Imagen cuantitativa de células vivas de la forma nuclear y la dinámica de la cromatina durante el desarrollo y el estrés ambiental en la raíz de Arabidopsis thaliana

Summary

Este proceso utiliza microscopía confocal junto con un núcleo marcado fluorescentemente y una línea de marcadores de cromatina en Arabidopsis thaliana para registrar simultáneamente la dinámica del núcleo y la cromatina en raíces de Arabidopsis e investigar cambios en estas dinámicas en respuesta a señales de desarrollo y ambientales.

Abstract

El núcleo es el orgánulo característico de los organismos eucariotas. A diferencia de la visión clásica de los núcleos estáticos, la forma nuclear es dinámica en células vivas. La forma nuclear alterada o deformada es una característica del cáncer en las células animales y del estrés ambiental en las plantas. Las proteínas de envoltura nuclear interactúan con la cromatina para regular la expresión génica. Desafortunadamente, se sabe poco sobre el impacto del estrés abiótico en la forma, el movimiento y la dinámica de la cromatina nuclear. Para abordar este problema, desarrollamos una cadena utilizando microscopía confocal y software de seguimiento de partículas para cuantificar la dinámica nuclear y de la cromatina en raíces de Arabidopsis bajo control y condiciones de estrés abiótico. Este método de imagen confocal utiliza una línea marcadora dual marcada con fluorescencia – proteína de envoltura nuclear y cromatina – para realizar imágenes de células vivas de la raíz en la planta modelo Arabidopsis thaliana bajo condiciones controladas y con estrés salino. Estas películas capturadas se analizan para cuantificar la dinámica nuclear y de la cromatina utilizando el software de procesamiento de imágenes de código abierto Fiji/ImageJ con la ayuda del plugin TrackMate. Para validar este método, imaginamos y cuantificamos el movimiento de cromatina en raíces de control y estresadas por sal, revelando una disminución en la velocidad de cromatina bajo condiciones de estrés salino. Este método permite obtener imágenes cuantitativas de células vivas de la forma nuclear radicular y la dinámica de la cromatina durante el desarrollo de plantas y el estrés ambiental, facilitando así el análisis de cambios en la dinámica nuclear y de la cromatina causados por factores abióticos.

Introduction

La forma nuclear varía entre diferentes tipos celulares y durante el desarrollo^{en las raíces 1,2} de Arabidopsis thaliana^. Por ejemplo, la forma nuclear es esférica en las regiones meristemáticas que se dividen activamente. A diferencia de la región meristemática, los núcleos en la zona de transición radicular y elongación son menos esféricos. Además, los núcleos en células diferenciadas, como los pelos radiculares, atraviesan la base densa del pelo radicular y se transforman activamente en núcleos ^{alargados 3,4,5}. Los cambios dinámicos en la forma y el movimiento nuclear son cruciales para el funcionamiento de la célula ^6,7. Los defectos en la forma nuclear conducen a una discapacidad funcional como la reducción del movimiento^{nuclear 1,3}. En las células de mamíferos, los cambios en la forma celular y del núcleo están directamente correlacionados con cambios en la expresión génica y la síntesis^{de proteínas 8}.

Durante la interfase, el ADN de una célula se organiza como cromatina. El ADN en la cromatina se agrupa alrededor de las histonas, lo que puede estrechar y aflojar el ADN para alterar la expresión. De manera similar, la posición de la cromatina en relación con la envoltura nuclear y la proximidad a la periferia nuclear también son importantes para la expresión^{génica 9}. El estrés ambiental, como el estrés osmótico, altera la forma nuclear y, en consecuencia, modifica la expresión de un conjunto de genes sensibles al tacto en las raíces 10 de A. thaliana. En este contexto, es importante estudiar la forma nuclear y la dinámica de la cromatina mediante imágenes en lapso de tiempo con células vivas. Un aspecto importante de la dinámica nuclear es la velocidad a la que se mueven los núcleos, ya que la posición nuclear dentro de la célula impulsa la expresión génica, y el reposicionamiento nuclear requiere movimiento^{nuclear 11}. La velocidad del movimiento de la cromatina dentro del núcleo es igualmente importante, ya que la posición de los genes dentro del núcleo es fundamental para determinar la expresión^{génica 12}.

