Cuantificación citométrica del flujo sanguíneo total de plaquetas positivas en factores tisulares: un flujo de trabajo multicéntrico armonizado

Resumen

Aquí presentamos un flujo de trabajo armonizado para la cuantificación por citometría de flujo de plaquetas con factor tisular positivo en estudios multicéntricos. El protocolo describe procedimientos estandarizados para la recogida de sangre, fijación de sangre total, tinción y armonización de instrumentos, permitiendo realizar análisis tanto localmente como de forma centralizada, dependiendo de las capacidades del laboratorio.

Resumen

Las plaquetas de factor tisular (TF^)pos representan un subconjunto de la población plaquetaria. Recientemente, se ha demostrado que este subconjunto predice la mortalidad cardiovascular en pacientes con enfermedad coronaria, estableciéndose como un biomarcador útil para la estratificación del riesgo trombótico. La cuantificación precisa de las plaquetas^pos de TF mediante citometría de flujo requiere una estricta estandarización del manejo preanalítico, los procedimientos de tinción y los ajustes de instrumentos, especialmente en estudios multicéntricos donde la variabilidad técnica puede afectar su medición. Este protocolo describe un flujo de trabajo armonizado para la evaluación de citometría de flujo sanguíneo total de plaquetas^{TF pos} circulantes, diseñado para garantizar la reproducibilidad en laboratorios con diferentes infraestructuras técnicas. El procedimiento incluye la recogida de sangre estandarizada y la fijación de sangre entera para preservar el fenotipo plaquetario in vivo. Se proporcionan dos métodos diferentes para la preparación de muestras según las capacidades del laboratorio local: envío de muestras fijas al Laboratorio Central para la tinción, adquisición y análisis centralizados en centros sin instalaciones de citometría de flujo, o tinción y adquisición local para centros equipados con instrumentación de citometría de flujo y personal formado. La evaluación del porcentaje de plaquetas^pos TF se consigue mediante marcaje directo con anticuerpos anti-TF Star Fluor 488 y anti-CD41 PerCP-Cy5.5 para identificar la proteína objetivo y el marcador poblacional de plaquetas, respectivamente. La armonización del citómetro de flujo se logra mediante una plantilla de adquisición compartida para modelos idénticos de citómetros o mediante alineación basada en perlas para diferentes plataformas. El flujo de trabajo incorpora además un enfoque estandarizado de acceso y un análisis centralizado de datos para permitir una comparación fiable de mediciones^TF pos-plaquetas entre sitios. Los resultados representativos demostraron que este flujo de trabajo permite la cuantificación reproducible de plaquetas^pos TF a través de los ajustes validados de adquisición multicónica. Este protocolo puede facilitar una aplicación más amplia de la evaluación^{de plaquetas pos} de TF en la estratificación de riesgo trombótico y apoyar una estandarización más amplia de la citometría de flujo plaquetario en investigación traslacional y clínica.

Introducción

El factor tisular (TF) es el principal iniciador de la cascada de coagulación sanguínea y un determinante clave en la generación de trombina. Más allá de su expresión clásica por células subendoteliales y leucocitos, TF también está asociada con plaquetas^circulantes 1,2,3,4,5. Durante la trombopoiesis, los megacariocitos transfieren TF a un subconjunto de^{plaquetas 6}. En condiciones fisiológicas, aproximadamente el 20–30% de las plaquetas circulantes contienen TF almacenada dentro del sistema canalicular abierto, separada espacialmente del factor plasmatico^{VII 7}. En este estado compartimentado, TF está funcionalmente protegida de factores de coagulación circulantes y permanece inactiva. Por tanto, solo una pequeña fracción de plaquetas muestra TF superficial detectable cuando se analiza sangre entera de individuos sanos mediante citometría de flujo, reflejando la homeostasis fisiológica ^2,8. Las condiciones patológicas caracterizadas por la activación plaquetaria y un desequilibrio tromboinflamatorio pueden alterar este equilibrio, lo que conduce a un aumento de la exposición superficial de la TF. Se han reportado proporciones elevadas de plaquetas TF-positivas (TF^pos) en varios trastornos trombóticos 9,10,11,12,13,14,15. Cabe destacar que, en la enfermedad coronaria, los niveles de plaquetas^pos de TF superiores al 4% predicen de forma independiente la mortalidad cardiovascular a los 5 años de seguimiento, estableciendo el porcentaje de plaquetas^pos TF como un biomarcador clínicamente relevante del riesgo^{trombótico 16}.

Por tanto, la cuantificación precisa y reproducible de las^{plaquetas pos} de TF es esencial tanto para aplicaciones de investigación traslacional como clínica. Un flujo de trabajo de flujo de plaquetas y citometría previamente publicado para la evaluación de^{plaquetas TF pos} ha mejorado el estudio de esta proteína en entornos^{monocéntricos 17} , proporcionando consejos para optimizar pasos preanalíticos o analíticos seleccionados. Sin embargo, ese enfoque no fue diseñado específicamente para abordar los desafíos logísticos y analíticos adicionales de los estudios multicéntricos, incluyendo los procedimientos de envío, el procesamiento estandarizado de muestras y también la necesidad de armonizar la adquisición de muestras entre diferentes plataformas de citómetros de flujo. Además, deben considerarse las diferentes infraestructuras y niveles de experiencia técnica de los centros participantes.

