Bioinformática y análisis cuantitativo en tiempo real de la reacción en cadena de la polimerasa de SUCNR1 y GPR37L1 en la esquizofrenia

Resumen

Este estudio evalúa SUCNR1 y GPR37L1 como marcadores moleculares asociados a la esquizofrenia candidatos mediante análisis bioinformático integrado del conjunto de datos GSE54913, validación cuantitativa en tiempo real de la reacción en cadena de la polimerasa (qRT-PCR) y análisis de correlación con memoria verbal en una cohorte independiente.

Resumen

La esquizofrenia es un trastorno mental grave, complejo y multifactorial que implica numerosos elementos de susceptibilidad genética, lo que conduce a una discapacidad sustancial, morbilidad y mortalidad. A pesar de los avances significativos en la comprensión de su fisiopatología y etiología, los biomarcadores diagnósticos específicos para la esquizofrenia siguen siendo esquivos. Este estudio tenía como objetivo identificar marcadores moleculares candidatos asociados con la esquizofrenia. Se realizó un análisis bioinformático integrado sobre el conjunto de datos público de microarrays GSE54913. Los análisis de la Ontología Génica (GO) y la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG) revelaron que los términos GO más enriquecidos estaban relacionados con la actividad del canal, incluyendo la actividad pasiva del transportador transmembrana, la actividad de canales iónicos, la actividad de canales controlados y la actividad específica del canal del sustrato. Las cinco principales vías enriquecidas de KEGG fueron secreción de insulina, vía de señalización de cAMP, reparación por escisión de nucleótidos, vía de señalización TNF y metabolismo del glutatión. La validación se llevó a cabo utilizando reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) en un conjunto de muestras independientes del Hospital Rongjun Youfu de Wuhan. Los resultados de qRT-PCR fueron en gran medida consistentes con el análisis de microarrays (Pearson r = 0,89, IC 95%: 0,66–0,97). El análisis de la red de interacción proteína-proteína (PPI) identificó dos genes centrales, SUCNR1 y GPR37L1, que estaban significativamente asociados con el término GO 'actividad de canales iónicos' y enriquecidos en la vía KEGG 'secreción de insulina'. Además, la expresión de SUCNR1 mostró una correlación negativa con las puntuaciones de memoria verbal (r = -0,54, P = 0,015), mientras que GPR37L1 expresión mostró una correlación positiva (r = 0,59, P = 0,0034). Estos hallazgos sugieren que la expresión alterada de SUCNR1 y GPR37L1 podría estar asociada con la esquizofrenia y representar marcadores moleculares candidatos para investigaciones posteriores.

Introducción

La esquizofrenia es un trastorno mental crónico y complejo de etiología no identificada, caracterizado por una grave disfunción cerebral, deterioro cognitivo y déficits psicosociales^. Supone una gran carga sanitaria global, afectando a más de 21 millones de personas en^{todo el mundo 2}. Aunque los enfoques diagnósticos y terapéuticos han evolucionado considerablemente en los últimos cincuenta años, la patogénesis central sigue siendo incierta, y los resultados a largo plazo asociados a una discapacidad sustancial, morbilidad y mortalidad no han mejorado^{notablemente 3}. Por lo tanto, es imprescindible identificar genes clave potenciales y objetivos reguladores.

La fisiopatología de la esquizofrenia, aunque no está completamente esclarecida, se atribúe ampliamente a polimorfismos genéticos y variaciones de expresión⁴. Por ejemplo, la variación genética en el gen alfa de estrógenos puede influir en la susceptibilidad a la esquizofrenia mediante una regulación genética alternativa y el procesamiento de^{transcripciones 5}. De manera similar, una variante promotora funcional de NRG1 se ha relacionado con la esquizofrenia y se ha correlacionado con la reducción de la expresión de la isoforma^{NRG1 tipo III 6}. Los estudios postmortem han demostrado una expresión significativamente reducida de isoformas de PDE4B en cerebros esquizofrénicos, lo que sugiere su potencial^predictivo. Otros candidatos incluyen el transportador de dopamina (DAT), el transportador vesicular de monoaminas (VMAT2) y la monoaminooxidasa (MAO), que regulan los niveles sinápticos de dopamina y pueden servir como biomarcadores⁸. Además, TCP1 puede contribuir a déficits del citoesqueleto mediante un plegamiento incorrecto de actina en la^{esquizofrenia 9}. Así, elucidar los perfiles de expresión génica en la patogénesis de la esquizofrenia podría aportar información sobre la predicción de riesgos, la comprensión mecanicista y la evaluación terapéutica.

