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Artículo de método

Fabricación de hidrogeles de poliacrilamida sintonizables para estudiar los efectos de rigidez de la matriz en células madre de Leydig

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DOI:

10.3791/71387

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5 de junio de 2026

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1Scientific Research Center, The Seventh Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2School of Medicine, Shenzhen Campus of Sun Yat-sen University, 3Department of Urology, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, 4Center for Stem Cell Biology and Tissue Engineering, Key Laboratory for Stem Cells and Tissue Engineering, Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la fabricación de hidrogeles de poliacrilamida con rigidez ajustable para estudiar los efectos de la mecánica matricial en el comportamiento de las células madre de Leydig en un sistema de cultivo bidimensional controlado.

Resumen

La rigidez de la matriz extracelular (MEC) regula críticamente el comportamiento de las células madre. Anteriormente, demostramos que los aumentos patológicos en la rigidez de la matriz durante el envejecimiento alteran la homeostasis de las células madre de Leydig (SLC), lo que conduce a una disminución de la testosterona. Basándonos en este descubrimiento, presentamos aquí un protocolo detallado—desarrollado originalmente en nuestro laboratorio—para fabricar hidrogeles de poliacrilamida (PA) con rigidez ajustable para modelar el microambiente testicular in vitro. Este método permite la fundición reproducible de geles en un rango de rigidez de 1 a 100 kPa, cubriendo condiciones fisiológicas a patológicas. Los pasos clave incluyen la mezcla precisa de acrilamida/bis-acrilamida, el equilibrio de hinchazón en gel, la activación superficial con Sulfo-SANPAH y el recubrimiento de colágeno para apoyar la adhesión y cultivo de SLC. Ofrecemos formulaciones optimizadas para rigidez de objetivos y orientación para la resolución de problemas comunes como polimerización incompleta y mala fijación de celdas. Este sistema permite una investigación sistemática de cómo la rigidez del sustrato modula la proliferación, diferenciación y función esteroidogénica de SLC bajo condiciones 2D definidas. Más allá de la biología reproductiva, también sirve como una plataforma valiosa para estudios mecanobiológicos en otros tipos celulares y para el cribado de terapias que abordan la disfunción relacionada con la rigidez.

Introducción

Las propiedades mecánicas de la matriz extracelular (ECM) desempeñan un papel fundamental en la regulación del destino de las células madre, incluyendo la proliferación, diferenciación y mantenimientofuncional 1,2,3,4. En los testículos, el endurecimiento de la ECM relacionado con la edad se ha implicado en la disminución de la producción de testosterona. Sin embargo, los mecanismos mecanobiológicos subyacentes siguen siendo poco comprendidos, en parte debido a la falta de modelos in vitro estandarizados que recapitulen fielmente el rango fisiológico de rigidez del nicho testicular. La rigidez fisiológica del tejido testicular de ratón joven es aproximadamente de 1–15 kPa, mientras que el tejido envejecido o fibrótico puede alcanzar entre 20 y 30 kPa o más.

Los hidrogeles de poliacrilamida (PA) han surgido como una plataforma versátil para estudiar las interacciones célula-matriz porque su rigidez puede ajustarse con precisión variando la proporción de acrilamida a bis-acrilamida 5,6. En comparación con otros sustratos como el vidrio recubierto de colágeno o los hidrogeles comerciales, los geles de PA ofrecen un control independiente sobre la rigidez y la densidad bioquímica de ligandos, permitiendo una disección sistemática de señales mecánicas. Aunque existen varios protocolos para la fabricación de gelPA 7,8,9, a menudo carecen de optimización detallada para tipos celulares específicos, especialmente para células primarias raras como las SLC.

Aquí presentamos un protocolo robusto y reproducible para preparar hidrogeles de PA con rigidez definida (1–100 kPa) adaptado para el cultivo de SLCs de ratón. El método incluye instrucciones paso a paso para el colado en gel, equilibrio de la hinchazón, funcionalización superficial con Sulfo-SANPAH y recubrimiento de colágeno para promover la adhesión celular. Siguiendo este protocolo, los investigadores pueden generar sustratos con rigidez ajustable (que oscila entre 1 y 100 kPa) que imitan el entorno mecánico de testículos jóvenes (blandos) y envejecidos (rígidos), permitiendo la investigación cuantitativa de respuestas SLC dependientes de la rigidez. El sistema también es adaptable a otros tipos celulares mecanosensibles y proporciona una plataforma para el cribado de fármacos que se dirigen a patologías relacionadas con la rigidez.