En este contexto, el valor añadido del protocolo actual reside en proporcionar un flujo de trabajo detallado que combine la extracción de sangre estandarizada y la fijación de sangre total, protocolos flexibles de procesamiento de muestras, armonización de adquisiciones multiplataforma y tinción directa y control centralizado de calidad mediante análisis de datos.

El objetivo de este trabajo es, por tanto, proporcionar un marco operativo para la implementación armonizada multicéntrica del análisis^{de plaquetas TF pos} en sangre total mediante citometría de flujo. Este diseño integrado reduce la variabilidad preanalítica, analítica e interinstrumental, estableciendo así la condición para la evaluación consistente de las^{plaquetas pos} TF en entornos multicéntricos.

Protocolo

Todos los donantes de sangre proporcionaron un consentimiento informado por escrito aprobado por el Comité Ético de la Institución (n.º 70/24, CE 18.06.24).

El flujo de trabajo multicéntrico para la cuantificación de citometría de flujo sanguíneo total de plaquetas^pos TF se resume en la Figura 1. El protocolo detallado a continuación guiará al usuario a través de cinco pasos principales.

Figura 1: Flujo de trabajo multicéntrico para el análisis^{de plaquetas pos} de TF. Representación esquemática de la tubería analítica para la evaluación multicéntrica de plaquetas^pos de TF circulantes mediante citometría de flujo sanguíneo total. Tras la inscripción y la extracción de sangre, las muestras se fijan y procesan según los recursos técnicos disponibles en cada Unidad Clínica. Los centros sin instalaciones de citometría de flujo envían muestras fijas al Laboratorio Central para su tinción, adquisición y análisis. Los centros equipados con citómetros de flujo pueden realizar tintes y adquisiciones in situ utilizando plantillas de adquisición estandarizadas. La armonización del instrumento se logra mediante plantillas compartidas (mismo modelo de instrumento), plantillas generadas en el Laboratorio Central (modelo diferente disponible para alineación) o calibración con perlas fluorescentes cuando la armonización directa de plantillas no es factible. El análisis de datos se realiza de forma centralizada mediante un flujo de trabajo de acceso estandarizado. El diagrama fue creado usando ChatGPT (OpenAI). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

1. Recogida de sangre

NOTA: La evaluación de plaquetas^pos TF requiere un máximo de 50 μL de sangre total.

1. Recoge sangre venosa periférica de la vena antecubital usando una aguja de mariposa calibre 19. Aplica el torniquete solo para la venpuntura y libéralo inmediatamente después de colocarlo la aguja para minimizar la activación plaquetaria ex vivo.
2. Descarta el primer tubo EDTA. Luego recoge sangre en un vacutainador de citrato de sodio 0,129 M, llenando el tubo hasta la marca del fabricante para preservar la proporción correcta de sangre respecto al anticoagulante.
3. Invierte suavemente 5 veces para mezclar bien sangre y anticoagulante.
4. Mantén el tubo vertical a temperatura ambiente, evitando agitación, refrigeración o transporte neumático.
5. Procesa la muestra en un plazo de 3 horas tras la recogida.

2. Preparación de muestras

NOTA: Todos los anticuerpos deben ser adquiridos por el Laboratorio Central y deben proceder todos del mismo lote. Si durante el estudio en curso es necesario un cambio de lote, el nuevo lote de reactivos debe conectarse directamente al lote en uso mediante pruebas paralelas bajo las mismas condiciones de ensayo y adoptarse solo si se confirma un rendimiento comparable. Los reactivos comúnmente utilizados (por ejemplo, PBS – solución salina con fosfato tamponado – y PFA – paraformaldehído) pueden ser adquiridos por cada centro participante; sin embargo, los códigos de producto deben coincidir con los utilizados por el Laboratorio Central, y la consistencia de lotes debe mantenerse durante todo el estudio.

