De los tejidos a la morfometría: un flujo de trabajo paso a paso de Golgi–Cox para el análisis neuronal y dendrítico de la columna en ratones adultos

Resumen

Este artículo describe un método paso a paso para la tinción de Golgi–Cox en ratones adultos, cubriendo la preparación de la solución, la impregnación de tejidos, la crioprotección, la sección, el revelado y el montaje. Hace hincapié en la preservación tisular y la tinción homogénea y de bajo fondo, permitiendo una visualización clara de la morfología neuronal. El método etiqueta los árboles dendríticos y soporta el análisis morfométrico cuantitativo de espinas dendríticas.

Resumen

El análisis de morfología neuronal en salud y enfermedad es fundamental para comprender la función cerebral y para evaluar los efectos de intervenciones experimentales. La tinción de Golgi–Cox sigue siendo una técnica clásica, pero muy relevante, para visualizar árboles neuronales completos y espinas dendríticas. Sin embargo, los protocolos publicados suelen diferir en pasos procedurales críticos y carecen de detalles metodológicos esenciales, lo que conduce a una variabilidad considerable en la calidad de la tinción y hace que la estandarización en laboratorio sea lenta y desafiante. Aquí se presenta un protocolo integral y paso a paso de Golgi–Cox para ratones adultos, que abarca todo el flujo de trabajo, desde la manipulación in vivo y el procesamiento de tejidos hasta la obtención de imágenes y la extracción de datos morfométricos. Detalla consideraciones prácticas y trampas comunes que influyen en la eficiencia de impregnación, la integridad de la sección y la relación señal-ruido, y proporciona orientación metodológica para mejorar la reproducibilidad. En conjunto, este protocolo permite una visualización fiable y un análisis cuantitativo de neuronas completas, segmentos dendríticos y espinas dendríticas. Se prevé que este recurso facilitará la implementación de la tinción de Golgi–Cox con mayor consistencia, transparencia y rigor técnico, al tiempo que ofrece un marco claro para adaptar el método a diversos entornos de laboratorio.

Introducción

El objetivo general del método de tinción de Golgi–Cox es permitir la visualización de alta resolución de la morfología neuronal completa, incluyendo árboles dendríticos y espinas dendríticas, en tejido cerebral^fijo 1,2,3,4. Esta técnica permite un análisis estructural detallado de neuronas individuales dentro de complejos circuitos neuronales, lo que la hace especialmente valiosa para estudios sobre plasticidad sináptica, neurodesarrollo, neurodegeneración y remodelación estructural dependiente de^{la experiencia 5,6}.

La razón de desarrollo y uso continuado de métodos basados en Golgi radica en su capacidad única para producir una impregnación neuronal escasa^{y completa 1,2}. Descrito originalmente por Camillo Golgi en 1873 y refinado en 1891 por^{Cox 7,8}, el método se basa en la precipitación de cromato de plata dentro de un subconjunto limitado de neuronas, lo que permite una reconstrucción morfológica completa sin solapamiento^{de marcajes 3}. La modificación de Golgi–Cox sustituye el nitrato de plata utilizado en el método original de Golgi por cloruro de mercurio, mejorando la penetración tisular y la consistencia de la^{tinción 2}. En comparación con técnicas alternativas de marcado neuronal como la expresión de proteínas fluorescentes, el trazado viral o los enfoques de relleno de colorantes, la tinción de Golgi–Cox ofrece varias ventajas. No requiere manipulación genética, inyecciones estereotaxicas ni equipos especializados de microscopía, y permite la visualización de espinas dendríticas con alto contraste bajo microscopía de campo^{claro 1,2}. Aunque los métodos modernos basados en fluorescencia proporcionan especificidad para el tipo celular, la tinción de Golgi–Cox sigue siendo especialmente ventajosa para muestreo morfológico^{imparcial 9,10} y para su uso en especies o condiciones experimentales donde no existen herramientas transgénicas disponibles.

