La oxidación de Fenton asistida por vitamina C mejora la eliminación oxidativa de Helicobacter pylori in vitro

Resumen

Este estudio examina cómo la vitamina C modula el comportamiento cinético de una reacción de Fenton bajo condiciones in vitro . Las pruebas de colorantes químicos y los ensayos bacterianos muestran que la dosificación controlada de vitamina C altera el comportamiento oxidativo de la reacción y se asocia con un aumento de la actividad antibacteriana contra Helicobacter pylori en un sistema modelo simplificado.

Resumen

La infección por Helicobacter pylori sigue siendo una importante carga sanitaria global, y la creciente prevalencia de la resistencia a los antibióticos subraya la necesidad de estrategias antibacterianas alternativas. Este estudio examinó si la dosificación de vitamina C podría modular la oxidación de Fenton y potenciar la actividad oxidativa antibacteriana contra H. pylori bajo condiciones ácidas in vitro definidas. La actividad oxidativa se evaluó utilizando la decoloración con ácido naranja 7 como lectura química indirecta y un ensayo de fluorescencia con ácido tereftálico como indicador relativo de la formación de producto asociada a radicales hidroxilo en reacciones de hierro-peróxido suplementadas con vitamina C. suspensiones en solución salina con urea a pH 3 hasta peróxido de hidrógeno y hierro ferroso con o sin suplementación escalonada de vitamina C, seguidas de un enumerado de unidades formadoras de colonias. La suplementación con vitamina C alteró las lecturas oxidativas y se asoció con mayores reducciones de bacterias viables en comparación con la química convencional de Fenton. Experimentos de rescate con deferoxamina y tiourea atenuaron la actividad antibacteriana, apoyando la hipótesis de que la actividad antibacteriana está asociada con procesos oxidativos mediados por el hierro y relacionados con radicales. La tinción de fluorescencia viva/muerta y la microscopía electrónica de barrido proporcionaron observaciones visuales cualitativas consistentes con los resultados de enumeración de la unidad formadora de colonias (UFC). En conjunto, estos hallazgos indican que la dosificación controlada de vitamina C puede modular las reacciones oxidativas basadas en Fenton y potenciar la actividad antibacteriana contra H. pylori en un modelo in vitro ácido y simplificado.

Introducción

H. pylori, una bacteria Gram-negativa con forma espiral que pertenece al género Helicobacter, ha demostrado mediante estudios de salud poblacional que presenta una alta prevalencia de infección en áreas geográficas, sexo y edad, con una tasa global de prevalencia de aproximadamente el 50%¹. La Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) ha clasificado a H. pylori como carcinógeno de Grupo 1, subrayando su fuerte relación con el cáncer gástrico y el linfoma del tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT). Actualmente, el manejo clínico de la infección por H. pylori se basa principalmente en regímenes farmacológicos. Los agentes más estudiados incluyen los inhibidores de la bomba de protones (IBP), que suprimen la secreción de ácido gástrico; compuestos de bismuto, que mejoran la eficacia antibiótica; y antibióticos como amoxicilina, claritromicina y metronidazol. Sin embargo, se ha demostrado que la monoterapia es insuficiente para la erradicación completa, lo que ha llevado al uso generalizado de regímenes combinados, comúnmente conocidos como terapia triple. Este enfoque suele consistir en un IBP, claritromicina y amoxicilina o metronidazol, administrados durante aproximadamente dos^semanas. Con el aumento de la prevalencia de cepas de H. pylori resistentes a los antibióticos, la eficacia de la triple terapia ha disminuido notablemente, lo que ha llevado a la adopción de la cuádruple terapia que combina un IBP, bismuto y dos^{antibióticos 3}. No obstante, estos regímenes siguen dependiendo fundamentalmente de los antibióticos, y la resistencia a los antibióticos sigue siendo un gran desafío en el manejo^{clínico 4,5}. En consecuencia, la exploración de estrategias antibacterianas alternativas independientes de los antibióticos ha despertado un interés creciente.

