodos de dispersión que emplean el fijador de Carnoy (una mezcla 3:1 de etanol y ácido acético) junto con diversos detergentes como Lipsol, Tween-20 y TritonX-100, así como mezclas enzimáticas que contienen celulasa, pectinasa y citohelicasas, para descomponer células y permitir una inmunolocalización eficaz en sus pequeños^{cromosomas 1,2}. Estas técnicas transforman una conformación cromosómica 3D en una 2D, permitiendo la observación rápida de la totalidad de cromosomas dispersos artificialmente en una sola imagen. Ciertas características de los cromosomas que soportan estos tratamientos severos pueden ser evidentes; sin embargo, a menudo no representan el comportamiento típico de las células y cromosomas in vivo⁶. La detección rápida y muy amplia de hasta dos anticuerpos es posible con técnicas de propagación 2D en diversas especies vegetales, incluyendo el^maíz 7,8,9,10,11.

No obstante, a pesar de la comodidad de las técnicas 2D heredadas, ahora se reconoce que ciertos fenómenos son sensibles a métodos disruptivos y no pueden observarse si la célula, el núcleo o los cromosomas se dañan durante la expansión o el aplastamiento. Por ejemplo, el movimiento de la proteína RAD50 desde el citoplasma hasta el núcleo durante la etapa leptoteno, o durante el acoplamiento del centrómero (leptonema/cigonema), solo se ha detectado en meiocitos 3D^{intactos 12}. Aquí, a los lectores se les ofrece un protocolo 3D detallado de 4 días que utiliza anteras fijadas en paraformaldehído al 4% para inmunolocalizar tres proteínas clave en los meiocitos machos del maíz, preservando así su integridad estructural. En comparación con una metodología similar de inmunolocalización 3D^{del maíz 8}, hemos añadido notas prácticas y consejos de solución de problemas para los investigadores. Este protocolo beneficiará el trabajo de biólogos vegetales y mejoradores de plantas interesados en estudiar diversos procesos meióticos, como el control de la recombinación meiótica por el complejo sinaptonero.

Protocolo

PRECAUCIÓN: Manipular formaldehído y acrilamida utilizando el equipo de protección personal adecuado y una capucha química; Ambos son tóxicos (la acrilamida también es neurotóxica antes de la polimerización). Todos los materiales utilizados en el estudio están listados en la Tabla de Materiales.

