Artículo de método

Consumo Intermitente Automatizado de Alcohol en Ratones Socialmente Alojados mediante el Sistema de Pruebas de Intellicage

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DOI:

10.3791/71345

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5 de junio de 2026

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1Section on Neurobiology of Compulsive Behaviors, National Institute on Mental Health, Intramural Research Program, National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta métodos para una evaluación automatizada y de alto rendimiento de los comportamientos de consumo de alcohol en ratones con viviendas sociales, realizada mediante el sistema de pruebas IntelliCage. Se proporciona una metodología detallada para un paradigma operante e intermitente de consumo de alcohol, junto con los archivos experimentales y el código para analizar los datos resultantes.

Resumen

A pesar de las conocidas confundencias del aislamiento social en el comportamiento de los roedores, muchos investigadores dependen de ratones que alojan individualmente para evaluar la preferencia por alcohol en modelos preclínicos de trastorno por consumo de alcohol (AUD). Este protocolo describe una tarea social de consumo de alcohol que permite una evaluación automatizada y de alto rendimiento de los comportamientos de consumo de alcohol en ratones, sin los efectos confusos del estrés inducido por el aislamiento social. El sistema de pruebas IntelliCage permite a los investigadores evaluar simultáneamente el comportamiento operante de consumo de alcohol en hasta 16 ratones del mismo sexo, cada uno identificado de forma única con un transpondedor de identificación por radiofrecuencia (RFID) implantado subcutáneamente. El acceso a las botellas de beber está controlado por software y puede ajustarse individualmente para cada ratón. En este paradigma crónico e intermitente de consumo de alcohol, los ratones interactúan voluntariamente con seposokes operantes para acceder a botellas con un 20% de alcohol durante seis semanas consecutivas. Las botellas de alcohol solo están disponibles día sí un día no durante 24 horas y pueden adulterarse opcionalmente con quinina para evaluar el consumo insensible al castigo. Las visitas a cada esquina operante, narices y datos de lick se registran automáticamente para cada ratón. Métodos experimentales detallados y el código abierto para analizar los datos grabados permitirán a los investigadores evaluar los comportamientos de consumo de alcohol relevantes para la AUD de manera cada vez más eficiente y etológicamente relevante.

Introducción

Los estudios en modelos preclínicos son fundamentales para desarrollar una comprensión más profunda de los mecanismos neurobiológicos que subyacen a los comportamientos similares al trastorno por consumo de alcohol (TA). Sin embargo, muchas medidas tradicionales de consumo de alcohol en roedores, como las pruebas de elección de dos botellas 1,2 y las pruebas de beber aoscuridad 3,4,5, requieren medir manualmente los volúmenes líquidos entre roedores alojados individualmente, un método de bajo rendimiento y propenso a errores. La reciente adopción de sistemas lickómetros de código abierto que utilizan tecnologíacapacitiva 6,7,8,9,10 o fotoeléctrica 11,12 para automatizar el recuento de lamedos representa un avance significativo en el rendimiento, precisión y sensibilidad técnica de la metodología de consumo de alcohol. Sin embargo, la mayoría de los sistemas de lickómetros de jaulas domésticas aún requieren que los roedores estén en una sola vivienda, lo que induce un estrés de aislamiento13,14. Aunque los hallazgos reportados varíanmucho 15,16, los roedores generalmente tienen una mayor preferencia por el alcohol cuando se alojan individualmente 17,18,19,20. Sin embargo, los efectos del aislamiento social en el consumo de alcohol varían según la edad del animal, el sexo, el entorno de vivienda y la exposición previa alestrés 20,21,22. El aislamiento social tiene el potencial de interactuar significativamente con manipulaciones experimentales para limitar la validez de resultados conductuales evaluados similares a los de la AUD.

Nuevos sistemas totalmente automatizados de monitorización de jaulas domésticas, como el sistema de pruebas IntelliCage (TSE Systems23, 24, 25) o alternativas de código abierto, LIQ PARTI20 y FARESHARE26, resuelven este problema combinando la lickometría con el seguimiento de identificación por radiofrecuencia (RFID) de múltiples animales alojados en grupo. Estos sistemas de monitorización en jaulas caseras permiten una cuantificación más eficiente y reproducible de los comportamientos de consumo de alcohol, sin las confundencias del estrés inducido por el aislamiento social. Por ello, son ideales para estudios confirmatorios de alto rendimiento sobre manipulaciones experimentales que afectan la vulnerabilidad a comportamientos similares a los de la AUD. Entre ellos, el sistema de pruebas IntelliCage es único al incorporar esquinas operantes programables para acceder a botellas de portón de entrada, permitiendo a los investigadores evaluar comportamientos de búsqueda en ausencia de acceso a fármacos, modular las proporciones operantes para animales individuales y más.

Aquí, los autores presentan un paradigma operante de consumo intermitente de alcohol ejecutado mediante el sistema de pruebas IntelliCage entre ratones con alojamientosocial 27,28. Este paradigma permite la evaluación automatizada a largo plazo del consumo de alcohol en hasta 16 ratones del mismo sexo, cada uno identificado de forma única por transpondedores RFID implantados subcutáneamente. Como se describe a continuación, se entrena a los ratones para que operan con una relación fija (FR)-3 para acceder a botellas sipper. Tras un breve periodo de formación, las botellas de beber en dos de las cuatro esquinas operantes se sustituyen por alcohol al 20% (95% etanol [190 grados] en el agua del grifo, v/v). Los ratones tienen acceso continuo al agua, pero acceso intermitente al alcohol día sí sí durante períodos de 24 horas (de 12:30 a 12:30 PM). Las lamidas con alcohol se cuantifican a lo largo de seis semanas, con una prueba de adulteración de quinina de dos días (0,5 mM, 1,0 mM) a mitad del experimento para evaluar el consumo de alcohol insensible al castigo. Los datos de visita, nosepoke y lick se registran para cada ratón (Figura 1), se extraen usando el software propietario de TSE y posteriormente se analizan usando la pipelinede código abierto 29 para obtener información sobre comportamientos similares a los de AUD.

Este protocolo complementa otros usos publicados del sistema de pruebas IntelliCage para evaluar comportamientos similares a losAUD 30,31,32,33,34,35,36,37,38,39, así como otros comportamientos similares a trastornos por consumo de sustancias 40,41,42 . En consonancia con los informes que sugieren que los programas de acceso intermitente aumentan el consumo voluntario de alcohol enroedores 1,43,44,45,46,47, este protocolo detecta altos niveles de consumo voluntario de alcohol en la mayoría de los ratones. No obstante, como señalan los autores a lo largo del protocolo, los parámetros experimentales pueden modificarse fácilmente para abordar cuestiones experimentales. En conjunto, esta metodología ofrece una solución eficiente y flexible para que los investigadores estudien los mecanismos subyacentes a la AUD.

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Figura 1: Seguimiento totalmente automatizado de visitas de ratones, sepoques y licks mediante identificación RFID única. (A) Diagrama de dibujos animados de la implantación de transpondedor RFID en ratón. Los transpondedores RFID se implantan subcutáneamente en la región dorsocervical para permitir el seguimiento individual en un sistema automatizado de monitorización de jaulas. (B) Esquema de las fases de recogida de datos durante el paradigma automatizado y operante del alcohol intermitente. Se lee la identidad animal y se registra una visita a la esquina mediante una antena de anillo RFID doble y lecturas de sensores de temperatura, ambas deben ser positivas para que se registre la visita (izquierda). Después, se entrena a los ratones para que se muevan con el nariz siguiendo un horario FR-3 para acceder a los biberones (en el centro). Un noepoking exitoso da acceso a 5 s de botella sipper, momento en el que se registran los lickómetros de capacidad (derecha) mediante un lickómetro basado en capacitancia. Dibujos animados realizados a partir de plantillas modificadas de BioRender por Lucy Anderson, bajo licencia CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) de los NIH y cumplieron con la política del Servicio de Salud Pública sobre el cuidado y uso humanitario de animales de laboratorio.