Más allá de sus efectos patológicos directos, la infección por H. pylori también se ha asociado con alteraciones en la homeostasis de los micronutrientes gástricos. Estudios clínicos y epidemiológicos han reportado concentraciones reducidas de vitamina C en el jugo gástrico y el suero de los individuos^{infectados 6}, lo que puede estar relacionado con inflamación mucosa, secreción alterada o aumento del consumo^{oxidativo 7,8,9}. Paralelamente, la infección por H. pylori se ha relacionado con la deficiencia de hierro a través de múltiples mecanismos, incluyendo la reducción de la acidez gástrica, la absorción alimenticia de hierro deteriorada y la competencia bacteriana por el hierro^{disponible 10}. Estas observaciones ponen de relieve el complejo entorno bioquímico que acompaña a la infección por H. pylori y subrayan la relevancia de los procesos relacionados con redox y hierro en condiciones gástricas ácidas.

Las especies reactivas de osígeno (ROS) han adquirido un considerable interés en la investigación antimicrobiana debido a las propiedades oxidativas de estas especies. ROS se refiere a una clase de moléculas químicamente reactivas formadas durante la reducción parcial del oxígeno, como el anión superóxido (O₂•⁻), el peróxido de hidrógeno (H₂O₂), el oxígeno singlete (¹O₂) y los radicales hidroxilo (•OH), entre otros. En los sistemas biológicos, las ROS están ampliamente implicadas en el metabolismo fisiológico normal y son esenciales para diversas actividades reguladoras^{celulares 11}. Cabe destacar que numerosos estudios han demostrado que un exceso de ROS puede alterar las membranas celulares bacterianas mediante la peroxidación lipídica, lo que provoca alteraciones en la estructura y función de las membranas, resultando finalmente en la inactivación^{bacteriana 12}. En consecuencia, los enfoques antimicrobianos basados en ROS han despertado interés como una posible vía para investigar los efectos antibacterianos no antibióticos contra H. pylori 13,14,15,16. Entre los diversos métodos de generación de ROS, la reacción de Fenton ha recibido una atención significativa por su producción de radicales altamente eficiente. La reacción de Fenton es un proceso avanzado de^{oxidación 17} en el que iones ferrosos (Fe²⁺) reaccionan con H₂O₂ en condiciones ácidas para producir radicales hidroxilo (•OH), que poseen un fuerte potencial oxidativo y pueden oxidar biomoléculas intracelulares.

Fe²⁺ +H→Fe³⁺+•OH+OH^-

Fe³⁺+ H→Fe²⁺+•OOH+ H⁺

H₂O→OH+•OOH+H₂O

Específicamente, a un pH de aproximadamente 2,8–4,5, H₂O₂ sufre descomposición catalítica por Fe²⁺, generando •OH mientras que Fe²⁺ se oxida a Fe³⁺. Fe³⁺ entonces reacciona con H₂O₂ para regenerar Fe²⁺, estableciendo un ciclo redox de Fe²⁺/Fe³⁺ que sostiene una producción continua de^{ROS 18}. Sin embargo, la reducción de Fe³⁺ a Fe²⁺ es relativamente lenta, constituyendo el paso limitante de tasa y, en consecuencia, disminuyendo la eficiencia global de la reacción de Fenton. Los estudios indican que introducir un agente reductor adecuado en el sistema de reacción de Fenton puede acelerar la reducción de Fe²⁺ a Fe²⁺, mejorando así la generación de ROS. La vitamina C tiene un papel redox dependiente del contexto. En sistemas que contienen hierro, puede promover la reducción de Fe²⁺ a Fe²⁺ y así apoyar el ciclo de Fenton, mientras que a concentraciones más altas o bajo diferentes condiciones de reacción también puede funcionar como antioxidante o como eliminador de^{radicales 19}.

