Ensayo de imagen basado en placas para cuantificar respuestas fotoperiódicas en Neurospora crassa utilizando el desarrollo de protoperitecios

Resumen

El ensayo de protoperitecios cuantifica las respuestas fotoperiódicas en Neurospora crassa midiendo la formación de protoperitecios bajo ciclos definidos de luz-oscuridad. Este método basado en placas proporciona un enfoque sencillo y escalable para comparar respuestas de desarrollo dependientes del fotoperíodo entre condiciones experimentales.

Resumen

Neurospora crassa es un organismo modelo bien establecido para estudiar el tiempo biológico y el desarrollo regulado por luz. El Ensayo de Protoperitecios (PPA) es un método de imagen basado en placas para cuantificar respuestas fotoperiódicas midiendo la formación de protoperitecios como resultado del desarrollo. El objetivo de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo reproducible y escalable para evaluar cómo los ciclos definidos de luz-oscuridad influyen en el desarrollo sexual fúngico. En este ensayo, se cultivan cultivos fúngicos en un medio sintético de cruce bajo condiciones controladas de fotoperiodo, seguidos de la eliminación estandarizada de conidios superficiales para mejorar la visualización. Los protoperitecios se cuantifican mediante conteo manual basado en imágenes, y los conteos medios por placa se utilizan para comparaciones estadísticas entre condiciones de fotoperiodo. A diferencia de enfoques anteriores, el PPA integra condiciones de cultivo estandarizadas, exposición controlada al fotoperíodo e imágenes basadas en cuadrantes para permitir comparaciones cuantitativas reproducibles entre cepas. Este flujo de trabajo va más allá de un protocolo básico al establecer un marco consistente y escalable para medir la salida de desarrollo dependiente del fotoperiodo bajo condiciones experimentales definidas. El método requiere aproximadamente una semana desde la inoculación hasta el análisis y puede aplicarse en múltiples cepas bajo condiciones ambientales definidas. La PPA proporciona una plataforma sencilla y accesible para el análisis comparativo del desarrollo dependiente del fotoperíodo en hongos bajo condiciones de laboratorio controladas.

Introducción

El ensayo de protoperitecios (PPA) cuantifica las respuestas fotoperiódicas en el hongo Neurospora crassa. Muchos organismos miden la longitud del día y de la noche para coordinar procesos biológicos en un fenómeno conocido como^{fotoperiodismo} 1,2,3,4,5,6,7,8. En este ensayo, el desarrollo de la estructura sexual femenina, el protoperitecio, actúa como un proxy medible dependiente de la luz para la respuesta fotoperiódica. Aunque el fotoperiodismo está bien caracterizado en plantas mediante experimentos^{nocturnos 3}, existen menos enfoques estandarizados para cuantificar respuestas fotoperiódicas en eucariotas no fotosintéticos como los hongos. N. crassa proporciona un sistema modelo manejable para este propósito gracias a su genética bien definida y a sus vías de desarrollo sensibles a la luz. Se ha observado regulación dependiente del fotoperiodo del tiempo reproductivo en^organismos 1,2,3,4,5,6,7,8, lo que respalda la relevancia de las respuestas fisiológicas impulsadas por la luz; sin embargo, los estudios mecanicistas en hongos siguen limitados por la falta de ensayos reproducibles.

Los protoperitecios son estructuras sexuales prematuras femeninas en N. crassa. Proceden de ascogonia, que desarrollan tricóginos en espiral que se fusionan con hifas o conidios del tipo de apareamiento^{opuesto 9}. Tras la fusión, los núcleos del compañero "masculino" entran en el protoperitecio. El número de protoperitecios producidos está regulado estacionalmente y fuertemente inducido por la^{luz 10}. La regulación fotoperiódica es central en la ecología, la cronobiología y la fisiología fúngica porque muchos procesos controlados por relojes dependen de la luz. La luz influye en numerosas vías genéticas, incluyendo fotorreceptores, quinasas y mecanismos de transducción de luz vinculados al desarrollo^{sexual 11}. Los protoperitecios son muy adecuados para medir la salida fotoperiódica porque se visualizan fácilmente bajo un microscopio y responden con sensibilidad a la luz.

A pesar de la importancia del fotoperiodismo en los hongos, existen pocos ensayos estandarizados y reproducibles disponibles para cuantificar la producción de protoperitecios bajo ciclos de luz controlados. Un ensayo de rendimiento medio basado en placas es valioso porque los hongos son organismos modelo económicos y fáciles de mantener, lo que permite un análisis sistemático del desarrollo sexual inducido por la luz y la función génica. La mayoría de la investigación en fotoperiodismo se ha centrado en plantas, mientras que los marcos cuantitativos equivalentes para sistemas fúngicos siguen siendo limitados. En otros organismos, incluidos los insectos, fenómenos dependientes de la luz como la diapausa están bien^{caracterizados,} pero faltan enfoques comparables en hongos. Esta brecha restringe la comparación reproducible de respuestas fotoperiódicas entre cepas y condiciones experimentales.