1. Preparación del aparato

NOTA: Cada aparato del sistema de prueba IntelliCage consiste en una gran jaula doméstica de plástico (39 cm x 58 cm x 21 cm) dentro de la cual pueden residir hasta 16 ratones del mismo sexo. Las cohortes anteriores variaban en tamaño entre 8 y 16 ratones/jaula. El aparato está equipado con cuatro esquinas operantes, todas conectadas a un microprocesador central en la tapa superior. El comedor de roedores es accesible desde una gran tolva metálica situada en el centro de la tapa. Dentro de la jaula, los ratones deambulan libremente entre esquinas operantes y un espacio central de vivienda, equipado con cama y materiales de enriquecimiento. Cada esquina operante tiene una pequeña entrada circular que solo permite físicamente la entrada de un ratón a la vez. La identidad del ratón se lee y registra en función de las lecturas duales de la antena en anillo RFID y del sensor de temperatura, ambas deben ser positivas para que se registre una visita. En cada esquina operante, los ratones disponen de dos puertos de nariz, cada uno de los cuales controla el acceso a una de las dos puertas motorizadas. Estas puertas programables y motorizadas permiten acceder a una de dos botellas de bebida. Los investigadores programan manualmente las condiciones para el acceso a las botellas de bebida, así como la sensibilidad de los lickómetros basados en capacitancia. Los datos de visita, nariz y lick se registran individualmente para cada ratón y se transponen mediante un microprocesador central a un ordenador en el que se carga el sistema de software propietario de TSE. Aunque no se discutirá en este protocolo, cada cámara operante también contiene una válvula de aire programable para su uso en el acondicionamiento aversivo.

  1. Equipar la jaula de plástico con cinco almohadillas de fibra de algodón comprimido (15,24 x 25,4 cm), dos pequeños cuadrados de algodón (5,08 x 5,08 cm) y cuatro estructuras de excavación de plástico para la cama y el enriquecimiento.
    NOTA: Se recomienda el uso de almohadillas de fibra de algodón comprimida por dos razones: (1) para evitar que el polvo o escamas de materiales de cama comúnmente usados interfieran con la mecánica de las puertas, y (2) para facilitar la identificación de las peleas entre animales.
  2. Coloca la tapa superior con esquinas operantes dentro de la jaula de plástico para la casa.
  3. Si se desconecta, conecta todas las esquinas operantes al microprocesador central usando los cables proporcionados y luego conecta el microprocesador central a un ordenador precargado con software TSE usando cables CAN.
    1. Si usas varios aparatos, conecta todas las jaulas al mismo ordenador de forma serial.
  4. Conecta el microprocesador a la fuente de alimentación y asegúrate de que las luces LED de cada esquina se enciendan y que las ocho puertas motorizadas se muevan.
  5. Llena ocho botellas de bebo con ~250 mL cada una de agua del grifo (u otro líquido), presiona firmemente los tapones para asegurar un sellado adecuado y luego gira suavemente en las aberturas del lickómetro, asegurando una conexión bien cerrada al lickómetro.
    NOTA: La sensibilidad de los sensores de visita, nariz y lamido puede optimizarse opcionalmente mediante un experimento piloto. Para ajustar la sensibilidad de cada esquina, sigue las instrucciones del fabricante descritas en el archivo "Ayuda" del programa "Controlador". Todos los estudios han utilizado los siguientes ajustes: visita- 816 ON/768 OFF; nosepoke- 21 EN ACTIVACIÓN/26 FUERA; Lickómetro - 69 ENCENDIDO/80 FUERA/15 TIEMPO MUERTO.
  6. Llena el depósito de comida con comida para roedores.
  7. Enciende el ordenador, abre la aplicación "Controlador" y carga el archivo del experimento deseado.

2. Preparación de animales

NOTA: Los animales deben ser implantados con transpondedores RFID al menos una semana antes del inicio de las pruebas de comportamiento para permitir un tiempo suficiente de recuperación. Utiliza ratones envejecidos al menos ~50 días, con un peso corporal superior a 15 g. Implantar ratones más pequeños aumenta el riesgo de lesionar al ratón durante la inyección. Dependiendo de la línea de ratones, la agresividad puede convertirse en un problema en condiciones de alojamiento en grupo, especialmente entre machos. Mitigar este riesgo alojando a todos los ratones juntos durante la adolescencia. Los autores no observaron agresividad significativa en estudios con ratones adultos (~PND 80–150) tipo salvaje C57BL/6, pero esto no garantiza la generalización de este protocolo a otros genotipos, edades o disposiciones de alojamiento.

  1. Implantar subcutáneamente ratones con transpondedores RFID en la región dorsocervical para una identificación única.
    1. Imprime una tabla de datos con todos los animales experimentales con un espacio junto a cada identificación para colocar una pegatina de código de barras que indique su código RFID.
    2. Recoge todos los animales y suministros necesarios: transpondedores RFID, inyector transpondedor RFID recargable y sistema de inducción con isoflurano.
    3. Colocar al primer ratón en la cámara de inducción y anestesiarlo mediante isoflurano vaporizado (caudalímetro de oxígeno: 1,5 mL/min, isoflurano: 1,5–3,5%) hasta que el ratón esté tomando grandes respiraciones entrecortadas y no responda a un pellizco en el dedo del pie.
      1. Mientras esperas a que el ratón se anestesie, carga el transpondedor RFID en el inyector atornillando la aguja precargada en la base del inyector y luego expulsa lentamente la jeringuilla hasta que se vea mover el microchip.
      2. Aplica el código de barras que identifica el código RFID en la tabla de datos impresa junto al identificador del animal correspondiente.
    4. Retirar al ratón de la cámara de inducción e implantar el transpondedor RFID precargado de forma subcutánea en la región dorsocervical.
      1. Después de verificar primero que el ratón no responde a un pellizco en el dedo del pie, usa el pulgar y el índice de la mano no dominante para pellizcar la nuca del ratón justo encima de los omóplatos.
      2. Con la mano dominante, introduce la aguja inyectora de forma subcutánea en la parte posterior de la nuca del ratón, asegurándote de mantener la aguja levantada por encima y paralela a la columna vertebral para evitar lesionar al ratón.
      3. Con la punta de la jeringuilla dentro de la nuca del ratón y firmemente estabilizada entre el pulgar y el índice, mueve cuidadosamente la mano dominante para que la persona pueda presionar el émbolo del inyector.
      4. Expulsa el transpondedor RFID, manteniendo los dedos de la mano no dominante pellizcados alrededor de la nuca para que se note una vez que el microchip ha salido de la punta de la jeringuilla.
      5. Mientras mantienes la nuca pellizcada, retira el inyector poco a poco. Solo suelta la barba cuando el inyector haya sido completamente retirado para evitar que el transpondedor se salga.
        NOTA: Opcionalmente, se puede añadir un único nudo de sutura para cerrar la piel mientras el ratón está bajo anestesia.
    5. Devuelve al ratón a su jaula y supervisa la recuperación de la anestesia hasta que esté completamente deambulado.
    6. Vigila al ratón en busca de signos de deterioro físico, incluyendo parálisis parcial, cojera o círculos, que puedan indicar una inyección fuera del objetivo. Si las discapacidades persisten durante más de 24 horas o afectan gravemente al bienestar animal, hay que sacrificar de forma humana.
      1. Apunta el lector de transpondedor RFID por encima de la región dorsocervical del ratón y escanea para confirmar la colocación correcta.
    7. Opcionalmente, toma una muestra de tejido para genotipado.
      1. Repite con todos los ratones experimentales.
  2. Un día después de la implantación inicial del transpondedor RFID, utiliza el lector de transpondedores RFID para verificar que ningún ratón ha perdido sus transpondedores RFID. Si algún ratón ha perdido sus transpondedores, repite el procedimiento con un transpondedor nuevo y actualiza los registros en consecuencia.
    NOTA: Normalmente, si un ratón va a perder su transpondedor RFID, ocurrirá en menos de 24 horas desde la implantación. Esto puede ocurrir debido a una colocación incorrecta del transpondedor RFID y/o a un aseo o arañazos del ratón en el lugar de inyección. Evita reinyectar en heridas de inyección anteriores y excluye ratones tras tres implantaciones fallidas de transpondedor RFID.
  3. Antes de volver a colocar los ratones en el aparato IntelliCage, verifica que todos los transpondedores RFID puedan leerse correctamente. Pesa y registra el peso corporal de todos los ratones.

3. Preparación de archivos experimentales

NOTA: El sistema de pruebas IntelliCage se controla y opera mediante interfaces gráficas de usuario proporcionadas por TSE. Hay tres aplicaciones utilizadas para ejecutar experimentos de IntelliCage: "Diseñador", "Controlador" y "Analizador". Las diferentes fases del experimento se ejecutan mediante distintos archivos experimentales, que se diseñan en la aplicación "Designer" y luego se ejecutan en la aplicación "Controlador". Información detallada sobre cómo diseñar y adaptar archivos experimentales ya se ha descritoanteriormente 48,49. Se han proporcionado plantillas de los cuatro archivos experimentales utilizados en el estudio (Habituation.experiment, Water Training.experiment, Intermitent Alcohol.experiment, Open Bar.experiment) para facilitar la replicación del protocolo. En estos archivos, los cambios de fase ocurren a las 12:30 PM. Los autores eligieron este horario porque los animales se alojaban en un ciclo de luz de 6:00 a 6:00 PM. Esto permitió una fase oscura ininterrumpida para medir los hábitos de bebida. Sin embargo, los investigadores podrían querer cambiar este horario para que sea coherente con otras metodologías de consumo de alcohol, como los procedimientos de "beber aoscuras" 50.