En la literatura más amplia, los métodos basados en Golgi se han empleado extensamente para cuantificar la densidad y morfología de la columna dendrítica en estudios sobre aprendizaje y^{memoria 5}, estrés y trastornos psiquiátricos¹¹, envejecimiento¹² años y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer 12,13,14. Su uso continuado durante décadas pone de manifiada su fiabilidad para la neuroanatomía^{estructural 2}. Este método es especialmente adecuado para investigadores que analizan la arquitectura dendrítica y la morfología de la columna en tejido cerebral cuando se requiere la visualización de células^{completas 1}. Es muy adecuado para estudios morfológicos comparativos entre grupos experimentales. Sin embargo, los investigadores que requieren especificidad de tipo celular, imagen en vivo o colocalización molecular pueden beneficiarse más de enfoques de marcaje fluorescentes o codificados^{genéticamente 9,10}.

Protocolo

En este estudio se utilizaron ratones adultos de tipo salvaje B6129SF2/J (n = 3). Sin embargo, una tinción similar puede lograrse usando ambos sexos en la etapa adulta. Todos los procedimientos experimentales recibieron la aprobación previa del Comité de Bioética. (#117.A, Instituto de Neurobiología (INb), Universidad Nacional Autónoma de México)

1. Preparación de soluciones

PRECAUCIÓN: El cloruro de mercurio es altamente tóxico y corrosivo. Usa el mango dentro de una campana extractora química mientras llevas guantes, bata de laboratorio y protección ocular. Elimina los residuos en un contenedor de residuos peligrosos etiquetado. El dicromato de potasio y el cromato potásico son oxidantes tóxicos y cancerígenos. Usa el mango dentro de una campana extractora química y evita el contacto con la piel o la inhalación.

1. Prepara soluciones de impregnación de stock
   1. Pesa 15 g de dicromato de potasio. Disuelva en 300 mL de agua destilada doblemente para obtener una solución al 5% (p/v).
   2. Pesa 15 g de cloruro de mercurio. Disuelva en 300 mL de agua destilada doblemente para obtener una solución al 5% (p/v).
   3. Pesa 15 g de cromato potásico. Disuelva en 300 mL de agua destilada doblemente para obtener una solución al 5% (p/v).
   4. Envuelva todos los recipientes en papel de aluminio y guárdalos a temperatura ambiente, protegidos de la luz.
2. Preparar la solución de trabajo de Golgi–Cox
   1. Mezcla 50 mL de dicromato de potasio, 50 mL de dicromato de mercurio y 40 mL de cromato de potasio.
   2. Añade 100 mL de agua destilada y mezcla bien.
   3. Incuba la mezcla durante 48 horas a temperatura ambiente, protegida de la luz.
   4. Deja que el precipitado se asiente. Usa solo el sobrenadante para la impregnación de tejido.
      NOTA: La solución de Golgi–Cox puede almacenarse hasta un mes si se mantiene protegida de la luz. Para reducir los residuos de reactivos y garantizar la frescura de la solución, preparar solo el volumen requerido tanto de las soluciones estándar como de la solución final de Golgi–Cox necesaria para el experimento. Prepara al menos 23 mL por cerebro para obtener 20 mL de sobrenadante utilizable tras la pérdida de precipitados.
3. Prepara la solución crioprotectora
   1. Disuelva 300 g de sacarosa en solución salina fosfatada (PBS) tamponada con fosfato (PBS) de 0,1 M, pH 7,4, preparada con fosfato de sodio dibásico anhidro, monobase monohidratada de fosfato de sodio y cloruro de sodio.
   2. Ajusta el volumen final a 1 L.
   3. Conservar a 4 °C durante hasta una semana.