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Protocolo

Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad Sun Yat-sen (Aprobación. SYSU-IACUC-2026-B1278) y se realizaron conforme a las directrices institucionales.

1. Aislamiento y cultivo de SLC primarios de ratones

  1. Diseccionar testículos de ratones C57BL/6 y retirar cuidadosamente la túnica albuginea.
  2. Pica los testículos en trozos pequeños.
  3. Disociar las células intersticiales de los túbulos seminíferos incubándolas en 1 mg/mL de colagénasa tipo IV en DMEM/F12 a 37 ºC durante 15 minutos.
  4. Añade DMEM/F12 que contenga un 10% de suero bovino fetal para detener la actividad de la colagenasa.
  5. Centrifuga a 1500 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
  6. Vuelve a suspender el pellet en PBS y filtra a través de un filtro de 70 μm.
  7. Enriquecer las células CD51⁺ mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando un clasificador de células de influxo.
  8. Siembra las células enriquecidas en un medio de cultivo SLC compuesto por DMEM/F12 suplementado con: 1 nM dexametasona, 1 ng/mL LIF, 5 μg/L de selenita de insulina-transferrina-sódica, extracto de embrión de pollo al 5%, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% N2, 2% B27, 20 ng/mL factor de crecimiento de fibroblastos básicos, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas y oncostatina M.
  9. Cultiva los SLC bajo condiciones estándar (37 °C, 5% CO₂) hasta que alcancen la densidad deseada para la siembra sobre hidrogeles.

2. Montar el recipiente de vidrio para colada en gel

  1. Inspecciona y limpia cuidadosamente las placas de vidrio especializadas y los separadores utilizados para la fundición de geles de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), asegurándote de que estén libres de polvo, daños y residuos.
  2. Montar correctamente las placas de vidrio, separadores y abrazaderas según las instrucciones del fabricante, asegurando que el conjunto esté bien sellado para evitar fugas durante la fundición en gel.
  3. Coloca el recipiente de cristal ensamblado de forma segura sobre un soporte de laboratorio, listo para el fundido.
    NOTA: El montaje de fundición utiliza placas estándar de vidrio Western blot (sulfato de dodecilo de sodio [SDS]-PAGE) con separadores fijos de 1,0 mm de grosor, asegurando un grosor de gel reproducible y una superficie plana para el cultivo celular.

3. Preparación de la solución de mezcla gel PAGE

  1. Mide con precisión los siguientes reactivos según el diseño experimental (véase la Tabla 1) en un tubo estéril de centrífuga de 15 mL o 50 mL: solución de stock de acrilamida al 40%, solución de stock de bis-acrilamida al 2%, tampón HEPES 1M (pH 8,5), ddH₂O estéril.
    PRECAUCIÓN: La acrilamida y la bisacrilamida son neurotoxinas. Siempre lleva guantes y una mascarilla para el polvo al pesar polvo seco para evitar el contacto con la piel y la inhalación de partículas en suspensión. Los procedimientos deben realizarse dentro de una campana extractora.

4. Añadir el iniciador y catalizador, y moldear el gel

  1. Añadir lo siguiente a la solución mixta secuencialmente: Persulfato de amonio al 10% (APS): actúa como iniciador para iniciar la reacción de polimerización. N,N,N',N'--Tetrametiletilendiamina (TEMED): Actúa como catalizador para acelerar la reacción de polimerización. Para un volumen total de gel de 6 mL, añadir 60 μL de APS al 10% y 6 μL de TEMED (véase la Tabla 1 para la escala).
    NOTA: La reacción de polimerización comienza inmediatamente después de añadir TEMED; Por lo tanto, los siguientes pasos deben realizarse rápidamente.

5. Verter la solución mixta

  1. Inmediatamente pipetea o vierte la solución mixta de forma constante a lo largo de un borde del recipiente de cristal para evitar crear burbujas.

6. Permitir que el gel se polimerice

  1. Deja reposar el recipiente de gel fundido a temperatura ambiente sin molestar.
    NOTA: La polimerización suele durar entre 15 y 30 minutos a temperatura ambiente (20–25 °C).
  2. Procede al siguiente paso una vez que se vea una interfaz clara entre la mezcla de gel sin polimerizar y el gel polimerizado, y el gel esté completamente sólido (el gel no fluye cuando el recipiente está inclinado).
  3. Inmediatamente después de la colada, se superpone cuidadosamente una fina capa de etanol absoluto (o etanol saturado en agua) sobre la mezcla en gel para excluir el oxígeno atmosférico, que inhibe la polimerización radical. El etanol también ayuda a formar una superficie superior plana.
  4. Tras la polimerización, retira el etanol antes de desmontar las placas.