  1. Configura los archivos de experimento en la aplicación "Designer".
    NOTA: Si trabajas con los archivos plantilla, elimina los cuatro animales de ejemplo antes de entrar en la cohorte actual. Además, cambia el nombre de los grupos al diseño experimental y añade grupos según sea necesario. Asegúrate de que los nuevos grupos empiecen todos con el mismo clúster que los de la plantilla.
    1. Abre el archivo Habituation.experiment en la aplicación "Designer" e introduce cuidadosamente el ID del animal, el código del transpondedor RFID y el grupo/genotipo experimental de cada ratón. Guarda el archivo con un nuevo nombre para mantener el archivo plantilla.
      NOTA: Si los códigos de transpondedor RFID se escriben mal, los datos no se registrarán. Asignar animales a grupos experimentales relevantes ayudará a monitorizar su comportamiento y, en última instancia, a analizar los datos.
    2. Exporta la información animal como un archivo de animales.
    3. Para cada fase del experimento, abre el archivo correspondiente y carga el archivo de animales. Guarda y cambia el nombre adecuadamente.
    4. Si diseñas archivos en un ordenador aparte, descarga los archivos de experimentos en una memoria USB portátil para transportarlos a la sala de comportamiento.
  2. Descarga todos los archivos experimentales en el ordenador conectado al(los) aparato(s) IntelliCage y abre el primer archivo en la aplicación "Controlador". Verifica que toda la información cargue correctamente.
  3. Ya sea en papel o electrónicamente, crea un archivo de registro experimental en el que se anoten la fecha y hora en que se pueden iniciar/detener diferentes fases del experimento. Esto ayudará mucho en el análisis, ya que ciertas condiciones de drogas (por ejemplo, alcohol adulterado con quinina) no están registradas en los archivos de archivo de IntelliCage.

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Figura 2: Cronología experimental para el paradigma operante e intermitente de consumo de alcohol. (A) Esquema del aparato IntelliCage con botellas de beber que contienen alcohol en dos de las cuatro esquinas. (B) Cronología experimental que muestra el calendario de todas las fases experimentales, tal como se usó en la publicaciónanterior 23. La cohorte 1 realizó una prueba de alcohol adulterado con quinina tras concluir el consumo intermitente de alcohol, mientras que las cohortes 2 y 3 volvieron a consumir alcohol intermitente tras la adulteración. (C) Calendario experimental detallado que muestra los cambios de software para todas las fases experimentales: habituación, entrenamiento con agua, consumo intermitente de alcohol, prueba de alcohol adulterado con quinina y consumo de alcohol "barra libre"/acceso libre. Los cambios de jaula se programan al menos una vez a la semana tras completar un módulo "Acceso al alcohol ACTIVADO". Dibujos animados realizados a partir de plantillas modificadas de BioRender por Lucy Anderson, bajo licencia CC BY 4.0 (https://BioRender.com/ko79xuy). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Llevar a cabo el experimento

NOTA: El paradigma operante e intermitente del consumo de alcohol consta de cinco fases: (1) habituación, (2) entrenamiento con agua, (3) consumo intermitente de alcohol, (4) prueba de alcohol adulterado con quinina y (5) consumo de alcohol "barra libre"/acceso libre. Cada fase del experimento se realiza en diferentes archivos experimentales, excepto para el consumo intermitente de alcohol y la prueba de alcohol adulterado con quinina, que utilizan los parámetros especificados en el archivo Intermitent Alcohol.experiment . Fuera de los cambios de jaula, los experimentadores deberían revisar los ratones al menos tres veces por semana para evaluar el bienestar animal y asegurarse de que el software funciona correctamente. Cualquier ratón que se encuentre herido o enfermo debe ser retirado del experimento. Para un ejemplo de calendario experimental, véase la Figura 2.

