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Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad Sun Yat-sen (Aprobación. SYSU-IACUC-2026-B1278) y se realizaron conforme a las directrices institucionales.
1. Aislamiento y cultivo de SLC primarios de ratones
- Diseccionar testículos de ratones C57BL/6 y retirar cuidadosamente la túnica albuginea.
- Pica los testículos en trozos pequeños.
- Disociar las células intersticiales de los túbulos seminíferos incubándolas en 1 mg/mL de colagénasa tipo IV en DMEM/F12 a 37 ºC durante 15 minutos.
- Añade DMEM/F12 que contenga un 10% de suero bovino fetal para detener la actividad de la colagenasa.
- Centrifuga a 1500 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
- Vuelve a suspender el pellet en PBS y filtra a través de un filtro de 70 μm.
- Enriquecer las células CD51⁺ mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un clasificador de células de influxo.
- Siembra las células enriquecidas en un medio de cultivo SLC compuesto por DMEM/F12 suplementado con: 1 nM dexametasona, 1 ng/mL LIF, 5 μg/L de selenita de insulina-transferrina-sódica, extracto de embrión de pollo al 5%, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% N2, 2% B27, 20 ng/mL factor de crecimiento de fibroblastos básicos, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas y oncostatina M.
- Cultiva los SLC bajo condiciones estándar (37 °C, 5% CO₂) hasta que alcancen la densidad deseada para la siembra sobre hidrogeles.
2. Montar el recipiente de vidrio para colada en gel
- Inspecciona y limpia cuidadosamente las placas de vidrio especializadas y los separadores utilizados para la fundición de geles de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), asegurándote de que estén libres de polvo, daños y residuos.
- Montar correctamente las placas de vidrio, separadores y abrazaderas según las instrucciones del fabricante, asegurando que el conjunto esté bien sellado para evitar fugas durante la fundición en gel.
- Coloca el recipiente de cristal ensamblado de forma segura sobre un soporte de laboratorio, listo para el fundido.
NOTA: El montaje de fundición utiliza placas estándar de vidrio Western blot (sulfato de dodecilo de sodio [SDS]-PAGE) con separadores fijos de 1,0 mm de grosor, asegurando un grosor de gel reproducible y una superficie plana para el cultivo celular.
3. Preparación de la solución de mezcla gel PAGE
- Mide con precisión los siguientes reactivos según el diseño experimental (véase la Tabla 1) en un tubo estéril de centrífuga de 15 mL o 50 mL: solución de stock de acrilamida al 40%, solución de stock de bis-acrilamida al 2%, tampón HEPES 1M (pH 8,5), ddH₂O estéril.
PRECAUCIÓN: La acrilamida y la bisacrilamida son neurotoxinas. Siempre lleva guantes y una mascarilla para el polvo al pesar polvo seco para evitar el contacto con la piel y la inhalación de partículas en suspensión. Los procedimientos deben realizarse dentro de una campana extractora.
4. Añadir el iniciador y catalizador, y moldear el gel
- Añadir lo siguiente a la solución mixta secuencialmente: Persulfato de amonio al 10% (APS): actúa como iniciador para iniciar la reacción de polimerización. N,N,N',N'--Tetrametiletilendiamina (TEMED): Actúa como catalizador para acelerar la reacción de polimerización. Para un volumen total de gel de 6 mL, añadir 60 μL de APS al 10% y 6 μL de TEMED (véase la Tabla 1 para la escala).
NOTA: La reacción de polimerización comienza inmediatamente después de añadir TEMED; Por lo tanto, los siguientes pasos deben realizarse rápidamente.
5. Verter la solución mixta
- Inmediatamente pipetea o vierte la solución mixta de forma constante a lo largo de un borde del recipiente de cristal para evitar crear burbujas.
6. Permitir que el gel se polimerice
- Deja reposar el recipiente de gel fundido a temperatura ambiente sin molestar.
NOTA: La polimerización suele durar entre 15 y 30 minutos a temperatura ambiente (20–25 °C).
- Procede al siguiente paso una vez que se vea una interfaz clara entre la mezcla de gel sin polimerizar y el gel polimerizado, y el gel esté completamente sólido (el gel no fluye cuando el recipiente está inclinado).
- Inmediatamente después de la colada, se superpone cuidadosamente una fina capa de etanol absoluto (o etanol saturado en agua) sobre la mezcla en gel para excluir el oxígeno atmosférico, que inhibe la polimerización radical. El etanol también ayuda a formar una superficie superior plana.
- Tras la polimerización, retira el etanol antes de desmontar las placas.
7. Desmontar el recipiente y extraer el gel
- Desmonta cuidadosamente las abrazaderas y utiliza una cuña o espátula de plástico para separar suavemente las placas de vidrio, permitiendo que el gel polimerizado PAGE permanezca intacto en una placa.
- Prepara un plato de cultivo que contenga una cantidad suficiente de PBS estéril.
- Quita cuidadosamente el gel de la placa de cristal usando una espátula o una mano enguantada, y déjalo deslizar suavemente en el PBS.
- Sella el plato que contiene el gel en PBS e incuba a 4 °C durante la noche.
NOTA: Este paso es crucial. El gel recién preparado está deshidratado y debe absorber completamente el agua y hincharse hasta sus dimensiones finales en PBS. Si se omite este paso y el gel se corta directamente, seguirá expandiéndose en el medio de cultivo celular posterior, probablemente superando el área del pozo de cultivo y dejándolo inutilizable. El grosor del gel tras la hinchazón es de 1 mm. Esto es fundamental porque cuando el grosor del gel cae por debajo de 100 μm, las células pueden percibir la rigidez de la placa de cultivo rígida subyacente, lo que interferiría con las mediciones mecanobiológicas previstas.