2. Recogida y fecundación de tejidos

1. Realizar perfusión intracardíaca
   1. Anestesiar al animal con pentobarbital sódico (252 mg/kg, i.p.). Confirma la profundidad adecuada de anestesia sin retirada del pedal antes de continuar.
   2. Realizar perfusión intracardíaca con aproximadamente 30 mL de PBS de 0,1 M (pH 7,4) hasta que el efluente se despeje, asegurando la eliminación completa de sangre del tejido cerebral. No se usó fijador; la propia solución de Golgi–Cox actúa como fijador en este flujo de trabajo.
   3. Extrae el cerebro con cuidado y enjuágalo con agua destilada. Asegúrate de que el cerebro esté correctamente perfundido y libre de sangre residual (Figura 1A).
2. Tejido impregnado
   1. Divide el cerebro en hemisferios o bloques coronales (~3 mm de grosor) usando una matriz cerebral para mejorar la impregnación. Los bloques de tejido más pequeños facilitan una impregnación más uniforme y reducen la variabilidad, mientras que las muestras más grandes pueden requerir tiempos de incubación más largos y mostrar una tinción menos homogénea.
   2. Colocar el cerebro en una solución de Golgi–Cox de 10 mL. Protege de la luz.
      NOTA: Un volumen de 10 mL de solución de Golgi–Cox es suficiente para un cerebro de ratón adulto completo. Cuando se utiliza un hemisferio único o bloques coronales más pequeños (~3 mm de grosor), el volumen de disolución puede reducirse proporcionalmente, siempre que el tejido permanezca completamente inmerso. Si se utiliza todo el cerebro, se recomienda seccionarlo preservando la región de interés para asegurar una penetración óptima del reactivo y una impregnación homogénea.
   3. Incubar durante 24 horas a temperatura ambiente.
   4. Sustituye por 10 mL de solución fresca de Golgi–Cox. Incuba durante 10-14 días a 22–25 °C en la oscuridad.
      PUNTO DE PAUSA: Almacenar tejido en solución de Golgi–Cox hasta 15 días sin pérdida significativa de viabilidad.
      NOTA: Tras la impregnación de Golgi–Cox, el cerebro adquiere una apariencia dorada oscura y se vuelve muy frágil; por lo tanto, manejarlo con cuidado (Figura 1B). Se recomienda usar pinzas de plástico para manipular y evitar reacciones químicas con materiales de acero.

3. Crioprotección

1. Transfiere el tejido a una solución crioprotectora de 10 mL (30% de sacarosa (p/v) en 0,1 M PBS, pH 7,4, preparado en el paso 1.3).
2. Incubar durante 24 horas (4 °C).
3. A la misma temperatura (4 °C), sustituir por una solución crioprotectora fresca e incubar durante al menos 4–7 días.
   PUNTO DE PAUSA: Antes de seccionar, almacena tejido en solución crioprotectora hasta 3 semanas a 4 °C.

4. Incrustación y seccionamiento

1. Tejido incrustado
   1. Prepara 8% (p/v) de agarosa en agua destilada caliente. Déjalo enfriar hasta aproximadamente 40 °C.
   2. Coloca el papel en moldes de incrustación y orienta adecuadamente.
   3. Vierte agarosa sobre el tejido y deja que se solidifique durante 1 hora a temperatura ambiente o 30 minutos a 4 °C (Figura 1 °C).
   4. Recorta el exceso de agarosa del bloque (Figura 1D).
2. Tejido seccional
   1. Fija el bloque de agarosa en la etapa de vibratome usando adhesivo. (Figura 1E)
   2. Llena la cámara de corte con solución crioprotectora.
   3. Tejido seccionado con un grosor de 100–200 μm. Se recomiendan secciones más finas (por ejemplo, 100–120 μm) para el análisis de la columna dendrítica para mejorar la resolución de imagen, mientras que secciones más gruesas (por ejemplo, 150–200 μm) pueden emplearse para la reconstrucción de neuronas completas. En este estudio, las secciones se cortaron a 120 μm (Figura 1F).
   4. Recoge secciones usando un pincel suave.
      NOTA: Anota los ajustes del vibratomo en la Tabla de Materiales. No enjuagues los toboganes bajo ninguna circunstancia una vez montadas las secciones. La sacarosa protegerá el tejido hasta la etapa de desarrollo.

