Manejo de túneles y enriquecimiento ambiental para la pletismografía repetida de todo el cuerpo en ratones

Resumen

Este protocolo describe procedimientos de manejo de túneles y enriquecimiento ambiental para pletismografía repetida de todo el cuerpo para reducir la variabilidad respiratoria asociada al estrés durante estudios longitudinales en ratones.

Resumen

La pletismografía repetida de todo el cuerpo (PBB) se utiliza ampliamente para la evaluación longitudinal de la función respiratoria en ratones. Sin embargo, el estrés inducido por el manejo puede introducir variabilidad fisiológica que desafía los efectos del tratamiento y reduce la reproducibilidad experimental. Los métodos tradicionales de manejo de la cola pueden producir respuestas sostenidas al estrés y una mala habituación a lo largo de sesiones repetidas, lo que puede afectar los resultados experimentales. Este protocolo describe métodos refinados de manejo y alojamiento que integran el manejo de túneles y el enriquecimiento ambiental para sesiones repetidas de WBP. Seis ratones salvajes tipo 129S1/SvImJ (3 machos y 3 hembras) recibieron manejo de túneles y enriquecimiento ambiental continuo durante un estudio de 10 semanas. Los animales se sometieron a sesiones repetidas de BPA y se analizaron los periodos de aclimatación en los puntos iniciales, tempranos, intermedios y tardíos del estudio. Se cuantificaron la frecuencia respiratoria durante la colocación inicial de la cámara (inicial f, 0–2 min) y la línea base estable (basal f, 8–10 min) para evaluar los patrones de aclimatación longitudinal. Se observaron cambios progresivos a lo largo de la cronología del estudio bajo las condiciones implementadas. La frecuencia respiratoria media inicial disminuyó de 345 ± 111 respiraciones de la DS/min al inicio a 267 ± 43 respiraciones de DS/min durante las sesiones tardías del estudio, acompañadas de un coeficiente de variación reducido (del 32% al 16%). Las mediciones respiratorias de base también disminuyeron de 255 ± 67 a 193 ± 43 respiraciones/min (p = 0,033), lo que es compatible con una mejor estabilidad en las mediciones en sesiones posteriores. Las observaciones conductuales mostraron una aclimatación tranquila con mínima defecación, micción o agitación. Este protocolo proporciona un enfoque práctico para los laboratorios que realizan evaluaciones respiratorias repetidas en ratones. El manejo de túneles y el enriquecimiento ambiental se asociaron con una aclimatación progresiva y una reducción de la variabilidad respiratoria durante los estudios longitudinales de WBP.

Introducción

La pletismografía de cuerpo entero (PBB) permite la evaluación no invasiva de la función respiratoria en roedores conscientes y sin restricciones, y se ha convertido en una herramienta indispensable para estudios longitudinales en fisiología respiratoria, toxicología por inhalación y modelización de^{enfermedades 1,2}. Las principales ventajas de la técnica, incluyendo su naturaleza no invasiva y su idoneidad para mediciones repetidas, la hacen especialmente valiosa para el seguimiento de los cambios respiratorios a lo largo de la progresión de la enfermedad, intervenciones terapéuticas o tiempos de exposición. Glaab y Braun² destacaron que la pletismografía corporal no invasiva de cabeza hacia fuera es un método fiable para mediciones repetidas de la función pulmonar en ratones conscientes, proporcionando herramientas esenciales para la investigación traslacional en enfermedades de las vías respiratorias, incluidas infecciones respiratorias emergentes. Sin embargo, la calidad y reproducibilidad de las mediciones de WBP dependen críticamente de alcanzar estados de baja frecuencia respiratoria compatibles con la quiescencia conductual, que pueden verse comprometidos por el estrés inducido por el manejo. El manejo del estrés representa una fuente bien reconocida pero a menudo poco valorada de variabilidad experimental que puede desconcertar las mediciones fisiológicas y comprometer la calidad de los datos. La práctica estándar de laboratorio suele implicar el manejo de la cola, en el que los ratones son sujetos por la cola para transportarlos y^{manipularlos 3,4}.