7. Desmontar el recipiente y extraer el gel

  1. Desmonta cuidadosamente las abrazaderas y utiliza una cuña o espátula de plástico para separar suavemente las placas de vidrio, permitiendo que el gel polimerizado PAGE permanezca intacto en una placa.
  2. Prepara un plato de cultivo que contenga una cantidad suficiente de PBS estéril.
  3. Quita cuidadosamente el gel de la placa de cristal usando una espátula o una mano enguantada, y déjalo deslizar suavemente en el PBS.
  4. Sella el plato que contiene el gel en PBS e incuba a 4 °C durante la noche.
    NOTA: Este paso es crucial. El gel recién preparado está deshidratado y debe absorber completamente el agua y hincharse hasta sus dimensiones finales en PBS. Si se omite este paso y el gel se corta directamente, seguirá expandiéndose en el medio de cultivo celular posterior, probablemente superando el área del pozo de cultivo y dejándolo inutilizable. El grosor del gel tras la hinchazón es de 1 mm. Esto es fundamental porque cuando el grosor del gel cae por debajo de 100 μm, las células pueden percibir la rigidez de la placa de cultivo rígida subyacente, lo que interferiría con las mediciones mecanobiológicas previstas.

8. Cortar y transferir el gel a una placa de cultivo

  1. Al día siguiente, recupera el gel de 4 °C. Utilizando un punzón de biopsia estéril o un cortador de cuchillas (con un diámetro que coincida con el tamaño del pozo de la placa de cultivo, por ejemplo, placa de 6 pozos), corta el gel en condiciones estériles.
  2. Dentro de un armario de bioseguridad, utiliza pinzas estériles para recoger suavemente el disco de gel cortado y colocarlo en el centro de un pozo de cultivo vacío y estéril.

9. Lavado inicial e irradiación UV

  1. Añade suficiente PBS estéril al pozo que contiene el gel, asegurándose de que esté completamente sumergido.
  2. Balancea suavemente la placa de cultivo para lavar la superficie del gel.
  3. Aspira el PBS usando una pipeta.
  4. Repite este proceso de lavado una vez más, para un total de dos lavados, cada uno de 3 minutos.
  5. Después de lavar, añade suficiente PBS estéril para cubrir el gel de nuevo. Coloca toda la placa de cultivo con la tapa ligeramente entreabierta bajo una lámpara UV (dentro de un armario de bioseguridad o un reticulador UV dedicado) e irradia durante 1 hora para la esterilización básica.

10. Activación del reticulador Sulfo-SANPAH

  1. Dentro del gabinete de bioseguridad, aspira cuidadosamente el PBS del pozo.
  2. Antes de aspirar, separa suavemente el gel de las paredes y el fondo del pozo usando una punta de pipeta para evitar dañar el gel debido a la tensión superficial del líquido.
  3. Transfiere el gel a otro pozo limpio en la misma placa de cultivo usando pinzas estériles.
    NOTA: Al transferir el gel, añadir primero una pequeña cantidad de PBS al pozo limpio puede ayudar a expulsar las burbujas de aire atrapadas entre el fondo del pozo y el gel al colocarlo, y también sirve como lavado adicional.
  4. Preparar la solución de trabajo con reticulador: Preparar frescamente una solución de trabajo de 0,2 mg/mL de Sulfo-SANPAH diluyendo la solución original (véase la Tabla 1) usando agua estéril o el tampón recomendado (por ejemplo, PBS).
    NOTA: Protege la solución de la luz.
  5. Añadir suficiente solución de trabajo Sulfo-SANPAH para cubrir el gel (por ejemplo, 250 μL para una placa de 12 pozos, 500 μL para una de 6 pozos), asegurando que el gel esté completamente cubierto.
  6. Coloca la placa bajo luz UV de 365 nm de longitud de onda /120 mJ/cm e irradia durante 1 hora.
    NOTA: Este paso activa Sulfo-SANPAH, permitiéndole unirse a grupos funcionales en la superficie del gel.