1. Fijación de anteras de maíz para preservar la estructura intacta de los meiocitos

1. Utiliza plantas de maíz en la etapa V13 con inflorescencias aún creciendo dentro del tallo. Durante la semana de fijación de la otra meótica, lleva guantes y presiona suavemente el tallo agrandado en el bulto para determinar si está lo suficientemente blando como para abrirlo.
   NOTA: Este protocolo para fijación e inmunolocalización puede utilizarse tanto para maíz como para brotes florales meióticos de Arabidopsis thaliana (menos de 400 μm). Pero en el caso del maíz, dependiendo de la variedad utilizada y la época del año (el crecimiento es más rápido en primavera), tarda unas 8 semanas desde la siembra para referencia, para referencia, la línea endogámica B73, pero solo 6 semanas para la línea endogámica de floración temprana A344.
2. Preparación de los amortiguadores.
   NOTA: El día antes de la fijación química, prepare las siguientes soluciones de trabajo, hágalo con cuidado y etiquete correctamente todas las botellas.
   1. Preparar 100 mL de 10x sales tampón A (BA), añadiendo 4,53 g de PIPES (piperazina-N, N′-bis (2-ácido etanosulfónico) a una concentración final de 150 mM), 5,96 g de KCl (concentración final 800 mM), 1,17 g de NaCl (concentración final 200 mM), 0,74 g de EDTA (concentración final 20 mM), 0,19 g de EGTA (concentración final 5 mM) y 90 mL_H2O, primero ajusta el pH a 6,8–7 con KOH, luego ajusta el volumen a 100 mL.
   2. Finalmente, esteriliza con filtro usando una unidad de filtro estéril desechable de flujo rápido con PES de 0,45 μm por poro (manténganla a 4 °C pero sin congelar; pueden almacenarla durante varios meses).
   3. Prepárate:
      -50 mM PIPES (pH ajustado a 7 con KOH).
      - reservas de espermina a una concentración de 0,4 M (previamente disueltas en tuberías de 50 mM, ajustar el pH a 7 con KOH, mantener alícuotas de 50 μL a -20 °C).
      - reservas de espermidina a una concentración de 0,4 M (disueltas en 50 mM PIPES, con pH ajustado a 7 con KOH, mantener alícuotas congeladas de 125 μL a -20°C).
      - reservas de Ditiotreitol (DTT) 1 M (disuelto en acetato de sodio 0,01 M, hasta pH 5,2, mantener alícuotas congeladas de 100 μL a -20 °C).
      - sorbitol 2 M, mantenido a 4 °C.
3. Preparar 50 mL de 2x Buffer A (BA), sobre hielo, usando 10 mL de 10x sales Buffer A (conservadas a 4 °C), 50 μL de espermina (0,4 M en PIPES de 50 mM, con pH ajustado a 7 con KOH), 125 μL de espermidina (0,4 M en PIPES de 50 mM, con pH ajustado a 7 con KOH), 100 μL de vórtice de DTT (1 M en acetato de sodio 0,01 M, pH 5,2) se disolven vigorosamente; Y no calientes.
   1. Luego, añade 16 mL de sorbitol de 2 M. Ajusta el volumen final a 50 mL con agua estéril. Filtrar y esterilizar usando un filtro estéril desechable de flujo rápido y almacenarlo a 4 °C.
4. Prepara una cámara húmeda hecha de 5 a 10 toallas de papel humidificadas colocadas en una caja de plástico. Verifica que la tapa cierre bien. Elimina cualquier exceso de agua.
5. Luego, coloca en una bandeja los siguientes objetos: la cámara húmeda, una cuchilla de afeitar, pinzas finas (previamente esterilizadas con etanol al 70%), una pequeña botella de agua estéril y cinta de enmascarar. Lleva la bandeja y su contenido a las plantas de maíz revisadas en el paso 1.1.
6. Usa una cuchilla de afeitar para cortar el tallo bulcado a la altura de la inflorescencia. Las ramas principales de borla, así como las ramas laterales de la inflorescencia, pueden utilizarse para la recolección de floretes meióticas.