  1. Cambios en la jaula
    NOTA: Realiza cambios de jaula al menos una vez por semana. Durante el consumo de alcohol, realiza estos cambios solo después de las 12:30 PM durante el "Acceso SOLO al agua" para evitar interrumpir el consumo de alcohol. Para facilitar esto, los archivos Intermitent Alcohol.experiment y Open Bar.experiment siempre comenzarán con "Solo acceso al agua". Debido al tamaño de las jaulas, es difícil manejar las jaulas ocupadas solo. Los autores recomiendan que al menos un investigador adicional ayude con los cambios de jaula. Revisa los ratones 24 horas después de cada cambio de jaula para asegurarte de que el software funciona correctamente y que no ha habido agresividad ni peleas debido al estrés del cambio.
    1. Antes de empezar a cambiar la jaula, prepara una jaula de plástico nueva y limpia con ropa de cama y materiales para el anidamiento. Llena cada una de las ocho botellas/jaula con ~250 mL de agua del grifo o un 20% de alcohol (95% etanol [190 proof] en agua del grifo, v/v).
      NOTA: Opcionalmente, los investigadores pueden añadir una pequeña cantidad del material de cama antiguo a la jaula nueva y limpia. Esto minimiza la interrupción de las jerarquías grupales establecidas y puede reducir el riesgo de enfrentamientos.
    2. Deja de experimentar con la aplicación "Controlador". Después de asegurarte de que no hay ratones en las esquinas operantes, retira la tolva metálica de comida. Haz que una persona levante el microprocesador metálico lo suficientemente alto para que la segunda pueda deslizar la jaula de plástico desde debajo. Verifica el número correcto de ratones.
    3. Saca a los ratones uno a uno de la jaula sucia, escanea el transpondedor RFID y registra el peso corporal. Examina visualmente a cada ratón en busca de signos de lesión o enfermedad.
      NOTA: Los autores recomiendan registrar el peso corporal en una hoja de cálculo electrónica (csv) para que pueda ser fácilmente leído en la cadena de análisis.
    4. Coloca temporalmente los ratones en un recipiente limpio después de registrar el peso corporal.
    5. Limpia la parte superior y las esquinas con una toalla húmeda empapada en desinfectante. Ten especial cuidado de limpiar la superficie y la cresta inferior de la placa de la esquina, sin que ningún líquido se filtre sobre las piezas electrónicas.
    6. Levanta el microprocesador metálico lo suficientemente alto para deslizar la nueva jaula de plástico limpia en su sitio.
    7. Gira suavemente las botellas nuevas dentro de las aberturas del lickómetro, asegurando una conexión bien ajustada al lickómetro.
    8. Transfiere ratones a un aparato nuevo y limpio.
    9. Sustituye la tolva de comida por una nueva y limpia y una comida fresca para roedores.
    10. Reinicia el mismo experimento en la aplicación "Controlador" o carga y inicia un nuevo archivo de experimento.
    11. Asegúrate de que el programa funciona correctamente y de que todos los ratones estén grabados correctamente las visitas, los narices y los licks.
      NOTA: El programa "Controlador" presentará automáticamente advertencias cuando un animal no tenga licks grabados en un periodo de 12 horas.
    12. Limpiar el equipo sucio. Las jaulas de plástico, las botellas de bebo y las estructuras de excavación de plástico generalmente pueden lavarse a través de sistemas típicos de lavado de jaulas.
  2. Día 0: Habituación
    NOTA: La fase de habituación se ejecuta usando el archivo Habituation.experiment . Durante esta fase, todas las botellas de agua del grifo contienen agua. Los ratones tienen acceso libre a todas las botellas sin nariz operante. Las puertas motorizadas se abren cuando los ratones entran en una esquina operante, revelando acceso a las boquillas de las botellas de bebida.
    1. Tras verificar la presencia del transpondedor RFID y registrar el peso corporal del ratón, llena las ocho botellas con ~250 mL de agua del grifo y gira suavemente en las aberturas del lickómetro.
    2. Coloca hasta 16 ratones del mismo sexo en el aparato IntelliCage preparado.
    3. Carga el archivo Habituation.experiment en la aplicación "Controlador" y comienza a grabar.
    4. Verifica que todas las puertas motorizadas se abran correctamente cuando un ratón entra en la esquina operante y que todas las visitas, narices y licks se estén registrando correctamente para cada ratón. Si no se han registrado visitas, narices ni lamidos en un ratón en un periodo de 6 horas, revisa el archivo .animal en busca de errores.
  3. Días 1-3: Entrenamiento en agua
    NOTA: La fase de entrenamiento en agua se realiza utilizando el archivo Water Training.experiment . Todas las botellas de bebo deben seguir conteniendo solo agua del grifo. Esta fase entrenará a los ratones para que se muevan con un FR-1 y posteriormente en un programa FR-3 para acceder a las boquillas de las botellas de aspiración. Tras un buen toque de nariz, las puertas motorizadas se abren para permitir el acceso a la botella de beber durante 5 segundos. Una vez que un ratón alcanza una tasa de éxito del 60% o más, se le pasa a un calendario FR-3 durante el resto de la duración del programa. Normalmente, los ratones pasan a un horario FR-3 en un plazo de 24–72 horas. Monitoriza el rendimiento de los animales en el "Controlador". Si un animal no alcanza un calendario FR-3 en 72 horas, exclúyelo de la experimentación posterior.
    1. Si todos los ratones parecen hidratados y sin lesiones tras 24 horas de habituación, deja de ejecutar el archivo Habitatuation.experiment y comienza a ejecutar el archivo Water Training.experiment .
    2. Verifica que las visitas, los nasores y los licks están siendo registrados correctamente por el software para cada ratón y que todas las puertas motorizadas se abren correctamente.
  4. Día 4+: Consumo intermitente de alcohol
    NOTA: La fase de consumo intermitente de alcohol se realiza utilizando el archivo Intermitent Alcohol.experiment . En esta fase, las botellas de bebo en dos de las cuatro esquinas operantes se sustituyen por alcohol al 20%. Las esquina agua frente a alcohol están predefinidas mediante la función "Clusters" en el archivo experimental. En la plantilla, el agua se administra en las esquinas uno y tres (etiquetadas como "neutras") mientras que el alcohol en las esquinas dos y cuatro (etiquetadas como "incorrectas"). Los ratones tienen acceso continuo al agua, pero acceso intermitente al alcohol durante periodos de 24 horas (de 12:30 a 12:30 PM) día sí y día no. El acceso a 5 s de botella de beber se proporciona en un FR-3 para todas las esquinas. Durante esta fase del experimento, realiza cambios de jaula durante los periodos de "Solo acceso al agua" para evitar interrumpir el consumo de alcohol. Los investigadores deben asegurarse de que los grupos experimentales muestren una preferencia aproximadamente igual por las cuatro esquinas durante el entrenamiento en agua antes de asignar las zonas de alcohol para el consumo intermitente de alcohol. En cada una de las cohortes, los grupos experimentales mostraron visitas y golpes aproximadamente iguales en las cuatro esquinas durante el entrenamiento acuático. Por esta razón, los autores mantuvieron las asignaciones de esquinas fijas entre cohortes. Los experimentadores pueden ver fácilmente la proporción de licks y visitas en las esquinas a través del programa "Controlador". Asegúrate de monitorizar los datos de visita y lamer regularmente durante todo el experimento para evitar problemas (por ejemplo, fallos en el equipo o ratones "acaparando" ciertas esquinas).
    1. Después de que todos los ratones hayan cumplido con éxito un programa FR-3 para acceder a botellas de bebida, prepara alcohol al 20% (etanol al 95% [190 proof] en agua del grifo, v/v; ~250 mL/botella).
    2. Deja de ejecutar el archivo Water Training.experiment .
    3. Retira las botellas de aspirador en las esquinas operantes dos y cuatro (o las esquinas que especificaste en el archivo del experimento, si son diferentes) y sustituye cada una por ~250 mL de alcohol al 20%.
    4. Gira suavemente las nuevas botellas de beber que contienen alcohol en las aberturas del lickómetro, asegurando una conexión firme al lickómetro.
    5. Carga el archivo Intermitent Alcohol.experiment y empieza a grabar.
    6. Verifica que las visitas, los nasores y los licks están siendo registrados correctamente por el software para cada ratón y que todas las puertas motorizadas se abren correctamente.
    7. Después de las 12:30 PM del día siguiente, verifica que el programa haya cambiado correctamente del módulo "Solo Acceso al Agua" al módulo "Acceso al Alcohol ENCENDIDO" y que se hayan registrado licks en las esquinas operantes que contienen alcohol.
  5. Día 16+: Prueba de alcohol adulterado con quinina
    NOTA: La fase de prueba de alcohol adulterado con quinina se realiza utilizando el archivo Intermitent Alcohol.experiment. En esta fase, las botellas de beber en dos esquinas operantes que antes contenían un 20% de alcohol se sustituyen por 0,5 mM, y posteriormente, 1 mM de quinina adulterada al 20% para evaluar el consumo insensible al castigo. Estas concentraciones de quinina, que se traducen en 0,016% y 0,032% de quinina (p/v), respectivamente, se han encontrado previamente aversivas en pruebas realizadas por el grupo27,28 yotros 31. Los ratones tienen acceso continuo al agua, pero acceso intermitente a alcohol adulterado con quinina durante periodos de 24 horas cada dos días (es decir, un día de 0,5 mM de quinina, un día de acceso solo con agua, un día de 1,0 mM de quinina). El acceso se proporciona en un horario FR-3 para todas las esquinas. En este estudio, los ratones realizaron esta fase de la tarea tras 16 o 24 días consecutivos de consumo intermitente de alcohol sin adulterar. No se realizaron cambios de jaula el día del agua entre pruebas de adulteración para evitar efectos de confusión del estrés. Tras esta fase del experimento, los ratones pueden empezar a beber alcohol "barra libre" o volver a beber de forma intermitente para evaluar el consumo de rebote tras la adulteración.
    1. Prepare 0,5 mM y 1 mM de alcohol adulterado con quinina al 20% (etanol al 95% [190 proof] en agua del grifo, v/v; ~250 mL/botella).
    2. Realiza un cambio de jaula, retirando todas las botellas de bebida.
    3. Llena cada botella de bebo en las esquinas de alcohol con ~250 mL de solución al 20% adulterada con quinina de 0,5 mM.
    4. Gira suavemente las nuevas botellas de beber que contienen alcohol en las aberturas del lickómetro, asegurando una conexión firme al lickómetro.
    5. Carga el archivo Intermitent Alcohol.experiment y empieza a grabar.
    6. Verifica que las visitas, los nasores y los licks están siendo registrados correctamente por el software para cada ratón y que todas las puertas motorizadas se abren correctamente.
    7. Después de las 12:30 PM, verifica que el programa haya cambiado correctamente del módulo "Acceso al agua SOLO" al módulo "Acceso al alcohol encendido" y que se hayan registrado licks en las esquinas operantes que contienen alcohol.
    8. Antes de las 12:30 PM del siguiente día de alcohol, sustituye cada botella en la esquina del alcohol por ~250 mL de una solución de alcohol al 20% adulterada con quinina de 1 mM. No hay necesidad de parar el experimento para el cambio de botella.
    9. Antes de las 12:30 PM del siguiente día de alcohol, retira las botellas de bebo que contienen alcohol adulterado y sustituye cada una por ~250 mL de alcohol al 20% sin adulterar.
  6. Día 20+: "Barra libre"/acceso gratuito al alcohol
    NOTA: Se puede opcionalmente organizar un día de "barra libre"/consumo de alcohol de acceso libre para servir como control no operante. Esta fase se ejecuta usando el archivo Open Bar.experiment . En esta fase, las botellas de beber en dos de las cuatro esquinas operantes contienen un 20% de alcohol, al que los ratones tienen acceso durante un periodo de 24 horas (de 12:30 a 12:30 PM). Una visita en la esquina abrirá las puertas sin necesidad de narices. En este estudio, los ratones realizaron esta fase de la tarea tras las fases de prueba de consumo intermitente de alcohol o de alcohol adulterado con quinina.
    1. Si es necesario, prepara un 20% de alcohol (95% etanol [190 grados] en agua del grifo, v/v; ~250 mL/botella).
    2. Antes de las 12:30 PM del siguiente día de alcohol, deja de ejecutar el archivo actual del experimento.
    3. Si es necesario, retira las botellas de bebo en las esquinas del alcohol y sustituye cada una por ~250 mL de alcohol al 20%.
    4. Gira suavemente las nuevas botellas de beber que contienen alcohol en las aberturas del lickómetro, asegurando una conexión firme al lickómetro.
    5. Carga el archivo Open Bar.experiment y empieza a grabar.
    6. Verifica que las visitas, los narices y los licks están siendo grabados correctamente por el software para cada ratón y que todas las puertas motorizadas están abiertas libremente.
    7. Después de las 12:30 PM, verifica que el programa haya cambiado correctamente del módulo "Acceso al agua SOLO" al módulo "Acceso al alcohol encendido" y que se hayan registrado licks en las esquinas operantes que contienen alcohol.

