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Artículo de investigación
Este estudio evalúa SUCNR1 y GPR37L1 como marcadores moleculares asociados a la esquizofrenia candidatos mediante análisis bioinformático integrado del conjunto de datos GSE54913, validación cuantitativa en tiempo real de la reacción en cadena de la polimerasa (qRT-PCR) y análisis de correlación con memoria verbal en una cohorte independiente.
La esquizofrenia es un trastorno mental grave, complejo y multifactorial que implica numerosos elementos de susceptibilidad genética, lo que conduce a una discapacidad sustancial, morbilidad y mortalidad. A pesar de los avances significativos en la comprensión de su fisiopatología y etiología, los biomarcadores diagnósticos específicos para la esquizofrenia siguen siendo esquivos. Este estudio tenía como objetivo identificar marcadores moleculares candidatos asociados con la esquizofrenia. Se realizó un análisis bioinformático integrado sobre el conjunto de datos público de microarrays GSE54913. Los análisis de la Ontología Génica (GO) y la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG) revelaron que los términos GO más enriquecidos estaban relacionados con la actividad del canal, incluyendo la actividad pasiva del transportador transmembrana, la actividad de canales iónicos, la actividad de canales controlados y la actividad específica del canal del sustrato. Las cinco principales vías enriquecidas de KEGG fueron secreción de insulina, vía de señalización de cAMP, reparación por escisión de nucleótidos, vía de señalización TNF y metabolismo del glutatión. La validación se llevó a cabo utilizando reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) en un conjunto de muestras independientes del Hospital Rongjun Youfu de Wuhan. Los resultados de qRT-PCR fueron en gran medida consistentes con el análisis de microarrays (Pearson r = 0,89, IC 95%: 0,66–0,97). El análisis de la red de interacción proteína-proteína (PPI) identificó dos genes centrales, SUCNR1 y GPR37L1, que estaban significativamente asociados con el término GO 'actividad de canales iónicos' y enriquecidos en la vía KEGG 'secreción de insulina'. Además, la expresión de SUCNR1 mostró una correlación negativa con las puntuaciones de memoria verbal (r = -0,54, P = 0,015), mientras que GPR37L1 expresión mostró una correlación positiva (r = 0,59, P = 0,0034). Estos hallazgos sugieren que la expresión alterada de SUCNR1 y GPR37L1 podría estar asociada con la esquizofrenia y representar marcadores moleculares candidatos para investigaciones posteriores.
La esquizofrenia es un trastorno mental crónico y complejo de etiología no identificada, caracterizado por una grave disfunción cerebral, deterioro cognitivo y déficits psicosociales. Supone una gran carga sanitaria global, afectando a más de 21 millones de personas entodo el mundo 2. Aunque los enfoques diagnósticos y terapéuticos han evolucionado considerablemente en los últimos cincuenta años, la patogénesis central sigue siendo incierta, y los resultados a largo plazo asociados a una discapacidad sustancial, morbilidad y mortalidad no han mejoradonotablemente 3. Por lo tanto, es imprescindible identificar genes clave potenciales y objetivos reguladores.
La fisiopatología de la esquizofrenia, aunque no está completamente esclarecida, se atribúe ampliamente a polimorfismos genéticos y variaciones de expresión4. Por ejemplo, la variación genética en el gen alfa de estrógenos puede influir en la susceptibilidad a la esquizofrenia mediante una regulación genética alternativa y el procesamiento detranscripciones 5. De manera similar, una variante promotora funcional de NRG1 se ha relacionado con la esquizofrenia y se ha correlacionado con la reducción de la expresión de la isoformaNRG1 tipo III 6. Los estudios postmortem han demostrado una expresión significativamente reducida de isoformas de PDE4B en cerebros esquizofrénicos, lo que sugiere su potencialpredictivo. Otros candidatos incluyen el transportador de dopamina (DAT), el transportador vesicular de monoaminas (VMAT2) y la monoaminooxidasa (MAO), que regulan los niveles sinápticos de dopamina y pueden servir como biomarcadores8. Además, TCP1 puede contribuir a déficits del citoesqueleto mediante un plegamiento incorrecto de actina en laesquizofrenia 9. Así, elucidar los perfiles de expresión génica en la patogénesis de la esquizofrenia podría aportar información sobre la predicción de riesgos, la comprensión mecanicista y la evaluación terapéutica.