   NOTA: Estas ramas de borla contienen los floretes de interés para recoger anteras meióticas. Cada florete contiene seis anteras, y las 3 superiores, más grandes, suelen utilizarse para el análisis. El tamaño aproximado y el color de las anteras se correlacionan con cada etapa meiótica. Anteras casi transparentes de unos 1 mm de longitud están en la etapa leptotena, anteras translúcidas de 1,5 mm de longitud en la etapa cigoteno, anteras blanquecinas de 2 mm de longitud en la etapa paquiteno, y anteras amarillentas de > 2 mm de longitud pueden contener meiocitos en diploteno, tétradas y granos de polen que terminan la gametogénesis. Cabe señalar que otra correlación longitud-etapa puede variar entre los antecedentes genéticos del maíz, y que factores ambientales (por ejemplo, alta temperatura) pueden acelerar la progresión meiótica y alterar esta relación. Se recomienda que los investigadores validen las correlaciones entre el tamaño y la etapa de otras para cada genotipo específico de maíz y condiciones de crecimiento (mediante aplastamiento con acetocarmina, cf. 1.6).
7. Utiliza pinzas finas para diseccionar y recoger cuidadosamente las ramas laterales de las inflorescencias y envolverlas dentro del papel de cocina de la cámara húmeda.
   NOTA: Con algo de práctica, solo se necesita una incisión lineal corta de 3–4 cm en el tallo para extraer las ramas del borlón meiótico. Puedes cerrar esta incisión envolviéndola tres o cuatro veces con cinta adhesiva estándar, lo que te permite cosechar después la misma planta usando la inflorescencia restante sin disecar. El tejido seguirá creciendo y más tarde podrá usarse para la polinización.
8. Mantén la cámara a temperatura ambiente. Utiliza solo aquellas ramas de la inflorescencia que contengan floretas que lleven anteras en la etapa meiótica. Asegúrate de cubrir las ramas con la mitad de las toallas húmedas, pero no las sumerjas en agua.
9. Vuelve a humidificar si las toallas se secan. Cierra la caja hasta que se despidan las anteras, preferiblemente hasta 30 minutos antes de empezar la recogida de otras.
10. Utilizando un estereomicroscopio binocular con una báscula calibrada, recoge anteras frescas de los floretes en 2 mL de 1x BA en una placa de Petri de 35 mm, asegurando la identificación precisa de las etapas meióticas mediante el proxy de tamaño y color de otra tera.
    NOTA: Para determinar con precisión el estadio de meiocitos en anteras muestreadas, se analiza rápidamente una de las tres anteras sincronizadas por florecillo utilizando fijación de ácido etanol-acético 3:1, tinción con acetocarmina y microscopía tradicional^{de calabaza 13}.
11. Prepara el fijador de formaldehído al 4% en 1x BA y 0,0025% Tween-20
    NOTA: Para 3 mL, añadir 750 μL de formaldehído al 16%, 750 μL de_{H 2}O, 1,5 mL de 2x BA y 7,5 μL de Tween-20 al 1%.
12. Retira el buffer inicial de BA y añade los 3 mL de esta solución fijadora fresca a las anteras escalonadas y fijalas durante 45 minutos dentro de una nueva placa de Petri de 35 mm, sellada con parafilm para evitar la evaporación del formaldehído, luego colócala sobre una placa de Petri más grande colocada sobre un agitador rotatorio (ajustada a 40–60 rpm, o 0,2 x g). Hazlo a temperatura ambiente. Las anteras deberían girar ligeramente para una buena fijación. Normalmente flotan en la superficie.
13. Enjuaga con 3 mL de 1x BA, luego transfiere la muestra a una pequeña placa de Petri y colócala sobre un agitador rotatorio (40–60 rpm) a temperatura ambiente durante 45 minutos.
14. Usando pinzas limpias, transfiere las anteras a una pequeña placa de Petri de 35 mm que contenga 3 mL frescos de 1X BA. Sella bien la placa de Petri con parafilm. Luego guarda la pequeña placa de Petri dentro de una placa de Petri, cubriéndola con papel de aluminio para mantenerla a oscuras, y colócala a 4 °C hasta que se use. Puedes almacenarlo durante varios meses si es necesario.

