Un método semiautomatizado para detectar diferencias de grupo en los números de neuronas dopaminérgicas del clúster anterior medial protocerebral en el cerebro de Drosophila

Resumen

Este protocolo presenta un método semi-automatizado para cuantificar el número de neuronas dopaminérgicas en el gran cúmulo medial anterior anterior protocerebral de Drosophila . Diseñado específicamente para detectar y comparar diferencias entre grupos experimentales y de control, este enfoque reduce la dependencia del recuento manual y proporciona una herramienta práctica para análisis a nivel de grupo.

Resumen

Drosophila melanogaster actúa como un organismo modelo potente para el estudio de enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson (EP), principalmente mediante el análisis de la degeneración neuronal dopaminérgica (DA) y los déficits asociados a la locomoción. Históricamente, la cuantificación de la pérdida de neuronas DA en el cerebro de la mosca se ha limitado a grupos más pequeños y fácilmente numerables, incluyendo grupos protocerebrales posteriores mediales (PPM) y grupos protocerebrales posteriores laterales (PPL). En contraste, el grupo protocerebral antero-medial (PAM) sustancialmente mayor, compuesto por más de 100 neuronas, presenta un desafío significativo para el recuento manual, lo que lleva a su subrepresentación en estudios cuantitativos. Hasta la fecha, las investigaciones reportadas siguen basándose en conteos manuales intensivos de mano de obra mediante pilas confocales Z, que son laboriosas y propensas a la variabilidad. Para cubrir esta brecha metodológica, desarrollamos una cadena de análisis de imágenes semi-automatizada utilizando la herramienta de código abierto Labkit. Este protocolo permite una cuantificación eficiente relativa a grupos de neuronas positivas a tirosina hidroxilasa (TH) en el grupo PAM dentro del mismo lote experimental. El método comienza con la tinción estándar de inmunofluorescencia e imagen confocal, seguida de una guía detallada paso a paso para segmentación y análisis. Este enfoque aborda el cuello de botella de la cuantificación de clústeres PAM y proporciona un flujo de trabajo práctico para detectar diferencias intergrupales en la vulnerabilidad de las neuronas DA en modelos de neurodegeneración. La relativa escasez de estudios sobre la MP en el grupo PAM refleja una barrera técnica histórica más que una falta de relevancia biológica. Al superar esta barrera, nuestro método abre la puerta a una investigación sistemática de la vulnerabilidad de las neuronas PAM en la EP y su posible vínculo con síntomas no motores.

Introducción

La mosca vinagre, Drosophila melanogaster, es un organismo modelo popular para investigar las bases genéticas y moleculares de enfermedades neurodegenerativas, especialmente la enfermedad de Parkinson (EP)¹. Sus conservadas vías de señalización neuronal, su sofisticado conjunto de herramientas genéticas y su corta esperanza de vida la hacen especialmente adecuada para estudiar la vulnerabilidad neuronal dependiente de la edad y para realizar cribados genéticos y farmacológicos de alto rendimiento ^2,3. El eje central de estas investigaciones es el análisis de neuronas dopaminérgicas (DA), cuya degeneración selectiva es una característica patológica de la^{PD 4}. En el cerebro de Drosophila, las neuronas DA están organizadas en clústeres discretos y genéticamente^{identificables 5,6}. La pérdida progresiva de neuronas DA dentro de grupos específicos, visualizada mediante la inmunotinción TH y cuantificada mediante microscopía, sirve como una lectura funcional principal para evaluar la progresión de la enfermedad e intervenciones neuroprotectoras en modelos^{experimentales 7,8}. Por tanto, una cuantificación fiable de la pérdida de neuronas de la DA es esencial para traducir el poder de la genética de Drosophila en resultados significativos de investigación sobre la EP.

Convencionalmente, el análisis cuantitativo de la pérdida de neuronas DA se ha centrado en la inmunotinción por tirosina hidroxilasa (TH) de pequeños grupos, incluyendo grupos protocerebrales posteriores mediales (PPM) y grupos protocerebrales posteriores laterales (PPL), cada grupo conteniendo menos de 10 células fácilmente numerables por el^{ojo 7}. La enumeración manual mediante pilas Z confocales, aunque laboriosa, ha sido el método establecido para estos grupos en muchos estudios de DP utilizando Drosophila ^9,10,11. En cambio, el conteo manual del grupo protocerebral anterior medial (PAM), el mayor grupo de neuronas DA en el cerebro de mosca, que comprende más de 100 células, presenta un cuello de botella metodológico de larga duración y impide su inclusión en la mayoría de los estudios sobre EP ^9,10,11. A pesar del papel fundamental de las neuronas PAM en los circuitos de aprendizaje, memoria y motivación, esta limitación ha resultado en su relativa subrepresentación en análisis cuantitativos de la neurodegeneración 12,13,14,15. Cabe destacar que incluso investigaciones recientes siguen basándose en este enfoque ineficiente de conteo manual, lo que subraya una necesidad persistente y no satisfecha de una solución estandarizada y automatizada dentro del campo¹³.

Para abordar esta brecha crítica, hemos desarrollado una cadena de análisis de imágenes semiautomatizada que permite una cuantificación eficiente en grupo de neuronas TH-positivas (TH⁺) en el cúmulo PAM dentro de un experimento. Este protocolo aprovecha el plugin de código abierto basado en aprendizaje automático Labkit dentro de la plataforma Fiji/ImageJ y el software de procesamiento de imágenes^{3D 16,17}. El flujo de trabajo central requiere que el usuario anote un subconjunto representativo de imágenes para entrenar un modelo de clasificación de píxeles, que luego se aplica a conjuntos de datos experimentales de tinción TH en procesos por lotes, seguido de la creación y clasificación de puntos del núcleo en relación con la región ^TH+. Este enfoque equilibra la automatización con la supervisión de expertos: reduce la carga y variabilidad de los recuentos totalmente manuales, al tiempo que mantiene la aportación de los investigadores para guiar el algoritmo y revisar los resultados.

El objetivo de este artículo es proporcionar a los investigadores un protocolo paso a paso para la cuantificación eficiente de la relativa neurona DA del clúster PAM para comparaciones relativas a grupos dentro de un experimento. Demostramos el flujo de trabajo completo, desde la disección cerebral, la tinción por inmunofluorescencia e imagen confocal hasta la cadena detallada de análisis de imágenes utilizando el método semi-automatizado. Al estandarizar este paso cuantitativo clave, este protocolo pretende empoderar a la comunidad investigadora para incorporar de forma constante el gran cúmulo de PAM en sus análisis. Este método semiautomatizado está diseñado específicamente para el clúster PAM y no es aplicable a otros cúmulos dopaminérgicos ni a neuronas TH-positivas en los lóbulos ópticos. Este método puede facilitar estudios a nivel de lote sobre la vulnerabilidad de las neuronas DA del clúster PAM y más investigaciones sobre plasticidad sináptica, neurodegeneración y cribado terapéutico utilizando el modelo Drosophila .

