Artículo de método

Construcción de organoides de cáncer de mama humano y cuantificación basada en ensayos de cometas del daño al ADN inducido por doxorubicina

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DOI:

10.3791/71299

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28 de julio de 2026

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1College of Life Science, North China University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, 3School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 4Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People's Hospital of Suzhou City, 5Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo establece un modelo de organoides (BCOs) para cáncer de mama humano y evalúa cuantitativamente el daño en el ADN inducido por doxorubicina utilizando el ensayo de cometas. Se demuestra la viabilidad de aplicar el ensayo cometa a los BCOs, y se proporciona un flujo de trabajo reproducible, escalable y operativo para detectar daños en ADN inducido por DOX en BCOs.

Resumen

El cáncer de mama es la malignidad más común entre las mujeres en todo el mundo y muestra una heterogeneidad considerable. La doxorrubicina (DOX) se utiliza ampliamente en el tratamiento del cáncer de mama, y su principal mecanismo de acción consiste en inducir fracturas de doble cadena del ADN y desencadenar la muerte celular. En este protocolo, se estableció un modelo de BCO humano para evaluar cuantitativamente el daño al ADN inducido por DOX. Las células primarias del cáncer de mama se aislaron de tejidos tumorales derivados del paciente mediante disociación mecánica y enzimática y posteriormente se cultivaron en una matriz tridimensional para generar BCOs. Los organoides se trataron con 8 μM DOX durante 2 horas. El daño en el ADN se evaluó tras 2 horas de tratamiento. Tras el tratamiento, los organoides se disociaron en células individuales, se incrustaron en agarosa de bajo punto de fusión y se electroforesaron bajo condiciones alcalinas. Tras la electroforesis, los patrones de migración del ADN se visualizaron como estructuras de cometas bajo microscopía de fluorescencia y se analizaron cuantitativamente usando el software OpenComet para determinar el porcentaje de ADN caudal (% ADN caudal). El ensayo cometa detectó con éxito daños en el ADN en los BCOs. En comparación con el grupo control, los BCOs expuestos a 8 μM DOX durante 2 horas mostraron colas de cometa alargadas tras disociación organoide y electroforesis. El análisis cuantitativo reveló que el porcentaje de ADN de la cola era significativamente mayor en el grupo tratado, lo que indica la inducción de daño en el ADN. Este método altamente sensible apoya estudios toxicológicos y farmacodinámicos de DOX y proporciona una plataforma técnica robusta para evaluar daños en el ADN en sistemas BCO derivados del paciente.

Introducción

El cáncer de mama es un tumor maligno que surge en los tejidos epiteliales mamarios debido a alteraciones genéticas, desregulación hormonal y otros factores patógenos. Es la malignidad más común entre mujeres en todo el mundo y presenta patrones epidemiológicos únicos y una considerable heterogeneidadintratumoral 1,2. DOX, un agente quimioterapéutico de primera línea, se intercala en el ADN, inhibe la actividad de la topoisomerasa II e induce la ruptura de la cadena de ADN, desencadenando finalmente la apoptosis en las célulastumorales 3. Los sistemas tradicionales de cultivo celular bidimensional tienen limitaciones para recapitular la compleja organización celular y la heterogeneidad de los tumores de mama. En cambio, las BCO son estructuras tridimensionales derivadas de tejidos tumorales del paciente que conservan las características clave del tumor original, incluyendo la composición celular, la arquitectura tisular y los fenotipos moleculares. Cabe destacar que los modelos de BCO demuestran una alta concordancia con las respuestas clínicas a los fármacos; para un agente terapéutico dado, la concordancia de respuesta negativa alcanza el 100%, y la concordancia de respuesta positiva alcanza el 98% entre BCOs y el pacientecorrespondiente 4.