Los enfoques computacionales recientes han avanzado en la identificación de genes asociados a enfermedades mediante análisis integrado de redes y métodos^{de aprendizaje automático 10,11,12}. A pesar de numerosos estudios genéticos, no se han traducido biomarcadores diagnósticos sanguíneos fiables en la práctica clínica de la esquizofrenia. Para cubrir esta carencia, el presente estudio empleó un enfoque integrado de bioinformática para reanalizar el conjunto de datos GSE54913, que contiene datos transcriptómicos derivados de la sangre de pacientes bien caracterizados con esquizofrenia y controles sanos. El conjunto de datos fue seleccionado porque (1) las muestras de sangre periférica son mínimamente invasivas y clínicamente prácticas, (2) incluye un tamaño de muestra relativamente grande entre los conjuntos de datos de microarrays de esquizofrenia disponibles públicamente, y (3) los datos en bruto estaban disponibles para su reanálisis. Los objetivos de este estudio fueron: (1) identificar genes expresados de forma diferencial en pacientes con esquizofrenia en comparación con controles sanos utilizando el conjunto de datos GSE54913; (2) realizar análisis de enriquecimiento funcional y redes PPI para identificar genes centrales; (3) validar la expresión de genes candidatos mediante qRT-PCR en una cohorte independiente; y (4) explorar la correlación entre la expresión génica central y el rendimiento de la memoria verbal. Según el conocimiento de los autores, este es el primer estudio que identifica SUCNR1 y GPR37L1 como marcadores moleculares sanguíneos candidatos para la esquizofrenia.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Rongjun Youfu de Wuhan (código de identificación del proyecto, YF-IRB202310215) y realizado conforme a los principios de la Declaración de Helsinki. Todos los participantes eran residentes de la comunidad china y proporcionaron su consentimiento informado por escrito.

Sujetos de estudio y análisis de sangre
Se incluyeron diez adultos diagnosticados con esquizofrenia y diez voluntarios controlados sanos sin antecedentes familiares de enfermedad mental en tres generaciones. Criterios de inclusión para pacientes con esquizofrenia: (1) diagnóstico de esquizofrenia según los criterios del DSM-5 confirmado por dos psiquiatras senior independientes; (2) edad de 18 a 65 años; (3) no cambiar la medicación antipsicótica durante al menos 4 semanas antes de la toma de muestras de sangre; (4) disposición a proporcionar consentimiento informado por escrito. Criterios de exclusión: (1) enfermedades médicas graves comórbidas (por ejemplo, diabetes, enfermedades cardiovasculares, cáncer); (2) abuso o dependencia de sustancias en los últimos 6 meses; (3) discapacidad intelectual; (4) embarazo o lactancia. Criterios de inclusión para controles sanos: (1) no hay antecedentes personales o familiares (en tres generaciones) de ninguna enfermedad mental; (2) no usar medicamentos antipsicóticos actuales o pasados; (3) coincidían por edad y sexo con el grupo de esquizofrenia; (4) no tener enfermedades médicas graves. La duración media de la enfermedad en pacientes con esquizofrenia fue de 12,5 ± 6,8 años; Todos los pacientes estaban con medicación antipsicótica estable (6 con risperidona, 4 con olanzapina); la puntuación media total de PANSS fue de 76,4 ± 12,3. Los controles se emparejaron por edad (±5 años) y sexo (5 hombres, 5 mujeres por grupo). La memoria verbal se evaluó utilizando la puntuación total de recuerdo en el Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R). Todos los sujetos fueron reclutados del Hospital Rongjun Youfu de Wuhan entre el 1 de enero y el 31 de julio de 2025. Las demografías de referencia se resumen en la Tabla 1.

El tamaño de la muestra se determinó utilizando software de cálculo de tamaño muestral para una prueba t independiente de dos colas con un tamaño de efecto de 1,2, α = 0,05 y potencia (1-β) = 0,80, lo que resultó en un mínimo de nueve sujetos por grupo.

Se extraía sangre venosa en tubos anticoagulados con EDTA y se procesaba sin demora. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se separaron de las muestras mediante centrifugación por gradiente de densidad utilizando un medio con gradiente de densidad. Brevemente, la sangre se diluyó 1:1 con solución fisiológica con suero tamponado con fosfato (PBS, pH 7,4), se aplicó en capas sobre el medio de gradiente de densidad y se centrifugó a 400 × g durante 30 minutos a 20 °C con el freno desconectado. Tras la centrifugación, la interfaz que contenía PBMC se transfirió cuidadosamente a un nuevo tubo. Las células se enjuagaron dos veces con PBS, con cada lavado seguido de centrifugación a 300 × g durante 10 minutos a 4 °C, y el último pellet se suspendió en PBS. Se evaluó la viabilidad utilizando el método de exclusión de colorantes con tripán azul, y solo se utilizaron preparaciones con ≥95% de células viables. Los PBMCs aislados fueron alicitados y almacenados a −80 °C durante un máximo de 3 meses antes de la extracción de ARN.