La PPA se basa en un estudio de 2004 que midió la producción de protoperitecios a lo largo de la duración creciente del día, desde la oscuridad constante hasta la luz constante, en el mutante banda (bd) (ras-1^bd), que se ha utilizado en estudios^{circadianos 4,12}. Se observaron cambios dependientes del fotoperiodo en la producción de protoperitecios en este fondo. El flujo de trabajo actual adapta y amplía este enfoque utilizando la cepa de referencia FGSC 2489, que está asociada con recursos de secuenciación del genoma completo y^{eliminación 13,14}. El ensayo cuantifica el número medio de protoperitecios producidos bajo fotoperiodos definidos durante una semana como indicador de la respuesta fotoperiódica. Este enfoque estandariza las condiciones de cultivo, la imagen y la cuantificación, permitiendo la comparación reproducible entre condiciones experimentales y cepas. Los avances metodológicos clave incluyen condiciones de cultivo basadas en placas estandarizadas, parámetros definidos de exposición al fotoperíodo, imágenes basadas en cuadrantes y un flujo de trabajo de cuantificación reproducible.

Este protocolo cuantifica las respuestas fotoperiódicas en N. crassa midiendo la formación de protoperitecios tras la exposición a ciclos definidos de luz-oscuridad. Para cada condición fotoperiódica, se utilizan cuatro réplicas biológicas, cada una consistente en una placa de cruce sintético (SC) inoculada de forma independiente. Se recogen cuatro imágenes por placa y se promedian para generar un único valor por réplica biológica para el análisis estadístico. Las placas se incuban durante siete días bajo fotoperiodos calibrados (por ejemplo, ciclos de luz y oscuridad de 12 h:12 h o 8 h:16 h).

Se coloca un registrador de datos dentro de la cámara de crecimiento para registrar continuamente la intensidad de luz, la temperatura y la humedad, verificando así condiciones ambientales estables. La intensidad de la luz se mantiene por encima de 1.000 lux, ya que niveles más bajos reducen la producción de protoperitecios. Se evita la iluminación excesiva para evitar aumentos de temperatura en la cámara y efectos térmicos de confusión. Tras la incubación, los macroconidios se retiran suavemente con una toalla de papel humedecida saturada con etanol al 70%. Cuatro cuadrantes espaciados uniformemente en el perímetro de cada placa se imajinan con una magnificación del 40× usando un microscopio estereoscópico bajo iluminación de campo claro. Los protoperitecios se cuentan manualmente mediante un paquete de procesamiento de imágenes, y se utilizan los conteos medios por placa para comparaciones estadísticas entre fotoperiodos.

Protocolo

Los reactivos, software y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de medios y materiales

(Tiempo estimado: 1–1,5 h de tiempo activo; refrigeración nocturna opcional)

1. Prepara medios de cruce sintético (SC)
   1. Preparar medio SC: 0,2% de sacarosa, 5 μg/L de biotina, 1,5% de agar y sales de Westergaard (pH 6,5 con 1 N NaOH)¹⁵.
   2. Autoclave, el medio. Déjalo enfriar a 50–55 °C hasta que alcance un estado vertible.
      PRECAUCIÓN: Utiliza guantes resistentes al calor al retirar los frascos del autoclave.
2. Vierte platos
   1. Pipete 10 mL de medio fundido en placas de Petri de 60 mm usando una pipeta desechable.
   2. Deja que las placas se solidifiquen a temperatura ambiente durante 30–45 minutos.
   3. Guarda los platos boca abajo a 4 °C durante hasta 4 semanas.
      NOTA: Mantén la hidratación de los platos. No guardes los platos durante más de 4 semanas a 4 °C.
3. Prepara cepas fúngicas
   1. Cultivar cada cepa en pequeños tubos de ensayo de vidrio que contengan medio completo o mínimo preparado según las instrucciones del manual^{de laboratorio 15}.
   2. Incubar los tubos en oscuridad constante (DD) a 30 °C hasta que se forme una cobertura micelial visible a lo largo de la superficie del tubo (normalmente 2–3 días).
      PRECAUCIÓN: Manejar cultivos fúngicos utilizando prácticas microbiológicas estándar y trabajar dentro de un gabinete de bioseguridad para minimizar la contaminación.