La práctica estándar de laboratorio suele implicar el manejo de la cola, en el que los ratones son sujetos por la cola para transportarlos y manipularlos. Gouveia y^{Hurst 3} demostraron que el manejo de la cola induce ansiedad en ratones, y los animales manejados muestran un comportamiento más elevado similar a la ansiedad en el laberinto elevado más en comparación con los controles con mango de túnel. Esta respuesta de ansiedad está asociada a parámetros fisiológicos alterados. Rasid et ^al.4 utilizaron la BPA para cuantificar los efectos respiratorios de los procedimientos de laboratorio rutinarios, encontrando que la sujeción y el manejo alteraban significativamente el volumen minúsculo de manera dependiente del sexo, con efectos que persistían hasta 24 horas después del procedimiento. La magnitud y duración de estos efectos inducidos por la manipulación subrayan que las mediciones respiratorias obtenidas poco después del manejo de la cola pueden reflejar la fisiología del estrés agudo más que una función basal estable.

La literatura más amplia sobre la sujeción y el manejo del estrés revela impactos que van más allá de las respuestas conductuales inmediatas. Buynitsky y^{Mostofsky 5} revisaron los extensos efectos del estrés de retención en los procesos fisiológicos, inmunológicos, endocrinos y del desarrollo, destacando que las confusión relacionadas con el estrés a menudo no están suficientemente documentadas en los artículos de investigación. En los estudios respiratorios específicamente, el problema se agrava por la necesidad de mediciones repetidas. Cada evento de manipulación puede reiniciar la respuesta al estrés, limitando la habituación progresiva y produciendo mediciones de línea base inconsistentes a lo largo de los puntos temporales longitudinales. DeLorme y^{Moss 1} compararon enfoques de pletismografía restringida frente a no restringida en ratones con diferencias fisiológicas conocidas entre detensiones, encontrando que, aunque los sistemas de cámara única sin restricciones proporcionaban un mejor análisis de la reactividad de las vías respiratorias, el reto de obtener mediciones reproducibles de referencia seguía siendo la siguiente.

El manejo en túneles, en el que los ratones entran voluntariamente en un túnel para transportarse, ha surgido como una alternativa basada en la evidencia que reduce sustancialmente la ansiedad inducida por el manejo. La eficacia del método se ha demostrado en múltiples cepas y contextos experimentales. Gouveia y^{Hurst 3} demostraron que los ratones con mango túnel mostraron mayor disposición a interactuar con los manejadores y menor comportamiento similar a la ansiedad en pruebas elevadas más en laberinto en comparación con ratones con mango de cola, con beneficios observados incluso cuando los túneles eran desconocidos. Es importante destacar que estos beneficios van más allá del periodo inmediato posterior a la manipulación. Sensini et ^al.6 examinaron los efectos de la técnica y frecuencia de manipulación entre sexos, encontrando que el manejo frecuente de la cola reducía conductas asociadas al bienestar, como la excavación, y aumentaba el comportamiento de tipo desesperación en los machos, mientras que el manejo por túnel era preferido por ambos sexos y se asociaba con comportamientos de aproximación más positivos y menos respuestas defensivas. Además, Davies et ^al.7 demostraron que los beneficios de la manipulación sin cola persisten durante procedimientos complejos. Los ratones expuestos a la manipulación de la cola durante toda su experiencia en laboratorio, incluyendo los procedimientos de sujeción, mostraron una mayor capacidad de respuesta a estímulos ambientales y una menor facilidad de manejo en comparación con ratones manipulados exclusivamente mediante métodos de capping o túnel.

Más allá de la selección del método de manejo, la habituación sistemática a los procedimientos experimentales puede reducir aún más la variabilidad inducida por el estrés. Sorli et ^al.8 investigaron el adiestramiento de ratones para la pletismografía head-out, un sistema basado en sujeción, y encontraron que cinco días consecutivos de entrenamiento mejoraron la tolerancia, demostrando una mayor estabilidad conductual para el segundo día, aunque los parámetros respiratorios se estabilizaron en 5 minutos durante todas las sesiones. De manera similar, Ueno et ^al.9 demostraron que el manejo repetitivo y suave de ratones machos C57BL/6 antes de las pruebas conductuales redujo el comportamiento similar a la ansiedad en pruebas elevadas más en laberinto y mejoró la cognición espacial, indicando que el contacto repetido con los manejadores puede producir efectos medibles de habituación. Estos hallazgos sugieren que combinar métodos de manejo no aversivos con protocolos de habituación sistemática puede aportar beneficios acumulativos para reducir la variabilidad fisiológica durante mediciones repetidas.