5. Análisis de datos

NOTA: Los datos de cada experimento se almacenan internamente hasta que el programa se detiene. En ese momento, se crea un archivo de archivo de datos comprimido y se almacena en el disco duro local en C:\Documents\NewBehavior\IntelliCage Plus\Archives. El nombre del archivo consiste en la fecha y hora en que se inició el programa y termina en .zip.  Los archivos de archivo de datos contienen toda la información relevante sobre el experimento, incluyendo visitas a las esquinas (hora de inicio, hora de finalización, duración, secuencia de visitas), nasales (hora de inicio, hora de finalización, duración), licks (hora de inicio, hora de finalización, duración), tiempos de luz y oscuridad, y datos de temperatura. Este archivo de datos puede ser leído y analizado con el programa "Analyzer". Aunque existen otros paquetes de código abierto para analizar las salidas de datos de IntelliCage (Ruffini et al., 2021; Gastaldi et al., 2025), los autores crearon una cadena de análisis de datos en R utilizando paquetes públicos del tidyverse para analizar datos del paradigma del consumo intermitente de alcohol. La tubería incluye múltiples pasos de control de calidad, incluyendo el análisis de la ocupación de esquinas por ratón; frecuencia media de visita, sepoke y lamido a lo largo del ritmo circadiano; Tasa de adquisición de lick FR-3 por ratón; y el número diario de lamidas por ratón. Además, los autores proporcionan análisis básicos de guion sobre las medidas de consumo de alcohol. La base es un archivo plantilla de cuaderno R usando el lenguaje de marcado Quarto que procesa los archivos de datos y puede adaptarse para variaciones específicas de cohortes animales. El análisis se realiza utilizando la versión gratuita de RStudio. Un archivo plantilla de proyecto para R se encuentra en el repositorio29 de GitHub.

  1. Compila todos los datos, incluidos los archivos zip generados por la aplicación "Controlador" y el archivo CSV que contiene los datos del peso corporal del ratón.
    NOTA: Los pesos son necesarios para normalizar la ingesta por peso corporal. En este flujo de trabajo, tenía más sentido recopilar los datos de peso en un archivo separado que añadirlos a cada archivo de experimento. La primera columna debe coincidir con el Animal ID de los archivos de archivo.
  2. Descarga la plantilla del proyecto R desde el repositorio de GitHub.
    1. Renombra el proyecto para que coincida con el experimento.
    2. La plantilla incluye archivos de datos de muestra para ilustrar cómo funciona el análisis, ubicados en la subcarpeta data/C1. Sustituye los archivos de archivo por archivos de datos personalizados.
  3. Lanza RStudio y abre el proyecto.
    1. En la sección de archivos de la ventana en la esquina inferior derecha de RStudio, navega a la carpeta qmd y abre el archivo IC_template.qmd.
    2. Duplique el archivo plantilla y renómelo para que coincida con el experimento.
    3. Ajusta los metadatos en la parte de cabecera YAML del archivo duplicado y el fragmento inicial de código.
    4. Ajusta los nombres de los grupos en el archivo IC_Commons.R del directorio R para que coincidan con los grupos experimentales. (La plantilla utiliza dos grupos: Control y LBN.)
  4. Ejecuta el archivo del cuaderno.
    NOTA: Se proporcionan instrucciones más detalladas con los archivos de README.md en el repositorio de GitHub.

figure-protocol-2
Figura 3: Acceso comparable a las esquinas operantes entre todos los ratones durante las fases de adiestramiento y consumo intermitente de alcohol. Entre los ratones de la primeracohorte 23, el mapa de calor muestra el tiempo total pasado en cada esquina por día por ratón durante (A) la habituación y el entrenamiento en agua frente a (B) los primeros cuatro días de consumo intermitente de alcohol (n = 15 F, 16 M). Los colores rojo oscuro indican más tiempo al día en la esquina. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: Los ratones realizan visitas, nasales y lamidos consistentes con el ritmo circadiano y consiguen con éxito el acceso a botellas operantes con un horario FR-3. Entre los ratones de la primeracohorte 23, la densidad media de visitas en la esquina operante (A), (B) sepoques nasales y (C) lamidas durante la sesión durante los primeros ocho días de pruebas. (D) Tiempo hasta que cada ratón logra lamer con éxito una relación FR-3 durante el entrenamiento en agua. (E) Tasa de éxito en las visitas (= % de visitas que resultan en lamido / total de visitas) entre ratones durante la habituación y el entrenamiento con agua (izquierda) frente a los primeros cuatro días de consumo intermitente de alcohol (derecha). Los símbolos de círculo denotan a las mujeres (n = 15); los símbolos cuadrados denotan a los hombres (n = 16). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 5: Los ratones participan en ritmos de lamido diarios comparables durante el entrenamiento y las fases intermitentes de consumo de alcohol. Entre (A) hembras (n = 15) y (B) machos (n = 16) cohorte unoratones 23, número total de lamidas diarias de agua (azul) y alcohol (rojo) durante la habituación y el entrenamiento con agua (día -4–0) frente al consumo intermitente de alcohol (día 1–4). C denota crianza controlada; L indica crianza LBN. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 6: Los ratones expuestos a la adversidad temprana consumen más alcohol que los controles en el paradigma operante e intermitente de consumo de alcohol. (A) Promedio de repasos de alcohol por día normalizados por peso corporal (g; medido semanalmente) durante 8 días de acceso intermitente al alcohol entre ratones control (gris; izquierda) y criados con LBN (rosa; derecha). (B) Consumo medio de alcohol al día normalizado por peso corporal antes, durante y después de la adulteración de quinina (0,5 mM, 1 mM). (C) Gráfico de densidad que muestra las lamidas medias de alcohol al día normalizadas por peso corporal durante un solo día de acceso al alcohol "barra abierta" con FR-0. Los símbolos de círculo denotan a las mujeres (n = 15); los símbolos cuadrados denotan a los hombres (n = 16). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Resultados

Los autores utilizaron pruebas automáticas de jaula en casa mediante IntelliCages para evaluar cómo la adversidad temprana en la vida (ELA) altera la vulnerabilidad a comportamientos similares a losAUD 27. Para inducir la adversidad, utilizaron el paradigma de cama y anidación limitada (LBN), un modelo de escasez de recursos que induce una atención materna impredecible yfragmentada 51,52,53,54,55,56. El estudio fue novedoso al evaluar los efectos del ELA en los comportamientos de consumo de alcohol entre ratones que vivían en viviendas sociales, sin los efectos confusos del estrés inducido por el aislamiento social. Esto era importante dado que se sabe que el aislamiento social en la edad adulta afecta de forma diferencial a los ratones expuestos aELA 22,57. Para lograr el máximo rendimiento, los autores midieron simultáneamente los comportamientos de consumo de alcohol en cuatro aparatos IntelliCage, dos para cada sexo.

Los autores comenzaron la cadena de análisis realizando un control de calidad exhaustivo de los datos en bruto. Los gráficos incluidos aquí muestran datos representativos de la primera cohorte (n = 15 F, 16 M) del estudiopublicado 23. El script para todo análisis y trazado está incluido en el repositorio29 de GitHub. El día 0 experimental ha sido excluido debido a un cambio de jaula, que interrumpió la recogida de datos. Entre las consideraciones para la exploración de datos y el control de calidad, los autores aseguraron que todos los ratones tuvieran acceso aproximadamente igual a todas las esquinas operantes durante la fase de entrenamiento (Figura 3A) y la de consumo intermitente de alcohol (Figura 3B). Esto descarta impactos significativos de ratones que "acaparen" las esquinas operantes, impidiendo que otros ratones accedan a los botes de bebida. Los autores validaron a continuación que los ratones realizaron visitas, nasales y lamidas en un ritmo circadiano esperado durante los días experimentales (Figura 4A–C) y que todos los ratones realizaron con éxito la primera lamida con una relación FR-3 dentro de las seis horas siguientes al inicio del módulo (Figura 4D). Al final de la fase de entrenamiento en agua, todos los ratones alcanzaron una tasa de éxito relativamente alta en el lavado (= % de las visitas resultaron en lamer/total de visitas), lo que confirma aún más que el entrenamiento fue exitoso al final del entrenamiento en agua (Figura 4E).

Durante la habituación, el entrenamiento con agua y el inicio del consumo intermitente de alcohol, los ratones mantuvieron un número aproximadamente similar de lamidas diarias (Figuras 5A–B). Aunque algunos ratones mostraron una disminución en el total de lamidas diarias al inicio del entrenamiento operante en agua en el día experimental -3 (por ejemplo, P241260-1), la mayoría adquirió un horario de nariz FR-1 y FR-3 lo suficientemente rápido como para mantener las tasas basales de lamida. Por tanto, es poco probable que los ratones sufrieran una deshidratación excesiva durante el entrenamiento en agua. Todos los ratones aprendieron el horario FR-3 a un ritmo razonable. Una vez que comenzó el consumo intermitente de alcohol en el día experimental 1, casi todos los ratones optaron por consumir alcohol, aunque a diferentes ritmos. En general, los ratones no aumentaron significativamente el total de lamidas diarias al consumir alcohol. En su lugar, los ratones se dedicaron a menos lamidos de agua para acomodar el aumento del consumo de alcohol.