Los BCOs sirven como un modelo avanzado in vitro que recapitula características estructurales y funcionales clave de tumores primarios y se han aplicado ampliamente para investigar la tumorigénesis, la progresión de la enfermedad y la resistenciaterapéutica 5. La iniciación tumoral en el cáncer de mama suele depender de la inactivación cooperativa de múltiples genes supresores tumorales, como TP53, PTEN, RB1 y NF1, ya que las alteraciones de un solo gen son insuficientes para provocar la transformación maligna del epitelio mamario normal. Este proceso va acompañado de pérdida de polaridad celular, desorganización arquitectónica y proliferación descontrolada 6,7,8.

El ensayo de cometas (también conocido como electroforesis en gel unicelular, SCGE) es un método clásico para evaluar el daño al ADN a nivel de célula única. La técnica fue introducida por primera vez por Rydberg y Johanson en 1978, y posteriormente perfeccionada por Ostling y Johanson, quienes establecieron el ensayo de cometas neutros para detectar rupturas de doble cadena de ADN. En 1988, Singh y sus colegas incorporaron condiciones de electroforesis alcalina, permitiendo la detección de rupturas de cadena simple de ADN, sitios abásicos y lesiones álcali-lábiles, ampliando sustancialmente la aplicabilidad delensayo 9. El principio fundamental del ensayo de cometas es que la movilidad electroforética del ADN depende de la integridad del ADN. Tras la incrustación y lisis de agarosa para eliminar membranas celulares y proteínas, los fragmentos de ADN dañados migran hacia el ánodo durante la electroforesis para formar una "cola cometa", mientras que el ADN intacto permanece cerca del lugar de carga, formando la "cabeza del cometa"10. Parámetros como la longitud de la cola, el porcentaje de ADN de la cola (% de ADN de cola) y el momento de la cola oliva permiten una evaluación semicuantitativa o cuantitativa del daño en el ADN, y los diseños experimentales de curso temporal pueden utilizarse para evaluar la capacidad de reparación del ADN. Debido a su alta sensibilidad, bajos requisitos de entrada de muestras y relativa simplicidad procedimental, el ensayo cometa ha sido ampliamente utilizado en toxicología genética, biología del cáncer y estudios de respuesta a fármacos, especialmente para evaluar daños en el ADN inducidos por agentes quimioterapéuticos y radioterapia, así como mecanismos de resistencia de células tumorales. El ensayo es muy sensible a las condiciones experimentales y a la variabilidad procedimental, y la reproducibilidad y la comparabilidad entre laboratorios dependen de flujos de trabajo estandarizados y análisis automatizadode imágenes 11. En los últimos años, la incorporación de software de imagen de alto rendimiento, modelos organoides y sistemas de edición genética ha potenciado aún más la utilidad del ensayo cometa para investigar el daño en el ADN y los mecanismos de reparación, así como para evaluar las respuestas al tratamiento tumoral.

En comparación con ensayos tradicionales de daño en el ADN como la tinción por inmunofluorescencia γ-H2AX o la citometría de flujo, el ensayo de cometas proporciona un medio directo para cuantificar las rupturas físicas de cadenas de ADN a nivel de célula única. Dado que esta metodología opera de forma independiente de la expresión específica de proteínas o de la especificidad de anticuerpos, elimina efectivamente los resultados falsos negativos derivados de variaciones en los estados del ciclo celular o aberraciones en las vías de respuesta al daño delADN 12. Además, a diferencia de los cultivos monocapa bidimensionales convencionales, el modelo organoide tridimensional utilizado en este estudio recapitula con mayor fidelidad la compleja arquitectura espacial, las interacciones de matrices extracelulares y los gradientes de permeación de fármacos de tumores in vivo. Mientras que los modelos tradicionales de líneas celulares suelen sobrestimar la genotoxicidad debido a la sobreexposición artificial a fármacos, la plataforma organoide evalúa el daño al ADN inducido por DOX dentro de un microambiente que refleja estrechamente las condiciones fisiológicas clínicas, mejorando así sustancialmente la fiabilidad y el valor traslacional de este paradigmade cribado 13.