Basándose en este contexto, el presente estudio investiga un sistema de reacción de Fenton asistido por vitamina C como un enfoque químicamente ajustable para modular la actividad oxidativa bajo condiciones ácidas in vitro ^{definidas 20,21}. La vitamina C se utilizó como agente reductor para facilitar la regeneración de Fe²⁺ y así alterar el comportamiento oxidativo efectivo de la reacción de Fenton. El sistema experimental utilizado aquí fue un modelo simplificado de solución salina-urea ácida y no estaba destinado a reproducir completamente el microambiente gástrico fisiológico, que contiene moco, componentes tampón, células huésped, factores inmunitarios y diversos sustratos orgánicos. Dentro de este modelo controlado, la actividad oxidativa se caracterizó mediante lecturas químicas y se evaluó en paralelo con las respuestas fenotípicas bacterianas, proporcionando una base experimental para investigar los efectos antibacterianos asociados a la ROS contra H. pylori in vitro.

Protocolo

Declaración ética
Este estudio fue un estudio bacteriano in vitro y no involucró participantes humanos, sujetos animales ni materiales derivados de pacientes. Por lo tanto, no se requería la aprobación de la junta de revisión institucional ni la aprobación de ética animal.

Evaluación de la degradación de AO7 en el sistema Fenton asistido por vitamina C
Para evaluar el efecto de la vitamina C en el comportamiento oxidativo observable de la reacción de Fenton, se utilizó la degradación por Ácido Naranja 7 (AO7) como lectura química indirecta de la actividad oxidativa. Este ensayo no cuantifica específicamente las especies reactivas individuales de oxígeno. Preparé 100 mL de solución de AO7 a 5 mg/L y ajusté la solución a pH 3. Se añadieron H₂O₂ y FeSO₄ a concentraciones finales de 2,2 mM y 0,055 mM, respectivamente. Añadía vitamina C ya fuera en bolo único al inicio de la reacción o en un esquema de dosificación en tres etapas. Para el experimento dosis-respuesta, se utilizaron proporciones molares Vc:^{Fe 2}⁺ de 0, 0,12, 0,24, 0,48, 2, 4, 6 y 8, correspondientes a concentraciones finales de vitamina C de 0, 0,0066, 0,0132, 0,0264, 0,110, 0,220, 0,330 y 0,440 mM, respectivamente, cuando se usa FeSO₄ a 0,055 mM. Para la condición de suma de tres pasos, dividí la misma cantidad total de vitamina C en tres alicuotas iguales y añadió una alicuota a los 3, 5 y 7 minutos después de iniciar la reacción. Por ejemplo, con una proporción^{Vc:Fe de 2}⁺ de 0,48, se añadió vitamina C a 0,0088 mM por alitera, dando una concentración total final de 0,0264 mM.

Se removió la solución de reacción de forma continua en la oscuridad durante 10 minutos manteniendo la temperatura por debajo de 30 °C. Recogí 2 mL de muestras antes y después de la reacción. Medí la absorbancia a 483 nm usando un espectrofotómetro UV-Vis y calculé la tasa de degradación del AO7 usando la Ecuación 1:

Tasa de degradación (%) = [(A₀ − A₁) / A₀] × 100% (1)

Aquí, A₀ representa la absorbancia de la muestra antes de la reacción, mientras que A₁ representa la absorbancia de la muestra después de la reacción.