Datos de microarrays
El flujo de trabajo del estudio se muestra en la Figura 1. El conjunto de datos de microarrays GSE54913 fue descargado de la base de datos GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Este conjunto de datos fue seleccionado porque (1) contiene datos transcriptómicos de muestras de sangre periférica, que son mínimamente invasivas y clínicamente prácticas para el descubrimiento de biomarcadores; (2) incluye un tamaño de muestra relativamente grande entre conjuntos de datos de microarrays de esquizofrenia disponibles públicamente (18 pacientes, 12 controles); (3) los datos en bruto estaban disponibles para su reanálisis. Según el registro GEO, las muestras se derivaron de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), no de plasma. La descripción original de 'muestras de plasma' en la versión anterior era un error y ha sido corregida.

Preprocesamiento de datos y cribado génico diferencialmente expresado (DEG)
Datos en bruto (. archivos CEL) se preprocesaban utilizando software de preprocesamiento de microarrays. La corrección de fondo se realizó utilizando el método Robust Multichip Average (RMA), seguida de la normalización de cuantiles y la transformación log2. Se filtraron los conjuntos de sonda sin ninguna anotación genética. Se excluyeron sondas con valores ausentes del >20% entre las muestras; Los valores faltantes de las sondas restantes se imputaron utilizando el algoritmo de k vecinos más cercanos (k = 10) implementado en el software de imputación de valores faltantes. No hubo efectos de lote ya que todas las muestras se procesaron en un solo lote según el registro GEO. Tras el preprocesamiento, se obtuvieron valores de expresión de 17.200 genes para análisis posteriores. Se identificaron las DEG entre pacientes con esquizofrenia y controles sanos mediante software de análisis de expresión diferencial. Se consideraron que los genes con una tasa de falsa tasa de descubrimiento (FDR) < 0,05, cambio absoluto de pliegue (FC) > 1,2 y P < 0,05 se expresaban de forma diferencial. Se eligió un umbral relativamente bajo de FC (FC absoluta > 1,2) porque la esquizofrenia es un trastorno psiquiátrico complejo en el que las diferencias de expresión génica individuales suelen ser sutiles en lugar de dramáticas.

GO y análisis de enriquecimiento de vías
Se realizaron análisis de enriquecimiento funcional para términos de Ontología Génica (GO) y vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) utilizando software de análisis de enriquecimiento funcional. El conjunto de genes de fondo consistía en todos los genes que pasaron el preprocesamiento (17.200 genes). Se reportaron términos de enriquecimiento y vías con valores P brutos < 0,05. Como se usaron valores P en bruto para las salidas de enriquecimiento GO y KEGG, estos resultados deben interpretarse como exploratorios.

Análisis de redes de PPI e identificación de genes centrales
Se utilizó una base de datos de interacción proteína-proteína para construir una red de IBP, con una puntuación combinada de interacción > 0,9 como umbral. La red se visualizaba mediante software de visualización de red. Los genes hub se identificaron mediante un plugin de identificación de genes hub con el algoritmo Degree. Los 10 mejores nodos con las puntuaciones de grado más altas fueron seleccionados como genes centrales. La subred de genes clave del hub se extrajo usando un plugin de extracción de subred con parámetros por defecto (corte de grado = 2, corte de puntuación de nodo = 0,2, núcleo de núcleo = 2, profundidad máxima = 100).

Aislamiento total de ARN y qRT-PCR
β-Actin se utilizaba como gen de referencia interno (de mantenimiento). La estabilidad de la expresión de β-actina entre muestras se confirmó por la ausencia de diferencias significativas en los valores de Ct entre los grupos esquizofrenia y control (P > 0,05). La cuantificación relativa se realizó utilizando el método 2^−ΔΔCt . Todas las reacciones se realizaron en triplicado y se utilizó el valor medio de Ct para el cálculo (véanse las secuencias de cebadores en la Tabla 2). Los diez principales DEG (cinco más significativamente al alza y cinco más significativamente a la baja por cambio de pliegue) fueron seleccionados para la validación inicial qRT-PCR con el fin de confirmar la fiabilidad global de los datos del microarray. Posteriormente, SUCNR1 y GPR37L1 fueron seleccionados para una validación enfocada basándose en tres criterios: (1) fueron identificados como genes hub en el análisis de redes PPI (grado ≥ 7); (2) se asociaron significativamente con el término GO enriquecido máximo 'actividad de canales iónicos' y la vía KEGG 'secreción de insulina'; (3) ambos codifican GPCRs, que son objetivos conocidos de fármacos en la esquizofrenia.