1. Arregla la muestra.
   NOTA: Antes de comenzar el análisis de sangre, prepare un 1% de PFA diluyendo un 4% con PBS a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico y debe manejarse con una capucha química mientras se lleva el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes y protección ocular). Evita inhalar y el contacto con la piel o los ojos. ELIMINACIÓN DE RESIDUOS: Recoger todas las soluciones que contengan PFA, muestras fijas y consumibles contaminados en contenedores cerrados y debidamente etiquetados, de acuerdo con la normativa institucional y local.
   1. Invierte suavemente el aspirador 5 veces para mezclar sangre y anticoagulante.
   2. Transfiere 50 μL de sangre a un tubo de 2 mL que contenga 950 μL de PFA al 1%.
   3. Mezcla suavemente la muestra e incuba durante 1 hora y 30 minutos a temperatura ambiente.
   4. Añade 500 μL de PBS.
   5. Centrifuga a 1500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   6. Retira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en 1 mL de PBS.
      NOTA: Punto de control técnico: Tras la centrifugación, confirma que el pellet es visible antes de retirar el sobrenadante. Retira cuidadosamente el sobrenadante sin mover el pellet. Tras la resuspensión, verifica que la muestra sea homogénea y libre de grumos o agregados visibles.
   7. Envía la muestra fija al Laboratorio Central en un envase controlado de temperatura mantenido a 2-8 °C en un plazo de 24 horas tras la fijación. No te congeles. Tiempo de recogida de documentos, tiempo de fijación y tiempo de envío.
2. Etiquetado de muestras para análisis de citometría de flujo.
   NOTA: Anti-TF Star Fluor 488 (clon HTF1; anti-CD142) se dirige contra el Factor Tisular, mientras que el anti-CD41 PerCP-Cy5.5 reconoce la integrina plaquetaria alfaIIb. Antes de comenzar el procedimiento de tinción, centrifugar anticuerpos a 17000 x g durante 5 minutos a +4 °C para eliminar cualquier^{agregado 18}. Diluir el anticuerpo anti-TF Star Fluor 488 (1:100) con PBS. El Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 no requiere dilución intermedia y debe usarse al volumen recomendado por el fabricante.
   1. Prepara cuatro tubos de polipropileno de 2 mL.
   2. Dispensar 80 μL de muestra fija en cada tubo.
   3. Añade a cada tubo el volumen correcto de PBS y anticuerpo anti-TF Star Fluor 488, según se indica en la Tabla 1 (Día 1).
   4. Mezcla suavemente las muestras.
   5. Incubar O/N a 4 °C en la oscuridad.
   6. Al día siguiente (Día 2), añadir Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 a los tubos 3 y 4 según se indica en la Tabla 1.
   7. Mezcla suavemente las muestras.
   8. Incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
   9. Diluye cada tubo con 300 μL de PBS.
   10. Almacenar las muestras teñidas en la oscuridad hasta la adquisición de citometría de flujo.
       NOTA: Las muestras pueden almacenarse a 4 °C durante hasta tres días¹⁷. Un almacenamiento más prolongado provoca una decaimiento progresivo de la señal y debe evitarse.

		Día 1		Día 2
No.	ID del tubo	1X PBS (μL)	Anti-TF Fluor Estelar 488 (μL)	Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 (μL)
1	Sin manchas	20	0	0
2	TF	12.5	7.5	0
3	CD41	15	0	5
4	TF/CD41	7.5	7.5	5

Tabla 1: Protocolo de tinción para la evaluación de^{plaquetas pos} de TF.

3. Estandarización de la adquisición de un citómetro de flujo

1. Establecimiento de una plantilla de adquisición (por el Laboratorio Central).
   1. Configuración de plantilla para el Citómetro de Flujo A.
      1. Abre el software A v2.6.
      2. Crea un gráfico de puntos FSC-A/SSC-A [Todos los eventos] a escala logarítmica para visualizar las poblaciones celulares (Figura 2A).
      3. Crea un gráfico de puntos CD41 PerCP-Cy5.5-A/SSC-A [Todos los Eventos] en escala logarítmica para identificar plaquetas dentro de una puerta [Plaquetas] (Figura 2B).
      4. Crea un diagrama de pseudocolor PerCP-Cy5.5-A/Star Fluor 488-A [Todos los Eventos] para comprobar si se derrama/compensa (Figura 2C).
      5. Crea un gráfico de puntos FSC-A/FSC-H en la puerta [Plaquetas] y define una región para identificar singlets ([Singlets]; Figura 2D).
      6. Crear un diagrama de puntos CD41 PerCP-Cy5.5-A/TF Star Fluor 488-A en la compuerta de [Singlets] para identificar plaquetas^pos TF (Figura 2E).
      7. Establece el umbral en 1000 en SSC-H.
      8. Pon el caudal en "Lento".
      9. Fija la ganancia B525 en 315 para asegurar una discriminación óptima entre eventos positivos y negativos; Ajusta si es necesario según el instrumento utilizado.
      10. Ajusta la ganancia de B690 según el control de calidad diario. La adquisición es aceptable solo si la población de plaquetas^pos- CD41 se resuelve completamente a partir del fondo negativo y permanece dentro de la puerta de referencia predefinida establecida en la plantilla durante la adquisición.
      11. Exporta la plantilla usando la "Exportar plantilla de experimento".
      12. Descargar: La plantilla de adquisición para el análisis^{de plaquetas pos} TF en el Citómetro de Flujo A está disponible para su descarga como Archivo Suplementario 1 y Figura Suplementaria 1.
          NOTA: Se incluye un gráfico para comprobar el desbordamiento/compensación (Figura 2C), aunque no es necesario para este análisis multiparamétrico. No obstante, debería considerarse si se utilizará una combinación de fluorocromos diferente a la propuesta en este protocolo.
   2. Crea una plantilla para el Citómetro de Flujo B.
      1. Crea un archivo de protocolo que incluya toda la configuración de adquisición tal y como se describe en la versión 3.1.1.
      2. Exporta la plantilla usando la función "Exportar protocolo" en el software B v1.6, generando un archivo de protocolo.
      3. En el instrumento receptor, importa el archivo de protocolo usando la función "Importar protocolo" dentro del software.
   3. Creación de plantilla para el Citómetro de Flujo C.
      1. Crea un archivo de espacio de trabajo que incluya toda la configuración de adquisición tal y como se describe en la versión 3.1.1. y exportarlo.
      2. En el instrumento receptor, importa el archivo de espacio de trabajo usando la función "Copiar" del software C v3.1.
2. Armonización de los citómetros de flujo usando perlas de calibración.
   NOTA: Utiliza perlas de calibración Rainbow de 6 picos.
   1. Definición del valor objetivo.
      NOTA: Utilice la siguiente fórmula para definir la Intensidad de Fluorescencia Mediana (MdFI) del primer pico en el canal de fluorescencia B525:
      MdFI_CU =
      donde CU: Instrumentos de Unidad Clínica y RI: Instrumento de Referencia.
   2. Preparación de muestras.
      1. Vortex, el frasco de cuentas.
      2. Añade 5 gotas de cuentas a un tubo de muestra.
      3. Añade 1 mL de PBS.
      4. Vórtice durante 5-10 segundos.
   3. Adquisición de cuentas.
      1. Crea un gráfico de puntos FSC-A/SSC-A en escala logarítmica mostrando [Todos los Eventos], y define una región llamada [Cuentas] (Figura 3A).
      2. Crea un gráfico de puntos FSC-A/FSC-H en la puerta [Beads] y define una región para identificar singlets [Singlet] (Figura 3B).
      3. Crea un gráfico histográfico para el canal de fluorescencia Star Fluor 488 (B525).
      4. Mostrar solo [Singlet]  en el histograma.
      5. Dibuja una puerta a lo largo de todo el ancho del primer pico (región B en la Figura 3C).
      6. En la cinta de Estadísticas, muestra los valores de la mediana X (X-Med).
      7. Elimina cualquier compensación existente.
      8. Pon el caudal en "Lento".
      9. Comienza la adquisición en modo "Correr".
      10. Desde "Ajuste de adquisición", modifica el voltaje/ganancia de B525 para alcanzar el objetivo X-Med calculado según el valor objetivo.
      11. Registrar un archivo de datos de 10.000 eventos en la puerta [Singlet] solo después de que se haya alcanzado ese criterio de aceptación. No adquieras muestras de estudio hasta que se haya alcanzado el rango objetivo.