Evaluación de la señal de fluorescencia •OH asociada utilizando una sonda TA
Para evaluar señales de fluorescencia asociadas a radicales hidroxilo bajo las mismas condiciones ácidas in vitro utilizadas en los experimentos antibacterianos, se estableció un sistema químico libre de células utilizando tereftalato disódico (TA, 1 mM) como sonda de fluorescencia. Este ensayo se utilizó como indicador relativo de la formación de productos asociados a •OH y no se interpretó como una cuantificación absoluta de la generación de radicales hidroxilo. Se incluyeron siete grupos: (1) blank (1 mM TA solo en el buffer de reacción), (2) H₂O₂ solo, (3) Fe²⁺ solo, (4) Vc solo (adición escalonada), (5) Fenton convencional (Fe²⁺ + H₂O₂), (6) Fenton asistido con vitamina C y adición de bolo Vc (Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc, bolus), y (7) Fenton asistido por Vc con adición escalonada de Vc (Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc, escalonado). En la condición de adición escalonada, el Vc se introdujo a los 3, 5 y 7 minutos después del inicio de la reacción en alicotas iguales, mientras que la condición del bolo recibió la misma cantidad total de Vc que una sola adición.

Las alicuotas se recogían durante un periodo de reacción de 10 minutos, se alcalinizaban inmediatamente con NaOH para calmar nuevas reacciones radicales y estabilizar la fluorescencia, y se almacenaban a 4 °C antes de la medición. La intensidad de fluorescencia del producto derivado de TA se midió usando un lector de microplacas (Ex/Em: 315/425 nm). La generación de radicales se expresó como intensidad de fluorescencia tras la resta de blank y se utilizó como indicador relativo de la generación de radicales. Se realizaron al menos tres experimentos independientes, y los datos se presentaron como perfiles de trayectoria temporal y comparaciones de puntos finales a 10 minutos.

Evaluación del rendimiento antibacteriano mediante recuento de colonias
Las cepas de H. pylori se almacenaron a −80 °C en un caldo de infusión cerebral y cardíaca (BHI) que contenía un 25% de glicerol. La cepa principal utilizada para el ensayo principal de conteo de colonias, ensayo de rescate, ensayo de interferencia matricial, tinción de fluorescencia viva/muerta y análisis de microscopía electrónica de barrido fue H. pylori G27. Antes de cada experimento, las bacterias se imprimían en placas de agar sanguíneo Columbia e incubadas durante 3 días a 37 °C bajo condiciones microaerofílicas que consistían en 5% de O₂, 10% CO₂ y 85% N^₂22.

Ensayo de conteo en colonia en la cepa primaria
Se utilizó la enumeración de unidades formadoras de colonias (UFC) para evaluar la actividad antibacteriana bajo diferentes condiciones de tratamiento. Incluyeron los siguientes grupos: control no tratado, H₂O₂ solo, vitamina C sola, reacción de Fenton convencional y reacción de Fenton asistida por vitamina C. Si no se incluyó un grupo solo de Fe²⁺ en el experimento original, evitar interpretar el ensayo primario como una separación total de los efectos oxidativos mediados por la reacción de Fenton. Se extrae H . pylori en cultivo y se resuspende la bacteria en solución fisiológica salina. Ajustó la densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) a 0,5, y transfirió la suspensión a una solución fisiológica salina que contenía 3 mM de urea ajustada a pH 3. Se añadió H₂O₂, FeSO₄ y vitamina C según el grupo de tratamiento asignado. Se utilizaron concentraciones finales de 2,2 mM H₂O₂ y 0,055 mM de FeSO₄. Para el tratamiento de Fenton asistido con vitamina C, se añadió vitamina C en tres alicuotas iguales a 3, 5 y 7 minutos, con una concentración total final de 0,0264 mM.

Tras 10 minutos de tratamiento, cada muestra se diluía inmediatamente 100 veces en solución fisiológica tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) para neutralizar la suspensión ácida y reducir la retención de oxidantes residuales y hierro en la etapa de placado. Colocaron la suspensión bacteriana diluida sobre placas de agar sanguíneo Columbia e incubaron a 37 °C durante 3 días bajo condiciones microaerofílicas de 5% O₂, 10% CO₂ y 85% N₂. Conté las UFC y calculé la actividad antibacteriana como reducción log₁₀ de la UFC respecto al control no tratado usando la Ecuación 2:

log₁₀ reducción de la UFC =_{logaritmate 10}(_control de la UFC) − logarítmium 10(_{UCC tratada}) (2)

Ensayo de rescate
Para examinar si la actividad antibacteriana del sistema Fenton asistido por vitamina C estaba asociada con la disponibilidad de hierro y procesos relacionados con los radicales, se realizaron experimentos de rescate utilizando deferoxmina (DFO) como quelante de hierro y tiourea como eliminador de radicales hidroxilo. DFO o tiourea se añadió a la suspensión bacteriana 5 minutos antes de la incorporación de FeSO₄ y H₂O₂. DFO y tiourea se usaron a concentraciones finales de 100 μM y 5 mM, respectivamente.