El enriquecimiento ambiental representa un factor adicional que puede influir en la respuesta al estrés y la fisiología basal, aunque sus efectos son complejos y dependen del contexto. Aunque el enriquecimiento generalmente promueve un bienestar positivo, un enriquecimiento excesivo o impredecible puede, paradójicamente, aumentar la variabilidad fisiológica y los comportamientos asociados al estrés en algunos contextos^{experimentales 10,11}. Un enfoque equilibrado que mantenga elementos centrales estables, como el material anidante, mientras proporciona novedad manejable mediante la rotación periódica de los elementos de enriquecimiento, puede optimizar el bienestar sin introducir la variación^{confusa 12}. La interacción entre enriquecimiento, método de manejo y protocolos de habituación sigue siendo poco estudiada en el contexto de mediciones respiratorias repetidas, lo que pone de manifiesto la necesidad de protocolos integrados que aborden los tres factores simultáneamente.

A pesar del creciente reconocimiento de los efectos del manejo en las mediciones fisiológicas, los protocolos estandarizados diseñados específicamente para minimizar el estrés durante sesiones repetidas de WBP siguen siendo limitados. Los protocolos existentes de PBA suelen basarse en períodos prolongados de aclimatación (10–30 minutos por sesión) para permitir que la taquipnea inducida por el estrés disminuya, pero rara vez abordan el método de manejo subyacente o evalúan sistemáticamente si la habituación progresiva ocurre entre sesiones. Además, la mayoría de los estudios no evalúan si los animales alcanzan estados fisiológicos consistentes con la quiescencia conductual, como que las frecuencias respiratorias se acerquen a rangos reportados en la literatura como asociados a estados de reposo o relacionados con el sueño, o si en su lugar hacen la transición de un estrés agudo a una excitación crónica de bajo nivel. Aquí presentamos un protocolo que integra el manejo de túneles, el enriquecimiento ambiental equilibrado y sesiones repetidas de PBA a lo largo de un estudio longitudinal de 10 semanas. Describimos un enfoque asociado a cambios progresivos en la frecuencia respiratoria consistentes con la habituación, incluyendo la disminución de frecuencias respiratorias iniciales a lo largo de las sesiones y mediciones de referencia que se acercan a rangos reportados en la literatura como asociados a estados de reposo o relacionados con el sueño. Es importante destacar que este protocolo se presenta no solo como una mejora del bienestar animal, sino también como una consideración experimental en el diseño que puede ayudar a reducir la variabilidad y mejorar la consistencia durante las mediciones respiratorias longitudinales.

Protocolo

Realizar todos los procedimientos de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Protocolo IACUC #23-103) de la Universidad de Miami. Ratones domésticos en un vivario acreditado por AAALAC, con condiciones ambientales mantenidas según los estándares institucionales.

1. Selección de animales y condiciones de alojamiento

1. Seleccionar y preparar animales para el estudio
   1. Selecciona animales de una colonia reproductora establecida o adquírelos a través de un proveedor comercial. Para este estudio, utiliza seis ratones salvajes tipo 129S1/SvImJ (3 machos, 3 hembras).
   2. Mantener a los animales bajo condiciones SPF (libres de patógenos específicos) en un centro acreditado por AAALAC, realizando un seguimiento rutinario de la salud conforme a los estándares institucionales.
   3. Confirma que los animales tienen aproximadamente 6 meses de edad (adultos jóvenes) al inicio del estudio.
      NOTA: Los ratones de este estudio habían estado previamente expuestos al manejo de túneles como parte del manejo rutinario. Para ratones ingenuos, implementa un periodo de acondicionamiento antes de comenzar las sesiones de WBP (véase el Paso 3.2).
2. Inicia los procedimientos experimentales cuando los ratones alcancen la edad adecuada para los objetivos del estudio. En este estudio, los ratones tenían aproximadamente 6 meses de edad (adultos jóvenes) al inicio de las sesiones de PBA. Para la reproducibilidad, utiliza ratones dentro de un rango de edad definido (por ejemplo, ±1 mes) e informa de las edades específicas utilizadas, ya que la edad puede influir en parámetros respiratorios basales y en la cinética de la habituación.