Análisis estadístico
La normalidad se evaluó con la prueba de Shapiro–Wilk. Las variables que mostraron una distribución aproximadamente normal (P > 0,05) se analizaron utilizando métodos paramétricos, incluyendo la prueba t de Student para comparaciones entre dos grupos y ANOVA unidireccional para comparaciones entre más de dos grupos. Cuando no se cumplía la suposición de normalidad, se utilizaban pruebas de Mann–Whitney U o Kruskal–Wallis, según correspondía. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos colas. Para comparaciones múltiples (por ejemplo, en pruebas post-hoc ANOVA), se aplicó el método de tasa de descubrimiento de falsos fondos de Benjamini-Hochberg (FDR), con un umbral FDR de 0,05. Para los análisis de correlación, no se aplicó corrección por comparación múltiple, ya que solo se realizaron dos correlaciones; los valores P brutos se informan con precaución.

Resultados

Identificación de DEGs y agrupamiento jerárquico
El análisis del conjunto de datos GSE54913 identificó 473 genes diferencialmente expresados (DEGs), incluyendo 357 genes con aumento y 116 genes con regulación a la baja, entre pacientes con esquizofrenia y controles (Figura 2A,B). El agrupamiento jerárquico de estos DEGs distinguió las muestras de esquizofrenia de los controles (Figura 2C).

Análisis de enriquecimiento funcional de las DEGs
El análisis de enriquecimiento GO identificó términos relacionados con la actividad del canal, incluyendo la actividad pasiva del transportador transmembrana, la actividad del canal iónico, la actividad del canal con compuertas y la actividad del canal específico del sustrato (P < sin parar 0,05; Tabla 3). El análisis de la vía KEGG identificó la secreción de insulina, la vía de señalización del cAMP, la reparación por escisión de nucleótidos, la vía de señalización del TNF y el metabolismo del glutatión como las vías más enriquecidas (P < en bruto 0,05; Figura 3C y Tabla 4).

Validación de los DEGs superiores mediante qRT-PCR
Los cinco genes con mayor regulación a la baja (HCN3, OLFML2A, NOX1, MRGPRX1 y BRIP1) y los cinco genes con mayor regulación al alza (CCL22, PNMA2, TBX20, ERAS y C12orf68) fueron validados mediante qRT-PCR. Los genes validados y los valores correspondientes de microarray logFC se enumeran en la Tabla 5, la validación qRT-PCR se muestra en la Figura 4, y los valores Ct en bruto se proporcionan en la Tabla Suplementaria S1. Los cambios en el plegamiento qRT-PCR fueron direccionalmente consistentes con los datos de microarray de los diez genes (todos P < 0,05 según la prueba U de Mann-Whitney). La correlación de Pearson entre microarray logFC y qRT-PCR logFC fue r = 0,89 (IC 95%: 0,66–0,97, P = 0,0004), lo que indica un fuerte acuerdo. También se confirmaron diferencias en la expresión de SUCNR1 y GPR37L1 (Figuras 5A,B).

Análisis de redes PPI
Se construyó una red PPI a partir de todos los DEG (puntuación de interacción > 0,9; Figura 6A). Las diez principales proteínas hub según el grado de conectividad fueron RTP5 (grado = 14), CXCL1 (grado = 8), CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4, SUCNR1 (grado = 7) y ATM (grado = 5) (Figura 6B y Tabla 6). Se extrajo una subred de genes clave del hub usando un plugin de extracción de subred con parámetros predeterminados. El algoritmo de extracción de subred identificó un clúster densamente conectado que contenía RTP5, CXCL1, CXCL10, GPR37L1, HCAR1, OPRL1, P2RY4, SSTR4 y SUCNR1, con una puntuación de clúster de 6,2. ATM no se incluyó en la subred porque tenía menor conectividad con el clúster central (Figura 6C).