2. Incrustación de meiocitos de maíz en almohadillas sándwich de poliacrilamida

DÍA 1: Preparación de diapositivas 3D

1. Prepara 2 mL de solución de acrilamida mezclando volúmenes iguales (1:1) de acrilamida y 2x BA. Antes de añadir sulfito de sodio (NaS) y persulfato de amonio (APS), desgasifica la solución de acrilamida al vacío durante 5–10 minutos.
2. La acrilamida y la relación 1:1 de 2x BA se mezclan pipeteando 100 μL en tubos de 1,5 mL.
   El número de tubos que prepares depende del número de diapositivas que vayas a preparar.
3. Haz 1 mL 1x BA.
4. Coloca trozos de parafilm de 2 cm x 2 cm sobre una placa de Petri y luego colócalos bajo un microscopio de disección. Pipetear 50 μL de solución de BA con anteras sobre parafilm. Recorta la punta de la pipeta con tijeras para facilitar la entrega de otras cosas.
   1. Pipeta 25 μL de solución BA sobre parafilm en otro lugar.
5. Usando pinzas para sujetar las anteras, corta la punta de las anteras con un bisturí y exprime suavemente los meiocitos. Con una pipeta, transfiere los meiocitos suavemente a la gota de 25 μL de BA y mezcle suavemente.
6. Pipetear 10 μL de la mezcla de meiocitos sobre una capa de cubierta separada.
7. Rápidamente, pipetear 5 μL de NaS al 20% (0,2g/1 mL) y 5 μL de APS al 20% (0,2g/1 mL) en un tubo de 1,5 mL con acrilamida/2x Buffer A.
8. Rápidamente, pipetear 5 μL de la capa anterior sobre una capa de cobertura y mezclar con meiocitos. Coloca una cubierta con capa de poli-L-lisina encima, pero gírala 45 grados. Utilizar solo un cache-linfos de poli-L-lisina (ya sea comercialmente o fabricado sumergiendo los cubretapes en una solución de poli-L-lisina en una placa de Petri durante unos minutos y dejándolos secar, en el borde de una nueva placa de Petri limpia) ayuda a liberar una almohadilla completa tras la polimerización. La capa de cobertura se retira rápidamente de la solución y se seca antes de su uso. Para microscopía de superresolución, se^{deben usar} coberturas de alto rendimiento con espesor estandarizado (≤170 nm).
9. Por favor, no toque las cubiertas durante 30–50 minutos para permitir la polimerización completa de la muestra a temperatura ambiente (un proceso de polimerización más rápido reduce el periodo de secado de la almohadilla, y la calidad resultante es inferior a la óptima).
10. Repite los pasos '2.6–2.9' para cada diapositiva que quieras preparar.
11. Separa todas las cubiertas con cuidado con una cuchilla de afeitar. Coloca todas las cubiertas, con la almohadilla hacia arriba, sobre una almohadilla de poliacrilamida (o la mayor parte de la almohadilla), en una placa de 6 pozos.
12. Lava cada capa con una almohadilla con 2 mL de solución salina con fosfato (PBS) durante 10 minutos. Repite este lavado una vez, para un tiempo total de lavado de 20 minutos a temperatura ambiente.
13. Prepara 50 mL mezclando 49,4 mL PBS 1x, 100 μL EDTA 0,5 M y 500 μL Triton.
14. Enjuaga cada capa de cubierta con una compresa en 1 mL de este PBS 1x complementado con 1 mM de EDTA y 1% de Triton durante 2 horas a temperatura ambiente.
15. Prepara un nuevo lote de buffer bloqueante que contenga 1x PBS, 1 mM de EDTA, 0,1% Tween-20 y 3% de BSA (1 mL por portaobjetos). Para 50 mL de tampón de bloqueo, mezcla 44 mL de PBS 1x, 100 μL de EDTA 0,5 M, 5 mL de solución Tween-20 al 1% y 1,5 g de BSA. Se prefiere el BSA sobre el suero de burro como agente bloqueante porque ayuda a minimizar señales inespecíficas al usar múltiples anticuerpos primarios y secundarios.

3. Inmunolocalizaciones

1. Prepara anticuerpos primarios (o anticuerpos) en la dilución deseada usando un tampón bloqueante. Combina anticuerpos primarios según su capacidad para producir señales distintas cuando se usan juntos. Deben proceder de diferentes organismos, como conejo, rata, conejillo de indias o pollo, que pueden ser reconocidos por anticuerpos secundarios específicos marcados con fluorescencia. Se evita el uso de anticuerpos contra burro o cabra porque están destinados a ser usados como anticuerpos secundarios. Recomendamos usar una sola especie de anticuerpo secundario (por ejemplo, cabra en el experimento mostrado en la Figura 1).
2. Añade 50 μL de este anticuerpo primario diluido en el centro de cada capa con una almohadilla.
   Añade agua entre pozos para ralentizar la evaporación. Coloca la placa en una cámara húmeda (una caja de plástico con tapa). Marcharse durante la noche.

DÍA 2: Lavando

3. Prepara 500 mL de tampón de lavado (1x PBS + 0,1% Tween-20 + 1 mM EDTA).
4. Retira la solución nocturna de los pozos por aspiración con tu pipeta.
5. Lava rápidamente cada cubierta con una almohadilla dos veces con 1 mL de tampón de lavado y luego sácala de los pozos.
6. Pipeteo otro 1 mL/cubrimiento con compresa y déjalo reposar durante 1 hora a temperatura ambiente.
   Repite 7 veces más. (8 h en total)
7. Después del lavado final, añade agua entre pozos, cubre la placa y déjala pasar la noche en una cámara húmeda.