Protocolo

1. Preparación de muestras e imagen confocal

1. Manejo y recolección de moscas
   1. Cruza moscas progenitoras de los genotipos deseados para generar descendencia experimental. Al eclosionar, recoge entre 20 y 30 moscas por vial de alimento fresco. Mantener las moscas según el diseño experimental del usuario hasta alcanzar la edad experimental deseada.
2. Preparación para la disección
   1. Prepara un plato de disección llenando la tapa de una placa de Petri de 30 mm hasta la mitad con elastómero de silicona Sylgard. Rellena el plato con 1x Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS). Alitera 450 μL de fijador que contiene 1x PBS y 4% de paraformaldehído (PFA) en un tubo microcentrífuga de 0,6 mL, luego coloca el tubo sobre hielo.
   2. Anestesiar 10–20 moscas con un pulso de CO₂ durante 5–10 s, y luego transfierirlas inmediatamente a una placa de Petri de 60 mm colocada sobre hielo para mantener la inmovilidad.
      PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico y se sospecha que es carcinógeno. Maneja en una campana extractora, con guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad. Eliminar los residuos según las directrices institucionales sobre materiales peligrosos.
3. Disección y fijación del cerebro de las moscas
   1. Agarra una mosca por la raíz del ala usando pinzas y sumerge su lado ventral hacia arriba en la bandeja de disección llena de PBS. Perfora el tórax con un fino pasador de disección para anclar la mosca en la almohadilla de Sylgard.
   2. Orienta el cuerpo horizontalmente (por ejemplo, cabeza izquierda, abdomen derecha). Sujeta la base de la probóscide con una pinza mientras con la otra se extrae toda la probóscide, creando una abertura entre los ojos compuestos.
   3. Agarra los bordes expuestos del ojo con dos pinzas y separalos muy lentamente de forma simétrica, exponiendo el cerebro mientras se mantiene su conexión con el cordón nervioso ventral.
   4. Elimina los sacos traqueales y el cuerpo graso que rodean el cerebro. Corta el cordón nervioso ventral para liberar el cerebro y permite que se asiente sobre el plato con su lado anterior hacia arriba.
      NOTA: Si el cerebro asentado muestra la mitad ventral posicionada más arriba que la dorsal (Figura 1B,C), utiliza fórceps para presionar suavemente la parte elevada.
   5. Prehumedece una punta de pipeta P10 con 0,1% de Triton X-100 para evitar que el cerebro disecado se adhiera a la pared interna de la punta. Usando esta punta prehumedecida, transfiere cada cerebro diseccionado al tubo que contiene el fijador y luego procede a la siguiente disección. Después de transferir todos los cerebros, invierte el tubo 5 veces y colócalo horizontalmente sobre hielo durante 30 minutos. Incuba el tubo a temperatura ambiente (RT) durante 1 hora con agitación.
   6. Deja que el cerebro se asiente en el fondo durante 1 minuto. Lava el cerebro durante 3 x 10 minutos con una solución que contenga 1x PBS y 0,1% Triton X-100 (PBST) con agitación. Almacena los cerebros en PBS que contiene azida de sodio al 0,1% a 4 °C o procede a la inmunotinción.
4. Inmunotinción
   1. Tinte cerebros en 300 μL de solución primaria de tinción de anticuerpos que contiene 1x PBS, 0,1% Triton X-100, 5% Suero normal de cabra, 0,1% azida sódica y anticuerpo anti-TH de conejo (dilución 1:500) durante 2 días a 4 °C con agitación. Lava el cerebro durante 3 x 10 minutos con PBST.
   2. Tinte el cerebro con una solución secundaria de anticuerpos que contiene 1x PBS, 0,1% Triton X-100, 5% Suero normal de cabra, 0,1% azida sódica y anti-conejo Alexa Fluor 635 durante 2 días a 4 °C. Lávate el cerebro una vez con PBST.
   3. Incubar cerebros en PBST suplementado con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (dilución 1:1.000) durante 2 horas en RT, luego lavar los cerebros con PBST durante 2 horas. Guarda los cerebros a 4 °C durante la noche o luego monta.
5. Montaje
   1. Carga 0,5 mL de montador en una jeringuilla de 1 mL equipada con una aguja de calibre fino. Crea una cámara de montaje fijando dos tiras paralelas de cinta adhesiva transparente sobre una corredera de vidrio, dejando un hueco de 3 mm (Figura 1A,D).
      PRECAUCIÓN: Las agujas afiladas suponen un riesgo de pinchazo. Siempre manipula con cuidado, recapsa con una técnica de cuchara con una sola mano si es necesario y desecha las agujas usadas inmediatamente en un recipiente aprobado para objetos punzantes.
   2. Transfiere cerebros a una placa de Petri limpia usando una punta de P200 truncada. Elimina el exceso de líquido que rodea los cerebros y administra 10 μL de montante sobre los cerebros. Mezcla suavemente los cerebros con el montador.
   3. Distribuye tres gotas de montador a lo largo de la rendija en la corredera y distribuye uniformemente a lo largo de la rendija. Transfiere y posiciona los cerebros a lo largo de la línea central del hueco con una pipeta P10 (Figura 1A).
   4. Coloca los cerebros de forma uniforme a lo largo de la línea central del espacio, con la parte anterior hacia arriba. Cubre lentamente el hueco con una capa de cobertura. Presiona cerca de los bordes de la funda con los pulgares durante 3 segundos para asegurar un contacto firme.
   5. Coloca el portaobjetos horizontalmente en una carpeta para que cure durante la noche en RT a oscuras, y luego a 4 °C para almacenamiento a largo plazo.
6. Imagen confocal
   1. Enciende el sistema de microscopio confocal y espera 15 minutos para la estabilización láser. Localiza los cerebros en campo brillante con una lente objetivo 10x, luego cambia a una lente objetivo de inmersión en aceite 100x y navega al clúster PAM en vista en vivo.
   2. Ajusta la etapa XY para localizar un clúster PAM en el centro de imagen. Vista previa a través de Z para confirmar los límites y la orientación. Ajusta el zoom digital y la orientación hasta que el panel PAM encaje en el fotograma de imagen a lo largo de la diagonal.
   3. Coloca la posición superior e inferior de la pila. Ajusta el tamaño Z-step a 0,34 μm y la resolución de imagen a 512 x 512. Pon el agujero del pasador en modo automático. Configura la tabla de consulta de visualización (LUT) en indicador de saturación.
   4. Ajusta la potencia láser y la ganancia del detector en el canal TH hasta saturar una cantidad mínima de puntos dispersos y discretos dentro de las neuronas PAM. Ajusta la configuración del canal DAPI para obtener una señal nuclear brillante y clara sin saturación.
      NOTA: El factor de zoom óptimo varía. Las diferencias en la contracción tisular pueden producirse entre lotes experimentales y entre cerebros individuales dentro del mismo lote.
   5. Adquirir y guardar imágenes en formato raw con 12 o 16 bits en la carpeta de entrada (por ejemplo, D:\Confocal\images). Vuelve a la vista en vivo, reinicia el zoom y navega por el hueco para encontrar el siguiente cerebro sin cambiar a una ampliación menor.
      NOTA: No guardes, exportes ni conviertas los archivos de datos primarios a un formato .tif procesado en esta fase. Preservar los metadatos originales en bruto es esencial para el procesamiento posterior de la imagen.