A pesar de las ventajas sustanciales del ensayo de cometa integrado en organoides establecido en este estudio para evaluar daños en el ADN, su implementación práctica requiere una cuidadosa consideración de varias limitaciones técnicas y parámetros de aplicabilidad relacionados con la entrada de muestras. El protocolo requiere una disociación enzimática exhaustiva pero suave de los organoides para obtener una suspensión unicelular altamente viable. Una densidad de siembra de 15.000–20.000 células primarias de cáncer de mama por cada 100 μL de la matriz basal de la membrana basal (~200 células/1 μL) mantiene la señalización paracrina intercelular necesaria para la formación robusta de esferas, al tiempo que previene la necrosis central inducida por la hiperdensidad y el rápido agotamiento de nutrientes. En cuanto a la ventana terapéutica, este ensayo requiere una calibración cuidadosa de la concentración de DOX y la duración de la exposición para evitar una muerte celular excesiva (>20–30%). La exposición supraletal a drogas genera una abundancia de cometas "erizos", que ocultan señales reales de daño en el ADN y confían la interpretación de los datos. En cuanto a las limitaciones del ensayo, el bajo rendimiento inherente del ensayo estándar de cometas alcalinos lo hace inadecuado para el cribado de fármacos de alto consumo. Además, esta técnica exige una rigurosa estandarización de los procedimientos experimentales—incluyendo la estabilidad de adherencia del gel, duración del desenrollado alcalino y uniformidad electroforética—ya que incluso pequeñas desviaciones operativas pueden introducir errores sistémicos sustanciales.

En conclusión, este protocolo establece las BCOs humanas y demuestra la viabilidad de aplicar el ensayo cometa para cuantificar el daño al ADN inducido por DOX. Tras el tratamiento DOX de 8 μM de BCOs completamente establecidos, se evaluó el daño en el ADN mediante el ensayo de cometa. Este enfoque permite una evaluación estable y directa del daño en el ADN inducido por DOX.

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Protocolo

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Popular Wuzhong de Suzhou (Aprobación nº 20251w03) y se llevó a cabo conforme a los estándares éticos médicos. Todos los sujetos de esta investigación proporcionaron su consentimiento informado por escrito.