DÍA 3: Anticuerpos secundarios, lavados y portaobjetos de montaje

8. Prepara los anticuerpos secundarios diluyendo cada uno en una proporción de 1:50 en el tampón de bloqueo.
   Aspira la solución de lavado. Dispensa 50 μL del anticuerpo secundario diluido en el centro de cada compresa usando una pipeta.
   NOTA: Cada anticuerpo secundario debe usarse en asociación con tintes fluorescentes distintos con longitudes de onda de emisión no solapadas. Por ejemplo, un anticuerpo secundario debe estar marcado con AlexaFluor488 (verde), el siguiente con AlexaFluor555 (naranja) y el tercero con AlexaFluor647 (rojo lejano), que puede combinarse con DAPI (excitación a 461 nM, azul). Otros tintes fluorescentes, como DyLight (de Dyomics GmbH), también son utilizables. Además, todos estos anticuerpos secundarios no deberían reaccionar cruzadamente con otras especies utilizadas en la mezcla de anticuerpos primarios. Por ejemplo, el anticuerpo secundario anticonejo debe estar adaptado cruzadamente para ser selectivo para anticuerpos de conejo y no reconocer ni anticuerpos de rata ni de conejillo de indias. Lo mismo ocurre con todos los anticuerpos secundarios. Debe utilizarse un experimento bien diseñado para validar todos estos requisitos simultáneamente al realizar coinmunolocalizaciones.
9. Añade agua entre los pozos, coloca una placa en la cámara húmeda y deja reposar 2 horas a temperatura ambiente.
10. Aspira la solución de los pozos.
11. Realiza cuatro lavados usando 1 mL por pozo, 1 h cada uno a temperatura ambiente (4 h en total).
12. Lava cada pozo con 1 mL de 1 PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente y repite este proceso dos veces más. (30 minutos en total)
13. Diluir DAPI en 1x PBS.
14. Teñir con una concentración final de 1 μg/mL de dapi (polvo de dapi disuelto en agua) durante 30 minutos a temperatura ambiente, y colocar 500 μL/pozo.
15. Retira el antifade ProLong™ Gold del congelador de 4 °C para que se descongele y alcance la temperatura ambiente.
16. Lava las láminas en 1x PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, con 1 mL/pozo. Hazlo dos veces más. (1 h 30 min en total)
17. Quita el último lavado.
18. Luego añade dos gotas de ProLong™ Gold antifade en el centro de cada almohadilla.
19. Monta los deslizamientos de la tapa en cada portaobjetos, etiqueta cada portaobjetos, levanta los deslizamientos de la tapa del pozo usando pinzas finas y colócalos lentamente sobre el deslizador. Usando pinzas finas, baja lentamente una segunda capa sobre la primera. Usando un vacío, elimina el exceso de glicerol de los bordes de las cubiertas. Sella los bordes de las cubiertas con dos capas de esmalte de uñas.
20. Si las láminas no se examinan inmediatamente bajo un microscopio fluorescente. Guárdalos en un congelador a -20 °C, protegidos de la luz, hasta que estén observados. Más tarde, deja reposar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 1 hora en una caja de diapositivas, horizontalmente y en la oscuridad, para evitar condensación.

DÍA 4: Observaciones microscópicas

21. Observa el deslizamiento bajo las longitudes de onda y filtros de excitación adecuados. La microscopía confocal estándar es suficiente, pero es recomendable utilizar un microscopio con objetivo 60x para permitir imágenes tridimensionales de toda la célula usando una pila z cada 0,2 μm, con adquisiciones secuenciales de imagen y procesamiento de deconvolución mediante el software Applied Precision SoftWoRx^® .

Resultados

Usando este protocolo, podemos observar simultáneamente los patrones de localización de las tres proteínas meióticas clave en el maíz (Figura 1). La proteína meiótica AUSENCIA DE PRIMERA DIVISIÓN 1 (AFD1) es un homólogo de la subunidad alfa-Kleisin REC8 del complejo cohesina meiótica. El ASINAPTIC 1 (ASY1) es un elemento axial crucial, mientras que el ZYPPER1 (ZYP1) es el elemento transversal del complejo^{sinaptonemal 15}. La tinción DA...