En todos los días de consumo intermitente de alcohol, los ratones de la cohorte uno variaron ampliamente en las lamidas diarias de alcohol en relación con el peso corporal (Figura 6A). Los autores encontraron que los ratones que se sometieron al paradigma LBN tenían un peso corporal significativamente menor que los controles cruzados23. Así, al examinar las diferencias de grupo en el consumo de alcohol, optaron por normalizar las lamidas diarias de alcohol según el peso corporal, que los autores evaluaban semanalmente durante los cambios de jaula. Los ratones criados con LBN generalmente bebieron más alcohol por gramo de peso corporal que los controles tanto durante el consumo intermitente (Figura 6A) como durante la adulteración de quinina (Figura 6B). Esta tendencia se mantuvo durante un solo día de acceso abierto no operante (Figura 6C). Estos hallazgos de la primera cohorte son coherentes con los resultados publicados, en los que los autores informan que los ratones expuestos a ELA bebieron consistentemente más alcohol por gramo de peso corporal que los controles cruzados durante el acceso intermitente, un efecto especialmente pronunciado en losmachos 23.

Gracias a la eficiencia de los sistemas automatizados de monitorización de jaulas en casa, el estudio publicado confirmó un aumento en el consumo de alcohol entre roedores expuestos a ELA con vivienda social en tamaños de muestra extremadamente robustos, incluyendo ambos sexos (n = 54 control, 43 LBN)23. Estos resultados suponen un avance en la modelización de los comportamientos similares a la UD observados en pacientes con UD con antecedentes de experiencias adversas en la infancia 58,59,60,61,62, y abren la puerta a futuros estudios mecanicistas que identifiquen la neurobiología subyacente al aumento de la vulnerabilidad a la AUD tras la ELA.

Discusión

Como ejemplifica el uso de IntelliCages por parte de los autores para evaluar de forma robusta comportamientos similares a la AUD en ratones expuestos aELA 27 , así como con trabajos previos en líneastransgénicas 28, los sistemas automatizados de monitorización de jaulas domésticas ofrecen una solución eficiente y flexible para estudiar modelos preclínicos de AUD. La evaluación simultánea de hasta 16 ratones que viven en co-vivienda aumenta significativamente el rendimiento de la metodología de consumo de alcohol, evitando al mismo tiempo los impactos desconcertantes del estrés inducido por el aislamiento social. El paradigma operante e intermitente del consumo de alcohol permite a los experimentadores investigar múltiples aspectos del comportamiento similar al UD durante un solo periodo de ~5–6 semanas, incluyendo el consumo excesivo de alcohol, la escalada a lo largo del tiempo y el consumo insensible al castigo. Aunque el paradigma ofrece un método para evaluar comportamientos similares a los de la AUD, el diseño puede adaptarse fácilmente para medir el consumo intermitente de forma más crónica, probar si el consumo insensible al castigo es en respuesta a una bocanada de aire, o añadir una proporción operante variable, entre otras posibilidades. En conjunto, los sistemas automatizados de monitorización de jaulas domésticas aumentan sustancialmente el rendimiento y la especificidad con los que los investigadores pueden evaluar comportamientos similares a los AUD, facilitando la identificación de circuitos y tratamientos subyacentes novedosos.

Como ocurre con toda tecnología, los autores ocasionalmente experimentan fallos mecánicos y técnicos. A pesar de la tentación de permitir que el sistema funcione sin supervisión, es fundamental que los investigadores sigan monitorizando regularmente el aparato para garantizar su correcto funcionamiento. Fallos mecánicos ocasionales en las puertas magnéticas hacían que las botellas de beber fueran inaccesibles para los ratones. Esto ocurría con poca frecuencia con una limpieza y mantenimiento adecuados y normalmente era mínimamente disruptivo para la recogida de datos. Para identificar errores rápidamente, es importante vigilar las botellas de beber para detectar disminuciones comparables de líquido y revisar regularmente la aplicación "Controlador" para verificar que se estén registrando lamidos en todas las esquinas para todos los animales. Para un asesoramiento más completo, Masuda y sus colegas ofrecen una excelente descripción de cómo instalar y realizar mantenimiento en IntelliCages48.

También es fundamental observar regularmente el comportamiento animal para vigilar si hay peleas u otros comportamientos que confunden. Aunque los autores no tuvieron grandes problemas de lucha al aplicar este paradigma con ratones C57/BL6, el coalojamiento de machos con genotipos más agresivos ha dado lugar a problemas significativos. Vigila regularmente la detección de sangre seca, animales cojeantes u otros signos de pelea, especialmente después de cambiar la jaula. Si se observan estas señales, se elimina rápidamente el animal o animales responsables y se excluye de más experimentos. Utiliza la sección "Rendimiento individual del ratón" del código proporcionado para evaluar si, y durante cuánto tiempo, la agresividad afectó al comportamiento de consumo de ratones individuales. Excluye todos los días afectados del análisis. Como se indicó antes, los autores no pueden garantizar la generalizabilidad del protocolo a diferentes genotipos o disposiciones de alojamiento.

Relacionado con esto, los autores ocasionalmente tuvieron problemas con ratones que "acaparaban" esquinas operantes, durmiendo o ocupando el mismo rincón durante horas. Este comportamiento impide que otros ratones accedan a las botellas de sipper en esa esquina. Estas situaciones pueden confundir los resultados del consumo de alcohol si no se tienen en cuenta adecuadamente en el análisis. Utiliza las secciones "Ocupación en las esquinas (duraciones de visita)" y "Rendimiento individual del ratón" del código proporcionado para decidir si el "acaparamiento" afectó el comportamiento del ratón lo suficiente como para excluir ciertos días experimentales. En general, la incapacidad para registrar o cuantificar comportamientos sociales durante los experimentos es una limitación importante de este sistema automatizado de monitorización.

Por último, como cada vez ocurre más con los métodos neurocientíficos avanzados, los sistemas automatizados de monitorización de jaulas en casa producen grandes cantidades de datos. A través de código abierto como el presentadoaquí 29 y desarrollado porotros 63,64, los experimentadores disponen de múltiples herramientas para organizar y analizar los datos que emiten. Sin embargo, las modificaciones al protocolo aquí presentadas requerirán la adaptación del código. Además, se podrían realizar numerosos análisis adicionales sobre el gran volumen de datos de salida no presentados aquí.

Por ejemplo, los investigadores pueden estar interesados en cuantificar el consumo de alcohol (g de alcohol por kg de peso de ratón por día). Los autores discuten esto brevemente y proporcionan algunos códigos preliminares para realizar este análisis en el repositorio29 de GitHub. Allí, los autores utilizan un factor de conversión lick-volumen-volumen de 1,94 μL/lick, consistente con los cálculos realizados por Kasia Radwanska y suscolegas 30,37. Aunque este factor de conversión lick se ha utilizado para estimar el consumo de alcohol por otros enel campo 30,37,38,39, se calculó midiendo el consumo de agua. Por tanto, puede no ser una medida precisa del consumo de alcohol del 20% debido a las diferencias en la tensión superficial entre el agua y el alcohol. Otros en el campo han utilizado un factor de conversión de lick de 3 μL/lick 31,34,36,38, lo que pone de manifiesto la necesidad de resolver esta medición. No se puede descartar la posibilidad de que los ratones se involucren en licks de diferentes tamaños, lo que complica aún más este cálculo. Si los investigadores están interesados en obtener una medida precisa del consumo de alcohol (g/kg/día), los autores recomiendan calcular un factor de conversión de lamida a volumen coherente con el diseño experimental.

En conclusión, el avance y la mayor accesibilidad de los sistemas automatizados de monitorización de jaulas domésticas ofrecen a los investigadores de AUD herramientas nuevas y mejoradas para evaluar el consumo de alcohol de forma preclínica. Los paradigmas operantes de consumo intermitente de alcohol como este permiten a los experimentadores evaluar simultáneamente múltiples aspectos del comportamiento similar al AUD a un rendimiento mucho mayor y con mayor relevancia etológica que la metodología tradicional. A través de los sistemas de pruebas IntelliCage y alternativas de códigoabierto 20,26, los investigadores pueden investigar de forma más eficiente y flexible los comportamientos de consumo de alcohol coherentes con la AUD, acelerando la identificación de intervenciones efectivas.

Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Programa de Investigación Intramuros de los NIH de los Institutos Nacionales de Salud para V.A.A. (ZIA AA000421; ZIA MH002987). Queremos agradecer a Miriam Bocarsly, Anoo Maskeri y Erin Murray por su ayuda en el desarrollo de este protocolo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Etanol, 190 ProofLaboratorios de Descontaminación2801G
Sistema de Pruebas IntelliCageSistemas TSEhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Incluye 1x 2000P Static Cage (Tecniplast, 2000P001),   4 casas de ratón (Tecniplast, ACRE011), y 8 botellas de sipper (Techniplast, ACBT0252) y tapones (Techniplast, ACCP3521)
Software IntelliCage ("Diseñador", "Controlador", "Analizador")Sistemas TSEhttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Versión 3.6.9.0
Almohadillas ISO, 6" x 10"Braintree Scientific, Inc.ISO 6105Almohadillas de fibra de algodón comprimida (15,24 x 25,4 cm)
IsofluranoBaxter10019-360-40
Isoflurano VXP y comercio; Vaporizador de rellenoMedVet91305535
Dieta de roedores de laboratorioLabDiet5001
Cámara de inducción para ratones/ratas de sellado medio y sello seguro y nbsp;Instrumentos de Precisión MundialEZ-178
NestletsAncareNES 3600Pequeños cuadrados de algodón (5,08 x 5,08 cm)
OHAUS Compass y comercio; Báscula CX - 2.200 gramos x 1 gramoUlineH-8110Para mediciones del peso corporal del ratón
PC + PantallaSupermicrohttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/Vendido como parte del sistema de pruebas IntelliCage
Transpondedor RFID (1,25 x 7 mm)Sistemas TSE290000-IC-60400
Inyector de transpondedor RFIDAVIDAVID2028
Lector de transpondedor RFIDSistemas TSE290000-IC-50800
RStudioPostulhttps://posit.co/download/rstudio-desktopVersión 2026.01.1+403; con Tidyverse (2.0.0) y Quarto (1.9.37)
Vaso desechable Tri PourPlásticos Consolidados45317Para mediciones del peso corporal del ratón