2. Protocolo de Enriquecimiento Ambiental

1. Proporcionar material de anidación constante
   1. Coloca un cuadrado de algodón comprimido (aproximadamente 5 cm × 5 cm, ~2,5 g) en cada jaula en cada cambio.
   2. Transfiere la mayor parte de la estructura del nido existente intacta a la nueva jaula durante los cambios de jaula usando ambas manos.
   3. Si el material acumulado de anidación supera aproximadamente los 10 g (aproximadamente el doble de la masa original), se retiran las partes más antiguas y compactas del fondo mientras se conserva la estructura externa de la cúpula.
   4. Añade un cuadrado de algodón nuevo (5 cm × 5 cm) a la jaula limpia para apoyar la construcción y el mantenimiento continuos del nido.
   5. Sustituye el material de anidación solo si está visiblemente húmedo (contaminación por orina cubriendo >25% de la superficie) o si el nido ha sido destruido y no se ha reconstruido en 48 horas (Figuras 1A y 1C).
      NOTA: Preservar la estructura del nido para minimizar el estrés asociado a los cambios en la jaula y mantener señales olfativas y táctiles consistentes a lo largo del estudio. La calidad del nido sirve como indicador del bienestar animal y del estado de salud¹³.
2. Evalúa la construcción del nido semanalmente utilizando el siguiente procedimiento estandarizado
   1. En cada cambio de jaula, transfiere cuidadosamente el nido intacto a una superficie limpia con ambas manos sin alterar la estructura.
   2. Fotografía el nido directamente desde arriba con la cámara situada a 30–40 cm perpendicular a la superficie para visualizar la estructura general y la formación del cráter.
   3. Fotografía el nido desde el lateral a la altura del nido para documentar la integridad de la pared y las características de la cúpula.
   4. Puntuar el nido usando la escala Deacon estandarizada de 5^{puntos 13}, donde 1 = material de anidación en gran parte intacto y 5 = nido en forma de cúpula con cráter claro. Consulte la Figura 1A–1C para ejemplos de nidos con puntuación 5.
   5. Devuelve el nido con cuidado a la jaula limpia.
      NOTA: Las fotografías semanales de nidos proporcionan una documentación objetiva de la calidad del nido a lo largo del estudio. El deterioro en la construcción del nido puede indicar enfermedad, estrés u otras preocupaciones de bienestar que requieran atención veterinaria.
3. Proporciona enriquecimiento rotado que cambia semanalmente
   1. Selecciona un objeto de enriquecimiento y colócalo en la jaula. Utiliza papel triturado (papel blanco simple, porción de un puñado), toallas de papel (2–3 hojas, sin perfume, blancas, dobladas o arrugadas) o refugios de papel (tubos de cartón o cajas pequeñas).
   2. Rotar los elementos de enriquecimiento semanalmente según un calendario predeterminado (por ejemplo, Semana 1: papel triturado; Semana 2: papel de cocina; Semana 3: tubo de cartón; Semana 4: repito) para mantener una novedad manejable.
      NOTA: La rotación semanal aporta novedad sin saturar a los ratones. Evita objetos de enriquecimiento plástico, como chozas de plástico, pelotas o estructuras rígidas, que pueden aumentar la variabilidad^{fisiológica 11}. Reemplaza todos los objetos de enriquecimiento en cada cambio de jaula.

Figura 1. Implementación del protocolo e indicadores de bienestar durante estudios longitudinales de pletismografía corporal completa (WBP). (A) Nido representativo de alta calidad (puntuación Deacon 5) de una jaula femenina que muestra una estructura de cúpula bien formada con un cráter definido. (B) Túnel transparente de manipulación de policarbonato (aproximadamente 10 cm de longitud × 5 cm de diámetro interno) integrado con material de anidación en la jaula del hogar. Los túneles permanecieron permanentemente en jaulas como dispositivos de enriquecimiento y manipulación durante todo el estudio. (C) Calidad representativa de nidos en estudios tardíos (Semana 10) mostrando una construcción sostenida de nidos con puntuación 5 tanto en jaulas de machos como de hembras. (D) Puntuaciones de calidad de Nest durante el periodo de estudio de 10 semanas. Cada punto de datos representa la puntuación semanal de nido de una jaula usando la escala Deacon estandarizada^{de 5 puntos 13}, donde 1 = material de anidación intacto y 5 = nido completo en forma de cúpula con un cráter. Ambas jaulas mantuvieron una calidad de nido con puntuación 5 constante durante todas las fases del estudio. La región verde sombreada indica las puntuaciones asociadas a condiciones óptimas de bienestar (puntuaciones 4–5). Las fases del estudio se indican por regiones de fondo coloreadas correspondientes a la Línea Base (Semana 0), Estudio Temprano (Semanas 2–3), Estudio Intermedio (Semanas 5–7) y Estudio Avanzado (Semanas 8–10). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Implementación de la gestión de túneles