11. Activación del reticulador y lavados finales

  1. Tras la irradiación, aspira la solución de Sulfo-SANPAH del pozo dentro del armario de bioseguridad.
  2. Añade suficiente PBS estéril al pozo, rocea suavemente la superficie del gel y aspira el PBS.
  3. Repite este proceso de lavado una vez más, para un total de dos lavados, cada uno de 3 minutos, para eliminar completamente cualquier Sulfo-SANPAH no reaccionado.

12. Preparación de solución de trabajo de colágeno tipo I para cola de rata

  1. Utiliza una solución de ácido acético 0,02 M como disolvente para diluir la solución de colágeno tipo I tipo cola.
  2. Ajusta la concentración de la solución de trabajo final a 60–100 μg/mL. Por ejemplo, si la concentración de colágeno es de 4 mg/mL, añadir 15–25 μL de stock a 985–975 μL de ácido acético 0,02 M para obtener 1 mL de solución de trabajo.

13. Recubrimiento e incubación de colágeno

  1. Añadir el volumen adecuado de solución de trabajo de colágeno a cada pozo que contenga el gel activado según el tipo de placa: añadir 2 mL para una placa de 6 pozos, o 1 mL para una de 12 pozos.
  2. Gira suavemente la placa de cultivo para asegurarte de que la solución de colágeno cubre uniformemente el gel y el fondo del pozo.
  3. Cubre la placa e incuba durante la noche en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ para permitir que el colágeno se fije en la superficie del gel mediante reticulación Sulfo-SANPAH.

14. Irradiación y fijación secundaria de los rayos UV

  1. Al día siguiente, retira la placa y irradia de nuevo bajo unos 120 mJ/cm2 de luz ultravioleta durante 1 hora.

15. Eliminar el colágeno no unido y las células de semillas

  1. Dentro del armario de bioseguridad, aspira cuidadosamente la solución de trabajo de colágeno tipo I de cola de rata de los pozos.
  2. Añade PBS estéril a los pozos, rocea suavemente la superficie del gel y aspira el PBS.
  3. Repite el lavado una vez más, para un total de dos lavados, cada uno de 3 minutos.
  4. Después de lavar, la matriz de gel está lista. Resuspende las células madre de Leydig preparadas en el medio de cultivo SLC completo (composición detallada en el paso 1).
  5. Siembra la suspensión celular directamente sobre la superficie del gel. La densidad de siembra recomendada es de 2 × 104 células/cm2 (por ejemplo, aproximadamente 2 × 105 celdas por pozo para una placa estándar de 6 pozos).
  6. Incubar las placas de cultivo a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO₂.
  7. Para mantener la viabilidad celular óptima y la función esteroidogénica, cambia el medio de cultivo cada 48 horas.

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Resultados

La ejecución exitosa de este protocolo produce hidrogeles de poliacrilamida con rigidez definida (que oscila entre 1 y 100 kPa) que permanecen firmemente adheridos a la placa de cultivo y soportan una adhesión y dispersión robustas del SLC. La Figura 1 ofrece una visión esquemática de todo el flujo de trabajo, desde el gel casting hasta la siembra de células, permitiendo a los usuarios visualizar las etapas clave del protocolo.

La...