Referencias

  1. Melendez, R. I. Intermittent (Every-Other-Day) Drinking Induces Rapid Escalation of Ethanol Intake and Preference in Adolescent and Adult C57BL/6J Mice. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (4), 652-658 (2011).
  2. Xiao, T., Chen, Y., Boisvert, A., Cole, M., Kimbrough, A. Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure Paired with Two-Bottle Choice to Model Alcohol Use Disorder. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (196), e65320 (2023).
  3. Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiology & Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
  4. Thiele, T. E., Crabbe, J. C., Boehm, S. L. “Drinking in the Dark” (DID): A Simple Mouse Model of Binge-Like Alcohol Intake. Curr Protoc Neurosci. 68, 9.49.1-9.49.12 (2014).
  5. Huynh, N., Arabian, N. M., Asatryan, L., Davies, D. L. Murine Drinking Models in the Development of Pharmacotherapies for Alcoholism: Drinking in the Dark and Two-bottle Choice. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (143), e57027 (2019).
  6. Longley, M., Willis, E. L., Tay, C. X., Chen, H. An open source device for operant licking in rats. PeerJ. 5, e2981 (2017).
  7. Melo, M. C., Alves, P. E., Nogueira Cecyn, M., Eduardo, P. M. C., Abrahao, K. P. Development of an Eight-Wireless Automated Cage System with Two Lickometers Each for Rodents. eNeuro. 9 (4), ENEURO.0526-21.2022 (2022).
  8. Petersen, N., Adank, D. N., Raghavan, R., Winder, D. G., Doyle, M. A. LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device): An Open-Source Tool for Recording Undisturbed Two-Bottle Drinking Behavior in a Home Cage Environment. eNeuro. 10 (4), (2023).
  9. Hou, S., Soto, N. M. A., Glover, E. J., Hou, S., Soto, N. M. A., et al. Modeling Alcohol Consumption in Rodents Using Two-Bottle Choice Home Cage Drinking and Microstructural Analysis. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (213), e67486 (2024).
  10. Wilcox, M. V., Cuzon Carlson, V. C., Sherazee, N., Sprow, G. M., Bock, R., et al. Repeated binge-like ethanol drinking alters ethanol drinking patterns and depresses striatal GABAergic transmission. Neuropsychopharmacology. 39 (3), 579-594 (2014).
  11. Godynyuk, E., Bluitt, M. N., Tooley, J. R., Kravitz, A. V., Creed, M. C. An Open-Source, Automated Home-Cage Sipper Device for Monitoring Liquid Ingestive Behavior in Rodents. eNeuro. 6 (5), (2019).
  12. Frie, J. A., Khokar, J. Y. An open source automated two-bottle choice test apparatus for rats. HardwareX. 5, e00061 (2019).
  13. Ieraci, A., Mallei, A., Popoli, M. Social Isolation Stress Induces Anxious-Depressive-Like Behavior and Alterations of Neuroplasticity-Related Genes in Adult Male Mice. Neural Plast. 2016, 6212983 (2016).
  14. Hebda-Bauer, E. K., Dokas, L. A., Watson, S. J., Akil, H. Adaptation to single housing is dynamic: Changes in hormone levels, gene expression, signaling in the brain, and anxiety-like behavior in adult male C57Bl/6J mice. Horm Behav. 114, 104541 (2019).
  15. Johnson, M. C., Zweig, J. A., Zhang, Y., Ryabinin, A. E. Effects of social housing on alcohol intake in mice depend on the non-social environment. Front Behav Neurosci. 18, (2024).
  16. Logue, S., Chein, J., Gould, T., Holliday, E., Steinberg, L. Adolescent mice, unlike adults, consume more alcohol in the presence of peers than alone. Developmental Science. 17 (1), 79-85 (2014).
  17. Holgate, J. Y., Garcia, H., Chatterjee, S., Bartlett, S. E. Social and environmental enrichment has different effects on ethanol and sucrose consumption in mice. Brain Behav. 7 (8), e00767 (2017).
  18. Panksepp, J. B., Rodriguez, E. D., Ryabinin, A. E. Sweetened-ethanol drinking during social isolation: Enhanced intake, resistance to genetic heterogeneity and the emergence of a distinctive drinking pattern in adolescent mice. Genes Brain Behav. 16 (3), 369-383 (2017).
  19. Johnson, M. C., Zweig, J. A., Zhang, Y., Ryabinin, A. E. Effects of social housing on alcohol intake in mice depend on the non-social environment. Front Behav Neurosci. 18, 1380031 (2024).
  20. Petersen, N., Adank, D. N., Quan, Y., Edwards, C. M., Hallal, S. D., et al. A Novel Mouse Home Cage Lickometer System Reveals Sex- and Housing-Based Influences on Alcohol Drinking. eNeuro. 11 (10), (2024).
  21. Lander, S. S., Linder-Shacham, D., Gaisler-Salomon, I. Differential effects of social isolation in adolescent and adult mice on behavior and cortical gene expression. Behavioural Brain Research. 316, 245-254 (2017).
  22. Kuhlman, K. R. Pitfalls and potential: Translating the two-hit model of early life stress from pre-clinical non-human experiments to human samples. Brain Behav Immun Health. 35, 100711 (2023).
  23. Lipp, H. P. High-throughput and Automated Behavioural Screening of Normal and Genetically Modified Mice. Bus Brief Future Drug Discov. , (2005).
  24. Kiryk, A., Janusz, A., Zglinicki, B., Turkes, E., Knapska, E., et al. IntelliCage as a tool for measuring mouse behavior - 20 years perspective. Behav Brain Res. 388, 112620 (2020).
  25. Iman, I. N., Yusof, N. A. M., Talib, U. N., Ahmad, N. A. Z., Norazit, A., et al. The IntelliCage System: A Review of Its Utility as a Novel Behavioral Platform for a Rodent Model of Substance Use Disorder. Front Behav Neurosci. 15, 683780 (2021).
  26. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. FARESHARE: An open-source apparatus for assessing drinking microstructure in socially housed rats. NPP—Digit Psychiatry Neurosci. 2 (1), 1 (2024).
  27. Anderson, L. G., Tischer, A. E., Bock, R., Michaelides, M., Alvarez, V. A. Early life adversity increases striatal dopamine D1 receptor density and promotes social alcohol drinking in mice, especially males. Transl Psychiatry. , (2026).
  28. Bocarsly, M. E., Shaw, M. J., Ventriglia, E., Anderson, L. G., Goldbach, H. C., et al. Preexisting risk-avoidance and enhanced alcohol relief are driven by imbalance of the striatal dopamine receptors in mice. Nat Commun. 15 (1), 1-17 (2024).
  29. Bock, R., Anderson, L., Averbeck, T. . IntelliCage Intermittent Drinking Analysis Template [R]. , (2026).
  30. Radwanska, K., Kaczmarek, L. Characterization of an alcohol addiction-prone phenotype in mice. Addiction Biology. 17 (3), 601-612 (2012).
  31. Smutek, M., Turbasa, M., Sikora, M., Piechota, M., Zajdel, J., et al. A Model of Alcohol Drinking under an Intermittent Access Schedule Using Group-Housed Mice. PLOS ONE. 9 (5), e96787 (2014).
  32. Mijakowska, Z., Łukasiewicz, K., Ziółkowska, M., Lipiński, M., Trąbczyńska, A., et al. Autophosphorylation of alpha isoform of calcium/calmodulin-dependent kinase II regulates alcohol addiction-related behaviors. Addiction Biology. 22 (2), 331-341 (2017).
  33. Holgate, J. Y., Garcia, H., Chatterjee, S., Bartlett, S. E. Social and environmental enrichment has different effects on ethanol and sucrose consumption in mice. Brain and Behavior. 7 (8), e00767 (2017).
  34. Koskela, M., Piepponen, T. P., Andressoo, J. O., Võikar, V., Airavaara, M. Towards developing a model to study alcohol drinking and craving in female mice housed in automated cages. Behavioural Brain Research. 352, 116-124 (2018).
  35. Beroun, A., Nalberczak-Skóra, M., Harda, Z., Piechota, M., Ziółkowska, M., et al. Generation of silent synapses in dentate gyrus correlates with development of alcohol addiction. Neuropsychopharmacology. 43 (10), 1989-1999 (2018).
  36. Simmons, K. E., Healey, K. L., Li, Q., Moore, S. D., Klein, R. C. Effects of sex and genotype in human APOE-targeted replacement mice on alcohol self-administration measured with the automated IntelliCage system before and after repeated mild traumatic brain injury. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 45 (11), 2231-2245 (2021).
  37. Pagano, R., Salamian, A., Skonieczna, E., Wojtas, B., Gielniewski, B., et al. Molecular fingerprints in the hippocampus of alcohol seeking during withdrawal. Res Sq. , rs.3.rs-3337670 (2023).
  38. Stefaniuk, M., Pawłowska, M., Barański, M., Nowicka, K., Zieliński, Z., et al. Global brain c-Fos profiling reveals major functional brain networks rearrangements after alcohol reexposure. Neurobiol Dis. 178, 106006 (2023).
  39. Frycz, B. A., Nowicka, K., Konopka, A., Hoener, M. C., Bulska, E., et al. Activation of trace amine-associated receptor 1 (TAAR1) transiently reduces alcohol drinking in socially housed mice. Addiction Biology. 28 (7), e13285 (2023).
  40. Skupio, U., Sikora, M., Korostynski, M., Wawrzczak-Bargiela, A., Piechota, M., et al. Behavioral and transcriptional patterns of protracted opioid self-administration in mice. Addiction Biology. 22 (6), 1802-1816 (2017).
  41. Ismail, N. I. W., Jayabalan, N., Mansor, S. M., Müller, C. P., Muzaimi, M. Chronic mitragynine (kratom) enhances punishment resistance in natural reward seeking and impairs place learning in mice. Addiction Biology. 22 (4), 967-976 (2017).
  42. Ajonijebu, D. C., Abboussi, O., Mabandla, M. V., Daniels, W. M. U. Differential epigenetic changes in the hippocampus and prefrontal cortex of female mice that had free access to cocaine. Metab Brain Dis. 33 (2), 411-420 (2018).
  43. Kimbrough, A., Kim, S., Cole, M., Brennan, M., George, O. Intermittent Access to Ethanol Drinking Facilitates the Transition to Excessive Drinking After Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure. Alcohol Clin Exp Res. 41 (8), 1502-1509 (2017).
  44. Gage, G. A., Muench, M. A., Jee, C., Kearns, D. N., Chen, H., et al. Intermittent-Access Operant Alcohol Self-Administration Promotes Binge-like Drinking and Drinking Despite Negative Consequences in Male and Female Heterogeneous Stock Rats. Neuropharmacology. 235, 109564 (2023).
  45. Hwa, L. S., Chu, A., Levinson, S. A., Kayyali, T. M., DeBold, J. F., et al. Persistent escalation of alcohol drinking in C57BL/6J mice with intermittent access to 20% ethanol. Alcohol Clin Exp Res. 35 (11), 1938-1947 (2011).
  46. Miczek, K. A., Akdilek, N., Ferreira, V. M. M., Kenneally, E., Leonard, M. Z., et al. Excessive alcohol consumption after exposure to two types of chronic social stress: intermittent episodes vs. continuous exposure in C57BL/6J mice with a history of drinking. Psychopharmacology (Berl). 239 (10), 3287-3296 (2022).
  47. Ko, Y. E., Hwa, L. S. Serotonin regulation of intermittent and continuous alcohol drinking in male and female C57BL/6J mice with systemic SB242084 and buspirone. Alcohol Alcohol. 58 (3), 280-288 (2023).
  48. Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer’s Disease, Using IntelliCage. Journal of Visualized Experiments (JoVE). (138), e58009 (2018).
  49. Kahnau, P. General Instructions for Using the IntelliCage with Mice. Curr Protoc. 6 (2), e70314 (2026).
  50. Thiele, T. E., Navarro, M. “Drinking in the dark” (DID) procedures: a model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
  51. Rice, C. J., Sandman, C. A., Lenjavi, M. R., Baram, T. Z. A novel mouse model for acute and long-lasting consequences of early life stress. Endocrinology. 149 (10), 4892-4900 (2008).
  52. Ivy, A. S., Brunson, K. L., Sandman, C., Baram, T. Z. Dysfunctional nurturing behavior in rat dams with limited access to nesting material: a clinically relevant model for early-life stress. Neuroscience. 154 (3), 1132-1142 (2008).
  53. Baram, T. Z., Davis, E. P., Obenaus, A., Sandman, C. A., Small, S. L., et al. Fragmentation and unpredictability of early-life experience in mental disorders. Am J Psychiatry. 169 (9), 907-915 (2012).
  54. Molet, J., Maras, P. M., Avishai-Eliner, S., Baram, T. Z. Naturalistic rodent models of chronic early-life stress. Dev Psychobiol. 56 (8), 1675-1688 (2014).
  55. Walker, C. D., Bath, K. G., Joels, M., Korosi, A., Larauche, M., et al. Chronic early life stress induced by limited bedding and nesting (LBN) material in rodents: critical considerations of methodology, outcomes and translational potential. Stress. 20 (5), 421-448 (2017).
  56. Demaestri, C., Gallo, M., Mazenod, E., Hong, A. T., Arora, H., et al. Resource scarcity but not maternal separation provokes unpredictable maternal care sequences in mice and both upregulate Crh-associated gene expression in the amygdala. Neurobiology of Stress. 20, 100484 (2022).
  57. Peña, C. J. Early-life stress sensitizes response to future stress: Evidence and mechanisms. Neurobiology of Stress. 35, 100716 (2025).
  58. Dube, S. R., Felitti, V. J., Dong, M., Chapman, D. P., Giles, W. H., et al. Childhood abuse, neglect, and household dysfunction and the risk of illicit drug use: the adverse childhood experiences study. Pediatrics. 111 (3), 564-572 (2003).
  59. Anda, R. F., Felitti, V. J., Bremner, J. D., Walker, J. D., Whitfield, C., et al. The enduring effects of abuse and related adverse experiences in childhood. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 256 (3), 174-186 (2006).
  60. Pilowsky, D. J., Keyes, K. M., Hasin, D. S. Adverse Childhood Events and Lifetime Alcohol Dependence. Am J Public Health. 99 (2), 258-263 (2009).
  61. Kirsch, D., Nemeroff, C. M., Lippard, E. T. C. Early Life Stress and Substance Use Disorders: Underlying Neurobiology and Pathways to Adverse Outcomes. ADV RES SCI. 1 (1), 29-47 (2020).
  62. Leza, L., Siria, S., López-Goñi, J. J., Fernández-Montalvo, J. Adverse childhood experiences (ACEs) and substance use disorder (SUD): A scoping review. Drug Alcohol Depend. 221, 108563 (2021).
  63. Ruffini, N., Müller, M. B., Schmitt, U., Gerber, S. IntelliPy: a GUI for analyzing IntelliCage data. Bioinformatics. 37 (21), 3972-3973 (2021).
  64. Daguano Gastaldi, V., Hindermann, M., Wilke, J. B. H., Ronnenberg, A., Arinrad, S., et al. A comprehensive and standardized pipeline for automated profiling of higher cognition in mice. Cell Reports Methods. 5 (3), 101011 (2025).

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