2. Procesamiento de imágenes y cuantificación

1. Conversión de archivo de imagen y división de canales TH
   1. Convierte las imágenes en bruto ubicadas en la carpeta de entrada a un formato compatible con el software de análisis de imágenes 3D usando el convertidor de archivos asociado (Tabla de Materiales). Coloca los archivos convertidos en la carpeta convertida (por ejemplo, D:\Confocal\converted)
   2. Abre Fiyi y navega a Archivo | Nuevo | Guion. En el editor de scripts, haz clic en Archivo | Abierto para cargar el archivo macro ImageFolder_Split_ChannelAndSaveMacro_UltimateDepth.ijm (Archivo Suplementario 1). Haz clic en Ejecutar cerca de la parte inferior de la ventana del editor (si el botón está oculto, haz clic en el pequeño icono triangular para mostrarlo).
   3. En el cuadro de diálogo de configuración, haz clic en Explorar y selecciona la carpeta convertida. En Convención de Nombres, selecciona la opción 3. En Canal para exportar, selecciona el índice de canal correspondiente a TH. Haz clic en OK para dividir por lotes el canal TH; las pilas de TH exportadas se guardarán automáticamente en una carpeta que termina con ChannelSplitOut.
2. Entrenamiento del clasificador Labkit
   1. Preparación del conjunto de datos de entrenamiento
      1. Selecciona 20 pilas representativas que capturen un rango de intensidades de señal y variaciones de fondo de muestras de la carpeta de pilas TH. Copia los archivos seleccionados a la carpeta de selección (por ejemplo, D:\Confocal\selection).
      2. Ejecuta la macro Fiji ImageFolder_UniCropZStack_ToThinestLayers.ijm (Archivo Suplementario 2). Cuando se le pida, selecciona la carpeta que contiene las imágenes de entrenamiento. La macro recorta cada pila al mismo número de Z-slices y concatena las pilas en un archivo TIFF de lapso de tiempo para entrenamiento.
   2. Entrenamiento interactivo de clasificadores de píxeles
      1. Lanzar Labkit a través de Fiji Plugins | Labkit | Imagen actual abierta con Labkit (tabla de materiales). En la barra de herramientas, haz clic en el botón 3D Box para cambiar al modo Slice View y navegar por Z-slices (deslizador a la derecha) y a través de muestras (deslizador abajo).
      2. Pulsa S para abrir el panel de Brillo y Contraste y ajusta el control deslizante Max para una visualización óptima de las neuronas TH⁺ . Establece un tamaño de pincel adecuado (por ejemplo, 5 píxeles). Haz clic en Configuración para expandir el panel de herramientas. Mantén los modos de visualización predeterminados (fusible, fuente, más cerca).
      3. Haz clic en Dibujar. En el panel de Etiquetado, resalta Fondo y utiliza algunas regiones no celulares; resaltar el primer plano y aprovechar el interior de unas pocas neuronas TH⁺ .
      4. Haz zoom en y fuera del campo con Ctrl + Shift + Scroll. Navega hacia otras Z-slices usando el deslizador vertical y hacia otras muestras de entrenamiento usando el deslizador inferior. Repite el dibujo varias veces para asegurar un entrenamiento sólido del clasificador.
      5. Haz clic en la clasificación de píxeles. Haz clic en el triángulo Iniciar entrenamiento para iniciar el entrenamiento y la predicción perezosa, que luego proporciona retroalimentación de segmentación en tiempo real mientras navegas entre muestras, cortes o posiciones (clic derecho y arrastre) en cualquier momento.
      6. Haz clic en Dibujar para añadir anotaciones correctivas donde la predicción sea inexacta, con opción de desactivar la visibilidad de la predicción y la etiqueta en el panel de Fuentes y volver a entrenar. Itera hasta que el clasificador distinga de forma fiable las neuronas ^TH+ del fondo, luego guarda el clasificador mediante Segmentación | Guarda el clasificador antes de cerrar Labkit.
3. Segmentación por lotes de Labkit
   1. Abre una imagen aleatoria de la carpeta TH stack en Fiji. Inicia Labkit y haz clic en Eliminar Todo, luego carga el clasificador preentrenado a través de Segmentación | Abre el clasificador para segmentar la imagen. Inspecciona visualmente la calidad para validar la generalización del clasificador y luego cierra la ventana.
   2. Repite la versión 2.3.1 en varias otras imágenes aleatorias. Cierra la ventana después de cada inspección excepto la última.
   3. Crea una carpeta de salida de Labkit (por ejemplo, D:\Confocal\LabkitOut). Inicia el procesamiento por lotes a través de Otros > Imágenes de Segmentos por lotes. Configura el Director de Entraday en la carpeta TH stack y el Directorio de Salida en la carpeta de salida Labkit, y luego haz clic en OK para iniciar el procesamiento por lotes.
   4. Para futuros experimentos usando el mismo anticuerpo TH y configuraciones confocales comparables, salta la 2.2 y reutiliza el clasificador anterior.
      NOTA: También proporcionamos un clasificador preentrenado para fines de prueba (Archivo Suplementario 3).
4. Creación de spots DAPI y TH⁺ Cuantificación neuronal
   1. Coloca XT_Jove_Labkit_TH.m (Archivo Suplementario 4) en una carpeta de scripts (por ejemplo, D:\scripts). Abre el software 3D y navega a Archivo | Preferencias, luego selecciona Herramientas personalizadas. En el panel de carpetas XTension , haz clic en Añadir... para seleccionar carpeta de scripts y hacer clic en OK.
   2. Para cada archivo convertido, el script ejecutará automáticamente las siguientes operaciones secuenciales.
      NOTA: Esta sección explicativa no contiene acciones para el usuario, pero es esencial para avanzar a los siguientes pasos.
      1. El canal DAPI se procesa mediante Rescrata de Fondo y Filtro Gaussiano para facilitar una identificación optimizada de puntos DAPI.
      2. La máscara de segmentación Labkit se refina mediante la reducción de ruido y el relleno de huecos, y se adjunta como un canal de máscara al conjunto de datos. Un objeto superficial refinado de TH se construye a partir del canal de la máscara. El objeto de superficie TH genera además una máscara refinada para sobrescribir el canal de la máscara.
      3. Se crea un canal de transformada de distancia a partir de la superficie TH, donde los vóxeles dentro de la superficie se establecen en 0 y los vóxeles fuera de la superficie se asignan con valores de punto flotante que representan su distancia euclidiana a la superficie TH más cercana.
      4. Utiliza el perfil de intensidad de cada punto DAPI en el canal de transformación de distancia como métrica para la identificación de la neurona ^TH+ . Los spots DAPI situados dentro o cerca de las regiones TH⁺ tienen valores de distancia bajos. Este criterio ayuda a rescatar falsos negativos, como núcleos reales de neuronas DA situados justo fuera pero inmediatamente adyacentes a una región de primer plano predicha por Labkit imperfecto.