2. Inoculación de placas

(Tiempo estimado: 15–30 minutos por juego de platos)

1. Conidios fúngicos de transferencia
   1. Inocular cada placa SC utilizando técnica estéril y un lazo de inoculación.
   2. Colocar conidios en el centro de la placa para asegurar un crecimiento uniforme (Figura 1A). Los conidios aparecen como esporas polvorientas y de color claro que cubren la superficie de la colonia.
   3. Aplicar aproximadamente 1–2 μL de suspensión conidal concentrada (o un bucle equivalente) para estandarizar la inoculación entre placas.
2. Prepara las placas para la incubación
   1. Cierra las placas de forma segura para evitar la contaminación y permitir el intercambio de gases.
   2. Etiqueta cada placa con el nombre de la cepa, la fecha y la condición del fotoperiodo.

3. Montaje de tratamiento con fotoperiodo

(Tiempo estimado: 10 minutos de preparación + incubación de 7 días)

1. Calibrar la cámara de crecimiento
   1. Ajusta la temperatura de la cámara a 25 °C.
   2. Ajusta la humedad al 50% (rango aceptable: 40%–60%) para evitar que se seque la placa.
   3. Ciclos de fotoperiodo del programa: EQ (equinoccio): 12 h luz / 12 h oscuro y SDP (día corto): 8 h luz / 16 h oscuro
   4. Ajusta la intensidad de la luz a >1.000 lux a nivel de placa usando un fotómetro calibrado. Evita intensidades que aumenten la temperatura de la cámara por encima de 25 °C.
      NOTA: Asegúrate de que las luces de la cámara no sobrecalienten el interior.
      PRECAUCIÓN: No uses parafilm ni bolsas de plástico para mantener la humedad, ya que restringen el intercambio de gases y dificultan el crecimiento de hongos. Si no hay control de humedad disponible, coloca un depósito de agua dentro de la cámara.
2. Coloca las placas en la cámara
   1. Coloca los platos de forma uniforme en las estanterías para asegurar una exposición uniforme a la luz.
   2. Coloca un registrador de datos dentro de la cámara para monitorizar continuamente la temperatura y la humedad y verificar condiciones ambientales estables.
3. Comienza el ensayo
   1. Incubar las placas bajo el fotoperiodo programado durante 7 días sin alteraciones.

4. Monitorización y preparación de placas para imagen

(Tiempo estimado: 15–20 minutos por plato)

1. Retira las placas de la recámara
   1. Retira las placas después de 7 días de incubación.
   2. Inspeccionar las placas para detectar crecimiento de conidios y formación de protoperitecios.
2. Placas limpias para mayor visibilidad
   1. Retira los conidios superficiales de la tapa de la placa y de la superficie del agar usando toallas de papel rasgadas (Figura 1B).
   2. Humedece una toalla de papel con 1–2 mL de etanol al 70%. Aplica suavemente la superficie de la placa 3 a 5 veces para eliminar los conidios. Deja que las placas se sequen al aire durante 1–3 minutos antes de la imagen (Figura 1C).
      PRECAUCIÓN: El etanol es inflamable; Mantente alejado de fuentes de calor.
      NOTA: Evita aplicar presión excesiva. No arrastres la toalla por la superficie del agar, ya que esto podría dañar el medio o alterar los protoperitecios.

5. Imagen de protoperitecios

(Tiempo estimado: 5 min por plato)

1. Prepárate para la imagen
   1. Monta un microscopio con iluminación y aumento constantes (normalmente 40×).
   2. Asegúrate de que la superficie de la placa esté seca y libre de restos.
2. Capturar imágenes
   1. Imagen de cuatro cuadrantes espaciados uniformemente en el perímetro de la placa usando aumento constante.
   2. Etiqueta cada imagen con deformación, condición del fotoperiodo, número de placa y posición del cuadrante.
   3. Guarda las imágenes en un formato consistente (por ejemplo, TIFF) para su análisis.

6. Cuantificación y análisis de datos

(Tiempo estimado: 10–20 minutos por placa para conteo; 15–25 minutos para análisis)

1. Conde protoperitecios
   1. Abre cada imagen en un paquete de procesamiento de imágenes.
   2. Usa el plugin Cell Counter para contar manualmente los protoperitecios. Excluye burbujas, artefactos de borde y estructuras ambiguas. Contar los protoperitecios agrupados como unidades individuales y distinguibles.
   3. Registrar los recuentos de cada cuadrante y calcular la media por placa.
2. Analizar datos
   1. Importar datos cuantificados en un software de análisis estadístico.
   2. Realizar un análisis estadístico utilizando la prueba t de Welch para comparaciones mostradas en la Figura 2.
   3. Genera gráficos comparando tratamientos de fotoperiodo, cepas o réplicas.