Asociación entre la memoria verbal y SUCNR1/GPR37L1
La expresión de SUCNR1 fue significativamente elevada, mientras que la expresión de GPR37L1 se redujo en pacientes con esquizofrenia en comparación con controles sanos (Figuras 5A,B). La expresión SUCNR1 mostró una correlación negativa con las puntuaciones de memoria verbal (r = -0,54, IC 95%: -0,79 a -0,13, R² = 0,287, P = 0,015; Figura 5C), mientras que GPR37L1 expresión mostró una correlación positiva con las puntuaciones de memoria verbal (r = 0,59, IC 95%: 0,20 a 0,82, R² = 0,349, P = 0,0034; Figura 5D). Se realizaron análisis de correlación en los 20 sujetos, incluyendo 10 pacientes con esquizofrenia y 10 controles sanos. Con un tamaño de muestra de 20, el estudio tenía un 80% de poder para detectar un coeficiente de correlación de |r| > 0,6 a α = 0,05. Dado el tamaño de muestra modesto, estos hallazgos correlacionales son preliminares y requieren validación en cohortes independientes más grandes.

Declaración de Disponibilidad de Datos
El GSE54913 conjunto de datos analizado en este estudio está disponible públicamente a través del Gene Expression Omnibus. Los valores brutos de qRT-PCR Ct se proporcionan en la Tabla Suplementaria S1. Los scripts de análisis, archivos de salida DEG, resultados de enriquecimiento, archivos de red PPI y archivos fuente de figuras están disponibles en https://sandbox.zenodo.org/records/514960 o 10.5072/zenodo.514960.

Figura 1: Diagrama de flujo: recogida, preprocesamiento, análisis y validación de datos. Análisis de microarrays de ARNm en PBMCs obtenidos de GSE54913. Se realizaron análisis funcionales y de enriquecimiento de vías GO en los DEGs. Los 10 genes más destacados clasificados por cambio de pliegue fueron seleccionados para validar datos de microarrays mediante qRT-PCR. El análisis de redes de IBP identificó dos genes centrales. Finalmente, se realizó un análisis ex vivo de los dos genes centrales SUCNR1 y GPR37L1 . Abreviaturas: DEGs = genes expresados diferencialmente; ARNm = ARN mensajero; PBMCs = células mononucleares de sangre periférica; qRT-PCR = reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa; IBP = interacción proteína-proteína. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Selección de DEG y análisis jerárquico de agrupamientos. (A) Trama volcánica de DEGs. El eje horizontal representa log₂ (cambio de pliegue), y el eje vertical representa –log₁₀ (valor P). Los puntos verdes y rojos representan genes expresados diferencialmente, y los puntos negros representan genes no expresados diferencialmente. (B) Número de DEGs regulados a la baja y al alza. (C) Mapa térmico de genes expresados diferencialmente. El rojo indica regulación al alza y el verde a la baja. Abreviatura: DEGs = genes expresados diferencialmente. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Análisis de enriquecimiento GO y KEGG de DEGs. (A,B) el enriquecimiento GO y (C) el enriquecimiento KEGG se muestran basados en valores P brutos. Abreviaturas: DEGs = genes expresados diferencialmente; GO = Ontología génica; KEGG = Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto; BP = proceso biológico; CC = componente celular; MF = función molecular. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Validación de datos de microarrays para los diez genes más desregulados utilizando qRT-PCR. (R) Regulación a la baja de los cinco primeros DEGs. (B) Aumento de los cinco primeros DEGs. Los datos son la media ± error estándar de la media. Los valores p se muestran en los paneles correspondientes. Abreviaturas: DEGs = genes expresados diferencialmente; qRT-PCR = reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Expresión de SUCNR1 y GPR37L1 en pacientes con esquizofrenia y controles sanos. (A) SUCNR1 y (B) GPR37L1 expresión determinada por qRT-PCR. Correlación entre la memoria verbal y (C) SUCNR1 y (D) GPR37L1 expresión. Los datos se muestran como media ± error estándar de la media cuando corresponde. Los valores p para las correlaciones se muestran en los paneles correspondientes. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Análisis de redes de interacción proteína-proteína. (A) Red PPI analizada utilizando una base de datos de interacción proteína-proteína. (B) Proteínas clasificadas por grado de asociación en la red de IBP. (C) Subred visualizada usando software de visualización de red tras el análisis de extracción de subred. Abreviatura: PPI = interacción proteína-proteína. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Variable	Sujetos de control (n = 10)	Pacientes con esquizofrenia (n = 10)
Edad (año)	36,5 ± 10,6	44,5 ± 9,5
Sexo femenino, n (%)	5 (50)	5 (50)
Tiempo de sueño diario (h)	5.4 ± 3.1	7.5 ± 1.2
Índice de masa corporal (IMC; kg/m²)	25,2 ± 4,1	22,9 ± 2,3
Puntuación de memoria verbal	61 ± 18	30,2 ± 10,8
Los datos se presentan como media ± desviación estándar o número (%).

Tabla 1: Características basales de pacientes con esquizofrenia y sujetos de control.