   3. Optimización manual de la Calidad para la creación de spots DAPI
      1. Abre una muestra aleatoria de la carpeta convertida en un software 3D. Navegar a Editar | Propiedades de la imagen y verifica si el tamaño del vóxel Z en el panel de Coordenadas es 0,340 μm. Si no, cámbialo manualmente a 0,340 μm.
      2. Aplica la rescesta de fondo al canal DAPI haciendo clic en Procesamiento de imágenes | Umbral | Sustracción de fondo. En el diálogo, marca solo el canal DAPI, pon Ancho de Filtro en 3 y haz clic en OK. Repite este paso una vez más y luego realiza una tercera repetición con un ancho de filtro de 1.
      3. Aplica suavizado gaussiano haciendo clic en Procesamiento de imágenes | Alisado | Filtro gaussiano. Marca solo el canal DAPI, pon el Ancho del Filtro en 0,2 y haz clic en OK.
      4. En la escena de Sobresaltar, haz clic en Añadir Nuevos Puntos para iniciar el asistente de creación de Manchas. Selecciona el canal DAPI e introduce un diámetro estimado XY de 1,2 μm. Siguiendo el asistente, añade un filtro "Calidad por encima" y ajusta el umbral hasta que proporcione robustamente un punto único preciso para cada núcleo.
      5. Repite los pasos 2.4.3.1–2.4.3.3.4 en varias muestras seleccionadas al azar y finalice valor(es) umbral(es) que funcionen de forma fiable entre muestras.
   4. Abre el script XT_Jove_Labkit_TH.m (Archivo Suplementario 4) en el editor de texto para modificar los siguientes parámetros definidos por el usuario.
      1. Establece ims_Folder en la ruta de la carpeta convertida; LabkitOut_Folder a la ruta de la carpeta de salida de Labkit. Establece Ch_DAPI al índice del canal DAPI para todos los archivos de la carpeta convertida (por ejemplo, 1 si DAPI es el primer canal, 2 si DAPI es el segundo canal).
      2. Establecer reVoxelSizeX, reVoxelSizeY, reVoxelSizeZ. Si los tamaños de vóxeles son correctos en Propiedades de Imagen (véase el paso 2.4.3.1), deja las respuestas entre corchetes vacíos []. De lo contrario, introduce manualmente los valores adecuados (por ejemplo, 0.130, 0.130, 0.340, respectivamente) que se aplicarán a todos los archivos de la carpeta convertida.
   5. Finaliza los parámetros de creación puntual.
      1. Personaliza varias versiones de parámetros en el array de celdas SpotsParameterAss , donde cada fila especifica una versión. Esto incluye definir el diámetro estimado XY (μm) para la detección puntual DAPI en la parte izquierda de cada fila, y definir la cadena de filtro compuesta por filtro(s) de criterio en la parte derecha de cada fila, que contengan el /los umbral(es) de calidad del paso 2.4.3.4 y/o umbral de intensidad en el canal de máscara refinado del paso 2.4.2.2 o el canal de transformación por distancia del paso 2.4.2.3.
      2. Coloque "Centro de intensidad Ch=aSizeC+1" por encima de 0,5 para conservar solo los puntos cuyo centro geométrico se encuentra dentro del canal refinado de la máscara TH desde 2,4.2.2 (valor voxel > 0,5). Este es el criterio más directo y estricto para el filtrado puntual TH⁺ DAPI.
      3. Establezca "Intensidad Media Ch=aSizeC+2" por debajo de [umbral] para conservar puntos cuya intensidad media en el canal de transformación de distancia del paso 2.4.2.3 queda por debajo de un umbral especificado. Los umbrales más bajos seleccionan puntos situados dentro o extremadamente cerca de la superficie TH; los umbrales más altos incluyen zonas progresivamente más alejadas. Esto permite calibrar empíricamente la proximidad aceptable para la asignación TH⁺ .
      4. Ejemplo preconfigurado:
         SpotsParameterAss = {
         1.2, ['"Calidad" por encima de 94,5,"Centro de intensidad Ch=aSizeC+1" por encima de 0.5'];
         1.2, ['"Calidad" por encima de 94,5,"Intensidad Media Ch=aTamañoC+2" por debajo de 0.0001'];
         1.2, ['"Calidad" por encima de 94,5,"Intensidad Media Ch=aSizeC+2" por debajo de 0.001'];
         1.2, ['"Calidad" por encima de 94,5,"Intensidad Media Ch=aSizeC+2" por debajo de 0.01'];
         ... Se proporcionan más combinaciones de filtros en script.
         };
      5. Para futuros experimentos usando los mismos ajustes de anticuerpos TH y confocales, reutiliza las combinaciones de parámetros anteriores. Elimina aquellas combinaciones pobres que generen conteos puntuales que se desvíen sustancialmente de los números reales, reduciendo así la carga computacional innecesaria.
   6. Creación de puntos por lotes
      1. Guarda todas las modificaciones anteriores al guion XT_Jove_Labkit_TH.m. Abre una nueva ventana de software 3D. Haz clic en el menú Procesamiento de imágenes | PAM_TH_processing ejecutar el script en lote.
      2. Inicialmente, observa durante unos minutos que para cada combinación de filtros, el script crea un objeto Spots llamado para reflejar sus parámetros, y que los archivos de la carpeta convertida se procesan y guardan como copias en una nueva carpeta de salida con el sufijo "procesado". Luego deja el ordenador sin vigilancia.
      3. Al completarse, se generará una hoja de cálculo. Observa la primera columna que contiene los nombres de los archivos, y las columnas posteriores que contienen los conteos de puntos DAPI correspondientes a cada combinación de filtros, con encabezados de columna que indican el diámetro estimado XY y la cadena de filtro utilizada.
   7. Validación de posprocesamiento
      1. Tras completar el paso 2.4.6, abre manualmente algunos archivos aleatorios de la carpeta "procesado" y examina los diferentes objetos Spots superpuestos con el canal original de TH. Basándose en la inspección visual, selecciona uno o dos filtros óptimos que proporcionen la representación más fiel de los conteos verdaderos de neuronas TH⁺ . Exporta las columnas correspondientes de la hoja de cálculo para análisis estadísticos posteriores y preparación de figuras.
      2. Para corregir errores de recuento de puntos en la(s) combinación(es) de filtros preferidas, selecciona el(los) objeto(s) Spots correspondiente(s) en la escena Surpass y haz clic en la pestaña Editar . Elimina manualmente los puntos erróneos o añade los que se faltan según sea necesario pulsando Shift y haciendo clic en la pantalla. Guarda las actualizaciones usando Almacenar como/Exportar como/Guardar para sobrescribir el archivo correspondiente en la carpeta "procesado" con el mismo nombre de archivo.
         NOTA: No elimines, añadas, renombres ni arrastres/reposiciones ningún objeto de Spots, solo edita los spots preferidos. No se requieren modificaciones en el guion; simplemente vuelve a ejecutar el script para generar instantáneamente una hoja de cálculo actualizada que refleje los refinamientos manuales. Para mayor coherencia, puedes dejar ninguno editado o editar el(los) objeto(s) Spots preferido(s) para todas las muestras de un experimento.