Archivo suplementario 1: Plantilla de adquisición para el análisis^{de plaquetas pos} de TF en el Citómetro de Flujo A disponible para descargar. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 1: Captura de pantalla de la plantilla de adquisición para el análisis de plaquetas^{TF pos} en el Citómetro de Flujo A. (A) El diagrama de puntos FSC-A frente a SSC-A proporciona una representación visual de la distribución global de eventos. (B) Las plaquetas se identifican en un gráfico CD41 frente a SSC-A y se identifican como [plaquetas]. (C) Se incluye un gráfico PerCP-Cy5.5 frente a Star Fluor 488 para evaluar el posible derrame. (D) Los dobletes se excluyen dentro de la compuerta [de plaquetas] usando un gráfico FSC-A frente a FSC-H, definiendo la población de [singletos]. Las plaquetas^pos de TF (E) se identifican dentro de la compuerta de los [Singlets] basándose en la fluorescencia PerCP-Cy5.5 y Star Fluor 488. (F-H) Se muestran los ajustes de adquisición, incluyendo la tasa de flujo de muestreo (Lenta), el umbral primario (SSC) y las ganancias del detector (B525 y B690), tal como se implementa en la plantilla. Los detalles completos de la configuración y el flujo de trabajo de adquisición se proporcionan en la sección 3.1. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura 2: Plantilla de adquisición y estrategia de compuerta para la identificación de plaquetas^pos TF. (A) Gráfico de puntos FSC-A/SSC-A (ESCALA LOGARÍTMICA) que muestra todos los eventos detectados. (B) Diagrama de puntos CD41-A/SSC-A utilizada para identificar la población de plaquetas. (C) Gráfico de pseudocolor PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 utilizado para evaluar los requisitos de desbordamiento espectral y compensación. (D) Gráfico FSC-A/FSC-H en la puerta [Plaquetas] usado para excluir dobletes y definir singletes. (E) Gráfico de puntos PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 en [Singlets] usado para identificar plaquetas^pos de TF. Los campos estadísticos que se muestran entre paréntesis se rellenan automáticamente con valores específicos de la muestra cuando la plantilla se aplica durante la adquisición de la muestra. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Procedimiento de calibración de instrumentos basado en perlas. (A) Gráfico FSC-A/SSC-A usado para identificar eventos de cuentas. (B) Gráfico FSC-A/FSC-H dentro de eventos de cuenta usados para excluir agregados y definir singletes. (C) Histograma de fluorescencia de Star Fluor 488 mostrando picos de perlas con gating aplicado al primer pico de la perla para determinar la intensidad mediana de fluorescencia. Las estadísticas visualizadas deben considerarse representativas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Adquisición de muestras de citometría de flujo para análisis^{de plaquetas pos} de TF

