Caracterización funcional de parejas pre- y postsinápticas individuales en el sistema nervioso central larvario de Drosophila usando CaMPARI

Summary

Este protocolo evalúa la actividad sináptica funcional entre parejas neuronales definidas in vivo en el sistema nervioso central de las larvas de Drosophila melanogaster utilizando herramientas codificadas genéticamente. CsLa estimulación optogenética mediada por Chrimson de neuronas sensoriales presinápticas cIVda induce la fotoconversión dependiente de calcio de CaMPARI en interneuronas possinápticas de la Cuenca-4.

Abstract

Los estudios sobre el connectoma han ampliado enormemente la comprensión de la conectividad sináptica en los sistemas nerviosos de diversas especies. Aunque la caracterización de los socios sinápticos mediante microscopía electrónica (EM) proporciona información anatómica detallada, los aspectos funcionales de las redes neuronales requieren enfoques complementarios. Estudios recientes en Drosophila han revelado no solo el conectoma completo de la larva, así como el sistema nervioso central adulto masculino y femenino, sino también los componentes celulares de las redes neuronales que regulan comportamientos específicos, como la red nociceptiva larval. En la etapa larvaria del tercer estadio, las neuronas sensoriales multidendríticas de arborización dendrítica de clase IV (nociceptores) establecen la mayoría de los contactos sinápticos con interneuronas de la Cuenca 4. Para evaluar la relevancia funcional de estas conexiones anatómicas, se empleó el indicador de calcio codificado genéticamente CaMPARI (Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator) en larvas vivas y no disecadas de tercer estadio como reportero dependiente de la actividad para evaluar la conectividad sináptica entre neuronas cIVda e interneuronas de la Cuenca-4. CaMPARI es un indicador fluorescente ratiométrico cuyo espectro de emisión cambia en respuesta a niveles elevados de calcio intracelular. Bajo condiciones de base, CaMPARI fluoresce en verde; en presencia de altas concentraciones de calcio y al exponerse a luz de fotoconversión (~400 nm), cambia irreversiblemente a fluorescencia roja. Dado que el afluencia de calcio en las neuronas postsinápticas es una característica distintiva de la activación sináptica, la fotoconversión CaMPARI proporciona una lectura de la señalización sináptica funcional. Se presenta un método paso a paso para inmovilizar larvas de tercer estadio en una lámina de microscopio para la activación optogenética de nociceptores cIVda utilizando la canalrodopsina CsChrimson desplazada al rojo, combinada con fotoconversión simultánea de CaMPARI en neuronas de la Cuenca-4. La fotoconversión dependiente del calcio en las neuronas de la Cuenca-4, a pesar de los movimientos internos y los cambios en el plano focal, proporciona evidencia funcional de conectividad sináptica entre estas células. Esto sirve como prueba de principio para el uso de CaMPARI en combinación con estimulación optogenética presináptica en larvas de Drosophila intactas y no disecadas.

Introduction

Identificar socios sinápticos precisos en el sistema nervioso central (SNC) permite rastrear la formación y el refinamiento de las conexiones sinápticas durante el desarrollo del sistema nervioso. En consecuencia, los esfuerzos se han centrado en el uso de microscopía electrónica volumétrica (EM) para reconstruir no solo conectomas completos en potentes organismos modelo genéticos como Caenorhabditis elegans ^1,2 y Drosophila melanogaster ^3,4,5, sino también volúmenes electromagnéticos a escala milimétrica de cerebros complejos de mamíferos, incluyendo la corteza visual primaria^{del ratón 6} y la corteza temporal^{humana 7}. Estos estudios ofrecen una visión única de los principios organizativos que subyacen a la conectividad sináptica a nivel anatómico. Sin embargo, la caracterización funcional de los socios sinápticos proporciona una visión complementaria de la conectividad neuronal y es necesaria para validar los hallazgos anatómicos.