Discusión

Este protocolo ofrece una ventaja clave sobre otros al preservar datos tridimensionales esenciales sobre la carga de proteínas cromosómicas meióticas. Estas características no pueden preservarse usando técnicas regulares de dispersión ^1,2. No obstante, este protocolo tiene dos limitaciones: es lento y técnicamente exigente en comparación con las técnicas de propagación habituales que se realizan en un solo día. En cambio, nuestro...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1.5 mL microtubes Axygen	Corning	MCT-150-C
15 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
50 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6 well plate Falcon polystyrene microplate	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B
Ácido acético, 60%	Thermo Fisher Scientific	A38-212
Acrilamide 30%  y solución de bis-acrilamida, 29:1	Biorad	1610157
Aluminio para plegar	Reynolds	U07211R0
Persulfato de amonio (APS)	Merck	A3678
Microscopio estereoscópico binocular	NA	NA
Albúmina de suero bovino (BSA)	Merck	A9418
DAPI	Merck	D9542
Microscopio DelltaVision	Olympus	NA
Agua destilada H2O	NA	NA
Unidades de filtro desechables con filtros PES de poro de 0,45 μm	Thermo Fisher Scientific/Nalgene	09-740-63B
Pinzas finas FST Dumont SS	Fine Science Tools	11200-33
cabra (IgG H+L) altamente adsorbida en cruz anti-rata etiquetada por AlexaFluor647	Invitrogen	A-21247
cabra (IgG H+L) altamente adsorbida en cruz anti-conejo etiquetada por AlexaFluor568	Invitrogen	A-21428
cabra (IgG H+L) altamente adsorbida en cruz anti-conejo etiquetada por AlexaFluor488	Invitrogen	A-11073
Guantes	Merck	Z412392
Cámaras de cultivo / invernadero / o campo	NA	NA
DTT	Merck	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
Cinta adhesiva 3M	Fisher Scientific	19-047-259
Semillas de maíz	NA
Portaobjetos de microscopio 22 x 22 mm-1,5 de vidrio	Fisher Scientific	12-542-B
Portaobjetos de microscopio 22 x 22 mm-H	Deckgläser, Zeiss	474030-9020-000
Diapositivas de microscopio de vidrio	Fisher Scientific	22-230-900
Caja para diapositivas de microscopio	Fisher Scientific,	03-448-9
Micropipetas P20, P200, P1000	Merck	CLS4069
NaCl	Merck	S7653
Esmalte de uñas	Electron Microscopy Science	72180
Toallas de papel	Merck	Z188956
Parafilm	Merck	P7668
Paraformaldehído solución 16%	Grado de Microscopía Electrónica	15710
PBS	Merck	P4474
Caja de plástico con tapa	Tupperware	NA
Poli-L-Lisina	Merck	P4707
Anticuerpos primarios (anti-ZmAFD1 de rata, anti-ZmASY1 de conejo, anti-ZmZYP1 de cobayo)	NA
Prolong Antifading	Molecular Probes	P36934
Placa de Petri (D x H: 35 mm x 10 mm	Corning	351008
Placa de Petri tamaño regular	Merck	P5731
PIPES	Merck	P1851
Puntas de pipeta (0.5-10 uL) estériles	Merck/Corning	AXYT300
Puntas de pipeta (200 uL) estériles	Merck/Corning	AXYT200Y
Puntas de pipeta (1000 uL) estériles	Merck/Corning	AXYT1000BRS
Hojas de afeitar de un solo filo	Fisher Scientific	12-640
Agitador de plataforma oscilante	NA	NA
Espermina	Merck	85590
Espermidina	Merck	S2626
Sorbitol	Merck	S8143
Tween-20	Merck	P9416
Tritón X-100	Fisher Scientific	9002-93-1
Acrilamida ultra pura	Invitrogen	15512023
Vacío