5. Montaje

1. Preparación de portaobjetos recubiertos de gelatina
   1. Prepara una solución de recubrimiento disolviendo 0,5 g de gelatina en 100 mL (0,5% p/v) de agua destilada calentada hasta hervir.
   2. Remueve hasta que la gelatina se disuelva completamente y deja que la solución se enfríe a temperatura ambiente.
   3. Añade 0,05 g de sulfato de cromo potásico (0,05% p/v) y mezcla hasta que esté completamente disuelto. Elimina la espuma residual si es necesario.
   4. Filtra la solución de gelatina con papel filtro para eliminar partículas no disueltas y espuma residual, asegurando un recubrimiento uniforme de las láminas.
   5. Lava las láminas de vidrio con detergente neutro y agua, enjuaga bien y luego enjuaga con agua destilada.
   6. Sumerge las láminas en etanol al 96% hasta que no queden gotas visibles.
   7. Seca en el horno a 50–60 °C durante 30 minutos o hasta que esté completamente seca.
   8. Se desliza en la solución de gelatina y deja que el exceso de solución drene.
   9. Coloca las láminas en el horno a 50–60 °C durante 30 minutos o hasta que estén completamente secas.
   10. Repite el proceso de recubrimiento y secado al menos cinco veces para asegurar una adherencia adecuada.
   11. Tras el último paso de secado, deja que las láminas se enfríen a temperatura ambiente en un ambiente libre de polvo (por ejemplo, dentro de una campana extractora química) y guárdalas en un recipiente limpio y cerrado hasta su uso.
       NOTA: Prepara solo el volumen de solución de gelatina necesario para el número de láminas a recubrir. Las cantidades de reactivo pueden escalarse proporcionalmente manteniendo las concentraciones especificadas (p/v).
2. Coloca secciones sobre láminas de microscopio recubiertas de gelatina usando un pincel suave
   NOTA: Utiliza portaobjetos de microscopio recubiertos con al menos cinco capas de gelatina al 0,5%. Prepara las láminas con cuidado para asegurar la integridad del tejido durante el desarrollo. Las correderas electrocargadas no se probaron en este protocolo.
3. Remojas el papel absorbente con solución crioprotectora y colócala sobre las secciones.
4. Presiona suavemente con la palma para eliminar las burbujas de aire y asegurar un contacto uniforme entre la sección de tejido y el portaobjetos recubiertos de gelatina, promoviendo una adherencia estable durante el procesamiento posterior.
   NOTA: La presión suave mejora la adhesión al maximizar el contacto entre la sección y la capa de gelatina, reduciendo el riesgo de desprendimiento durante el desarrollo acuoso.
5. Retira el papel con cuidado y deja que las láminas se sequen a oscuridad durante 2–3 días a temperatura ambiente.
   NOTA: El secado en un entorno de baja humedad es fundamental para una adherencia estable. La protección contra la luz minimiza las alteraciones fotoquímicas del tejido impregnado de Golgi–Cox, que es sensible a la luz debido a la presencia de sales de cromato. Además, la agarosa residual no interfiere significativamente con el proceso de desarrollo y puede observarse alrededor del tejido en la sección desarrollada (Figura 2A). La presencia de agarosa facilita un manejo más seguro del tejido durante el montaje, ya que el tejido impregnado con Golgi–Cox es muy frágil. Si se desea, el exceso de agarosa puede retirarse cuidadosamente manualmente una vez que las secciones se hayan montado en las correderas.
   PUNTO DE PAUSA: Mantén las correderas protegidas de la luz.

6. Desarrollo

PRECAUCIÓN: El xileno es inflamable y tóxico por inhalación. Maneja la maneta en una campana extractora química y evita llamas abiertas. El amoníaco es corrosivo y produce vapores irritantes. Mango en una campana extractora.

1. Rehidratar Secciones
   1. Sumerge los toboganes en agua destilada durante 5 minutos.
   2. Transfiere a agua destilada fresca durante 5 minutos.
   3. Sumerge en etanol al 50% durante 5 minutos.
      NOTA: El paso del 50% de etanol proporciona una transición gradual de condiciones acuosas a deshidratación, facilitando la penetración del reactivo y ayudando a preservar la integridad tisular antes del paso de desarrollo.
2. Revelar tinción
   1. Incubar las láminas en solución acuosa de amoníaco preparadas mezclando 2 volúmenes de amoníaco al 25% con 1 volumen de agua destilada (2:1, v/v) durante 8 minutos
   2. Lava en agua destilada durante 5 minutos.
   3. Lava de nuevo en agua destilada durante 5 minutos.
   4. Incuba en un 5% (p/v) de tiosulfato de sodio en agua destilada durante 10 minutos en la oscuridad.
   5. Lava con agua destilada durante 1 minuto.
   6. Lava de nuevo en agua destilada durante 1 minuto.
      NOTA: Completar el proceso de desarrollo sin interrupciones una vez iniciado.
3. Deshidrata y limpia
   1. Sumerge las láminas en etanol al 70% durante 5 minutos.
   2. Sumerge las láminas en etanol al 96% durante 5 minutos.
   3. Sumerge las láminas en etanol 100% durante 5 minutos.
   4. Transfiere las láminas a xileno durante al menos 6 minutos.