1. Compras usando una plantilla de FCM.
   1. Importa la plantilla de adquisición usando la función "Importar plantilla" dentro del software A.
   2. Obtén las muestras preparadas en el paso 2.
   3. Verifica que las puertas de plaquetas y singletes coincidan con la geometría del gráfico de referencia antes de registrar los datos. Ajusta las puertas si es necesario.
   4. Empieza a grabar después de 5–10 segundos de flujo estable. Registrar un archivo de datos de 20.000 eventos dentro de la puerta  de los [Singlets] (véase la Figura 2D). Guarda archivos .fcs sin compensar y envíalos al Laboratorio Central.
2. Adquisición sin plantilla de FCM.
   1. Recrea una hoja de cálculo de adquisición según se informa en la sección 3.1, incluyendo los cinco gráficos descritos y la jerarquía de puertas: Todos los eventos > plaquetas > singlets > cuadrantes TF/CD41.
   2. Establece el umbral en 1000 en SSC-H.
   3. Pon el caudal en "Lento".
   4. Establece el voltaje/ganancia B525 según la definición de la 3.2.3.
   5. Prepara la muestra en el paso 2. Empieza a grabar tras 5–10 segundos de flujo estable; adquiere 20.000 eventos dentro de la puerta [Singlets]. Guarda archivos .fcs no compensados y envíalos al Laboratorio Central.
      NOTA: La adquisición solo es aceptable si se aprueba el instrumento de control de calidad diario. Si no se puede alcanzar el objetivo de 20.000^pos CD41 plaquetas, adquiere un mínimo de 10.000 eventos pos-plaquetas CD41.

5. Análisis de datos

NOTA: El flujo de trabajo de análisis descrito a continuación está destinado a apoyar las actividades del Laboratorio Central responsable del procesamiento centralizado de datos y el control de calidad.

1. Abre una nueva hoja de análisis y carga los archivos .fcs.
2. Para cada muestra, crea una plantilla de análisis como se muestra en la Figura 2. Para plataformas no idénticas, utiliza una plantilla equivalente específica de cada plataforma con la misma estructura de puertas y salidas estadísticas.
3. Verificar que la gating identifica correctamente la población plaquetaria según las características de dispersión predefinidas y la estrategia de discriminación de singlets (Figura 4A,B,D).
4. Comprueba si hay desbordamiento/compensación mediante un gráfico de pseudocolor [Todos los eventos] (Figura 4C).
   NOTA: La estrella fluorocroma Fluor 488 tiene una emisión espectral de 520 nm, en comparación con PerCP-Cy5.5, que tiene una emisión espectral de 676 nm, lo que explica la falta de solapamiento y la necesidad de no compensar.
5. Aplica la siguiente secuencia de gating en el gráfico de puntos Star Fluor 488 (Figura 5):
   1. No teñido: definan cuadrantes usando el control no teñido de modo que los^{eventos pos} de TF de fondo permanezcan en o por debajo del 0,01% de los eventos plaquetarios, excluyendo por la presente la autofluorescencia plaquetaria (Figura 5A).
   2. TF: aplicar las coordenadas del cuadrante definidas en la muestra sin teñir para identificar la señal^pos TF en muestras con una sola tinción (Figura 5B).
   3. CD41: definir cuadrantes usando la muestra de CD41 teñida para excluir la fluorescencia de fondo de las plaquetas (Figura 5C).
   4. TF/CD41: aplicar las mismas coordenadas de cuadrantes para identificar la señal^pos de TF en muestras teñidas con TF/CD41 (Figura 5D).
      NOTA: El porcentaje final de pos-plaquetas TF se obtiene a partir de las estadísticas generadas por el software de análisis y se informa como el porcentaje de^pos-eventos CD41 que caen dentro del cuadrante^pos TF de la población plaquetaria con acceso.
6. Realizar un control centralizado de calidad en la identificación de nombres de archivo, lotes de reactivos, intervalo de fijación a adquisición, temperatura de envío, conteo de eventos y distribuciones de fluorescencia de valores atípicos. Los archivos que muestren desviaciones documentadas en la manipulación local, envío, momento de fijación o configuración de adquisición deben ser señalados, revisados de forma centralizada y excluidos o repetidos, según el plan específico de gestión de desviaciones del estudio.

Figura 4: Estrategia de gating secuencial para el análisis^{de plaquetas pos} de TF. El flujo de trabajo de análisis representativo ilustra la identificación de poblaciones de plaquetas tras cargar archivos .fcs. (A-B) Gráficos de puntos que confirman la correcta gating de poblaciones de plaquetas. (C) Gráfico de pseudocolor PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 utilizado para evaluar el desbordamiento espectral. (D) Gráfico FSC-A/FSC-H dentro de la puerta de plaquetas usado para excluir dobletes y definir singletes. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Plantilla para análisis de datos. Gráficos de puntos representativos del control sin tinción (A) usados para definir la autofluorescencia base y la posición de cuadrantes. (B) Muestra TF con tinción única; (C) Muestra de tinte único CD41 usada para definir la posición de los cuadrantes. (D) Muestra de doble tinción TF/CD41 utilizada para el análisis de^{plaquetas pos} de TF. Los números indican el porcentaje de plaquetas^pos de TF en una muestra representativa. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Resultados