Resultados

Los datos en bruto recogidos del software se han depositado en un repositorio público y son accesibles en el siguiente DOI: 10.5281/zenodo.19814348. Para demostrar el uso de esta cadena de cuantificación semi-automatizada, la aplicamos a un modelo bien establecido de Drosophila de PD utilizando expresión panneuronal de la α-sinucleína humana (nSyb-QF2>QUAS-SNCA). Las moscas de control albergaban únicamente al driver del nSyb-QF2 . Ambos genotipos fueron envejecidos a 29 °C durante 3 semanas, tras lo cual se diseccionaron cerebros, se inmunetizaron para TH y se realizaron imágenes para el grupo PAM. Como se muestra en la Figura 3E, la tubería semiautomatizada detectó una reducción significativa en el recuento de neuronas TH⁺ de PAM en moscas que expresan α-sinucleína en comparación con los controles (test t de Student, p < 0,0001), demostrando que el método puede capturar diferencias dependientes del genotipo dentro del mismo lote experimental. Las siguientes secciones describen la configuración de montaje (Figura 1), la interfaz de entrenamiento Labkit (Figura 2) y los pasos de procesamiento de imagen (Figura 3) que permiten esta cuantificación.

La Figura 1 ilustra la configuración de montaje de cerebros diseccionados de Drosophila y su impacto en la imagen de conglomerados de PAM. Tras la disección, los cerebros ocasionalmente muestran flexión o inclinación hacia arriba del tejido adyacente al cordón nervioso ventral seccionado. Este levantamiento en la parte ventral del cerebro altera la perspectiva bajo el estereoscopio, lo que provoca una proyección alterada del surco estereotípico en el contorno dorsal y una diferencia en la perspectiva relativa de los puntos de referencia ventrales. (Figuras 1B,C). Esta deformación suele ocurrir en el momento en que el cerebro se desprende del cuerpo. Dicha deformación afecta la orientación del cúmulo PAM durante el montaje, influyendo así en la profundidad requerida del pile Z (Figura 1C,D). En condiciones óptimas de montaje, el separador de cinta Scotch de una sola capa crea una compresión adecuada en la región central del cerebro, haciendo que el grupo de PAM ubicado dorsalmente adopte una orientación horizontal inmediatamente adyacente al vestivestible. Esta configuración produce pilas Z de 15–25 cortes a intervalos de 0,34 μm (Figura 1D). En la otra condición, el grupo PAM mantiene una posición inclinada, lo que requiere pilas Z más profundas (Figura 1D). De manera similar, el uso de un separador de cinta de doble capa no proporciona una compresión adecuada, dejando el clúster PAM en su conformación nativa inclinada y aumentando igualmente la profundidad de la pila Z (Figura 1D). La Figura 1E muestra vistas representativas de proyección lateral de pilas en Z teñidas con TH tanto en condiciones óptimas de posición como de inclinación.

La Figura 2 presenta la interfaz de usuario de Labkit y un flujo de trabajo de entrenamiento representativo. Con solo unas pocas anotaciones escasas de garabatos en una sola muestra (Figura 2A), el clasificador inicial de píxeles ya produce una segmentación notablemente razonable (Figura 2B). Sin embargo, es fundamental enfatizar que una anotación tan mínima es insuficiente para un rendimiento robusto y generalizable en todo un conjunto de datos. Se requiere un marcado mucho más iterativo —que abarque múltiples Z-slices, muestras y variaciones de coloración— para generar un clasificador que segmente de forma fiable las neuronas ^TH+ a lo largo de todo el conjunto de datos. Cabe destacar que las múltiples imágenes de entrenamiento se concatenan a lo largo de la dimensión temporal (fotograma) en lugar de apilarse a lo largo del eje Z. Este diseño preserva la integridad espacial de cada volumen cerebral individual, asegurando que los núcleos de filtro 3D operen exclusivamente dentro de los ejemplares biológicos y no a través de. Si las muestras se apilaran verticalmente en una sola pila Z gruesa, los Z-slices en los límites entre muestras adyacentes se volverían espacialmente contiguos, lo que haría que los vóxeles de diferentes cerebros se trataran como estructuras vecinas, lo que aumentaría el riesgo de correcciones manuales innecesarias (Figura 2C). La concatenación a lo largo del eje temporal evita esta contaminación cruzada de muestras, permitiendo al mismo tiempo un entrenamiento eficiente y multimuestra en una sola sesión de Labkit.

La Figura 3 ilustra la cadena de postprocesamiento y la cuantificación final. Las máscaras de segmentación de Labkit sin crudo (Figura 3A) contienen numerosos pequeños moteados falsos positivos y agujeros internos. Tras aplicar operaciones morfológicas de reducción de ruido y relleno de huecos (Figura 3B), se construye una superficie TH suavizada que se utiliza para generar una máscara binaria refinada (Figura 3C). La mejora lograda por este refinamiento se visualiza como una superposición que compara las máscaras inicial y final (Figura 3D, superior). Cabe destacar que algunas regiones neuríticas ricas en TH se retienen ocasionalmente en la máscara final; sin embargo, estas áreas casi siempre carecen de núcleos con coloración DAPI y, por tanto, contribuyen de forma insignificante al recuento final de neuronas. Los usuarios avanzados pueden ajustar aún más los parámetros morfológicos en el script de procesamiento por lotes proporcionado para afinar la eliminación de tales artefactos residuales. La figura 3D (abajo) muestra los puntos finales de DAPI (magenta) superpuestos en el canal TH (verde) a partir de una proyección de máxima intensidad. La Figura 3D también revela un tipo raro de falso positivo observado ocasionalmente en nuestra pipeline: un núcleo teñido con DAPI ubicado en una región neurita rica en TH puede clasificarse incorrectamente como un punto TH⁺ cuando la señal neurita se solapa fuertemente con el núcleo. Sin embargo, como se muestra en la Figura 3C, los núcleos DAPI-positivos en las proximidades de neuritas suelen ser escasos. Además, las pocas señales DAPI presentes cerca de tales regiones neuríticas suelen clasificarse correctamente como verdaderos negativos (es decir, no cuentan como TH⁺), ya que no son identificadas erróneamente por el oleoducto. La Figura 3E demuestra la utilidad práctica del método: las moscas nSyb-QF2>SNCA de 3 semanas presentan una reducción significativa en el conteo de neuronas TH⁺ del PAM en comparación con los controles de nSyb-QF2 a través de múltiples filtros (prueba t de Student, p < 0,0001). Aunque los conteos puntuales absolutos pueden variar entre diferentes combinaciones de filtros y el método no logra una precisión perfecta en un solo punto, la diferencia relativa entre los grupos experimental y control sigue siendo robusta. Para múltiples filtros probados, el resultado estadístico de la comparación de grupos se conserva en gran medida entre filtros dentro del mismo lote experimental. Por tanto, la salida debe interpretarse como una lectura comparativa dentro de lotes en lugar de un recuento absoluto sin errores de neuronas PAM.