Se incluyeron seis grupos experimentales: control no tratado, Fenton asistido con vitamina C, Fenton asistido con vitamina C con DFO, Fenton asistido con vitamina C con tiourea, DFO solo y tiourea sola. Todos los demás parámetros experimentales, incluyendo pH, fondo de suero/urea, concentración de H₂O₂, concentración de FeSO₄, esquema de dosificación de vitamina C, duración del tratamiento, dilución/neutralización antes del ensayo de placado y condiciones de incubación, fueron idénticos a los utilizados en el ensayo primario de recuento de colonias. La actividad antibacteriana se cuantificó mediante la enumeración de UFC y se expresó como una reducción log₁₀ de UFC en relación con el control no tratado.

Validación multideformación
Para proporcionar un soporte limitado en la cepa cruzada para el efecto antibacteriano observado en la cepa primaria, se aplicó además el ensayo de conteo de colonias a dos cepas adicionales de referencia de H. pylori , ATCC 43504 y ATCC 26695. Para cada cepa, se incluyeron tres grupos experimentales: control no tratado, reacción de Fenton convencional y reacción de Fenton asistida por vitamina C con adición de vitamina C por etapas consecutivas. Las condiciones y procedimientos experimentales eran idénticos a los utilizados en el ensayo primario de conteo de colonias. La actividad antibacteriana se expresó como reducción log₁₀ de la UFC relativa al control no tratado para cada cepa. Cada experimento se realizó con n = 3 réplicas biológicas independientes, y los datos se presentaron como puntos individuales con media ± desviación estándar.

Ensayo de interferencia matricial
Para evaluar si los componentes de la matriz orgánica podían atenuar la actividad antibacteriana del sistema Fenton asistido por vitamina C, se estableció un modelo de interferencia proteica utilizando albúmina sérica bovina (BSA). Se incluyó la BSA en concentraciones finales de 0, 1 y 3 g· L⁻¹. En cada concentración de BSA, se incluyeron tres grupos experimentales: (1) control no tratado, (2) Fenton convencional (Fe²⁺ + H₂O₂) y (3) Fenton asistido con vitamina C y adición gradual de vitamina C. El ensayo se realizó utilizando la cepa primaria bajo el mismo protocolo descrito en el ensayo primario de conteo de colonias, con condiciones idénticas de pH, fondo salino/urea, concentraciones de reactivos, duración del tratamiento (10 min) y procedimientos de reposición. La actividad antibacteriana se expresó como una reducción logarítmica₁₀ de la UFC relativa al control no tratado en cada concentración de BSA. Cada experimento se realizó al menos tres veces de forma independiente. La comparación principal se centró en si la condición de Fenton mejorada seguía siendo superior, o al menos no más débil que, la condición convencional de Fenton bajo condiciones que contenían proteínas.