Los enfoques computacionales recientes han avanzado en la identificación de genes asociados a enfermedades mediante análisis integrado de redes y métodosde aprendizaje automático 10,11,12. A pesar de numerosos estudios genéticos, no se han traducido biomarcadores diagnósticos sanguíneos fiables en la práctica clínica de la esquizofrenia. Para cubrir esta carencia, el presente estudio empleó un enfoque integrado de bioinformática para reanalizar el conjunto de datos GSE54913, que contiene datos transcriptómicos derivados de la sangre de pacientes bien caracterizados con esquizofrenia y controles sanos. El conjunto de datos fue seleccionado porque (1) las muestras de sangre periférica son mínimamente invasivas y clínicamente prácticas, (2) incluye un tamaño de muestra relativamente grande entre los conjuntos de datos de microarrays de esquizofrenia disponibles públicamente, y (3) los datos en bruto estaban disponibles para su reanálisis. Los objetivos de este estudio fueron: (1) identificar genes expresados de forma diferencial en pacientes con esquizofrenia en comparación con controles sanos utilizando el conjunto de datos GSE54913; (2) realizar análisis de enriquecimiento funcional y redes PPI para identificar genes centrales; (3) validar la expresión de genes candidatos mediante qRT-PCR en una cohorte independiente; y (4) explorar la correlación entre la expresión génica central y el rendimiento de la memoria verbal. Según el conocimiento de los autores, este es el primer estudio que identifica SUCNR1 y GPR37L1 como marcadores moleculares sanguíneos candidatos para la esquizofrenia.
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Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Rongjun Youfu de Wuhan (código de identificación del proyecto, YF-IRB202310215) y realizado conforme a los principios de la Declaración de Helsinki. Todos los participantes eran residentes de la comunidad china y proporcionaron su consentimiento informado por escrito.
Sujetos de estudio y análisis de sangre
Se incluyeron diez adultos diagnosticados con esquizofrenia y diez voluntarios controlados sanos sin antecedentes familiares de enfermedad mental en tres generaciones. Criterios de inclusión para pacientes con esquizofrenia: (1) diagnóstico de esquizofrenia según los criterios del DSM-5 confirmado por dos psiquiatras senior independientes; (2) edad de 18 a 65 años; (3) no cambiar la medicación antipsicótica durante al menos 4 semanas antes de la toma de muestras de sangre; (4) disposición a proporcionar consentimiento informado por escrito. Criterios de exclusión: (1) enfermedades médicas graves comórbidas (por ejemplo, diabetes, enfermedades cardiovasculares, cáncer); (2) abuso o dependencia de sustancias en los últimos 6 meses; (3) discapacidad intelectual; (4) embarazo o lactancia. Criterios de inclusión para controles sanos: (1) no hay antecedentes personales o familiares (en tres generaciones) de ninguna enfermedad mental; (2) no usar medicamentos antipsicóticos actuales o pasados; (3) coincidían por edad y sexo con el grupo de esquizofrenia; (4) no tener enfermedades médicas graves. La duración media de la enfermedad en pacientes con esquizofrenia fue de 12,5 ± 6,8 años; Todos los pacientes estaban con medicación antipsicótica estable (6 con risperidona, 4 con olanzapina); la puntuación media total de PANSS fue de 76,4 ± 12,3. Los controles se emparejaron por edad (±5 años) y sexo (5 hombres, 5 mujeres por grupo). La memoria verbal se evaluó utilizando la puntuación total de recuerdo en el Hopkins Verbal Learning Test–Revised (HVLT-R). Todos los sujetos fueron reclutados del Hospital Rongjun Youfu de Wuhan entre el 1 de enero y el 31 de julio de 2025. Las demografías de referencia se resumen en la Tabla 1.
El tamaño de la muestra se determinó utilizando software de cálculo de tamaño muestral para una prueba t independiente de dos colas con un tamaño de efecto de 1,2, α = 0,05 y potencia (1-β) = 0,80, lo que resultó en un mínimo de nueve sujetos por grupo.