7. Montaje permanente

1. Aplica un medio de montaje Permount® (índice de refracción ~1,52) en cada sección.
   NOTA: El índice de refracción del medio de montaje debe ser compatible con objetivos de inmersión en aceite para garantizar una calidad óptima de imagen.
2. Coloca cuidadosamente una cubierta para evitar burbujas de aire.
3. Sella los bordes con esmalte de uñas transparente.
4. Deja que las láminas se sequen en la oscuridad durante 48 horas a temperatura ambiente.

8. Imagen

NOTA: Las modalidades de imagen y configuraciones de adquisición varían según la marca del microscopio; Los ajustes óptimos deben determinarse para cada sistema.

1. Enciende el microscopio.
2. Abre el software del microscopio
3. Coloca una lámina en el escenario del microscopio.
4. Captura una imagen panorámica 2D de la sección cerebral usando un objetivo de baja ampliación como 1X/0,04 N.A. o 4x/0,10 (Figuras 2A, B).

9. Imagen de neuronas completas

1. Captura pilas de imágenes de alta resolución del área que contiene la neurona de interés, usando un objetivo N.A. de 10x/0,25 o 20x/0,40 N.A. (Figura 2C).
   NOTA: Las neuronas seleccionadas para el análisis deben mostrar una impregnación completa y homogénea de Golgi–Cox, con arbores dendríticos claramente definidos y una tinción de fondo mínima. Las células con procesos truncados, impregnación incompleta, estructuras superpuestas o señal de fondo alta deben excluirse para garantizar un análisis morfométrico preciso.
2. Enfoca la imagen y ajusta los ajustes de la cámara, incluyendo la exposición y el balance de blancos.
3. Establece los límites superior e inferior para la pila de imágenes.
4. Establece la distancia de paso a 0,5 μm dentro de la ventana de adquisición de la imagen.
5. Captura la pila de imágenes usando el comando de software para la adquisición de la pila.
6. Repite los pasos anteriores para captar todas las áreas de interés.
7. Guarda el archivo de datos y guarda todos los archivos de imagen. Formato TIFF para procesamiento externo.

10. Imagen de espinas dendríticas

1. Capturar pilas de imágenes de alta resolución del área que contiene la neurona de interés, utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 63x/1,4 N.A. en un microscopio de campo claro apropiado (Figura 2D).
   NOTA: En el presente manuscrito, se obtuvieron imágenes de alta resolución de espinas dendríticas mostradas en la Figura 2D utilizando el modo de campo claro de un microscopio confocal, modelo Zeiss LSM 780. Sin embargo, otros microscopios de campo claro pueden servir para obtener imágenes z-stack de alta calidad 63x, cuyos parámetros deberían ser estandarizados por cada laboratorio.
2. Aplica entre 1 y 2 gotas de aceite de inmersión sobre el deslizador y coloca el objetivo sobre el tobogán, asegurándote de que el objetivo entre el objetivo y el aceite estén en contacto.
3. Enfoca la imagen y ajusta los ajustes de la cámara, incluyendo la exposición y el balance de blancos.
4. Establece los límites superior e inferior para la pila de imágenes.
5. Establece la distancia de paso a 0,3 μm dentro de la ventana de adquisición de la imagen.
6. Captura la pila de imágenes usando el comando de software para la adquisición de la pila.
7. Repite los pasos anteriores para captar todas las áreas de interés
8. Guarda el archivo de datos y guarda todos los archivos de imagen en formato TIFF para procesamiento externo.
   NOTA: Para los pasos 9 y 10. Si el microscopio no está equipado con una etapa motorizada para la adquisición por pila Z, las imágenes pueden recogerse manualmente ajustando el enfoque micrométrico. Sin embargo, el espaciado entre secciones ópticas puede ser menos preciso. En este caso, los Z-stacks pueden reconstruirse posteriormente en software de procesamiento de imágenes (por ejemplo, ImageJ) a partir de la secuencia de imágenes adquirida.