Este flujo de trabajo fue diseñado específicamente para permitir que centros con infraestructuras técnicas heterogéneas participen en estudios multicintrónicos que requieren cuantificación de plaquetas^pos TF. La Figura 1 ilustra el diagrama de flujo de trabajo organizacional diseñado para apoyar estudios multicéntricos destinados a medir plaquetas^pos de TF circulantes mediante citometría de flujo sanguíneo total. Se implementan diferentes procedimientos de preparación de muestras según los recursos técnicos disponibles en los centros participantes. Específicamente, (i) cuando una Unidad Clínica carece de instalaciones de citometría de flujo o personal formado, las muestras de sangre entera se fijan inmediatamente después de la recogida y luego se envían al Laboratorio Central para una tinción, adquisición y análisis centralizados. (ii) Alternativamente, los centros equipados con instalaciones de citometría de flujo pueden realizar tinciones y adquisiciones localmente. En estos casos, la adquisición de datos sigue un flujo de trabajo armonizado definido por el Laboratorio Central. Si el modelo del instrumento coincide con el utilizado en el Laboratorio Núcleo, la adquisición se realiza utilizando una plantilla estandarizada proporcionada por el Laboratorio Central. Cuando se utilizan diferentes modelos de instrumentos, la armonización puede lograrse mediante transferencia de plantilla —cuando hay instrumentos disponibles para alineación en el Laboratorio de Núcleo— o mediante procedimientos de calibración basados en perlas antes de la adquisición de la muestra. Luego se pueden adquirir muestras y analizarse según el flujo de trabajo estandarizado.

Los siguientes resultados representativos están destinados a ilustrar la viabilidad del flujo de trabajo y los pasos clave de armonización, más que a proporcionar una validación formal de ensayos multicéntricos. Para asegurar una detección fiable de TF, primero se evaluó la estrategia de tinción para verificar la compatibilidad espectral y la estabilidad de la señal. Las plaquetas se identificaron usando anti-CD41 PerCP-Cy5.5, mientras que la detección de TF se basó en un anticuerpo monoclonal anti-TF conjugado a Star Fluor 488. Se utilizaron controles con una sola tinción para verificar la ausencia de desbordamiento de fluorescencia entre canales de detección. Como se muestra en la Figura 6A, las muestras de tinción única de CD41 PerCP-Cy5.5 no produjeron señal detectable en el canal de Star Fluor 488. De forma consistente, el porcentaje de plaquetas^pos de TF medidas en muestras con doble tinción fue comparable al obtenido en muestras de tinción simple con TF (Figura 6B).

Figura 6: Validación de la especificidad de la tinción. (A) Muestra anti-CD41 de PerCP-Cy5.5 con tinción única analizada en un gráfico de puntos PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 para verificar la especificidad de la señal. (B) Los porcentajes de plaquetas^pos de TF medidos en muestras de tinción simple con TF frente a las de TF/CD41 con doble tinción se muestran como mediciones individuales por pares (puntos) y la media ± SD (n = 18 sujetos independientes). Los datos fueron analizados mediante la prueba de pares emparejados de Wilcoxon con rango firmado. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.La sensibilidad analítica del ensayo propuesto se evaluó en muestras de n=200 sujetos sanos. Utilizando muestras biológicamente en blanco, el límite calculado de vacío (LoB) era del 0,39%, el límite de detección (LoD) del 0,77% y el límite de cuantificación (LoQ) era del 1,12%, definido como el nivel más bajo asociado a un CV ≤ el 20%. La reproducibilidad interoperadora de la estrategia de gating se evaluó en 40 muestras independientes analizadas por 6 operadores utilizando la plantilla de análisis predefinida, lo que obtuvo un ICC de 0,985 (IC 95%: 0,978-0,990).

La estabilidad de la detección de TF tras la fijación de sangre entera se evaluó mediante la tinción longitudinal de muestras fijas. En comparación con las muestras basales teñidas el día de la fijación (D0), los niveles de ^{plaquetas pos} de TF se mantuvieron estables hasta cuatro días después de la fijación (D3-D4), mostrando solo una disminución no significativa de aproximadamente un 22% en D3-D4 (77,8 ± 7,2% - porcentaje relativo en plaquetas pos TF) en comparación con el nivel de D0. Cuando se realizó la tinción en D5-D6, la detección de^{plaquetas pos} de TF disminuyó significativamente al 53,8% ± al 20,7% (porcentaje relativo en plaquetas^pos TF; p< 0,0001; Figura 7). Estos resultados indican que las muestras fijas pueden analizarse de forma fiable dentro de los cuatro días posteriores a la fijación con solo una pérdida modesta de señal.

Figura 7: Análisis del curso temporal tras la fijación de la muestra. La cuantificación de las^{plaquetas pos} de TF medida en diferentes puntos temporales tras fijación indicó en el eje x de la siguiente manera: D0 = día de extracción de sangre; D1 = día 1; D2 = día 2; D3-4 = día 3 o 4; D5-6 = día 5 o 6. Los datos se expresan como media ± porcentaje relativo de DE en comparación con D0 (n = 7-10 sujetos sanos, evaluados en los puntos de tiempo post-fijación indicados). Los datos se analizaron utilizando Anova seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Posteriormente, se evaluó el rendimiento del flujo de trabajo armonizado de adquisición en diferentes plataformas de citometría de flujo. La armonización basada en plantillas se evaluó primero utilizando instrumentos FACSLyric y MACSQuant como citómetros de referencia. Se utilizaron instrumentos adicionales de los mismos modelos ubicados en instalaciones externas como plataformas de prueba. Se obtuvieron muestras de sangre entera que contenían plaquetas en reposo tanto en instrumentos de referencia como de prueba utilizando la plantilla de adquisición estandarizada. Como se muestra en la Figura 8A,B, se obtuvieron porcentajes comparables de^{plaquetas TF} pos en citómetros de referencia y prueba, confirmando la reproducibilidad del enfoque de plantilla compartida.