Tinción bacteriana viva/muerta por fluorescencia
Tras el tratamiento, la suspensión bacteriana se diluyó cien veces en PBS como se describió anteriormente para reducir la retención de ácido y oxidación residual. Centrifugó la suspensión a 1.800 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente y descartó el sobrenadante. Resuspendió el pellet bacteriano en 200 μL de solución fisiológica fisiológica. Se añadió SYTO9 y yoduro de propidio (PI) a concentraciones finales de 6 μM y 30 μM, respectivamente. Incubé la suspensión a oscuridad durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se colocaron 5–10 μL de la suspensión bacteriana teñida sobre una lámina de cristal limpia y la cubrieron con una cubierta. Imágenes de fluorescencia adquiridas usando un microscopio de fluorescencia con canales de fluorescencia verde y rojo bajo la misma configuración de exposición para todos los grupos de tratamiento. Capturó al menos tres campos seleccionados al azar para cada grupo. Utilizó las imágenes como evidencia visual cualitativa de patrones de tinción viva/muerta en lugar de como una medida cuantitativa de la viabilidad bacteriana.

Análisis de morfología bacteriana mediante microscopía electrónica de barrido
Tras el tratamiento, las muestras bacterianas se recogieron y fijaron en glutaraldehído al 2,5% preparadas en un tampón fosfato de 0,1 M (pH 7,4) a 4 °C durante 12 horas. Tras la fijación, las muestras se lavaron con tampón de fosfato para eliminar el fijador residual. Las muestras se deshidrataron secuencialmente en soluciones de etanol graduadas del 50%, 70%, 90% y 100%. Tras la deshidratación, se realizó un secado en puntos críticos. Las muestras secas se montaron sobre muñones de SEM y se recubrieron con sputter con una fina capa dorada de aproximadamente 10 nm. La morfología bacteriana se examinó mediante microscopía electrónica de barrido a un voltaje acelerado de 5 kV. Se adquirieron imágenes representativas a bajo y alto aumento para cada grupo de tratamiento. Las imágenes de SEM se utilizaron como observaciones morfológicas cualitativas en lugar de como evidencia cuantitativa de un mecanismo de daño definido.

Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 10.0. Todos los experimentos cuantitativos se realizaron con n = 3 réplicas biológicas independientes, y los datos se presentan como media ± desviación estándar (DS). Para los ensayos de fluorescencia TA, se realizaron comparaciones estadísticas entre varios grupos de tratamiento utilizando análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Para los ensayos de recuento de colonias en la cepa primaria que involucraba múltiples condiciones de tratamiento, se realizaron comparaciones estadísticas utilizando ANOVA unidireccional seguidas de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Para los ensayos de rescate, se realizaron comparaciones entre grupos utilizando ANOVA unidireccional seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett, con el grupo de Fenton asistido por vitamina C como referencia. Para experimentos limitados de validación cruzada de deformaciones, se compararon reducciones log₁₀ de UFC entre los grupos Fenton convencional y Fenton asistido por vitamina C dentro de cada cepa utilizando una prueba t de dos colas no emparejada. Para ensayos de interferencia matricial, se realizó ANOVA bidireccional con tratamiento y concentración de BSA como factores, incluyendo el término de interacción. Se realizaron comparaciones por pares entre los tratamientos en cada concentración de BSA utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Šídák. La significación estadística se definió como P < 0,05. Los niveles de significación se indican como *p < 0,05, ** P < 0,01, ***P < 0,001 y ****p < 0,0001.

Resultados

Evaluación de la degradación de AO7 en el sistema Fenton asistido por vitamina C
La degradación de AO7 se utilizó como sonda química para examinar cómo la vitamina C influye en el comportamiento oxidativo observable de la reacción de Fenton bajo condiciones ácidas. En ausencia de vitamina C, el sistema convencional de Fenton provocaba una degradación parcial de AO7 durante el periodo de reacción de 10 minutos. Cuando se introdujo la vitamina C, el grado de degradación...