1. Preparar los túneles de manejo
   1. Utiliza túneles transparentes de policarbonato (100 mm o 130 mm de longitud × 50 mm de diámetro interno) con bordes lisos y redondeados (Figura 1B).
   2. Coloca un túnel permanente en cada jaula como parte del enriquecimiento de la jaula.
   3. No elimines túneles entre eventos de manejo.
      NOTA: Mantener el túnel dentro de la jaula permite que adquiera olores familiares de la jaula y se asocie con el entorno doméstico en lugar de con los procedimientos de manipulación. Los ratones suelen usar túneles como refugios o sitios de anidación.
   4. En cada cambio de jaula, limpia el interior del túnel con una pequeña cantidad de cama usada de la jaula anterior antes de colocarla en la jaula limpia.
   5. Túneles de autoclave o lavarlos con el mismo agente desinfectante que se usa para la limpieza de jaulas si es necesario desinfectarlo entre usos. Enjuaga bien y deja que los túneles se sequen al aire antes de devolverlos a la jaula.
      NOTA: Mantener la continuidad olfativa ayuda a minimizar el estrés asociado a olores desconocidos. Los túneles son autoclavables y reutilizables.
2. Condicionar ratones para manipular túneles
   1. Para ratones adultos ingenuos, implementa un periodo de condicionamiento de al menos 1–2 semanas antes de iniciar las sesiones de^{BPA 14 y 15}.
   2. Coloca túneles de policarbonato transparentes (véase el Paso 3.1) de forma permanente en la jaula de la casa y deja de 3 a 7 días para una familiarización pasiva.
   3. Tras la exposición pasiva, realiza sesiones diarias de manipulación suave. Anima a los ratones a entrar voluntariamente en el túnel, luego levanta el túnel horizontalmente durante 30–60 segundos antes de volver a meter el ratón en la jaula.
   4. Evaluar la habituación exitosa utilizando los siguientes criterios: entrada voluntaria en el túnel en un plazo de 10–30 segundos, comportamiento calmado dentro del túnel sin intentos de escape ni vocalización, y uso espontáneo del túnel para descanso o exploración durante observaciones rutinarias en^{jaula 14,15}.
   5. Comienza las sesiones de WBP una vez que se cumplan todos los criterios de habituación.
      NOTA: Los ratones de este estudio ya habían estado expuestos previamente a la manipulación de túneles como parte del mantenimiento rutinario antes de iniciar las sesiones de PBA.
3. Ejecutar un manejo no aversivo
   1. Usa guantes de nitrilo libres de polvo para todos los procedimientos de manipulación.
   2. Utiliza la manipulación de túneles como método principal de manejo. Si el ratón está dentro del túnel, levanta el túnel horizontalmente con una mano sosteniendo la base.
   3. Si el ratón está fuera del túnel, posiciona la abertura del túnel a un radio de 5–10 cm del ratón y permite entre 10 y 30 segundos para la entrada voluntaria sin perseguir ni forzar.
   4. Si el ratón no entra en un plazo de 30 segundos, fomenta el movimiento hacia el túnel usando una mano en forma de concha colocada detrás del ratón sin hacer contacto.
   5. Si el ratón no entra tras dos intentos (máximo total 60 s), utiliza el método de la ventosa. Coloca una mano aplanada cerca del ratón, permite el acercamiento voluntario durante 10–20 segundos, luego recoge suavemente al ratón con ambas manos evitando manipular la cola.
   6. Utiliza el método de manipulación que resulta en un comportamiento calmado, definido como ausencia de vocalización, intentos de escape o defecación asociada al estrés.
4. Transferir ratones a la cámara de pletismografía
   1. Transfiere el ratón del túnel a las manos en forma de copa antes de colocarlo en la cámara.
   2. Sujeta el túnel en horizontal e inclina la parte trasera (lado trasero) hacia arriba aproximadamente 10–20°.
   3. Deja que el ratón retroceda fuera del túnel, primero con las patas traseras y apoyándose en las manos en forma de concha.
   4. Baja ambas manos dentro de la cámara y permite que el ratón pise voluntariamente el suelo de la cámara en un plazo de 5–10 segundos.
      NOTA: Este método de transferencia de túnel a manos a cámara proporciona un mejor control durante la colocación de la cámara.
   5. Alternativamente, transfiere el ratón directamente del túnel a la cámara inclinando el túnel sobre la abertura de la cámara.
      NOTA: La transferencia directa de túnel a cámara proporciona menos control durante la colocación y se utilizó con menos frecuencia en este estudio.
   6. Nunca inviertas el túnel verticalmente ni lo agites.
   7. Sella la tapa de la cámara inmediatamente después de colocar el ratón y vuelve el túnel a la jaula de la casa.
      PASO CRÍTICO: Nunca agarres a los ratones por la cola en ningún momento del estudio. Si un ratón no entra en el túnel en 30 segundos o no se acerca a una mano en forma de concha, fomenta el movimiento suave con ropa de cama suave sin perseguir ni forzar la interacción. Permite que el ratón elija el método túnel o manual según su preferencia individual. La paciencia durante las primeras sesiones ayuda a establecer asociaciones positivas con el manejo no^{aversivo 3,7}.