Figura 8: Reproducibilidad entre instrumentos usando plantillas de adquisición compartidas. Porcentajes de^{plaquetas pos} de TF medidos en sangre entera de n=6 sujetos sanos adquiridos en instrumentos de referencia y prueba FACSLyric (A) o MACSQuant (B) mediante una plantilla de adquisición compartida aplicada entre instrumentos. Los datos se expresan como determinaciones individuales (puntos) y media ± DS. Los datos se analizaron mediante una prueba t pareada. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Finalmente, se evaluó la armonización basada en cuentas para alinear instrumentos de diferentes configuraciones. El citómetro A se utilizaba como instrumento de referencia y un FACSymphony como instrumento de prueba. La alineación se realizó utilizando perlas de calibración Rainbow de 6 picos ajustando el voltaje del detector FACSymphony de 488 nm hasta que la intensidad de fluorescencia de las perlas cayó dentro del rango objetivo predefinido. Los perfiles de histogramas que ilustran las distribuciones de picos de las perlas antes y después de la alineación se muestran en la Figura 9A. Después, se obtuvieron muestras de sangre entera en el instrumento de prueba antes y después de la calibración. Antes de la armonización, los porcentajes de plaquetas^pos de TF variaban entre ambas plataformas. Tras la alineación basada en perlas, los valores coincidieron estrechamente con los obtenidos en el citómetro de referencia (Figura 9B), demostrando una armonización exitosa entre plataformas y cuantificación reproducible de TF.

Figura 9: Armonización de instrumentos basada en cuentas. (A) Histograma representativo de fluorescencia de las perlas de calibración Rainbow de 6 picos adquiridas antes (picos rojos) y después de la alineación del instrumento (picos verdes). (B) Porcentajes de plaquetas^pos de TF medidos en muestras en reposo preparadas de n=6 sujetos sanos adquiridos en el instrumento de prueba antes de (Pre) y después de la armonización (Post). Se muestran las mediciones obtenidas con el instrumento de referencia para comparación. Los datos se analizaron mediante una prueba t emparejada. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo paso a paso para la cuantificación de citometría de flujo sanguíneo total de plaquetas^pos TF, diseñado específicamente para una implementación multicéntrica. Su principal ventaja metodológica frente a los flujos de trabajo convencionales basados en el análisis de citometría de flujo plaquetario es que estandariza todo el proceso analítico, desde la recogida de sangre y fijación de sangre entera hasta el etiquetado de la muestra, la armonización de instrumentos antes de la adquisición, y el análisis centralizado y el control de calidad de los datos. Esto permite que los centros que no tienen la capacidad de procesamiento de muestras participen en estudios multicéntricos, si pueden proporcionar muestras de sangre. El flujo de trabajo actual aborda las fuentes prácticas de variabilidad entre centros que son más relevantes, considerando que solo una proporción menor de plaquetas presenta TF asociada a la superficie detectable bajo condiciones^{fisiológicas 7,8}. Estas fuentes incluyen diferencias en el manejo local de muestras, acceso a instalaciones de citometría de flujo, configuración del instrumento y análisis de datos dependiente del operador.

Para superar estos problemas, se fija la sangre entera poco después de la recogida, estabilizando el fenotipo plaquetario in vivo y evitando la necesidad de marcar y adquirir muestras de inmediato. Los resultados representativos indican que este enfoque de muestra fija permite un procesamiento centralizado retardado dentro del intervalo validado posterior a la fijación. Esto amplía el potencial de participación en estudios a centros que no disponen de instalaciones de citometría de flujo in situ, manteniendo al mismo tiempo un flujo de trabajo preanalítico consistente. Una segunda ventaja del protocolo es el uso de una estrategia simplificada de tinción directa con un panel bicolor sencillo, lo que reduce la complejidad del procedimiento.

En el panel, utilizamos el clon monoclonal anti-TF HTF1, bien caracterizado, que reconoce el sitio catalítico de la TF y compite con la unión al factor VII, convirtiéndolo en uno de los reactivos más fiables disponibles para la detección de TF, también en plaquetas^{14, 16 y 17}. El anticuerpo se conjugó a Star Fluor 488, un fluorocromo brillante y fotostable espectralmente similar al FITC pero con mejor estabilidad de señal. Es importante destacar que la excitación a 488 nm permite la detección de muestras con la configuración láser azul disponible en prácticamente todos los citómetros de flujo convencionales, incluidos los instrumentos de nivel básico. Esta combinación de especificidad de epítopos y detección directa de fluorocromo mejora la sensibilidad analítica y la escalabilidad en múltiples sitios. En este ensayo, se definieron umbrales de positividad utilizando controles no tintidos y FMO como mejor opción en comparación con el control isotipo para la colocación de umbrales en poblaciones de baja^{frecuencia 18}.

El uso de diferentes citómetros de flujo puede representar una fuente de variabilidad en los estudios de citometría de flujo^{multicintrónico} 19,20,21. Anteriormente hemos asesorado sobre manejo preanalítico, montaje de tintes y optimización local^{de instrumentos 17}. Pero estas medidas no garantizan señales de fluorescencia consistentes entre diferentes plataformas. El flujo de trabajo actual aborda este problema combinando análisis centralizado con armonización de adquisiciones prospectivas. Las plantillas de adquisición compartida pueden usarse cuando hay citómetros idénticos disponibles, mientras que la alineación basada en cuentas puede aplicarse cuando se deben incluir diferentes plataformas. Esta estrategia dual ofrece una ventaja práctica frente a los modelos analíticos multicéntricos que dependen únicamente del análisis centralizado tras una adquisición local heterogénea, al reducir la variabilidad del análisis de datos ab initio y apoyar una aplicación de compuertas más reproducibles entre sitios.