1. Construcción de BCOs humanos

  1. Transporte y almacenamiento de tejido contra el cáncer de mama
    1. Colocar inmediatamente tejido humano recién resecado del cáncer de mama en una solución de preservación de tejido preenfriada (4 °C).
      NOTA: Asegúrese de que el tejido permanezca completamente sumergido durante el transporte.
  2. Disociación mecánica del tejido del cáncer de mama
    1. Realiza todos los procedimientos en un armario de bioseguridad. Coloca el tejido del cáncer de mama en una placa de cultivo de 6 cm y retira el tejido adiposo visible usando bisturís y fórceps estériles.
    2. Añade 3 mL de PBS al molde de cultivo de 6 cm y lava el pañuelo tres veces.
    3. Aspira y descarta la solución salina con fosfato (PBS).
    4. Repite los pasos 1.2.2 y 1.2.3 dos veces más.
    5. Transfiere el tejido con cáncer de mama a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL usando tijeras quirúrgicas estériles y corta el tejido en pequeños fragmentos de aproximadamente 2 x 5 mm de tamaño.
  3. Digestión enzimática del tejido del cáncer de mama
    1. Añade 1 mL de solución de disociación organoide al tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y transfiere la suspensión a un tubo de centrífuga de 15 mL.
    2. Añadir 8 mL adicionales de solución de disociación organoide al tubo de la centrífuga de 15 mL.
    3. Incuba el tubo centrífugo de 15 mL a 37 °C durante 40 minutos.
    4. Agita el tubo con un agitador durante 1 minuto cada 10 minutos durante la digestión.
    5. Tras 40 minutos, añade 6 mL de PBS al tubo de la centrífuga de 15 mL para terminar la digestión.
      NOTA: Añadir PBS directamente a la mezcla digestiva para detener la actividad enzimática.
  4. Aislamiento de células tumorales primarias de mama e incrustación de organoides
    1. Coloque un colador de celda de 100 μm sobre un tubo de centrífuga de 50 mL.
    2. Añade 1 mL de medio de cultivo celular completo sobre el colador celular.
      NOTA: Prepara el medio de cultivo celular completo utilizando 500 mL de medio basal, 50 mL de suero bovino fetal y 5 mL de penicilina-estreptomicina.
    3. Aspira 1 mL de la suspensión de tejido digerido del tubo centrífugo de 15 mL y aplícala sobre el colador celular.
    4. Repite el paso 1.4.3 hasta que toda la suspensión pase por el colador.
    5. Enjuaga el colador celular con 1 mL adicional de medio de cultivo celular completo.
    6. Centrifuga el tubo de 50 mL a 350 × g durante 3 minutos a 4 °C.
    7. Aspira y desecha el sobrenadante.
    8. Resuspende el pellet celular en 1 mL de medio de cultivo celular completo y transfiere a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
    9. Centrifuga la suspensión a 370 × g durante 5 minutos a 4 °C.
    10. Aspira y desecha el sobrenadante.
    11. Añade 100 μL de la matriz de membrana basal al tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y mezcle bien.
      NOTA: Mantener una densidad de siembra de 15.000–20.000 células primarias de cáncer de mama por cada 100 μL de la matriz basal de la membrana basal (200 células/1 μL). Esto mantiene la señalización paracrina intercelular para la formación robusta de esferas y previene la necrosis central.
    12. Dispensar 25 μL de la mezcla matriz membrana basal en cada pozo de una placa de 24 pozos.
    13. Invierte la placa de 24 pozos e incubala a 37 °C durante 10 minutos para permitir la polimerización de la matriz de membrana basal.
    14. Añadir 500 μL de medio de cultivo BCO a cada pozo de la placa de 24 pozos.
      NOTA: Cultivar BCOs utilizando un medio comercial listo para usar con una formulación propietaria.
    15. Incubar la placa en una incubadora humidificada a 37°C con un 5% de CO₂.
      NOTA: Tras la siembra en la matriz extracelular, los BCOs se cultivaron durante 7–10 días para permitir un desarrollo estructural 3D adecuado. Los organoides se consideraron completamente establecidos y listos para tratamiento farmacológico cuando presentaron morfologías 3D esféricas densas y alcanzaron un diámetro medio de aproximadamente 50–100 μm, sin signos de necrosis central. Una vez cumplidos estos criterios de endpoint, los BCOs fueron tratados posteriormente con DOX.

2. Detección de daños por ADN inducidos por DOX en BCOs mediante el ensayo de cometa

El protocolo experimental fue adaptado a partir de las directrices establecidas y optimizado aún más para adaptarse a condiciones específicas de laboratorio14.

PRECAUCIÓN: Ejecute todos los procedimientos de manipulación DOX —incluyendo pesaje de polvo seco, preparación de soluciones de stock y dilución en serie de soluciones de trabajo— exclusivamente dentro de un gabinete certificado de seguridad biológica Clase II o una campana extractora química. Evita estrictamente cualquier manipulación en bancos de laboratorio abiertos. Lleva guantes de nitrilo de doble capa y protege el fármaco de la luz durante todos los procedimientos. Finalmente, segregar todos los consumibles contaminados con DOX (por ejemplo, puntas de pipeta y tubos de microcentrífuga) estrictamente como 'residuos citotóxicos' para su eliminación especializada; Nunca mezcles estos objetos con residuos biopeligrosos rutinarios.