Símbolo génico	Secuencia de cebador hacia adelante (5'→3')	Secuencia de cebador inverso (5'→3')
HCN3	GTCCGCCGGGGGGTGGAT	CCTCCCACTGGTGTTATGTAGC
OLFML2A	CAGGCAGAGCGGGCGAAG	AATATTTGCGGACTGGGTCA
NOX1	CACCCCAAGTGTGTGTGGGAG	CCAGACTGGAATATCGGTGACA
MRGPRX1	CTAGGGTACCACGGAGGATT	TGGTTCTGGAGGCTCCTTGC
BRIP1	CAGATGAGGGCG-TAAGTGA	CGTCCCCCCGGAGCTCTCTAG
CCL22	TCCATCATCTCTCTCTGACTCTGA	CTGTGGGTCAGAGAGTCAGAAGAGA
PNMA2	GCGGGTCAATTCTCGGGACA	GTCCTGCCCCCAGGTGGTTT
TBX20	GAGGGAAAGTGTGGAGAGCC	AAGGCTGACCCTCGATTTGG
ERAS	AGTCTATTATTTTTGGGCACC	CCTTGTGGTTCCCTGAGAC
C12orf68	TTCAACCCCTACACCGAGTT	CTTGAACGTGGACTGCAGC
GPR37L1	ATGTTTCTTGCCGAGCAGTG	CCACATGGAATCGGTCTAT
SUCNR1	ACAGAAGCCGACAGCAGAAT	GCACAGGAAAGCAAGTCAG
β-Actina	CTAAGGCCAACCGTGAAAAG	GCATACAGGGACAACACAG
qRT-PCR: reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real.

Tabla 2: Cebadores de PCR para qRT-PCR.

GO ID	Término	Valor p bruto	Conde
GO:0015267	Actividad del canal	0.000000056	13
VAMOS:0022803	Actividad pasiva del transportador transmembrana	5.78E-08	13
¡ADELANTE:0005216	Actividad en canales iónicos	0.000000127	12
¡VAMOS:0022839	Actividad de canales con acceso iónico	0.000000131	11
GO:0022836	Actividad en canales restringidos	0.000000136	11
GO:0022838	Actividad de canal específica del sustrato	0.00000017	12
GO:0005261	Actividad del canal catiónico	0.00000668	9
GO:0015276	Actividad en canales iónicos con ligando	0.000315	5
¡VAMOS:0022834	Actividad de canales con acceso a ligandos	0.000315	20
GO:0022890	Actividad del transportador transmembrana de cationes inorgánicos	0.000487	20
GO:0008324	Actividad del transportador transmembrana catiónico	0.0009	18
GO:0099094	Actividad en canales cationes con ligandos	0.00128	16
GO:0005244	Actividad de canales iónicos dependientes de voltaje	0.001382	16
GO:0022832	Actividad de canal dependiente de voltaje	0.001382	18
GO:0046873	Actividad del transportador transmembrana de iones metálicos	0.001836	21
GO:0022824	Actividad en canal iónico controlado por transmisor	0.002762	19
¡VAMOS:0022835	Actividad de canal con puerta de transmisor	0.002762	13
Nota: Los valores P son en bruto y no ajustados; significación se definió como P < en bruto 0,05.

Tabla 3: Análisis de ontología génica de genes expresados diferencialmente (P < en bruto 0,05).

ID	Descripción	Valor p bruto	Conde
HSA04911	Secreción de insulina	0.007066	6
HSA04024	Vía de señalización cAMP	0.010661	10
HSA03420	Reparación por escisión de nucleótidos	0.013724	4
HSA04668	Vía de señalización TNF	0.023694	6
HSA00480	Metabolismo del glutatión	0.02466	4
HSA04740	Transducción olfativa	0.032104	15
HSA05222	Cáncer de pulmón de células pequeñas	0.03572	5
HSA00590	Metabolismo del ácido araquidónico	0.035991	4
HSA04080	Interacción neuroactiva ligando-receptor	0.037546	12
HSA05031	Adicción a las anfetaminas	0.045653	4
HSA05203	Carcinogénesis viral	0.046404	8
HSA04933	Vía de señalización AGE-RAGE en complicaciones diabéticas	0.04831	5
Nota: Los valores P son en bruto y no ajustados; significación se definió como P < en bruto 0,05.

Tabla 4: Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto, análisis de enriquecimiento de genes (raw P < 0,05).