Drosophila ofrece numerosas ventajas para el estudio de la conectividad neuronal, incluyendo la disponibilidad de conectomas completos para la larva³, así como para el sistema nervioso central adulto^{de la hembra 4} y^{macho 5}, además de circuitos neuronales bien caracterizados que regulan comportamientos predecibles ^8,9,10. La red nociceptiva larvaria representa uno de esos circuitos bien adaptados para estudiar la conectividad sináptica^{precisa 11}. La reconstrucción EM de esta red ha revelado asociaciones sinápticas detalladas necesarias para procesar estímulos nociceptivos, lo que ha dado lugar al comportamiento característico de escape conocido como rodamiento^{nocifensitivo 12,13}.

Dentro de esta red, las neuronas de arborización dendrítica de clase IV (cIVda)¹⁴ funcionan como nociceptores sensoriales primarios responsables de la detección^{del dolor 11,12,13,15,16}. Sus cuerpos celulares y dendritas se encuentran periféricamente en la pared corporal, mientras que sus axones se proyectan en la médula nerviosa ventral larval (VNC⁾¹⁵. Dentro del SNC, las neuronas cIVda arborizan sus terminales axonales en un patrón estereotipado y forman la mayoría de sus contactos sinápticos con las interneuronas de la Cuenca-4 11,12,13,17. Esta relación sináptica definida establece a las neuronas cIVda y a las interneuronas de la Cuenca-4 como un par ideal para la evaluación funcional de la conectividad sináptica in vivo. El desarrollo de métodos para analizar conexiones funcionales entre socios sinápticos identificados individualmente facilitará la investigación de los mecanismos subyacentes al desarrollo y refinamiento sináptico, especialmente en sistemas genéticamente manejables con circuitos neuronales estereotipados.

CaMPARI (Integrador Ratiométrico Fotoactivable Modulado con Calcio⁾¹⁸ es un indicador fluorescente ratiométrico codificado genéticamente cuyo espectro de emisión se desplaza en respuesta a niveles elevados de calcio intracelular. Bajo condiciones de base, CaMPARI fluoresce en verde; En presencia de altas concentraciones de calcio y al exponerse a luz de fotoconversión (~400 nanómetros (nm)), se convierte irreversiblemente en fluorescencia^{roja 18}. Debido a que la entrada de calcio en las neuronas postsinápticas es una característica distintiva de la activación sináptica, la fotoconversión CaMPARI proporciona una lectura de la señalización sináptica^{funcional 19,20}.

Además de CaMPARI, la actividad neuronal puede visualizarse mediante sensores reversibles como indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) como GCaMP o RCAMP²¹, así como indicadores de voltaje codificados genéticamente (GEVI⁾²² como Arclight²³, Ace2N-mNeon²⁴ o VARNAM²⁵. Aunque estos sensores rápidos y reversibles son muy adecuados para monitorizar la actividad transitoria en tiempo real, son susceptibles a artefactos de movimiento durante la imagen in vivo . En cambio, las propiedades integrativas e irreversibles de fotoconversión de CaMPARI permiten capturar la actividad durante una ventana de tiempo definida, permitiendo la detección de activación neuronal incluso cuando los planos focales se desplazan durante la imagen²⁰. Además, la fotoconversión CaMPARI puede ajustarse ajustando la intensidad de la luz violeta, lo que permite detectar la reducción de la fuerza sináptica o entradas^{subumbrales 26}. Estas propiedades han permitido el mapeo de actividad en animales en movimiento libre sin fijación ni anclaje de cabeza, incluyendo estudios en la corteza^{de ratón 27}, cerebro de pez^{cebra 28}, C. elegans²⁹ y Drosophila^{adulta 20}.

Se describe un protocolo para visualizar parejas sinápticas funcionales mediante fotoconversión CaMPARI combinada con estimulación optogenética presináptica mediante microscopía confocal en larvas de Drosophila intactas y no disecadas. En este enfoque, CaMPARI se utiliza para detectar la entrada de calcio postsináptica en interneuronas de la Cuenca-4 tras la activación optogenética de neuronas cIVda en larvas vivas de tercer estadio. Las neuronas cIVda expresan la channelrodopsina activada por luz roja CsChrimson^30,31, mientras que las interneuronas de la cuenca-4 expresan CaMPARI. La exposición a la luz roja activa selectivamente los nociceptores, imitando un estímulo nociceptivo de manera temporalmente^{controlada 16,30}. Esta estrategia permite evaluar si la activación presináptica induce la fotoconversión CaMPARI dependiente de calcio en neuronas postsinápticas, proporcionando así evidencia funcional de conectividad sináptica.