  1. Tratamiento DOX de las BCOs
    1. Aspira y descarta el medio de cultivo gastado.
    2. Añadir 500 μL de medio de cultivo fresco de BCOs a cada pozo
    3. Retira y descarta 4 μL del medio de cada pozo
    4. Añade 4 μL de solución stock DOX de 1 mM a cada pozo.
      NOTA: Para establecer una concentración final de trabajo de 8 μM, determina el volumen de stock requerido usando la ecuación estándar de dilución: C1V1 = C2V2. Donde C1 representa la concentración inicial de stock DOX (1 mM), C2 es la concentración objetivo (8 μM) y V2 es el volumen final del pozo (500 μL). Resolver para V1 da 4 μL. Por lo tanto, el protocolo requiere añadir 4 μL del stock DOX de 1 mM a los 496 μL restantes de medio de cultivo por pozo, y luego mezclar a fondo para asegurar una distribución homogénea.
    5. Incubar la placa en una incubadora a 37°C con un 5% de CO₂ durante 2 horas.
  2. Disociación de las BCO
    1. Aspira y descarta el medio de cultivo BCO de la placa de 24 pozos.
    2. Añade 500 μL de solución de disociación organoide a cada pozo.
    3. Pipetear hacia arriba y hacia abajo repetidamente para alterar completamente la matriz de membrana basal y las estructuras organoides.
    4. Incuba la placa a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 10 minutos.
    5. Transfiere 500 μL de la suspensión resultante de cada pozo a un tubo centrífuga de 15 mL.
    6. Centrifuga la suspensión a 350 × g durante 3 minutos a 4 °C.
    7. Aspira y desecha el sobrenadante.
    8. Añadir 1 mL de medio de cultivo completo al tubo de centrífuga de 15 mL para resuspender la pastilla de celda y posteriormente transferir la suspensión resultante a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
    9. Centrifuga la suspensión a 350 × g durante 3 minutos a 4 °C.
    10. Aspira y desecha el sobrenadante.
      NOTA: Tras la centrifugación, el pellet organoide permanece en el tubo de la centrifugadora.
  3. Resuspensión de celdas e incrustación de agarosa
    1. Precalienta el bloque calefactor metálico a 95 °C.
    2. Coloca 1 mL de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) en un bloque calefactor metálico e incuba durante 10 minutos para asegurar la fusión completa.
    3. Pipetear 100 μL de agarosa fundida al 0,5% de bajo punto de fusión en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL que contiene BCOs.
    4. Transfiere inmediatamente las muestras a un baño maria a 37 °C y déjalas equilibrarse durante 10 minutos.
    5. Mezcle bien y de inmediato pipetee 50 μL de la suspensión de celda de agarosa sobre una lámina de microscopio.
  4. Lisis celular y desenrollamiento del ADN
    1. Sumerge las láminas en solución de lisis fría e incuba a 4 °C en la oscuridad durante 12 horas.
    2. Retira las láminas de la solución de lisis y sumérgelas inmediatamente en una solución alcalina de desenrollamiento.
      NOTA: Para preparar la solución alcalina de desenrollado, disuelva 0,6 g de NaOH en 4,975 mL de agua ultrapura y luego añade 250 μL de 200 mM de EDTA. Para preparar el tampón de electroforesis alcalina, disuelva 12 g de NaOH en 995 mL de agua ultrapura y luego añade 5 mL de 200 mM de EDTA.
      PRECAUCIÓN: El NaOH en el tampón de ensayo del cometa es una base fuerte altamente corrosiva capaz de causar quemaduras cutáneas y oculares graves. Durante la preparación de la solución, añade los pellets sólidos de NaOH al agua de forma lenta, incremental y bajo una agitación magnética continua. Nunca viertas agua directamente sobre los pellets secos, ya que la reacción exotérmica violenta puede hacer que el líquido cáustico hierva y salpique. Además, aplicar toda la pólvora seca pesada exclusivamente dentro de una campana extractora química para evitar la inhalación de polvo corrosivo.
    3. Sumerge las láminas en solución lisis-lisis e incuba a 4 °C en la oscuridad durante 1 hora.
  5. Electroforesis
    1. Transfiere las láminas de la solución alcalina de desenrollamiento a la cámara de electroforesis.
    2. Añade 1 L de tampón de electroforesis alcalina en el tanque de electroforesis para asegurar la inmersión completa de las láminas.
    3. Realizar electroforesis a 25 V y 300 mA durante 30 minutos.
  6. Lavado y fijación de la varandilla
    1. Sumerge las láminas en 5 mL de etanol al 70% y incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente.
      NOTA: El etanol presenta un grave riesgo de inflamabilidad. Al realizar preparaciones de gran volumen o deshidratación de tejidos, mantener una ventilación robusta en el entorno experimental. Aíslen estrictamente el área operativa de todas las fuentes de ignición, incluidas llamas abiertas (como los quemeros de alcohol) y chispas electrostáticas. Después de su uso, sella inmediatamente los contenedores de reactivos y guarda los recipientes en un armario de almacenamiento inflamable dedicado a prueba de explosiones.
    2. Coloca las láminas en una incubadora a 37 °C y déjalas secar durante 15 minutos.
  7. Tinción e imagen del ADN
    1. Añade 1 μL de tinción fluorescente de ácido nucleico a 10 mL de agua ultrapura.
      PRECAUCIÓN: Trata estos agentes intercalantes de ácidos nucleicos como posibles mutágenos y manténtalos con estrictas precauciones. Para evitar la contaminación cruzada en los espacios de trabajo rutinarios, establezca una 'zona de tinción de ácidos nucleicos' equipada con pipetas dedicadas. Si suplementas la agarosa fundida con colorantes, deja que el gel se enfríe hasta aproximadamente 60 °C antes de añadirlo para evitar la inhalación de vapores peligrosos y cargados de colorantes. Por último, descarta todas las soluciones de tinción gastadas y geles de residuos estrictamente en recipientes designados para riesgos de ácido nucleico.
    2. Sumerge las láminas en la solución teñidora preparada en el paso 2.7.1 e incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
    3. Realiza un lavado de 5 minutos con 5 mL de agua ultrapura.
    4. Seca las láminas al aire durante 15 minutos en una incubadora a 37 °C.
    5. Visualiza las estructuras de cometas usando un microscopio de fluorescencia con un filtro de excitación verde y detecta fluorescencia roja.