Resultados

Tras la inoculación con la cepa silvestre, los conidios cubrieron la superficie del SC en un plazo de 36–48 horas. Tras 7 días de exposición fotoperiodal, se formó una densa capa conidal que se eliminó con una toalla de papel humedecida saturada con un 70% de etanol (Figura 1). Este paso expuso protoperitecios subyacentes sin alterar su estructura. En microscopía, los protoperitecios aparecían como estructuras circulares oscuras distribuidas a lo largo de la superficie de la placa. Estas est...

Discusión

El objetivo de la PPA es utilizar el desarrollo sexual en hongos como un indicador para determinar si un organismo percibe un fotoperiodo específico. Cuantificando el número medio de protoperitecios producidos bajo diferentes ciclos de luz, se pueden evaluar y comparar las respuestas fotoperiódicas entre condiciones. En coherencia con observaciones^{previas 4,16}, N. crassa muestra una mayor producción de protoperitecios ba...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar	BD	90000-786	Para Synthetic Crossing Media/Minimal Media
Alcohol burner flame	Wards	470346-104	Para esterilizar asa de inoculación
Ammonium iron sulfate hexahydrate	Supelco	FX0245-1	Para Synthetic Crossing Media/Minimal Media
Ammonium nitrate (NH4NO3)	BeanTown Chemical	BT134170-250G	Para Minimal Media
Autoclave	VWR International	76683-456	Para esterilizar cristalería y medios
Biological Safety Cabinet	ThermoFischer Scientific	1323TS	Para reducir la contaminación de las placas y del laboratorio.
Biotin	VWR	97061-444	Para Synthetic Crossing Media
Boric acid (H3BO3)	Electron Microscopy Sciences	100503-696	Para Synthetic Crossing Media/Minimal Media
Calcium chloride (CaCl2)	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT1311-1	Para Synthetic Crossing Media
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	223506-25G	Para Minimal Media
Citric acid monohydrate (C6H8O7·H2O)	Sigma-Aldrich	1002440500	Para Synthetic Crossing Media/Minimal Media
Copper sulfate pentahydrate (CuSO4·5H2O H2O)	BeanTown Chemical	BT121245-1KG	Para Synthetic Crossing Media/Minimal Media
Ethanol	Decon Labs	71001-754	Utilizado para eliminar conidias de la superficie de la placa y esterilizar la asa de inoculación
FIJI/ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	N/A	Para analizar imágenes/conteo
Gloves	SW Safety Solutions	76382-944	Para seguridad
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	N/A	Para realizar pruebas estadísticas y crear figuras
Growth Chamber	Caron Products & Services	6320 & 6340 Series	Programable para ciclos de fotoperíodo
HOBO Data Logger	Onset Computer Corporation	MX2202	Para registrar la intensidad de la luz y la temperatura
Inoculation loop	VWR International	10806-354	Para transferir material fúngico a platos de Petri
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O)	BeanTown Chemical	BT145380-1KG	Para Synthetic Crossing Media/Minimal Media
Manganese sulfate monohydrate (MnSO4·H2O H2O)	Sigma-Aldrich	1059410250	Para Synthetic Crossing Media/Minimal Media
Microscope (Leica S6 D Greenough Stereo Microscope)	Leica Microsystems	10446297	Para imágenes
Neurospora crassa FGSC 2489	Fungal Genetics Stock Center	74-OR23-1VA, JCM19069	Cepa fúngica
Paper Towels	Kimberly-Clark Professional, Scott and Kleenex	6666114	Para verter medios
Permanent Marker	Sharpie	30072	Para etiquetar placas
Petri Dishes	VWR International	25384-164	Para colocar Synthetic Crossing Media
Pipettes	VWR International	75816-090	Para verter medios
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	BeanTown Chemical	BT225070-500G	Para Synthetic Crossing Media/Minimal Media
Potassium nitrate (KNO3)	Sigma-Aldrich	221295-100G	Para Synthetic Crossing Media
Small Disposable Glass Test Tubes	VWR International	470211-698	Para el crecimiento inicial de cepas fúngicas
Sodium chloride (NaCl)	VWR International	BDH9286-500G	Para Synthetic Crossing Media
Sodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7·2H2O)	VWR	97061-008	Para Minimal Media
Sodium hydroxide (NaOH)	AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC	JT5635-2	Para Synthetic Crossing Media
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)	Supelco	1.06524.1000	Para Synthetic Crossing Media/Minimal Media
Sucrose	VWR International	BDH9308-500G	Para Synthetic Crossing Media/Minimal Media
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)	BeanTown Chemical	BT122545-500G	Para Synthetic Crossing Media/Minimal Media