Símbolo génico	Nombre completo oficial	logFC	Valor p bruto
Regulación a la baja
HCN3	Canal cíclico activado por hiperpolarización y dependiente de nucleótidos 3	-1.489	0.0001
OLFML2A	Proteína similar a la olfactomedina 2A	-1.521	0.0042
NOX1	NADPH oxidasa 1	-1.522	0.0022
MRGPRX1	Miembro receptor acoplado a proteínas G relacionadas con MAS X1	-1.526	0.0003
BRIP1	Anemia de Fanconi grupo J	-1.699	0.0018
Regulados al alza
CCL22	Quimoquina con motivo C-C 22	2.517	0.0041
PNMA2	Antígenos Ma paraneoplásicos	2.159	0.0062
TBX20	Factor de transcripción T-box TBX20	1.866	0.0001
ERAS	GTPase Eras	1.846	0.0008
C12orf68	Dominio de bobina enrollada que contiene 184	1.839	0.0002
Nota: logFC y los valores P en bruto provienen del análisis de expresión diferencial de microarrays.

Tabla 5: Los diez principales DEG clasificados por cambio de pliegue en genes regulados al alza y a la baja.

Símbolo génico	Descripción	Cogenes (n)	Valor p
RTP5	Proteína transportadora receptora 5	14	0.000276
CXCL1	Proteína alfa regulada por crecimiento 1	8	0.011423
CXCL10	Quimoquina con motivo C-X-C 10	7	0.046144
GPR37L1	Receptor de prosaposina GPR37L1	7	0.003792
HCAR1	Receptor de ácido hidroxicarboxílico 1	7	0.046572
OPRL1	Receptor de nociceptina 1	7	0.039753
P2RY4	P2Y purinoceptor 4	7	0.001279
SSTR4	Receptor de somatostatina tipo 4	7	0.006742
SUCNR1	Receptor succinato 1	7	0.000105
Cajero automático	Quinasa de proteínas serinas ATM	5	0.004961
IBP: interacción proteína-proteína; DEGs: genes expresados diferencialmente.

Tabla 6: Los 10 principales genes hub identificados en la red de IBP para los DEGs.

Tabla suplementaria 1: Valores de CT en bruto de qRT-PCR, flujo de trabajo completo de análisis bioinformático y resultados procesados (DEG, GO/KEGG y PPI) del estudio Por favor haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La esquizofrenia es un trastorno grave y multifactorial que implica numerosos factores de susceptibilidad genética^13,14. Aunque se han avanzado en la comprensión de su fisiopatología, aún faltan biomarcadores diagnósticos fiables. En este estudio, un enfoque integrado de bioinformática identificó 473 DEGs en muestras de sangre de pacientes con esquizofrenia. Los análisis de GO y KEGG destacaron el enriquecimiento en términos y vías relacionados con la actividad de los canales, incluyendo la secreción de insulina, la señalización de cAMP, la reparación por escisión de nucleótidos, la señalización de TNF y el metabolismo del glutatión. El análisis de redes IBP identificó además SUCNR1 y GPR37L1 como genes centrales, y su expresión se asoció con el rendimiento de la memoria verbal, lo que sugiere su posible relevancia como marcadores moleculares asociados a la esquizofrenia.

El enriquecimiento de los términos GO de "actividad de canales" se alinea con investigaciones previas sobre esquizofrenia. Los canales de calcio dependientes de voltaje (por ejemplo, CACNA1C, CACNB2) y canales de potasio (por ejemplo, Kv3, Kv2.1) han sido implicados en la susceptibilidad a la esquizofrenia y la excitabilidad neuronal 15,16. De manera similar, las principales vías KEGG identificadas son consistentes con la literatura existente. Se reportan hiperinsulinemia y anomalías en la secreción de insulina en la esquizofrenia^{temprana 17}. La vía de señalización del cAMP está cada vez más vinculada a la fisiopatología^{de la enfermedad 18}. Los mecanismos de reparación por escisión de nucleótidos, incluida la modificación de H2AX en variantes de histonas, también pueden desempeñar un papel 19,20,21,22. Además, la señalización del TNF y el metabolismo del glutatión se han asociado con la patogénesis de la^{esquizofrenia 23,24}.

El deterioro de la memoria verbal es un déficit cognitivo central en la esquizofrenia, está presente al inicio de la enfermedad y está asociado con resultados funcionales. El Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R) es una medida bien validada del aprendizaje verbal y la memoria. Evaluar la correlación entre la expresión de marcadores candidatos y el rendimiento de la memoria verbal ayuda a establecer la relevancia clínica, ya que el deterioro cognitivo es un determinante importante de la discapacidad en la esquizofrenia.