3. Procesamiento de datos

  1. Realizar análisis cuantitativos automatizados de imágenes de ensayos de cometas utilizando el plugin OpenComet en Fiyi (distribución oficial) para obtener parámetros relacionados con el daño al ADN.
    NOTA: En cuanto al análisis estadístico, este trabajo incluyó estrictamente solo cometas de alta resolución, claramente fotografiados, que presentan morfología intacta y sin solapamientos. Por el contrario, el protocolo de cribado excluía cometas 'erizo' o 'fantasma' (que presentan una cabeza disminuida y una cola extensa, indicando apoptosis o necrosis severa), así como imágenes con bordes borrosos, agrupamiento celular o artefactos de fondo.
    1. Abre el software de Fiji (Figura suplementaria 1A).
    2. Haz clic en Plugins en la barra de menú (Figura suplementaria 1A).
    3. Seleccione OpenComet (Figura suplementaria 1B).
    4. Haz clic en Explorar en Archivos de entrada y selecciona las imágenes del ensayo del cometa para su análisis (Figura suplementaria 1C).
    5. Haz clic en Explorar en el directorio de salida y define la carpeta de destino para los archivos de salida (Figura suplementaria 1C).
    6. Haz clic en Ejecutar para iniciar el análisis automatizado (Figura suplementaria 1C). Este paso concluye el flujo de trabajo de procesamiento y análisis de datos.
      NOTA: Para cada grupo experimental, este estudio cuantificó el porcentaje de ADN de cola (%ADN de cola) de una selección aleatoria de al menos 50 células. El análisis estadístico posterior utilizó un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) para comparar las medias de grupo, considerando p < 0,05 estadísticamente significativo.