Varias ventajas técnicas apoyan el uso de CaMPARI en combinación con CsChrimson para el análisis de la conectividad cIVda–Cuenca-4. Primero, las dendritas cIVda forman un mosaico completo y no solapado de la pared corporal^{larval 32}, permitiendo la activación optogenética de neuronas sensoriales intactas sin efectos de confusión por daño inducido por^{disección 16}. Segundo, aunque las larvas están físicamente inmovilizadas en una lámina de microscopio, los movimientos internos alteran frecuentemente la posición del SNC y el plano focal durante la imagen; La fotoconversión CaMPARI es menos sensible a estos artefactos de movimiento y proporciona una lectura estable e integrada en el tiempo de la actividad neuronal. En tercer lugar, las propiedades integradoras y sintonizables de CaMPARI permiten la detección de actividad sináptica incluso cuando la fuerza sináptica o el número de contacto se reducen, como durante las primeras etapas del desarrollo, apoyando así futuros estudios sobre la formación y refinamiento de sinapsis.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales que involucraron a Drosophila melanogaster se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales. El genotipo w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4 (obtenida al recombinar RRID:^{BDSC_54899 12} y RRID:BDSC_32079¹⁶) se utilizó para impulsar la expresión optogenética y CaMPARI (usando la línea w^-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo obtenido al recombinar RRID:BDSC_81085 con marcadores cromosómicos segundos) en parejas presinápticas, respectivamente. Las herramientas de investigación utilizadas en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de larvas

1. Establecer cruces genéticos entre hembras vírgenes UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; CyO/sp (RRID:BDSC_81085) y machos de una línea de moscas que contiene dos sistemas binarios, por ejemplo, con la neurona presináptica de interés impulsando la expresión de GAL4 y la neurona postsináptica de interés impulsando^{LexA 33,34}.
2. Colocar cruces genéticos en viales de plástico que contienen medio estándar de ágar de harina de maíz 35,36,37,38 suplementado con 0,5 mM de retinal all-trans (ATR) para la activación de CsChrimson^30,33. Prepara viales paralelos sin ATR como controles sin ATR.
   NOTA: Derrite el medio de ágar de harina de maíz sin hervirlo. Déjalo enfriar sin solidificarse. Prepara una solución ATR de 40 mM (ATR en polvo diluido en etanol al 95% según las instrucciones del fabricante), luego diluye hasta 0,5 mM en el medio y mezcla bien.
3. Cubre completamente los frascos con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.
   NOTA: Mantener condiciones de cría en oscuridad constante debido a la sensibilidad a la luz de la ATR y para prevenir la activación neuronal no deseada. Aunque CsChrimson es más sensible a la luz roja (590–680 nm), también puede activarse por otras longitudes de onda^{visibles 31,39}.
4. Incubar frascos a 25 °C y elevar las larvas al estadio de tercer estadio.

2. Inmovilización larvaria

1. Recoge una larva de tercer estadio usando un pincel. Lava las larvas en una placa micro puntual de tres pozos que contiene 0,1 M PBS para extraer el alimento.
   NOTA: No retires el exceso de PBS; Ayuda a mantener la hidratación.
2. Coloca una pequeña cantidad de plastilina en cada esquina de una capa limpia (18 × 18 mm). Coloca la larva en una gota de PBS sobre la capa de cobertura y déjala orientar con el lado ventral hacia abajo.
   NOTA: Para la imagen de la médula nerviosa ventral (VNC), se coloca la larva sobre su lado dorsal de modo que la superficie ventral toque el engobe de cobertura. Esta orientación permite que las interneuronas de la Cuenca-4 en el VNC se orienten hacia el objetivo a través del deslizamiento de cobertura.
3. Coloca una lámina limpia sobre la capa de cobertura que contiene la larva.
4. Asegura la cubierta aplicando más plastilina en las esquinas. Aplicar suficiente presión para inmovilizar a la larva evitando la ruptura o el deslizamiento de cobertura.