4. Protocolo de Sesión WBP

1. Preparar el sistema de pletismografía
   1. Calibra el pletismógrafo de cuerpo completo una vez al día antes de la adquisición de datos.
   2. Con las cámaras vacías y selladas, iniciar la secuencia de calibración automatizada mediante el software de análisis respiratorio FinePointe (objetivo: 18–22 cm H₂O). Confirmar la calibración exitosa cuando el rango efectivo de flujo en caja supere los ±40 mL/s por sitio.
   3. Ajusta el flujo de polarización a 1,0 L/min por cámara.
   4. Monitorizar la temperatura de la cámara (22°C–24°C) y la humedad de forma continua utilizando sensores digitales.
   5. Coloca las cámaras en un lugar tranquilo con iluminación constante y vibraciones mínimas.
      NOTA: Mantener condiciones constantes de la cámara en todas las sesiones. Las fluctuaciones de temperatura alteran los patrones respiratorios y confunden las comparaciones^{longitudinales 1}.
2. Realizar sesiones de PBA durante una fase circadiana constante
   1. Realiza todas las mediciones durante la misma ventana temporal del ciclo de luz.
   2. Realiza sesiones entre las 08:00 y las 10:00 (luces encendidas a las 06:00) y evita las primeras 2 horas después de encender las luces cuando los ritmos circadianos están en transición.
3. Transporta ratones a la sala experimental
   1. Transporta las jaulas a casa a la sala experimental en un carrito aproximadamente 15 minutos antes de que comience la sesión.
   2. Permite que los ratones se adapten al ambiente experimental de la sala mientras permanecen en su jaula familiar.
   3. Coloca jaulas de casa cerca de las cámaras de pletismografía.
   4. Utiliza el manejo de túneles (véase los Pasos 3.3–3.4) para transferir a cada ratón desde la jaula de casa a las manos en forma de concha y luego a la cámara.
   5. Manipula los ratones con calma y minimiza los movimientos bruscos durante la transferencia.
      NOTA: La transferencia individual del ratón requiere solo unos segundos.
4. Coloca el ratón en la cámara
   1. Transfiere el ratón suavemente de las manos en forma de copa a la cámara (ver Paso 3.4).
   2. Sella la tapa de la cámara en menos de 5 segundos de la colocación del ratón.
5. Inicio de la aclimatación y grabación
   1. Empieza a registrar señales respiratorias usando el software de análisis respiratorio.
   2. Deja 10 minutos para la aclimatación sin molestias ni intervenciones.
6. Monitorizar la estabilidad conductual durante la aclimatación
   1. Observa al ratón de forma continua durante todo el periodo de aclimatación.
   2. Registrar movimientos excesivos, inmovilidad sostenida acompañada de signos de estrés (por ejemplo, postura rígida) o intentos repetidos de escape sin periodos de comportamiento calmado en el registro de la sesión.
   3. Reconocer que tales sesiones pueden seguir proporcionando datos inicialesválidos; Sin embargo, las mediciones basales de la Fpueden ser poco fiables.
   4. Sesiones de señalización sin períodos de calma observables durante la ventana de aclimatación para posible exclusión de los análisis de referencia según criterios específicos del estudio.
   5. Conservar todas las sesiones de este estudio, ya que ninguna cumplió con los criterios de exclusión basados en el comportamiento de aclimatación.
      PASO CRÍTICO: El periodo de aclimatación de 10 minutos es esencial para evaluar la habituación. Aunque algunos protocolos utilizan periodos de aclimatación de 20–30 minutos, ratones bien habituados en este estudio alcanzaron patrones respiratorios estables en 8–10 minutos, lo que hace que la aclimatación prolongada sea innecesaria y potencialmente contraproducente debido al aumento del movimiento.