Se extraía sangre venosa en tubos anticoagulados con EDTA y se procesaba sin demora. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se separaron de las muestras mediante centrifugación por gradiente de densidad utilizando un medio con gradiente de densidad. Brevemente, la sangre se diluyó 1:1 con solución fisiológica con suero tamponado con fosfato (PBS, pH 7,4), se aplicó en capas sobre el medio de gradiente de densidad y se centrifugó a 400 × g durante 30 minutos a 20 °C con el freno desconectado. Tras la centrifugación, la interfaz que contenía PBMC se transfirió cuidadosamente a un nuevo tubo. Las células se enjuagaron dos veces con PBS, con cada lavado seguido de centrifugación a 300 × g durante 10 minutos a 4 °C, y el último pellet se suspendió en PBS. Se evaluó la viabilidad utilizando el método de exclusión de colorantes con tripán azul, y solo se utilizaron preparaciones con ≥95% de células viables. Los PBMCs aislados fueron alicitados y almacenados a −80 °C durante un máximo de 3 meses antes de la extracción de ARN.
Datos de microarrays
El flujo de trabajo del estudio se muestra en la Figura 1. El conjunto de datos de microarrays GSE54913 fue descargado de la base de datos GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Este conjunto de datos fue seleccionado porque (1) contiene datos transcriptómicos de muestras de sangre periférica, que son mínimamente invasivas y clínicamente prácticas para el descubrimiento de biomarcadores; (2) incluye un tamaño de muestra relativamente grande entre conjuntos de datos de microarrays de esquizofrenia disponibles públicamente (18 pacientes, 12 controles); (3) los datos en bruto estaban disponibles para su reanálisis. Según el registro GEO, las muestras se derivaron de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), no de plasma. La descripción original de 'muestras de plasma' en la versión anterior era un error y ha sido corregida.
Preprocesamiento de datos y cribado génico diferencialmente expresado (DEG)
Datos en bruto (. archivos CEL) se preprocesaban utilizando software de preprocesamiento de microarrays. La corrección de fondo se realizó utilizando el método Robust Multichip Average (RMA), seguida de la normalización de cuantiles y la transformación log2. Se filtraron los conjuntos de sonda sin ninguna anotación genética. Se excluyeron sondas con valores ausentes del >20% entre las muestras; Los valores faltantes de las sondas restantes se imputaron utilizando el algoritmo de k vecinos más cercanos (k = 10) implementado en el software de imputación de valores faltantes. No hubo efectos de lote ya que todas las muestras se procesaron en un solo lote según el registro GEO. Tras el preprocesamiento, se obtuvieron valores de expresión de 17.200 genes para análisis posteriores. Se identificaron las DEG entre pacientes con esquizofrenia y controles sanos mediante software de análisis de expresión diferencial. Se consideraron que los genes con una tasa de falsa tasa de descubrimiento (FDR) < 0,05, cambio absoluto de pliegue (FC) > 1,2 y P < 0,05 se expresaban de forma diferencial. Se eligió un umbral relativamente bajo de FC (FC absoluta > 1,2) porque la esquizofrenia es un trastorno psiquiátrico complejo en el que las diferencias de expresión génica individuales suelen ser sutiles en lugar de dramáticas.
GO y análisis de enriquecimiento de vías
Se realizaron análisis de enriquecimiento funcional para términos de Ontología Génica (GO) y vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) utilizando software de análisis de enriquecimiento funcional. El conjunto de genes de fondo consistía en todos los genes que pasaron el preprocesamiento (17.200 genes). Se reportaron términos de enriquecimiento y vías con valores P brutos < 0,05. Como se usaron valores P en bruto para las salidas de enriquecimiento GO y KEGG, estos resultados deben interpretarse como exploratorios.
Análisis de redes de PPI e identificación de genes centrales
Se utilizó una base de datos de interacción proteína-proteína para construir una red de IBP, con una puntuación combinada de interacción > 0,9 como umbral. La red se visualizaba mediante software de visualización de red. Los genes hub se identificaron mediante un plugin de identificación de genes hub con el algoritmo Degree. Los 10 mejores nodos con las puntuaciones de grado más altas fueron seleccionados como genes centrales. La subred de genes clave del hub se extrajo usando un plugin de extracción de subred con parámetros por defecto (corte de grado = 2, corte de puntuación de nodo = 0,2, núcleo de núcleo = 2, profundidad máxima = 100).