Anteriormente, la forma nuclear y la dinámica de la cromatina se imaginaban y cuantificaban por separado; Como resultado, la relación entre la forma nuclear y la dinámica de la cromatina permaneció sin explorar. Al obtener imágenes simultáneas de núcleos y cromatina, se pueden observar sus posiciones entre sí, lo que puede revelar movimientos como la rotación nuclear y el movimiento intra-nuclear de la cromatina que de otro modo serían difíciles o imposibles de demostrar. En este método, presentamos una técnica de imagen de células vivas para visualizar y cuantificar la forma nuclear mediante la proteína interaccionante con dominio WPP (WIP1)¹³ , marcada fluorescentemente y la cromatina mediante la dinámica de la histona centromérica H3 (CENH3)¹⁴ , simultáneamente bajo condiciones de control y estrés salario, con el objetivo de permitir el análisis de cambios en la dinámica nuclear y de la cromatina causados por factores abióticos. Para habilitar este método, hemos generado una línea WIP1-GFP/CENH3-mRFP de A. thaliana. Además, estudiamos la dinámica de la cromatina de forma cuantitativa utilizando el plugin TrackMate del software de código abierto ImageJ/Fiji. Probamos una línea fluorescente dual y técnicas de dinámica de la cromatina presentadas aquí bajo condiciones de tensión salina y descubrimos una alteración en la morfología y dinámica de los focos centróricos debido a las condiciones de tensión. Este método simple y reproducible es ideal para el seguimiento de alto rendimiento de la dinámica nuclear y de la cromatina en raíces de Arabidopsis bajo diversas condiciones de estrés abiótico.

Protocol

1. Crecimiento de plántulas de A. thaliana

1. Preparación de medios de cultivo
   1. Coloca 800 mL de agua pura en un vaso de precipitados de 1 L sobre una placa para remover. Añade una barra de agitación al vaso de precipitados.
   2. Enciende la placa de agitación a 600 rpm.
   3. Añade 10 g de sacarosa al vaso.
   4. Añade 2,16 g de medio de crecimiento Murashige y Skoog (MS) al vaso de precipitados.
   5. Añade 5 mg de agar a cada uno de dos frascos de medio de 1 L.
   6. Etiqueta una botella como "1/2 MS" y la otra como "100 mM NaCl".
   7. Etiqueta ambas tapas de botella con cinta de autoclave.
   8. Añade 5,84 g de NaCl a la botella etiquetada como "100 mM NaCl".
   9. Llena el vaso con 1 litro de agua pura.
   10. Vuelve a colocar el vaso en la placa de agitación y espera hasta que la sacarosa y la esclerosis múltiple se hayan disuelto.
   11. Vierte el contenido del vaso en un cilindro graduado de 1 L.
   12. Vierte 500 mL del contenido del cilindro graduado en cada botella.
   13. Medio de cultivo autoclave y 250 mL de agua pura con un ciclo líquido de 60 minutos a 121 °C.
       NOTA: Al autoclavar medios y agua, asegúrate de que las tapas estén sueltas para evitar posibles explosiones.
   14. Vuelve a atornillar las tapas del medio de crecimiento.
   15. Invierte las botellas del medio de cultivo 7 veces para asegurarte de que el agar esté bien distribuido por todo el cuerpo.
   16. Guarda el medio de cultivo en una nevera a 4 °C hasta que sea necesario, y mételo en el microondas para licuar.
2. Colocación de placas de crecimiento y semillas
   1. En una campana de flujo, utiliza una pistola de pipetas para filtrar 50 mL de medio de crecimiento en cada una de las diez placas (Figura 1A).
   2. Mientras el medio se solidifica, limpia las semillas WIP1-GFP x CENH3-mRFP inundándolas en un tubo de microcentrífuga con 1 mL de etanol al 70% durante 10 minutos (Figura 1B).
      NOTA: Al manipular etanol, asegúrese de que no haya llamas abiertas en las cercanías.
   3. Después de 10 minutos, en la campana de ventilación, retira el etanol y enjuaga las semillas dos veces con 1 mL de agua autoclavada (Figura 1C).
   4. Una vez que el medio se ha firmado, utiliza una pipeta de 1000 μL para colocar las semillas limpias sobre placas de crecimiento en dos filas de 14 semillas por placa (Figura 1D).
   5. Etiqueta las placas con un rotulador permanente y sella con cinta microporosa antes de salir de la campana de flujo (Figura 1E).
3. Plántulas en germinación
   1. Envuelva las placas de cultivo en papel de aluminio y estratifica en frío en una nevera a 4 °C durante un mínimo de 2 días (Figura 1F).
   2. Después de la estratificación en frío, retira los platos de la nevera y déjalos verticalmente bajo luces de crecimiento (~80 μmol/^{m 2}/s) durante un mínimo de 4 días (Figura 1G).
   3. Transfiere la mitad de las placas a un medio de crecimiento NaCl de 100 mM en la campana de flujo, luego sella y etiqueta las placas (Figura 1H).
   4. Placas de cultivo bajo luces de cultivo durante 2 días antes de la imagen (Figura 1I).