Figura 1. Disección cerebral de Drosophila y configuración de montaje. (A) Diagrama esquemático del conjunto de montaje del cerebro. Las barras amarillas representan los separadores de cinta adhesiva. Un esquema cerebral agrandado indica la ubicación aproximada del cúmulo PAM (morado). (B) Esquemas de sección transversal lateral correspondientes al plano discontinuo en A que representan dos morfologías cerebrales comunes tras la disección: posicionado óptimamente (superior) e inclinado (inferior). (C) Dos cerebros de mosca disecados vistos bajo un estereoscopio: posicionados óptimamente (izquierda) frente a inclinados (derecho). Las flechas amarillas indican el surco estereotipado a lo largo del contorno dorsal. Líneas azules discontinuas conectan dos puntos de referencia correspondientes en los lados izquierdo y derecho de la mitad ventral. Las flechas azules resaltan el cambio resultante en la perspectiva relativa de estos puntos ventrales. Barra de escala = 500 μm. (D) Ilustración esquemática que muestra cómo la morfología cerebral y el grosor del separador de cinta (de una sola o doble capa) influyen en la posición vertical del cúmulo PAM y, en consecuencia, en la profundidad requerida de la pila Z. (E) Vistas laterales representativas (proyección en Y) de pilas confocales en Z teñidas con TH desde condiciones de montaje óptimamente posicionadas (superiores) y deformadas (inferiores). Barra de escala = 5 μm. Abreviatura: PAM = protocerebral antero-medial. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2. Entrenamiento en kits de laboratorio y segmentación interactiva. (A) Interfaz gráfica de Labkit. Las anotaciones (garabatos) se muestran en dos clases: primer plano (rojo) y fondo (azul). (B) Resultado de segmentación generado inmediatamente después del entrenamiento sobre los garabatos mostrados en A. El rojo indica el color del primer plano; El azul indica el color de fondo. Barra de escala = 5 μm. (C) Diafonía entre Z-slices adyacentes. Se concatenaron imágenes de un solo corte de mitocondrias marcadas con proteínas fluorescentes de diferentes cerebros de moscas a lo largo del eje Z. Las porciones 1 y 3 son copias idénticas de la misma imagen, mientras que las porciones 2 y 4 provienen de cerebros diferentes. Flechas amarillas, predicción filtrada desde la sección 2 hasta la 1. Flechas verdes, la predicción se filtra desde la sección 4 hasta la 3. Barra de escala = 3 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3. Postprocesamiento de máscaras de segmentación Labkit y cuantificación de neuronas TH⁺. (A) Máscara binaria Raw Labkit (cian, superior) y superposición con el canal TH original (inferior). Nótese abundantes pequeñas manchas y un llenado incompleto de cuerpos celulares neuronales. (B) Enmascarar tras la reducción morfológica de ruido y el relleno de agujeros (magenta, superior); superposición con canal TH (inferior). (C) Máscara binaria refinada (roja, superior) a partir de una superficie TH suavizada para B y re-enmascaramiento; superposición con canal TH (inferior). (D) Superior: Superposición de máscaras crudas (cian) y refinadas (rojas), destacando regiones corregidas por postprocesado. Inferior: Proyección de máxima intensidad mostrando los puntos finales de DAPI (magenta) superpuestos sobre el canal TH (verde). Cabe señalar que los dos puntos en la esquina superior derecha se originan en el grupo contralateral de PAM. El filtro 4 se utilizó para ilustración. (E) Validación cuantitativa en un modelo de enfermedad de Parkinson utilizando múltiples combinaciones de filtros. Las moscas nSyb-QF2>SNCA (modelo PD) de tres semanas presentan una reducción significativa en el recuento de neuronas TH⁺ de PAM en comparación con los controles nSyb-QF2 en múltiples filtros (arriba). Los datos en bruto se proporcionan en una hoja de cálculo (abajo). filtro 1: 1,2, ['"Calidad" por encima de 94,5,"Intensidad Media Ch=aTamañoC+2" por debajo de 0,0001']; filtro 2: 1,2, ['"Calidad" por encima de 94,5, "Media de intensidad Ch=aSizeC+2" por debajo de 0,001']; filtro 3: 1,2, ['"Calidad" por encima de 94,5,"Intensidad media Ch=aSizeC+2" por debajo de 0,01']; filtro 4: 1,2, ['"Calidad" por encima de 94,5,"Intensidad Media Ch=aTamañoC+2" por debajo de 0,05']; filtro 5: 0,6, ['"Calidad" por encima de 94,5,"Intensidad Media Ch=aSizeC+2" por debajo de 0,001']; filtro 6: 0,6, ['"Calidad" por encima de 94,5,"Intensidad Media Ch=aTamañoC+2" por debajo de 0,01']; filtro 7: 0,9, ['"Calidad" por encima de 94,5,"Intensidad Media Ch=aTamañoC+2" por debajo de 0,01']; n = 57 cerebros (control), n = 65 cerebros (DP); Prueba t del estudiante, p < 0,0001 (****). Las moscas se cultivaron a 29 °C. Barras de escala = 5 μm (A–D). Los datos se presentan como media ± SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Expediente suplementario 1. Fiji macro para dividir el canal TH de archivos de imagen convertidos y guardar las pilas de salida.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente suplementario 2. Fiji macro para recortar pilas Z de entrenamiento a una profundidad común de Z-slice y concatenarlas en un archivo TIFF de time-lapse para el entrenamiento de clasificadores Labkit.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente suplementario 3. Clasificador Labkit preentrenado utilizado para probar el flujo de trabajo de segmentación TH de PAM.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente suplementario 4. MATLAB para procesamiento por lotes de máscaras Labkit, generación de spots DAPI, aplicación de combinaciones de filtros y exportación de conteos de neuronas TH⁺ .Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La cuantificación de las neuronas DA en el cúmulo PAM de Drosophila ha sido históricamente un desafío formidable. Aquí presentamos un flujo de trabajo semiautomatizado que integra la clasificación de píxeles basada en aprendizaje automático con software de análisis de imágenes para abordar este problema de larga data. Este método permite la detección a nivel de lotes de variaciones en neuronas ^TH+ en el grupo PAM entre grupos dentro del mismo experimento, apoyando estudios comparativos en modelos de enfermedad de^{Parkinson 18}.

Al seleccionar el filtro óptimo para un experimento dado, los usuarios pueden elegir el filtro que mejor se ajuste a la inspección visual de las imágenes en bruto, o consultar el rango y/o la media reportada del número de neuronas PAM de tipo salvaje en la literatura^12,13. Sin embargo, es necesario tener precaución: solo dos estudios han reportado recuentos de grupos de PAM, ninguno de los cuales está relacionado con la EP, y los valores reportados muestran una considerable inconsistencia. Además, la desviación estándar puede aumentar con la edad, lo que complica aún más las comparaciones entre estudios. Por lo tanto, la referencia basada en literatura debe usarse solo como una guía aproximada, no como un estándar absoluto. Reconocemos que esta tubería no produce recuentos absolutos libres de errores (Figura 3D). Sin embargo, siempre que las comparaciones se limiten a grupos dentro del mismo lote experimental (es decir, no agrupando datos entre diferentes lotes en un solo plot), el método puede usarse para detectar diferencias relativas entre genotipos o condiciones de tratamiento dentro de un lote.

En nuestra experiencia, los anticuerpos secundarios conjugados con AF488 deben evitarse debido a un alto fondo de fondo, y AF546 debe evitarse debido a una mayor atenuación de señal a lo largo del eje Z. También descubrimos que una incubación y lavado exhaustivos de DAPI son fundamentales para lograr una alta relación señal-ruido y señales nucleares claras, que impactan directamente en el rendimiento de la segmentación automatizada. DAPI es preferible a Hoechst para esta aplicación, ya que su tinción preferencial de heterocromatina genera manchas nucleares más brillantes y definidas, facilitando una detección más precisa.