11. Análisis morfométrico

NOTA: Se pueden utilizar diversos enfoques y programas de software especializados para este propósito. Algunas herramientas de acceso libre para el análisis de la columna dendrítica incluyen ImageJ o, como en este estudio, PyReconstruct¹⁵. Para una descripción más detallada de PyReconstruct y su funcionalidad para la reconstrucción neuronal y el análisis morfométrico, véase la fuente referenciada.

1. Procedimiento para el análisis morfométrico de espinas dendríticas
   1. Una vez que el archivo esté abierto en ImageJ, cambia el formato a RGB seleccionando Imagen > Tipo > Color RGB.
   2. Convierte las pilas Z en una secuencia de imágenes en ImageJ: haz clic en Archivo > Guardar como > secuencia de imágenes. Guarda cada secuencia de imágenes en una carpeta separada para su análisis posterior. En PyReconstruct, carga la secuencia de imágenes haciendo clic en Archivo > Nueva > De Imágenes.
   3. Aparecerá una ventana de diálogo que solicitará la asignación de un nombre al archivo (por ejemplo, WTVR1N1 – Ratón Vehículo de Tipo Salvaje 1 Neurona 1).
   4. Entonces aparecerán tres ventanas de diálogo consecutivas. En la primera ventana, introduce el valor de calibración (μm/px). Esta información está disponible en los metadatos de la pila Z y puede consultarse en ImageJ.
   5. En la segunda ventana, introduce el grosor de cada sección óptica consecutiva (μm). Finalmente, la serie de imágenes comenzará a cargarse automáticamente (Figura suplementaria 1A).
   6. Una vez identificado el segmento de interés, según los criterios de inclusión definidos por el investigador, procede al rastreo para obtener datos cuantitativos.
   7. Asigna un nombre y dominio distintos a cada tipo de traza. Localiza los dominios en el panel inferior, donde están representados por formas geométricas de diferentes colores (Figura suplementaria 1B).
   8. Dibuja una línea correspondiente a la longitud de muestra deseada usando la herramienta lápiz. Luego, genera una segunda traza a través de la pila Z a lo largo del segmento dendrítico usando la herramienta Z.
   9. Utiliza la traza inicial para determinar la longitud adecuada del segmento y verifica la información en Listas > Lista de trazas Z (Figura suplementaria 1B).
   10. Navega por el pila Z e identifica las cabezas de las columnas dendríticas con enfoque óptimo. Con la herramienta lápiz, traza la región distal más ancha de cada cabeza de la espina. Luego, utiliza la herramienta Z para trazar el cuello de la columna vertebral a lo largo de la pila Z (Figura suplementaria 1C, D). Repita este procedimiento hasta que se hayan trazado todas las cabezas de las espinas y cuellos dentro del segmento dendrítico seleccionado.
2. Mediciones de cabeza de columna de exportación
   1. Abre las listas que contienen las medidas de ancho y longitud de la cabeza de columna. Accede a estos bajo Listas > Lista de Trazas (para ancho) y Listas > Lista de trazas Z (para longitud), respectivamente.
   2. Exporta los datos a la ubicación deseada en el ordenador. Se generarán dos archivos Excel separados, cada uno con los datos de medición correspondientes.
3. Clasificar la morfología de las espinas y calcular la densidad
   1. Extrae las medidas de ancho y longitud de las cabezas y cuellos de la columna vertebral a partir de los archivos Excel generados previamente.
   2. Los datos deben organizarse en las columnas correspondientes etiquetadas como Ancho y Longitud para la clasificación morfológica según los siguientes^{criterios 16}: filopodia (>2 μm), delgado (< 2 μm), corto (relación longitud-ancho de cabeza ≤1) y hongo (ancho de cabeza >0,6 μm). (Figura suplementaria 1E). Los filopodias rara vez se observaron en los segmentos dendríticos analizados y, por tanto, no se incluyeron en el análisis.
   3. En esta etapa se determina el número total de espinas por segmento dendrítico analizado, junto con la densidad de espinas (espinas por μm lineal), así como el tipo y número de cada subtipo de espina. La plantilla de Excel¹⁶ utilizada para este análisis está disponible en la fuente referenciada. Con este método, se cuantificó la densidad espinosa dendrítica basal en la región CA1 del hipocampo en ratones hembras de 12 meses.
   4. Exportar datos cuantificados y generar gráficos con aplicaciones científicas especializadas diseñadas para el análisis de datos, la elaboración gráfica y la estadística. Aquí, el gráfico de la Figura 3 fue construido con el software GraphPad Prism.