Discusión

El presente estudio examinó si la dosificación de vitamina C podría modular el comportamiento oxidativo y las lecturas antibacterianas de un sistema basado en Fenton bajo condiciones definidas de ácido in vitro . En los ensayos químicos y microbiológicos, la suplementación con vitamina C escalonada alteró el comportamiento de reacción observable y se asoció con una mayor actividad antibacteriana contra H. pylori que la reacción convencional de Fenton bajo las condicione...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acid Orange 7 (AO7)	Aladdin Reagent (Shanghai) Co., Ltd.	O113230	Usado como un tinte modelo para el ensayo de degradación de AO7.
Bovine serum albumin (BSA)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	B885114	Usado para el ensayo de interferencia de matriz.
Brain Heart Infusion (BHI) broth powder	Sichuan Hapyear Bio-engineering Co., Ltd.	N/A	Usado para el cultivo de bacterias y almacenamiento criogénico.
Columbia blood agar plates (5% sheep blood)	Changde Bkmam Biotechnology Co., Ltd.	110701028.0	Usado para el cultivo de bacterias y enumeración de UFC.
Critical point dryer (EM CPD300)	Leica Microsystems	EM CPD300	Usado para la preparación de muestras SEM después de la deshidratación con etanol graduado.
Deferoxamine (DFO)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D873692	Usado como quelante de hierro en el ensayo de rescate.
Disodium terephthalate	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	D835937	Usado como sonda de fluorescencia TA para la detección de señales asociadas a •OH.
Ethanol, absolute	Sigma-Aldrich	E7023	Usado para preparar la serie de etanol graduado para la deshidratación de muestras SEM.
Fluorescence microscope (DMi8)	Leica Microsystems	DMi8	Usado para imagen de fluorescencia vivo/muerto.
Glutaraldehyde solution	Sigma-Aldrich	G5882	Usado para la fijación de muestras bacterianas antes de SEM.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Usado para el almacenamiento criogénico de bacterias en caldo BHI.
GraphPad Prism 10	GraphPad Software, LLC	Prism 10	Usado para análisis estadístico y creación de gráficos.
Helicobacter pylori strain ATCC 26695	American Type Culture Collection (ATCC)	700392	Cepa de referencia adicional utilizada para la validación limitada entre cepas.
Helicobacter pylori strain ATCC 43504	American Type Culture Collection (ATCC)	43504	Cepa de referencia adicional utilizada para la validación limitada entre cepas.
Helicobacter pylori strain G27	Center of Infectious Diseases, West China Hospital, Sichuan University	N/A	Cepa primaria utilizada para recuento de colonias, ensayo de rescate, ensayo de interferencia de matriz, tinción vivo/muerto y SEM.
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009	Usado como sustrato de peróxido en ensayos de reacción Fenton.
Iron(II) sulfate monohydrate (FeSO4·H2O)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	F904376	Usado como fuente de iones ferrosos en la reacción Fenton.
Microplate reader (Synergy H1)	Agilent BioTek	Synergy H1	Usado para medir la fluorescencia derivada de TA (Ex/Em = 315/425 nm).
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Sigma-Aldrich	P4417	Usado para la dilución/neutralización posterior al tratamiento antes de la siembra y el lavado de muestras.
Physiological saline (0.9% sodium chloride solution)	Millipore	567442	Usado para la suspensión bacteriana y la preparación del modelo de solución salina ácida-urea.
Scanning electron microscope (INSPECT F)	FEI Company	INSPECT F	Usado para el análisis de morfología bacteriana.
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	Usado para alcalinizar las alícuotas del ensayo TA y estabilizar la fluorescencia.
Sputter coater (EM ACE200)	Leica Microsystems	EM ACE200	Usado para aplicar el recubrimiento de oro delgado antes de la imagen SEM.
SYTO 9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit	Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd.	MX4234	Usado para la tinción bacteriana vivo/muerto basada en fluorescencia.
Thiourea	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	T81602	Usado como captador de radicales en el ensayo de rescate.
Urea	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	U820349	Usado para preparar el modelo de solución salina ácida-urea.
UV-Vis spectrophotometer (UV-2600i Plus)	Shimadzu Corporation	UV-2600i Plus	Usado para medir la absorbancia de AO7 a 483 nm.
Vitamin C (L-ascorbic acid)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.	A800295	Usado como reductor en el sistema Fenton asistido por vitamina C.