Discusión de resolución de problemas para modos de fallo comunes

Fallos relacionados con la mancha. La habilidad de disección es un factor determinante importante de la calidad de los datos. El grupo de PAM se localiza superficialmente y se daña fácilmente al extraer los dos sacos traqueales y la grasa dorsal de esta región. Las pinzas deben manipularse con cuidado para evitar perforar o comprimir la zona del PAM. La deformación ventral suele ocurrir en el momento en que se secciona el cordón nervioso ventral, haciendo que el cerebro se incline o se curve al colocarse sobre una lámina de cristal; esta deformación puede fijarse de forma permanente tras la incubación con PFA. Los usuarios deberían experimentar con los ángulos de las pinzas durante el corte para encontrar una técnica óptima. Si se observa inclinación tras la disección, una presión suave sobre la región elevada puede revertir la deformación (aceptable si el área comprimida no es la región de interés).

Fallos de segmentación. La mala segmentación suele surgir de datos de entrenamiento insuficientemente diversos. El clasificador Labkit debe entrenarse con un conjunto representativo de imágenes que abarcan todo el rango de calidad de tinción dentro del lote, incluyendo la mejor, media y peor. Durante la corrección iterativa, prioriza anotar los falsos positivos y falsos negativos en los que tengas confianza. Evita corregir regiones ambiguas o inciertas, ya que esto podría engañar al clasificador y degradar el rendimiento.

Fallos en la detección puntual. La optimización de parámetros requiere una exploración sistemática en un pequeño subconjunto de muestras representativas. Prueba diferentes diámetros estimados de puntos y umbral de filtros de calidad, o incluso tipos de filtros más allá del filtro "Calidad superior" utilizado en este protocolo. El asistente de creación de spots ofrece varias opciones de filtrado (por ejemplo, intensidad). Se anima a los usuarios a adaptar umbrales y tipos de filtro a su conjunto de datos específicos, y a realizar ajustes empíricos antes del procesamiento por lotes.

¿Por qué sigue siendo excepcionalmente difícil contar manualmente neuronas de los clústeres PAM? El grupo PAM presenta características anatómicas y de tinción únicas que hacen que los métodos tradicionales de conteo manual sean insuficientes. En primer lugar, la inmunofluorescencia TH en el citosol de las neuronas dopaminérgicas de Drosophila marca predominantemente un delgado anillo citoplasmático que rodea un gran vacío nuclear sin teñir. En consecuencia, el núcleo teñido con DAPI y el compartimento citoplasmático ^TH+ presentan una superposición espacial mínima. Esta falta fundamental de colocalización impide la estrategia directa de clasificación "mancha DAPI dentro de la máscara TH". En segundo lugar, el cúmulo PAM comprende más de 100 neuronas densamente empaquetadas dispuestas en una arquitectura tridimensional similar a una uva. A medida que uno navega por pilas Z confocales, las neuronas aparecen y desaparecen gradualmente —algunas entran en el plano, otras salen— creando una alta carga cognitiva y una considerable variabilidad entre observadores. El estudio más reciente que cuantifica las neuronas PAM DA se basó en el recuento manual usando el plugin de contador celular de ImageJ. Aunque totalmente apropiado para grupos más pequeños como PPM1/2 o PPL1, este enfoque resulta prohibitivamente laborioso cuando se aplica al clúster PAM, especialmente en estudios que requieren decenas o cientos de muestras.

¿Por qué la arquitectura de bosque aleatorio de Labkit es especialmente adecuada para la segmentación de neuronas TH? Labkit implementa un clasificador de píxeles basado en bosque aleatorio que está excepcionalmente bien adaptado a los desafíos específicos de las imágenes de clúster PAM teñidas con TH. El algoritmo calcula un vector de características completo para cada píxel aplicando una cascada de filtros de transformación, incluyendo desenfoque gaussiano, diferencia de gaussianos, magnitud del gradiente gaussiano, laplaciano de Gaussiano y valores propios de Hessiano, cada uno evaluado en múltiples escalas sigma (1, 2, 4, 8). Esta extracción de características a múltiples escalas captura eficazmente las características texturales y de bordes que distinguen el interior nuclear del fondo extracelular. Es importante destacar que, dado que los bosques aleatorios requieren órdenes de magnitud menos datos de entrenamiento que los enfoques de aprendizaje profundo, los usuarios pueden refinar iterativamente el clasificador con anotaciones escasas de garabatos en tan solo 20–40 imágenes representativas. Cada iteración añade nuevos árboles de decisión al conjunto, que colectivamente votan para clasificar cada píxel. Este proceso acomoda inherentemente la variabilidad de lote a lote en las condiciones de tinción e imagen, una ventaja crítica dada la variabilidad biológica inherente a los cruces genéticos y estudios de envejecimiento de Drosophila . Con este enfoque, se puede detectar la pérdida de neuronas ^TH+ en modelos de Parkinson que expresan α-sinucleína, y se pueden comparar los efectos de potenciadores y supresores genéticos sobre el recuento de neuronas en clústeres de PAM dentro de un lote experimental.

Es importante destacar que, para fines de entrenamiento, las pilas recortadas se concatenan a lo largo de la dimensión temporal en lugar de apilarse a lo largo del eje Z. Esta elección de diseño es fundamental para un entrenamiento óptimo de clasificadores. La clasificación de píxeles 3D de Labkit considera la información de los vóxeles a través de segmentos Z consecutivos, lo cual es esencial para resolver con precisión el delgado anillo citoplasmático TH que define la morfología de las neuronas PAM. Si las muestras individuales se apilaran verticalmente en una única pila Z ultragruesa, las cortes Z en los límites entre muestras adyacentes se volverían espacialmente contiguas dentro de la pila. En consecuencia, los vóxeles pertenecientes a diferentes muestras biológicas serían tratados como estructuras vecinas dentro del mismo volumen tridimensional. Durante el entrenamiento interactivo, un garabato dibujado cerca de dicho límite puede capturar inadvertidamente características de dos muestras diferentes simultáneamente, confundiendo el clasificador (Figura 2B, flechas). Además, señales falsas positivas originadas en una muestra podían proyectarse en el volumen de la muestra adyacente, resultando en garabatos correctivos erróneos que se propagaban a través de iteraciones de entrenamiento posteriores, generando árboles de decisión que codificaban reglas biológicamente sin sentido. Concatenar muestras a lo largo del eje temporal preserva la integridad espacial de cada volumen individual, permitiendo que los núcleos del filtro 3D operen exclusivamente dentro de — no a través de— muestras biológicas, mientras se permite un entrenamiento eficiente y multimuestra en una sola sesión de Labkit.