2. Imagen de células vivas de núcleos de raíces de A. thaliana y cromatina

1. Preparación de diapositivas
   1. Pipete 60 μL de agua pura sobre una lámina de vidrio (Figura 2A).
   2. Deposita 3 raíces de plántula de A. thaliana de 6 días en el agua (Figura 2B).
   3. Coloca una cubierta deslizante #1.5 de 22 mm × 22 mm sobre las raíces sin cubrir las hojas (Figura 2C).
2. Ajustes del microscopio confocal
   1. Ajusta el tiempo de exposición láser a 1000 ms (1 s).
   2. En el combinador láser, ajusta el láser de 488 nm al 50% para la proteína fluorescente verde (GFP) y el de 561 nm al 50% para la proteína fluorescente roja (RFP) (Figura 2D). Imagen con objetivo del 20× sin zoom óptico. Si grabas durante más de 10 minutos, reduce la intensidad para reducir el fotoblanqueo.
   3. Ajusta el tamaño del paso de la sección Z a 0,3 μm.
   4. Pon el intervalo en 1 minuto y la duración total en 10 minutos.
3. Imagen
   1. Localiza raíces y selecciona hasta 20 z-slices y captura imágenes de 16 bits.
   2. Comienza timelapse.
   3. Ahorra timelapse como archivo TIFF usando compresión sin pérdida.
   4. Mueve los datos a un ordenador para su análisis.

3. Seguimiento y análisis de datos

NOTA: Se necesitará la versión Fiji del software de código abierto ImageJ (se recomienda la versión 1.54), que viene con TrackMate preinstalado.