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Resultados

Establecimiento de las BCOs

Este estudio estableció con éxito organoides de cáncer de mama a partir de muestras primarias de tejido tumoral. En la etapa inicial del cultivo, se observó claramente un gran número de células individuales o pequeños grupos celulares, con células distribuidas de manera relativamente dispersa y sin una organización esférica tridimensional evidente. Algunas células presentaban morfologías redondas o casi redondas, lo...

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Discusión

El ensayo del cometa representa un avance significativo en los métodos de evaluación de genotoxicidad. Debido a su resolución unicelular y a la visualización directa de patrones de daño del ADN basados en la migración electroforética, esta técnica ofrece claras ventajas sobre los ensayos de genotoxicidadconvencionales 15.

Varios pasos críticos durante el procedimiento experimental influyen en la reproducibilidad y la interpretación de l...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por el Proyecto del Centro de Investigación de Ingeniería de la Provincia de Jiangsu de Terapia Molecular con Dianas y Diagnóstico Complementario en Oncología (SGK2202319), el equipo de investigación innovadora de la institución de educación superior de Jiangsu en ciencia y tecnología (2021), el Programa del Centro de Investigación en Tecnología de la Facultad de Ingeniería Profesional de Jiangsu (2023), la Fundación Clave de Ciencias Naturales de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu de China (Subvención nº 24KJA310008). los Programas Clave del Colegio de Salud Vocacional de Suzhou (szwzy202406), el Proyecto del Laboratorio Estatal Clave de Medicina y Protección Radiológica, Universidad de Soochow (Nº GZK1202506), el Programa de Talento en Salud de Dongwu (DWWS2024002, DWWS2025009, DWWS2025013).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
100 μm cell strainerBIOLOGIX15-1100
15 mL centrifuge tubesBIOFILNone15 mL centrifuge tubes
1 mL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808633
200 μL pipette tipsZhejiang Baidi Biotechnology Co., LTDH808214
24-well platesCorning Incorporated3524
50 mL centrifuge tubesBIOFILNone50 mL centrifuge tubes
Breast Cancer Organoid Kit PlusMogenel Biotechnology MA-0807T011LPBCO culture medium
Comet SlideR&D SYSTEMS4250-050-03
Dry-bulb thermostatHangzhou Ruiyi Science and Technology Trading Co., Ltd.DH100-2Heating block
Dulbecco’s Modified Eagle MediumgibcoC11995500BTComplete cell culture medium
EDTATREVIGEN4250-050-04
Electric Constant-Temperature Water BathShanghai Mulang Instrument Manufacturing Co., Ltd.MSY-24Water bath
Electrophoresis apparatusBIO-RAD1645052
Fetal bovine serumEallBio03.U16001DC
Fluorescence microscopeWEIDAIM-300LD4
ForcepsBeyotimeFS019
GelRedBeyotimeD0140
GraphPad Prism 8.0GraphPad SoftwareStatistical analysis software
ImageJNational Institutes of Health, NIH1.54pImage processing software / image
LMA garoseR&D SYSTEMS4250-050-02Low-melting-point agarose 
Low-temperature high-speed centrifugeAnhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTDKDC-40Centrifuge
Lysis SolutionTREVIGEN4250-050-01Lysis solution
MatrigelMogenel Biotechnology82755The basement membrane matrix
NaOHDAMAO1588
OpenComet softwareOpen-source ImageJ plugin, National University of Singapore, Singaporev1.3.1
Organoid Dissociation SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L01L
Penicillin – StreptomycinBeyotimeCO22
Phosphate-buffered saline (1x PBS)Fdbio Science Biotech Co.,LtdFD7032PBS
PipettesRaininPipet-Lite XLS
ScissorsBeyotimeFS001
Tissue Digestion SolutionMogenel BiotechnologyMB-0818L06L/MB-0818L06SOrganoid dissociation solution

Referencias

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