Consideraciones metodológicas y limitaciones

Existen varios matices importantes que merecen ser discutidos. En primer lugar, este protocolo está optimizado específicamente para el clúster PAM y puede no generalizarse a otros clústeres DA (por ejemplo, PPM1/2/3, PPL1) ni a neuronas ^TH+ en los lóbulos ópticos. La región PAM se beneficia de una densidad DAPI relativamente escasa, con núcleos bien separados en el espacio tridimensional, lo que permite una detección robusta e inequívoca de puntos DAPI. En cambio, este flujo de trabajo no es fácilmente transferible a otros clústeres de DA como PPL1 o PPM1/2. En esas regiones, las neuritas tienen más probabilidades de estar yuxtapuestas o solaparse con núcleos de células no DA, tintadas con DAPI. Dado el número muy bajo de neuronas DA en estos pequeños grupos (a menudo menos de 10 células por grupo), incluso unas pocas clasificaciones erróneas pueden provocar errores proporcionalmente grandes, haciendo que el método sea menos fiable para estas aplicaciones. En segundo lugar, la inmunotinción TH también etiqueta neuritas y proyecciones axonales dentro del neuropilo. A pesar de las anotaciones correctivas durante el entrenamiento, estos trayectos fibrados ocasionalmente producen señales TH fuertes y pueden ser clasificados erróneamente como primer plano por el clasificador. Sin embargo, estas regiones en el cúmulo PAM casi siempre carecen de núcleos teñidos con DAPI; por tanto, los vóxeles falsos positivos en la región rica en neuritas del cúmulo PAM contribuyen mínimamente al recuento final de neuronas. En tercer lugar, la clasificación de píxeles de Labkit opera sobre características locales de texturas dentro de un vecindario finito (los núcleos de filtro por defecto responden a aproximadamente 16 × 16 ventanas de píxeles). Este diseño garantiza la eficiencia computacional y permite la segmentación interactiva en tiempo real, pero también significa que el clasificador no puede aprovechar el contexto anatómico global. En consecuencia, artefactos raros o irregularidades de tinción que se desvíen sustancialmente del conjunto de entrenamiento pueden requerir una curación caso por caso. Finalmente, la tubería de procesamiento por lotes descrita aquí —integrando segmentación Labkit con detección puntual DAPI y transformación de distancia— genera múltiples canales de salida y combinaciones de filtros. Los usuarios deben validar sistemáticamente los parámetros óptimos del filtro para sus condiciones experimentales específicas en lugar de adoptar sin crítica los umbrales predeterminados presentados en este protocolo.

Aplicaciones futuras

Más allá del modelo de DP demostrado aquí, esta cadena semi-automatizada puede aplicarse directamente a cualquier modelo de Drosophila que implique cuantificación de neuronas DA en clúster PAM, incluyendo estudios sobre aprendizaje y memoria, motivación, regulación del sueño y neurodegeneración relacionada con la edad. Específicamente, la capacidad de procesamiento por lotes de este método puede hacerlo adecuado para: (1) Cribados de fármacos de rendimiento medio a alto: Probar múltiples compuestos neuroprotectores a través de dosis se vuelve más factible sin un aumento proporcional en el esfuerzo manual de conteo. (2) Cribado de modificadores genéticos: Cuantificar el recuento de neuronas PAM en cientos de cruces genéticos (por ejemplo, líneas de ARNi, líneas de sobreexpresión) para identificar potenciadores o supresores de la toxicidad por α-sinucleína. (3) Estudios de envejecimiento longitudinal: Seguimiento de la pérdida de neuronas PAM a lo largo de múltiples puntos temporales con una menor carga de conteo manual. Además, el flujo de trabajo de segmentación basado en Labkit no se limita a la tinción TH; con el reentrenamiento adecuado, puede adaptarse para cuantificar otras poblaciones neuronales en el cerebro de Drosophila , siempre que compartan dos características clave con el cúmulo PAM: una densidad relativamente baja de núcleos teñidos con DAPI y una mínima interferencia por la tinción de neuritas. Más allá de Labkit y el software 3D utilizado aquí, la lógica general de esta cadena —clasificación de píxeles basada en aprendizaje automático seguida de detección puntual y transformación de distancia— puede implementarse en otras plataformas de análisis de imágenes 3D soportadas, aumentando así su accesibilidad y flexibilidad para la comunidad investigadora en general.

En resumen, presentamos un flujo de trabajo semi-automatizado para detectar diferencias de grupo en el número de neuronas TH⁺ de los clústeres PAM. Al combinar la clasificación de píxeles basada en Labkit con detección puntual y transformación de distancia, este método permite comparar el número de neuronas TH⁺ entre grupos experimental y control dentro del mismo lote, al tiempo que reduce la carga del recuento manual a medida que aumenta el tamaño de la muestra. Escalar de decenas a cientos de muestras aumenta proporcionalmente el tiempo de cálculo, pero el esfuerzo manual adicional se limita principalmente a la organización de archivos y la comprobación puntual de calidad. Aunque el cúmulo PAM ha recibido poca atención en la investigación sobre la DP hasta la fecha, esto se debe en gran medida a limitaciones técnicas más que a irrelevancia biológica. Al proporcionar una herramienta práctica de cuantificación, nuestro protocolo facilitará en el futuro la investigación de si y cómo degeneran las neuronas PAM en modelos de EP y explorará su posible contribución a síntomas no motores, como déficits olfativos y deterioro motivacional. Prevemos que este protocolo facilitará estudios comparativos a nivel de lote sobre neurodegeneración dopaminérgica, plasticidad sináptica y cribado de fármacos neuroprotectores en el sistema modelo Drosophila .

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Software de procesamiento de imágenes 3D - Bitplane Imaris 8.0+	Oxford Instruments	http://www.bitplane.com/	Software de análisis de imágenes 3D utilizado en este estudio
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	62248
D. melanogaster: nSyb-QF2	Centro de Stock Drosophila de Bloomington	51960
D. melanogaster: nSyb-QF2>QUAS-SNCA	Centro de Stock Drosophila de Bloomington	600605
DOWSIL SYLGARD 184	Tat Lee Engineering Pte Ltd	https://www.tatlee.com.sg/
Pinza Dumont Styple 3C Dumoxel, 0,04/0,08 mm	Ciencias de la Microscopía Electrónica	72680-D(0203-3C-PO)
Confocal FV3000	Olimpo	https://www.olympus-global.com/
Anticuerpo secundario adsorbido cruzado anti-conejo IgG (H+L), Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A-21244
ImageJ/Fiyi (1.53q)	Fiyi/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/
Labkit	Fiyi/ImageJ	https://imagej.net/plugins/labkit/
Pines Minutien, acero inoxidable, 0,15 mm de diámetro	Austerlitz	https://mothandbeetle.com/products/austerlitz-stainless-steel-minutens.html
Suero normal de cabra, liofilizado sólido	Sigma-Aldrich	566380
Software de computación numérica - Python	Python	3.8+
Software de computación numérica - Matlab	Trabajo en matemáticas	R2016a+	Software de computación numérica utilizado en este estudio
Octilfenol etoxilato (Triton X-100)	Bio-rad	1610407
Solución de paraformaldehído 4% en PBS	Santa Cruz Biotecnología	SC-281692
Plato de cultivo celular de poliestireno	Nest Scientific	706001
Montaje antifade de oro ProLong	Thermo Fisher Scientific	P36934
Conejo anti-tirosina hidroxilasa (TH)	Pel Freeze	P40101-0
Azida de sodio	Sigma-Aldrich	S2002
Estereoscopio	Olimpo	SZ51
Einmalkan etericano; len 27 G grau 0,40 x 12 mm	Estérican	D-34209
Jeringuilla, 1 mL	Terumo	DVR-5175
Cinta adhesiva transparente	3M Scotch 600, despejado	600