7. Observa el comportamiento del ratón durante la aclimatación
   1. Observa a los ratones de forma continua durante los 10 minutos de aclimatación mediante monitorización visual de las cámaras.
   2. Observa indicadores evidentes de estrés, como defecación, micción, intentos prolongados de escape o inmovilidad prolongada.
   3. Registra la presencia y cantidad aproximada de pellets fecales y orina en la cámara después de cada sesión.
      NOTA: Estas observaciones proporcionan una evaluación cualitativa de los niveles de estrés y el progreso de la habituación, pero no se evaluaron formalmente mediante un etograma estandarizado en este estudio.
8. Analizar métricas respiratorias de la fase de aclimatación
   1. Utiliza el software de análisis respiratorio para calcular automáticamente la frecuencia respiratoria a partir de señales de presión utilizando el algoritmo predeterminado de detección de aliento y la configuración de umbrales por defecto en este software.
   2. Adquirir señales respiratorias bajo condiciones de flujo de aire estables (véase el Paso 4.1) utilizando parámetros estándar de adquisición.
   3. Calcular la frecuencia respiratoria media para dos periodos: finicial (0–2 min), que representa la respuesta inicial al estrés y la fisiología inmediata tras el manejo, y fbase (8–10 min), que representa la frecuencia respiratoria base estabilizada.
   4. Excluye los periodos con artefactos visibles de movimiento, definidos como desviaciones de presión no respiratorias o formas de onda irregulares asociadas al movimiento de animales o alteraciones en la cámara.
      NOTA: Inspecciona visualmente un subconjunto de grabaciones (aproximadamente el 10%) para confirmar la detección precisa de la respiración mediante el algoritmo automatizado. La validación manual confirmó la concordancia entre la detección automatizada y los patrones respiratorios observados.
9. Proceder con el protocolo experimental si es aplicable
   1. Continúa con las intervenciones experimentales después del periodo de aclimatación de 10 minutos según el diseño del estudio (por ejemplo, administración aerosolizada de fármacos, desafío hipóxico, pruebas de ejercicio).
      NOTA: No se realizaron intervenciones experimentales durante las sesiones de evaluación de habituación en este estudio. Las métricas respiratorias reportadas (inicial fy línea base f) se obtuvieron durante sesiones solo de aclimatación sin procedimientos adicionales.
10. Devuelven al ratón a la jaula de casa
    1. Utiliza el manejo de túneles o las manos en forma de copa para transferir al ratón de la cámara de vuelta a la jaula de la casa.
    2. Observa al ratón durante 5 minutos después de la sesión para confirmar el comportamiento normal, incluyendo movimientos espontáneos, acicalado, interacción con compañeros de jaula e investigación de comida y agua.
    3. Amplíe la observación y consulte al personal veterinario si el comportamiento anormal persiste más allá de los 15 minutos, incluyendo inmovilidad prolongada (>5 minutos), dificultad para respirar, postura encorvada o incapacidad para interactuar con las parejas de jaula.
       NOTA: No se observaron comportamientos anormales tras la sesión en este estudio.
11. Mantener una frecuencia de sesión constante
    1. Realiza sesiones de PBA regularmente durante el periodo de estudio longitudinal (10 semanas en este protocolo).
    2. Realiza sesiones a intervalos semanales para seguir la progresión de la habituación.
    3. Programar las sesiones en horarios consistentes del día (véase el Paso 4.2) para mantener la consistencia circadiana y procedimental.