3. Flujo de trabajo de estimulación, fotoconversión e imagen

1. Adquiere un pila z de base de neuronas postsinápticas que expresan CaMPARI usando canales simultáneos verde (488 nm, 0,8% de potencia láser) y rojo (~561 nm, 0,8% de potencia láser). Utiliza un paso Z de 1 μm, resolución de 256 × 256 píxeles, promedio lineal de 2, escaneo bidireccional y velocidad de escaneo de 9 en un microscopio confocal equipado con un objetivo 40×/1.2. Realiza todas las imágenes en un entorno oscuro. Mantener parámetros idénticos de la pila z durante todo el experimento.
   NOTA: Espera cuerpos celulares verde brillante en posiciones estereotipadas en el VNC larvario y ninguna fluorescencia roja detectable en el punto de partida.
2. Estimular la larva de forma continua durante 30 s utilizando luz de fotoconversión simultánea (405 nm, 0,5% de potencia láser) y luz de estimulación optogenética (594 nm, 0,8% de potencia láser).
3. Adquiere un z-stack post-estimulación usando los mismos parámetros que en el paso 3.1 bajo los canales rojo (~561 nm) y verde (488 nm). Espera que los cuerpos de las células VNC estén en posiciones similares a las de la línea base. Detectar fluorescencia roja de CaMPARI en neuronas activadas durante la estimulación en larvas alimentadas con ATR, con fotoconversión mínima en controles sin ATR.
   NOTA: El flujo de trabajo y los parámetros se resumen en la Figura 1.

Figura 1: Flujo de trabajo para estimulación, fotoconversión (PC) e imagen. Se utilizaron tres fases secuenciales de imagen para evaluar la actividad calcio en las neuronas de la Cuenca 4. Durante la fase base, se adquirieron pilas z utilizando láseres de 488 nm y 561 nm para capturar la fluorescencia verde y roja de CaMPARI antes de la estimulación. Durante la fase de estimulación, las neuronas cIVda se activaron optogenéticamente mediante CsChrimson (594 nm) mientras que la iluminación simultánea de 405 nm fotoconvertía CaMPARI activo de fluorescencia verde a roja; No se realizaron pruebas de imagen durante este periodo de 30 años. Durante la fase post-estimulación, los pilas z se readquirieron usando los mismos ajustes láser que en la línea base para detectar señales rojas fotoconvertidas en los cuerpos celulares de la Cuenca-4. Todas las pilas z se adquirieron a 256 × 256 píxeles con pasos Z de 1 μm, promedio lineal de 2 y escaneo bidireccional en condiciones de oscuridad utilizando un microscopio confocal equipado con un objetivo de 40×/1,2 NA. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Análisis de imágenes