Aislamiento total de ARN y qRT-PCR
β-Actin se utilizaba como gen de referencia interno (de mantenimiento). La estabilidad de la expresión de β-actina entre muestras se confirmó por la ausencia de diferencias significativas en los valores de Ct entre los grupos esquizofrenia y control (P > 0,05). La cuantificación relativa se realizó utilizando el método 2−ΔΔCt . Todas las reacciones se realizaron en triplicado y se utilizó el valor medio de Ct para el cálculo (véanse las secuencias de cebadores en la Tabla 2). Los diez principales DEG (cinco más significativamente al alza y cinco más significativamente a la baja por cambio de pliegue) fueron seleccionados para la validación inicial qRT-PCR con el fin de confirmar la fiabilidad global de los datos del microarray. Posteriormente, SUCNR1 y GPR37L1 fueron seleccionados para una validación enfocada basándose en tres criterios: (1) fueron identificados como genes hub en el análisis de redes PPI (grado ≥ 7); (2) se asociaron significativamente con el término GO enriquecido máximo 'actividad de canales iónicos' y la vía KEGG 'secreción de insulina'; (3) ambos codifican GPCRs, que son objetivos conocidos de fármacos en la esquizofrenia.
Análisis estadístico
La normalidad se evaluó con la prueba de Shapiro–Wilk. Las variables que mostraron una distribución aproximadamente normal (P > 0,05) se analizaron utilizando métodos paramétricos, incluyendo la prueba t de Student para comparaciones entre dos grupos y ANOVA unidireccional para comparaciones entre más de dos grupos. Cuando no se cumplía la suposición de normalidad, se utilizaban pruebas de Mann–Whitney U o Kruskal–Wallis, según correspondía. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos colas. Para comparaciones múltiples (por ejemplo, en pruebas post-hoc ANOVA), se aplicó el método de tasa de descubrimiento de falsos fondos de Benjamini-Hochberg (FDR), con un umbral FDR de 0,05. Para los análisis de correlación, no se aplicó corrección por comparación múltiple, ya que solo se realizaron dos correlaciones; los valores P brutos se informan con precaución.
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Identificación de DEGs y agrupamiento jerárquico
El análisis del conjunto de datos GSE54913 identificó 473 genes diferencialmente expresados (DEGs), incluyendo 357 genes con aumento y 116 genes con regulación a la baja, entre pacientes con esquizofrenia y controles (Figura 2A,B). El agrupamiento jerárquico de estos DEGs distinguió las muestras de esquizofrenia de los controles (Figura 2C).
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La esquizofrenia es un trastorno grave y multifactorial que implica numerosos factores de susceptibilidad genética13,14. Aunque se han avanzado en la comprensión de su fisiopatología, aún faltan biomarcadores diagnósticos fiables. En este estudio, un enfoque integrado de bioinformática identificó 473 DEGs en muestras de sangre de pacientes con esquizofrenia. Los análisis de GO y KEGG destacaron el enriquecimiento en términos y ví...
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Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.
Este estudio fue apoyado por el Proyecto Mayor de Ciencia y Tecnología Nacional de Enfermedades Crónicas No Transmisibles de China (2025ZD0549004).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| affy | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/affy/ | microarray preprocessing software. Description: R package for microarray preprocessing |
| clusterProfiler | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/ | functional enrichment analysis software. Description: R package for functional enrichment analysis |
| CytoHubba | National Institute of Bioinformatics | https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba | hub gene identification plugin. Description: Cytoscape plugin for hub gene identification |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | network visualization software. Description: Software for network visualization and analysis |
| G*Power | Heinrich Heine University Düsseldorf | https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower | sample size calculation software. Description: Sample size calculation software |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | https://www.graphpad.com/ | statistical analysis and graphing software. Description: Statistical analysis and graphing software |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | density gradient medium. Description: Density gradient medium for PBMC isolation |
| impute | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/impute/ | missing-value imputation software. Description: R package for missing-value imputation |
| Limma | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/limma/ | differential expression analysis software. Description: R package for differential expression analysis |
| MCODE | Cytoscape app | https://apps.cytoscape.org/apps/mcode | subnetwork extraction plugin. Description: Cytoscape plugin for subnetwork extraction |
| R/Bioconductor | R Foundation | https://www.r-project.org/ | statistical computing environment. Description: Statistical computing environment |
| STRING | EMBL | https://string-db.org/ | protein-protein interaction database. Description: Protein-protein interaction database |
| SYBR Green | Takara | RR820A | fluorescent dye for qRT-PCR. Description: Fluorescent dye for qRT-PCR |
| TRIzol | Takara | 9109 | RNA extraction reagent. Description: Reagent for RNA extraction |
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