8. Cortar y transferir el gel a una placa de cultivo
- Al día siguiente, recupera el gel de 4 °C. Utilizando un punzón de biopsia estéril o un cortador de cuchillas (con un diámetro que coincida con el tamaño del pozo de la placa de cultivo, por ejemplo, placa de 6 pozos), corta el gel en condiciones estériles.
- Dentro de un armario de bioseguridad, utiliza pinzas estériles para recoger suavemente el disco de gel cortado y colocarlo en el centro de un pozo de cultivo vacío y estéril.
9. Lavado inicial e irradiación UV
- Añade suficiente PBS estéril al pozo que contiene el gel, asegurándose de que esté completamente sumergido.
- Balancea suavemente la placa de cultivo para lavar la superficie del gel.
- Aspira el PBS usando una pipeta.
- Repite este proceso de lavado una vez más, para un total de dos lavados, cada uno de 3 minutos.
- Después de lavar, añade suficiente PBS estéril para cubrir el gel de nuevo. Coloca toda la placa de cultivo con la tapa ligeramente entreabierta bajo una lámpara UV (dentro de un armario de bioseguridad o un reticulador UV dedicado) e irradia durante 1 hora para la esterilización básica.
10. Activación del reticulador Sulfo-SANPAH
- Dentro del gabinete de bioseguridad, aspira cuidadosamente el PBS del pozo.
- Antes de aspirar, separa suavemente el gel de las paredes y el fondo del pozo usando una punta de pipeta para evitar dañar el gel debido a la tensión superficial del líquido.
- Transfiere el gel a otro pozo limpio en la misma placa de cultivo usando pinzas estériles.
NOTA: Al transferir el gel, añadir primero una pequeña cantidad de PBS al pozo limpio puede ayudar a expulsar las burbujas de aire atrapadas entre el fondo del pozo y el gel al colocarlo, y también sirve como lavado adicional.
- Preparar la solución de trabajo con reticulador: Preparar frescamente una solución de trabajo de 0,2 mg/mL de Sulfo-SANPAH diluyendo la solución original (véase la Tabla 1) usando agua estéril o el tampón recomendado (por ejemplo, PBS).
NOTA: Protege la solución de la luz.
- Añadir suficiente solución de trabajo Sulfo-SANPAH para cubrir el gel (por ejemplo, 250 μL para una placa de 12 pozos, 500 μL para una de 6 pozos), asegurando que el gel esté completamente cubierto.
- Coloca la placa bajo luz UV de 365 nm de longitud de onda /120 mJ/cm e irradia durante 1 hora.
NOTA: Este paso activa Sulfo-SANPAH, permitiéndole unirse a grupos funcionales en la superficie del gel.
11. Activación del reticulador y lavados finales
- Tras la irradiación, aspira la solución de Sulfo-SANPAH del pozo dentro del armario de bioseguridad.
- Añade suficiente PBS estéril al pozo, rocea suavemente la superficie del gel y aspira el PBS.
- Repite este proceso de lavado una vez más, para un total de dos lavados, cada uno de 3 minutos, para eliminar completamente cualquier Sulfo-SANPAH no reaccionado.
12. Preparación de solución de trabajo de colágeno tipo I para cola de rata
- Utiliza una solución de ácido acético 0,02 M como disolvente para diluir la solución de colágeno tipo I tipo cola.
- Ajusta la concentración de la solución de trabajo final a 60–100 μg/mL. Por ejemplo, si la concentración de colágeno es de 4 mg/mL, añadir 15–25 μL de stock a 985–975 μL de ácido acético 0,02 M para obtener 1 mL de solución de trabajo.
13. Recubrimiento e incubación de colágeno
- Añadir el volumen adecuado de solución de trabajo de colágeno a cada pozo que contenga el gel activado según el tipo de placa: añadir 2 mL para una placa de 6 pozos, o 1 mL para una de 12 pozos.
- Gira suavemente la placa de cultivo para asegurarte de que la solución de colágeno cubre uniformemente el gel y el fondo del pozo.
- Cubre la placa e incuba durante la noche en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ para permitir que el colágeno se fije en la superficie del gel mediante reticulación Sulfo-SANPAH.
14. Irradiación y fijación secundaria de los rayos UV
- Al día siguiente, retira la placa y irradia de nuevo bajo unos 120 mJ/cm2 de luz ultravioleta durante 1 hora.
15. Eliminar el colágeno no unido y las células de semillas
- Dentro del armario de bioseguridad, aspira cuidadosamente la solución de trabajo de colágeno tipo I de cola de rata de los pozos.
- Añade PBS estéril a los pozos, rocea suavemente la superficie del gel y aspira el PBS.
- Repite el lavado una vez más, para un total de dos lavados, cada uno de 3 minutos.
- Después de lavar, la matriz de gel está lista. Resuspende las células madre de Leydig preparadas en el medio de cultivo SLC completo (composición detallada en el paso 1).
- Siembra la suspensión celular directamente sobre la superficie del gel. La densidad de siembra recomendada es de 2 × 104 células/cm2 (por ejemplo, aproximadamente 2 × 105 celdas por pozo para una placa estándar de 6 pozos).
- Incubar las placas de cultivo a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO₂.
- Para mantener la viabilidad celular óptima y la función esteroidogénica, cambia el medio de cultivo cada 48 horas.