1. Abrir imágenes z-stack en Fiji (RRID:SCR_002285) con Bio-Formatos activados. Pon la visualización de pila en Hyperstack, el modo de color en Compuesto y activa el Autoescalado. Desplázate por los planos Z y selecciona el plano con el enfoque óptimo. Duplicar el plano seleccionado (Imagen → Duplicar; Canales: 1–2; plano Z seleccionado).
2. Divide los canales rojos y verdes (Imagen → Color → Canales Divididos).
   NOTA: Ajusta brillo y contraste usando Imagen → Ajusta → Brillo/Contraste → Auto para ambos canales.
3. Resta fondo de ambos canales (Proceso → Resta fondo) usando un radio de bola rodante de 50 px.
4. Configura las mediciones (Analizar → establecer mediciones) para incluir Área, valor gris medio, densidad integrada (IntDen), desviación estándar y valores mínimos y máximos de gris.
5. Dibuja regiones de interés (ROIs) alrededor de cada celda en el canal verde usando la herramienta a mano alzada. Añade los ROIs al Gestor de ROI y mide. Aplica el mismo ROI al canal rojo y mide.
6. Registra todas las mediciones en una hoja de cálculo, incluyendo identificadores de larvas y células.
   NOTA: Realiza mediciones tanto para imágenes pre como post-estimulación.
7. Calcula las relaciones de fluorescencia roja-verde usando valores de densidad integrada para obtener (R/G)_post y (R/G)_pre para cada celda. Valores medios a nivel celular por larva.
   NOTA: La Densidad Integrada (Área × Media) permite la comparación entre celdas de diferentes tamaños.
8. Calcula Δ(R/G) como (R/G)_post − (R/G)_pre usando promedios larvales. Interpreta valores positivos de Δ(R/G) como un aumento de la actividad calciativa postsináptica durante la fotoconversión.
   NOTA: Los valores negativos de Δ(R/G) pueden surgir por ruido o asimetría de fondo. Establece valores negativos a 0. En este conjunto de datos, una larva mostró un valor negativo (−0,008), que se estableció en 0.

Results

Siguiendo este protocolo, se evaluó la conectividad funcional entre las neuronas cIVda y las interneuronas de la Cuenca-4 en larvas vivas de tercer estadio de D. melanogaster vivas y no disecadas utilizando CaMPARI (Figura 2). Antes de cualquier estimulación con luz de fotoconversión (PC) o activación optogenética, las interneuronas de la Cuenca-4 mostraban fluorescencia verde debido a la expresión citosólica de CaMPARI (Figura 2A). No se detectó fluore...

Discussion

El protocolo descrito aquí permite una evaluación cualitativa y cuantitativa de la conectividad sináptica entre compañeros sinápticos definidos en larvas intactas de D. melanogaster . Este enfoque aprovecha la combinación de la estimulación optogenética de neuronas sensoriales cIVda con la visualización basada en CaMPARI de interneuronas postsinápticas activadas de la Cuenca-4 para monitorizar la actividad sináptica en el sistema nervioso central (SNC) de larvas no diseccionadas...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK	Químico utilizado en solución para hidratar y montar larvas
All-trans-retinal (ATR)	Sigma Aldrich	R2500-500mg	Químico añadido a la comida para activar herramientas optogenéticas
Microscopio confocal	ZEISS	LSM900 Confocal	Microscopio confocal, Objetivo (40×/1.2 NA), Fuente de luz/láser (405, 488, 561 nm)
Láminas de cubreobjetos (18x18mm)	VWR	48366-205	Utilizadas para montar animales para imagen
Etanol (95%)	Sigma Aldrich	E7023	Utilizado como solvente para el polvo de ATR
Fiji (ImageJ)	Código abierto	RRID:SCR_002285	Utilizado para análisis de imágenes
Prism versión 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID:SCR_002798	Utilizado para análisis estadístico
Portalaminas	VWR	48300-041	Utilizados para montar animales para imagen
Arcilla de modelar	Flinn scientific	FB0600	Utilizada para sostener el cubreobjetos en el portaobjetos del microscopio con larvas en medio
Pincel	Genesee scientific	59-204	Utilizado para transferir larvas entre ubicaciones
Agar de maíz estándar	Genesee scientific	66-123	La comida también puede prepararse usando recetas e ingredientes estándar similares
Viales de plástico estándar para Drosophila (viales estrechos de Drosophila de 25mm x 95mm)	Genesee scientific	32-109	También se pueden usar viales o botellas grandes
Placa de micro manchas de tres pocillos	Electron Microscopy Sciences	71561-01	Placa utilizada para separar y limpiar larvas individuales
Cepa de Drosophila (genotipo: w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079	Obtenida a partir de la recombinación de RRID:BDSC_54899 y RRID:BDSC_32079
Cepa de Drosophila (genotipo: w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_81085	Obtenida a partir de la recombinación de RRID:BDSC_81085 con marcadores del segundo cromosoma