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Discusión

Las propiedades mecánicas de la matriz extracelular desempeñan un papel fundamental en la regulación del comportamiento de las células madre, pero las herramientas para estudiar sistemáticamente estos efectos en las células reproductivas siguen siendo limitadas. Nuestro trabajo previo demostró que el endurecimiento patológico de la matriz durante el envejecimiento altera la homeostasis de las células madre de Leydig (SLC) a través del eje Piezo1/ROS/Gli1, lo que conduce a la disminución ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La financiación de este proyecto fue proporcionada por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de la Investigación en Células Madre y Traslacional de China (2021YFA1100601), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82371608), la Fundación de Investigación Básica y Básica Aplicada de Guangdong (2023B1515020016) y el Programa de Investigación Fundamental de Shenzhen (JCYJ20240813150417024, JCYJ20240813150422030).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido acéticoSigma-AldrichCat#A6283Diluyente para colágeno de cola de rata (0,02 M)
Acryiamida     Sangon BiotechCat#A100341-0500Monómero para preparación de gel de poliacrilamida
Persulfato de amonio (APS) y nbsp;Sangon BiotechCat#A100486-0100Iniciador para la polimerización en gel
Suplemento de B27InvitrogenGato#A1486701Suplemento definido enriquecido para antioxidantes y hormonas; Apoya la supervivencia neuronal y de células madre (2% v/v)
Factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF)InvitrogenGato#13256029factor de crecimiento mitogénico; promueve la proliferación y la formación de los SLC (20 ng/mL)
Bis-acrilamida y nbsp;Yuanye de Shanghái BiotecnologíaCat#S14002Reticulador para geles de poliacrilamida
Extracto de embrión de polloBiológicos estadounidensesCat#C3999Fuente rica en factores de crecimiento y nutrientes; apoya el crecimiento y la viabilidad del SLC (5% v/v)
Colágeno, tipo I, de la cola de rataYEASENCat#40125ES50Recubre la superficie de hidrogel de poliacrilamida activada por Sulfo-SANPAH para promover la adhesión y el cultivo del SLC.
Colagenasa Tipo IVGibcoCat#17104-0191 mg/mL en DMEM/F12 para la digestión del tejido testicular
CYP11A1 AnticuerpoGeneTexGato#GTX56293Para el blot occidental
DexametasonaSigma-AldrichCat#D1756Agonista de los receptores glucocorticoides; apoya la proliferación de SLC y el mantenimiento de la tallancia (1 nM)
DMEM/F12 mediaGibcoGato#11320033Medio basal para digestión, lavado y cultivo de SLC
Factor de crecimiento epidérmico (EGF)PeproTechCat#AF-100-15Estimula la proliferación de SLC y mantiene un estado indiferenciado (20 ng/mL)
Suero fetal bovino (FBS)VISTECHCat#SE100-011Se usa al 10% para detener la actividad de la colagénasa
FiyiN/Ahttps://imagej.net/FijiSoftware de análisis de imágenes
Anticuerpo GADPHProteintechCat#60004-1-IGPara el blot occidental
Enzimas digestivas en gel y nbsp;Biotecnología precisaGato#GXDLFAMezcla enzimática para la digestión del tejido testicular y el aislamiento de SLC
HEPES CytivaCat#SH30237.01Amortiguador para mantener el pH 7.0 y guiño; 7.4
HSD3 y beta; anticuerpoSanta CruzCat#sc-515120Para el blot occidental
Clasificador de celdas de influjoBDhttps://www.bdbiosciences.com/content/dam/bdb/marketing-documents/BD_Influx_tech_specs.pdf
Selenita de Insulina Transferrina-Sódico (ITS)Sigma-AldrichGato#11074547001Promueve la supervivencia celular, la absorción de glucosa y la defensa antioxidante (5 & mu; g/L)
Reemplazo sérico KnockOut (KSR) y nbsp;GibcoCat#10828-028Sustituto sérico del medio de cultivo SLC
LIF (Factor inhibidor de la leucemia)MilliporeGato#LIF1010Citocina que mantiene la pluripotencia de las células madre y la autorrenovación (1 ng/mL)
Testículos de ratónEste periódicoN/AAislado de ratones C57BL/6
Kit ELISA de testosterona para ratonesBiotecnología finaCat#40203ES80Para la cuantificación de la testosterona en cultivos de supernadantes
Ratón: C57BL/6 Shenzhen TopBiotechN/ACepa de ratón utilizada para la recogida de testículos
Ratón: Células de Leydig de los Testículos Madre (SLCs) y nbsp;Este periódicoN/ACélulas primarias aisladas de testículos de ratón
Suplemento N2InvitrogenGato#17502001Suplemento definido sin suero que apoya cultivos neuronales y de células madre (1% v/v)
Aminoácidos no esencialesHyCloneCat#SH30050.03Proporciona fuentes de nitrógeno para la síntesis de proteínas y el metabolismo celular (1% v/v)
Oncostatin M (OSM)PeproTechCat#300-10TCitocinas implicadas en la regulación de la diferenciación SLC y la maduración de células de Leydig (20 ng/mL)
Solución salina con fosfato tamponado (PBS)GibcoGato#10010023Amortiguador de lavado y resuspensión
Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)PeproTechCat#100-14BApoya la proliferación, migración y supervivencia celular (20 ng/mL)
Prism 9.0GraphPadhttps://www.graphpad.com/Software para análisis estadístico y gráficos
Anticuerpo StARProteintechCat#67130-1-IGPara el blot occidental
Sulfo-SANPAH MACKLINCat#102568-43-4Reticulador heterobifuncional para la activación superficial del gel
TEMED PhygeneCat#PH0341Catalizador para la polimerización
β-MercaptoetanolInvitrogenGato#21985023Reduce el estrés oxidativo y favorece el crecimiento celular en cultivo (0,1 mM)

Referencias

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