1. Inicialización
   1. Imagen abierta: J/Fiji.
   2. Haz clic y arrastra un archivo .vsi a la ventana principal de la aplicación ImageJ/Fiji (Figura 3A).
   3. Aparecerá un prompt titulado Opciones de Importación de Bio-Formatos ; haz clic en Ok en la esquina inferior derecha (Figura 3B).
   4. Aparecerá un prompt titulado Opciones de la serie de Bio-Formatos . Asegúrate de que la Serie 1 esté seleccionada y haz clic en Ok en la esquina inferior izquierda (Figura 3C).
      NOTA: El archivo puede tardar un minuto en cargarse, especialmente si tiene muchas capas Z o puntos de tiempo.
   5. Una vez que la imagen se ha abierto (Figura 3D), divide las señales navegando por la ventana principal de ImageJ hasta Imagen > color > canales divididos (Figura 3E). Esto creará dos ventanas separadas, una para núcleos etiquetados con GFP y otra para la cromatina marcada con RFP (Figura 3F).
2. Preprocesamiento de cromatina
   1. Determina cuál de las dos ventanas corresponde a la cromatina.
   2. Haz clic en la ventana de cromatina (Figura 3F) y aplica la operación del proyecto Z navegando por la ventana principal de ImageJ para > pilas de imágenes > proyecto Z (Figura 4A).
   3. Cambia el tipo de proyección a Intensidad Máxima y asegúrate de que Todos los Marcos de Tiempo esté activo, luego haz clic en Aceptar (Figura 4B).
   4. Abre el menú de contraste pulsando Ctrl+Shift+C o navegando por la ventana principal de ImageJ para la imagen > ajustar > Brillo/Contraste (Figura 4C).
   5. Deslica la segunda barra (etiquetada como Máximo) hacia la izquierda hasta que la cromatina sea fácilmente visible (Figura 4D).
3. Cromatina de seguimiento
   1. Navega a plugins (Figura 5A).
   2. Haz clic en la flecha hacia abajo en el menú de plugins para desplazarte hasta la opción de seguimiento (Figura 5A).
   3. Haz clic en rastrear y luego en TrackMate.
   4. Aparecerán los ajustes iniciales. Confirma que los ajustes de calibración son precisos y luego haz clic en Siguiente (Figura 5B).
   5. Seleccione Detector de umbral y haga clic en Siguiente (Figura 5C).
   6. En la ventana de imagen, pasa al último fotograma del timelapse (Figura 5D).
   7. Junto al umbral de intensidad, haz clic en Auto y luego en Vista previa.
   8. Ajusta el umbral de intensidad y haz clic en Vista previa. Ajusta y previsualiza repetidamente el umbral hasta que la vista previa incluya toda la cromatina y el ruido mínimo, luego haz clic en Siguiente (Figura 5D).
   9. Se realizará la detección inicial de umbral; haz clic en Siguiente (Figura 5E).
   10. Ajusta manualmente el umbral hasta que solo sea visible la cromatina, luego haz clic en Siguiente (Figura 5F).
   11. Esta página permite filtrar los puntos. Ignora esto y haz clic en Siguiente (Figura 6A).
   12. Selecciona Simple LAP tracker y haz clic en Siguiente (Figura 6B). El rastreador LAP es aplicable cuando los objetos rastreados no se fusionan ni se dividen.
   13. Ajusta la distancia máxima de enlace a 5 micras, la distancia máxima de cierre de huecos a 15 micras y la distancia máxima de cierre de distancias a 1. Haz clic en Siguiente (Figura 6C).
   14. Se realizará un seguimiento. Las pistas aparecerán en la ventana original de la imagen. Haz clic en Siguiente (Figura 6D).
   15. Esta página permite filtrar pistas. Pulsa el botón verde + en la esquina inferior izquierda para crear un filtro, luego elige el número de puntos en modo pista y pulsa Auto (Figura 6E).
   16. Asegúrate de que el modo esté configurado en Arriba. Esto eliminará las manchas que aparecen y desaparecen rápidamente.
   17. Haz clic en Siguiente (Figura 6E).
   18. La página de opciones de visualización permite exportar datos como archivo csv. Al final de la página, haz clic en el botón Tracks y luego exporta a CSV (Figura 7A).
   19. Esta página permite la trazación integrada; ignóralo y haz clic en Siguiente.
   20. En la última página, guarda el vídeo usando la superposición de Captura y pulsa ejecutar. Haz clic en él y luego navega al archivo > guarda como > GIF (Figura 7B).
4. Análisis básico de velocidad
   1. Abre el CSV de las pistas en un software de hoja de cálculo.
   2. Elimina todas las columnas excepto TRACK_ID, POSITION_X, POSITION_Y, POSITION_T, FRAME y RADIUS.
   3. Los espacios en cada pista estarán desordenados. Para ordenarlas, primero congela las cuatro filas superiores y luego crea una nueva columna titulada TRACK_FRAME y copia y pega esta fórmula en la columna: =concatenate(A4, "_", if(E4>9, E4, concatenate("0", E4))).
   4. Selecciona la columna TRACK_FRAME , haz clic derecho en ella y luego haz clic en Ordenar hoja A–Z. Los espacios dentro de cada pista deberían estar ahora en orden.
   5. Para confirmar que no faltan puntos en el centro de ninguna pista, crea una nueva columna y usa esta fórmula: =if(E4>E3, E4-E3, "NA"). Asegúrate de que el primer lugar de cada pista devuelva "NA" y el resto 1.
   6. Crea una columna para Velocidad (micras/fotograma) y pega la siguiente fórmula en ella: =if(H4="NA", "NA", sqrt((B4-B3)^2 + (C4-C3)^2)). Esto usará el teorema de Pitágoras para calcular la distancia entre dos puntos.
   7. Para traducir esto a Velocidad (micras/segundo), crea una nueva columna y pega la siguiente fórmula en ella: =IF(I5="NA", "NA", I5/(D5/E5)). Esto encontrará los segundos/fotograma y traducirá micras/fotograma en consecuencia.

Results

Imagen de células vivas de la envolvente nuclear y dinámica de la cromatina
Generamos una línea dual de marcadores fluorescentes, que incluye la proteína del envolvente nuclear externo WIP1-GFP y la cromatina centromérica CENH3-mRFP (Figura 8). Las plántulas de 4 días se transfirieron a placas de control o a placas que contenían NaCl de 100 mM durante 2 días. Tras 2 días de incubación, se observa una clara inhibición del crecimiento radic...

Discussion

El método presentado aquí es ideal para seguir la dinámica de la cromatina. En comparación con métodos anteriores de imagen de células vivas con imágenes separadas, la imagen simultánea de núcleos y cromatina permite explorar la relación entre la dinámica nuclear y la de la cromatina. Esto puede revelar movimientos como la rotación nuclear y el movimiento intra-nuclear de la cromatina que de otro modo serían difíciles de mostrar.

Como método de imagen de célul...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
½ Medios Murashige y Skoog (MS)	bioWorld	30630058
Cintas microporosas 3M	Amazon	A-1530-0
Software de adquisición	Olimpo/Evidente	CellSens
Agar	bioWorld	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
Cubierta	Genesee	29-116
Corredera de vidrio	Genesee	29-101
Imagen/Fiyi	Código abierto	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Microscopio	Olimpo/Evidente	IX83
Cloruro de sodio	Fisher Scientific	BP358-212
Disco giratorio	Yokogawa	CSU-W1
Placas de Petri cuadradas	Simport	26-275
Sacarosa	bioWorld	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987