Resultados

La aplicación de este protocolo de manejo de túneles y enriquecimiento ambiental a seis ratones salvajes tipo 129S1/SvImJ (3 machos, 3 hembras) a lo largo de un estudio longitudinal de WBP de 10 semanas arrojó evidencia de una habituación progresiva y una mejora de la estabilidad fisiológica. Se obtuvieron mediciones de frecuencia respiratoria durante sesiones repetidas de WBP realizadas a intervalos longitudinales regulares, analizando datos de cuatro fases del estudio: Base (Semana 0),...

Discusión

Este protocolo describe un enfoque integrado que combina manejo de túneles, enriquecimiento ambiental y exposición repetida en el contexto de la WBP longitudinal. Bajo estas condiciones, las mediciones de frecuencia respiratoria mostraron una estabilización progresiva a lo largo de sesiones repetidas, consistente con una reducción de la activación y una habituación progresiva. Varios factores de implementación parecen importantes para un buen rendimiento del protocolo. Primero, se debe i...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aspen Chip Bedding	Suministro de laboratorio	Aspen 323	Cama de virutas de madera Aspen. Autoclavado antes de su uso; colocado a una profundidad aproximada de 1 cm en el piso de la jaula.
Agua autoclavada	Provisto por la instalación	No aplicable	Agua municipal autoclavada proporcionada ad libitum a través de botellas de agua estándar.
Tubo de cartón	Generado por la instalación	No aplicable	Rollo de papel higiénico de cartón liso. Se utiliza como enriquecimiento rotativo y elemento de refugio.
Crink-I-Nest (Irradiado)	The Andersons / Suministro de laboratorio	CNKR	Material de enriquecimiento de papel triturado. Irradiado con gamma. Se proporciona como enriquecimiento rotativo en una base de semana alterna.
Software FinePointe	Data Sciences International	Sin número de catálogo	Software de adquisición y análisis de datos respiratorios, versión 3.0. Utilizado para la recopilación de datos de WBP y el cálculo de parámetros.
Rack de jaulas ventiladas individualmente (IVC)	Allentown	EP5000E	Rack IVC de paquete de escape, capacidad para 140 jaulas. Sistema de alta densidad de doble cara con conexiones de ventilación automática.
Alimento irradiado para roedores	Envigo	T.2918.15	Dieta irradiada estándar para roedores. Se proporciona ad libitum a través de un tolva de barras de alambre.
Túnel de transferencia de ratones	Braintree Scientific	TRANS-TUBE 100X50MM	Túnel de policarbonato transparente, 100 mm de longitud × 50 mm de diámetro interno. Autoclavable y reutilizable. Se utiliza para procedimientos de transferencia de animales con bajo estrés.
Nestlets (Irradiados)	Suministro de laboratorio	IRR	Cuadrados de anidación de algodón comprimido (~ 5 cm & times; 5 cm, ~ 2.5 g cada uno). Irradiados con gamma. Se proporciona como enriquecimiento constante; uno por jaula.
Guantes de nitrilo, sin polvo	Kimberly-Clark	KC500	Guantes de examen de nitrilo sin polvo color púrpura. Usado durante todos los procedimientos de contacto con animales.
Esponja de gasa no tejida	Pivetal	21295040	Esponja de gasa no tejida no estéril, 4 capas, 4 en & times; 4 en (10.16 cm & times; 10.16 cm). Utilizado como material de enriquecimiento.
Toalla de papel	Tork (Essity)	MB 540A	Toalla de mano multidoble blanca. Se utiliza como material de enriquecimiento rotativo.
Cámara de teléfono inteligente	Apple	Sin número de catálogo	Cámara de teléfono inteligente iPhone. Utilizado para la documentación semanal de la puntuación del nido.
Sistema de pletilsmografía de cuerpo completo	Data Sciences International	10222C (2 sitios); 770621 (4 sitios)	Sistema de pletilsmografía de cuerpo completo FP Series FinePointe sin restricciones para ratones. Disponible en configuraciones de 2 y 4 sitios.