Aunque los diez principales DEG validados por qRT-PCR coincidieron con datos de microarrays, no coincidieron estrechamente con los hallazgos principales de GO/KEGG. En cambio, SUCNR1 (regulado al alza) y GPR37L1 (regulado a la baja) se asociaron significativamente con "actividad de canales iónicos" y enriquecieron en "secreción de insulina". Ambos genes codifican receptores acoplados a proteínas G (GPCR), que son objetivos críticos de los antipsicóticos y modulan la actividad del canal^{iónico 25}.

SUCNR1 (GPR91) vincula el estrés metabólico con la secreción y resistencia a la insulina^26,27, y la resistencia a la insulina es un factor de riesgo conocido para la^{esquizofrenia 28}. GPR37L1, un receptor huérfano altamente expresado en el cerebro, está implicado en el desarrollo cerebeloso y la función^{motora 29}, y ha sido implicado en la enfermedad de^{Parkinson 30} y el transporte renal^{de sodio 31}. Su papel en la esquizofrenia puede implicar la modulación de la actividad de los canales iónicos.

El deterioro de la memoria verbal es una característica central de la esquizofrenia, reflejando la responsabilidad genética y la gravedad de la^{enfermedad 32,33}. La correlación inversa entre la expresión de SUCNR1 y la correlación positiva de la expresión GPR37L1 con las puntuaciones de memoria verbal apoyan aún más su posible relevancia en la esquizofrenia.

Deben reconocerse varias limitaciones. Primero, el tamaño de la muestra para la cohorte de validación (n = 10 por grupo) era pequeño, lo que limita el poder estadístico y la generalizabilidad. En segundo lugar, todos los pacientes con esquizofrenia estaban recibiendo medicamentos antipsicóticos, por lo que los cambios observados en la expresión pueden reflejar efectos de la medicación más que patologías de la enfermedad. Los estudios futuros deberían incluir pacientes con ingenuidad en medicamentos en el primer episodio. En tercer lugar, la cohorte de validación carecía de confirmación de RNA-seq; Se justifica la secuenciación a nivel de transcriptoma en cohortes independientes más grandes. En cuarto lugar, el diseño transversal impide la evaluación de las relaciones causales entre los niveles de biomarcadores y la progresión de la enfermedad. Quinto, los análisis de correlación con la memoria verbal fueron exploratorios y requieren replicación. En sexto lugar, el conjunto de datos GSE54913 se generó en una plataforma de microarrays que tiene menor sensibilidad que RNA-seq. Las direcciones futuras incluyen estudios longitudinales para rastrear los niveles de SUCNR1 y GPR37L1 a lo largo de la enfermedad y el tratamiento, estudios funcionales para esclarecer los roles mecanicistas de estos GPCRs en la fisiopatología de la esquizofrenia y el desarrollo de un ensayo clínicamente validado para estos biomarcadores.

En resumen, este análisis integrado sugiere que la alteración de la expresión de SUCNR1 y GPR37L1 está asociada con la esquizofrenia y el rendimiento de la memoria verbal. Estos genes pueden representar marcadores moleculares candidatos asociados a la esquizofrenia. Sin embargo, las limitaciones incluyen un tamaño de muestra relativamente pequeño y la evaluación parcial de la gravedad de la esquizofrenia mediante la memoria verbal. Se requieren estudios adicionales para validar estos hallazgos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
affy	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/affy/	microarray preprocessing software. Description: R package for microarray preprocessing
clusterProfiler	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	functional enrichment analysis software. Description: R package for functional enrichment analysis
CytoHubba	National Institute of Bioinformatics	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba	hub gene identification plugin. Description: Cytoscape plugin for hub gene identification
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	network visualization software. Description: Software for network visualization and analysis
G*Power	Heinrich Heine University Düsseldorf	https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower	sample size calculation software. Description: Sample size calculation software
GraphPad Prism	GraphPad Software	https://www.graphpad.com/	statistical analysis and graphing software. Description: Statistical analysis and graphing software
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	density gradient medium. Description: Density gradient medium for PBMC isolation
impute	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/impute/	missing-value imputation software. Description: R package for missing-value imputation
Limma	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/limma/	differential expression analysis software. Description: R package for differential expression analysis
MCODE	Cytoscape app	https://apps.cytoscape.org/apps/mcode	subnetwork extraction plugin. Description: Cytoscape plugin for subnetwork extraction
R/Bioconductor	R Foundation	https://www.r-project.org/	statistical computing environment. Description: Statistical computing environment
STRING	EMBL	https://string-db.org/	protein-protein interaction database. Description: Protein-protein interaction database
SYBR Green	Takara	RR820A	fluorescent dye for qRT-PCR. Description: Fluorescent dye for qRT-PCR
TRIzol	Takara	9109	RNA extraction reagent. Description: Reagent for RNA extraction