La generalización del flujo de trabajo no debe subestimarse. El protocolo fue validado utilizando condiciones específicas de fijación de sangre entera, la combinación anti-TF-Star Fluor 488 y anti-CD41 PerCP-Cy5.5, procedimientos de armonización y un conjunto limitado de configuraciones de citómetros de flujo. Si se utilizan otros clones anti-TF, combinaciones de fluorocromo, tiempos de fijación o concentraciones fijadoras, o citómetros de flujo con ópticas sustancialmente diferentes, debe comprobarse el rendimiento analítico del flujo de trabajo. En general, cualquier fallo de protocolo debe gestionarse mediante las reglas de desviación predefinidas sugeridas. Dependiendo de la gravedad de la desviación, los datos pueden ser señalados, repetidos o excluidos según el plan de desviación específico del estudio. Dentro de estos límites, el protocolo actual debe considerarse como un marco operativo para la implementación multicéntrica del análisis pos-plaquetas TF. La validación analítica formal, que incluye una evaluación más amplia del rendimiento interlaboratorio, la validación de envíos y la repetibilidad del ensayo, está siendo abordada actualmente en un estudio internacional dedicado a la normalización de la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasis. La relevancia clínica de la cuantificación precisa de^{plaquetas pos} TF queda subrayada por la evidencia que demuestra su valor pronóstico en la enfermedad coronaria, donde niveles de plaquetas^pos TF superiores al 4% predicen de forma independiente la mortalidad cardiovascular a largo plazo en el seguimiento¹⁶ de cinco años. Por tanto, una medición multicéntrica fiable es esencial para validar las^{plaquetas pos} de TF como biomarcador y para ampliar su aplicación a ensayos clínicos prospectivos y registros del mundo real. La futura implementación de algoritmos automatizados de normalización y estrategias de autogating podría reducir aún más el sesgo del operador y apoyar el análisis descentralizado, manteniendo la comparabilidad entre sitios^22,23.

En conclusión, este flujo de trabajo armonizado proporciona un enfoque práctico y reproducible para la cuantificación de plaquetas^pos de TF mediante citometría de flujo sanguíneo total en entornos multicéntricos. Al combinar procedimientos preanalíticos estandarizados, procesamiento simplificado de muestras y estrategias de armonización de instrumentos, el protocolo permite una comparación fiable entre sitios de mediciones^{de plaquetas pos} de TF. Más allá de apoyar la evaluación de las plaquetas^pos de TF como biomarcador de riesgo trombótico, los principios descritos aquí pueden contribuir a esfuerzos más amplios para estandarizar la citometría de flujo plaquetario para aplicaciones de investigación traslacional y clínica.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1X PBS w/o Calcium and Magnesium	Gibco	10010-015	Para anticuerpos y diluciones de muestra
Anti-CD41 PerCP-Cy5.5  (clone HIP8)	BD	333148	Anticuerpo monoclonal anti humano CD41a utilizado como marcador de población plaquetaria; debe ser proporcionado por el Laboratorio Central
Anti-TF Star Fluor 488  (clone HTF1)	Cyanagen	CR304	Anticuerpo monoclonal anti Factor de Tejido (CD142) humano; debe ser proporcionado por el Laboratorio Central
BD FACSLyric Flow Cytometer	BD	no es un artículo de catálogo	En el texto, Flow Cytometer B
BD FACSuite software v1.6	BD	no es un artículo de catálogo	En el texto, software B
Butterfly Needle G19	PIKDARE	02044019030010	Para extracción de sangre
CytExpert Software	Beckman Coulter	no es un artículo de catálogo	En el texto, software A
CytoFLEX S flow cytometer	Beckman Coulter	no es un artículo de catálogo	En el texto, Flow Cytometer A
MACSQuant Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	no es un artículo de catálogo	En el texto, Flow Cytometer C
MACSQuantify software v3.1	Miltenyi Biotec	no es un artículo de catálogo	En el texto, software C
Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	120094	Para fijación de sangre entera
Paraformaldehyde	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	Para fijar muestras
Pipet tips 10 µL	Gilson	F161630	Para transferir muestras de sangre
Pipet tips 1000 µL	Gilson	F161670	Para transferir muestras de sangre
Pipet tips 200 µL	Gilson	F161930	Para transferir muestras de sangre
Polystyrene Round-Bottom Tube 5 mL	Corning	352052	Necesario para la adquisición del flujo citómetro
Rainbow calibration beads (6 peaks)	Spherotech (BD)	556286	Para la armonización del flujo citómetro
Vacutainer EDTA	BD	368857	Para recoger los primeros 3 ml de sangre
Vacutainer multiple sample luer adapter	BD	367300	Para extracción de sangre
Vacutainer one use holder	BD	364815	Para extracción de sangre
Vacutainer with 0,129 M sodium citrate	BD	363079	Para recoger sangre