Resultados

Impregnación y seccionamiento de tejidos
El protocolo de Golgi–Cox descrito aquí produjo una tinción neuronal fiable y homogénea en tejido cerebral de ratón adulto. Tras la impregnación en solución de Golgi–Cox, el cerebro adquirió una característica coloración dorada oscura, lo que indica una difusión exitosa de la solución de tinción por todo el tejido. La sección con vibratomos preservó la integridad estructural de los procesos neuronales somáticos y dendríticos.

Discusión

El método de tinción de Golgi–Cox sigue siendo una de las técnicas más utilizadas para visualizar la morfología neuronal y las espinas dendríticas en tejido cerebral^{fijo 3,4}. Al impregnar un pequeño subconjunto aleatorio de neuronas, este método permite la visualización de árboles dendríticos completos con un tinte de fondo mínimo. En el protocolo actual, la técnica permitió la visualización clara de neuronas piramidales del hipo...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarose	Tecnologías de la vida	15510-027	CAS 9012-56-6
Solución de amoníaco 25%	Merck	208380	CAS 1336-21-6. Peligroso.
Dibásico fosfato de sodio anhidro	Sigma-Aldrich	S3264	CAS 7558-79-4
Microscopio de campo claro	Nikon	Eclipse Ci
Sulfato de cromo potásico	Sigma-Aldrich	243361
Microscopio Confocal	Zeiss	LSM 780
Balance digital	Instrumentos Accuris	W3200-1200
Embedding de moldes	Merck	E6032	Dimensiones: 22x22 mm
Etanol	Meyer	394
Animales experimentales	El Laboratorio Jackson	2124-01	Cepa de ratón B6129SF2/J
Polvo de gelatina	Sigma-Aldrich	G2500
Software de prisma GraphPad	GraphPad Software Inc.		Versión 8.0.2
ImageJ Fiji Software	Instituto Nacional de Salud de EE. UU.		Versión 1.54p, https://imagej.net/software/fiji/downloads
Cloruro de mercurio	J.T. Baker	2594-01	CAS 7487-94-7. Peligroso.
Cámara de microscopio	Nikon	DS-Vi1
Objetivo de microscopio (10x)	Nikon	93183	Plan 10x/0,25 N.A.
Objetivo de microscopio (1x)	Nikon	93180	Plan UW 1x/0.04 N.A.
Objetivo de microscopio (20x)	Nikon	93184	Plan 20x/0,40 N.A.
Objetivo de microscopio (4x)	Nikon	93182	Plan 4x/0.10 N.A.
Objetivo de microscopio (63x)	Zeiss	420782-9900-799	Plan APO 63x/1.4 N.A. oil DIC
Portaobjetos de microscopio	Sigma-Aldrich	S8902
Monóbasico monohidratado de fosfato de sodio	J.T. Baker	3818-05	CAS 10049-21-5
Esmalte de uñas	COLORES PECAMINOSOS	COLOR AUDAZ	Transparente
Medios de montaje permontados	Fisher Scientific	SP15-500
Cromato potásico	Productos Quí Micos Monterrey	2784	CAS 7789-00-6. Peligroso.
Dicromato de potasio	Sigma-Aldrich	207802	CAS 7778-50-9. Peligroso.
PyReconstruct Software	Universidad de Texas, Austin		versión 1.19.0, https://github.com/SynapseWeb/PyReconstruct
Cloruro de sodio	Fermont	24912	CAS 7647-14-5
Tiosulfato de sodio	Productos Quí Micos Monterrey	7291	CAS 7772-98-7. Peligroso.
Sacarosa	J.T. Baker (Avantor)	4072-05	66,55 º Rotación específica, reactivo ACS
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200S	VELOCIDAD 20 mm/s, AMPL y guion; 0,60 mm
Xileno	CTR Scientific	CTR05128	CAS 1330-20-7. Peligroso.