Hibridación asistida por expansión, reacción en cadena smFISH e inmunohistoquímica en el cerebro de Drosophila

Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo de HCR-smFISH e inmunohistoquímica asistido por expansión para el análisis cuantitativo y específico de tipo celular de la expresión de ARN y proteínas en el cerebro de Drosophila , incluyendo imágenes con microscopía de lámina de luz o confocal y cuantificación automatizada de transcritos nucleares y citoplasmáticos.

Resumen

El análisis cuantitativo y resuelto espacialmente de la expresión génica es esencial para evaluar perfiles moleculares específicos de cada tipo celular. En el sistema visual de Drosophila , extensas herramientas genéticas abren un marco para la evaluación directa tanto de los niveles de ARN como de proteínas en poblaciones neuronales definidas. Aquí presentamos un protocolo paso a paso que combina HCR-smFISH asistido por expansión (hibridación en cadena de reacción en cadena de fluorescencia in situ de molécula única) con inmunohistoquímica para permitir el análisis cuantitativo de perfiles moleculares específicos de tipo celular en tipos neuronales de sistemas visuales definidos genéticamente. El flujo de trabajo está optimizado para células marcadas con marcadores localizados nuclearmente o unidos a membranas, permitiendo medir los niveles de transcritos y proteínas en las mismas neuronas. Tras la expansión del tejido, las muestras se capturan mediante microscopía de lámina de luz para una adquisición volumétrica rápida, demostrándose un flujo de trabajo alternativo de montaje e imagen para microscopios confocales estándar de escaneo láser invertido y disco giratorio. Además, proporcionamos un algoritmo automatizado de segmentación que distingue los transcritos nucleares y citoplasmáticos, permitiendo análisis del estado transcripcional y la localización del ARN subcelular. Se proporciona orientación práctica sobre parámetros experimentales y errores comunes que afectan a la calidad de la señal, la integridad tisular y el rendimiento cuantitativo. Las aplicaciones representativas incluyen la validación de la interferencia de ARN específica de tipo celular cuantificando los cambios correspondientes en los niveles de ARN y proteínas. Al permitir mediciones integradas a nivel de ARN y proteína con especificidad de tipo celular, este enfoque proporciona una estrategia escalable para el análisis molecular basado en hipótesis y, en contextos específicos, una alternativa práctica a los ensayos transcriptómicos unicelulares. Este protocolo proporciona un enfoque práctico para validar perturbaciones moleculares específicas de cada tipo celular, preservando al mismo tiempo el contexto anatómico del cerebro intacto de Drosophila .

Introducción

El sistema visual de Drosophila melanogaster ha servido como un modelo potente para abordar una amplia gama de cuestiones en neurociencia del desarrollo, incluyendo la diferenciación^{neuronal 1,2}, la especificación de tipo^{celular 3,4} y la lógica molecular del cableado cerebral ^5,6,7. Este progreso ha sido impulsado por un conjunto experimental inusualmente rico, que incluye grandes colecciones de líneas genéticas específicas de tipo celular ^8,9,10, recientes reconstrucciones conectómicas^integrales 10,11,12, y cada vez más detalladas transcriptómicas ^{unicelulares 13,14} y^{multiómica 15} conjuntos de datos. En conjunto, estos recursos definen tipos neuronales de forma multimodal y permiten manipulaciones genéticas precisas. Como resultado, el campo puede ahora generar hipótesis cada vez más predictivas sobre cómo genes específicos regulan la identidad neuronal, la conectividad y^{la función 16}.. Aunque la secuenciación de ARN unicelular proporciona información poderosa sobre los estados transcripcionales, la abundancia de ARN no siempre predice la expresión de^{proteínas 17}, y muchos experimentos de perturbación requieren finalmente una medición directa y cuantitativa tanto del ARN como de la proteína en las mismas neuronas.

La hibridación in situ por fluorescencia de molécula única (smFISH^)18,19 permite la medición cuantitativa de la abundancia de transcritos con resolución celular y subcelular, preservando al mismo tiempo el contexto anatómico. La combinación de smFISH con microscopía de expansión 20,21,22 ha ampliado aún más su utilidad a cerebros intactos al agrandar físicamente el tejido dentro de un hidrogel hinchable, reduciendo así el apiñamiento molecular, mejorando el acceso óptico y aumentando la resolución espacial efectiva. Cuando se combina con la amplificación de señal basada en reacción en cadena de hibridación^{(HCR) 23}, el smFISH asistido por expansión permite una detección robusta de transcritos discretos a lo largo de tejido neural grueso y soporta la imagen de todo el cerebro mediante microscopía de lámina de luz o microscopía confocal.

Se han aplicado diversas técnicas de imagen de ARN in situ al cerebro de Drosophila , reflejando diferentes prioridades experimentales. El HCR-FISH iterativo asistido por expansión ha permitido la detección de ARN resuelto espacialmente en todo el^{cerebro 24}. Paralelamente, se han utilizado enfoques FISH de montaje completo sin expansión para mediciones de ARN en neuronas genéticamente marcadas, incluyendo estrategias de mapeo de actividad basadas en HCR centradas en genes tempranos^{inmediatos 25} y flujos de trabajo de recuento de transcritos basados en segmentación utilizando marcadores codificados genéticamente^{vinculados por membrana 26}. Métodos comerciales basados en sondas, como RNAscope, han permitido además la detección de ARN multiplex en cerebros completos, a menudo combinados con inmunohistoquímica para identificar poblaciones celulares^{objetivo 27}. En conjunto, estos enfoques establecen que el análisis espacialmente resuelto de ARN en el cerebro de la mosca es técnicamente factible. Sin embargo, los experimentos de perturbación basados en hipótesis imponen un conjunto más específico de requisitos que no están completamente atendidos por ningún flujo de trabajo existente. Muchos métodos priorizan el mapeo de transcritos de tipo descubrimiento multiplex, el perfilado de estado de actividad o la cuantificación de ARN únicamente, siendo la inmunotinción que suele servir como identificador celular en lugar de lectura emparejada de la proteína perturbada, o aplicándose en ausencia de la asignación genética de tipo celular²⁸. Además, las aplicaciones rutinarias se beneficiarían de la compatibilidad con múltiples plataformas de imagen y de canales de análisis automatizados y escalables.

Aquí presentamos un flujo de trabajo integrado y paso a paso para el sistema visual de Drosophila que combina HCR-smFISH asistido por expansión con inmunohistoquímica realizada antes de la expansión, permitiendo la medición por pares de niveles de ARN y proteínas en las mismas neuronas dentro del mismo espécimen biológico. Basándonos en el marco^{FlySeg 29} que desarrollamos previamente, proporcionamos una cadena automatizada de cuantificación para la segmentación nuclear y el conteo de transcritos que distingue puntos nucleares y citoplasmáticos, soportando tanto mediciones de expresión total como análisis sensibles al estado transcripcional. El protocolo se demuestra tanto en un microscopio de lámina de luz como en dos sistemas confocales con flujos de trabajo alternativos de montaje e imagen. Finalmente, ilustramos la utilidad de la lectura integrada ARN–proteína con un experimento representativo de validación de perturbaciones (es decir, el knockdown mediado por ARNi de un objetivo definido), proporcionando orientación práctica sobre parámetros y riesgos que afectan a la calidad de la señal, la integridad tisular y el rendimiento cuantitativo.

Este protocolo se basa generalmente en el marco^{de 24} EASI-FISH previamente descrito para la detección de ARN cerebral completo en Drosophila, y mantiene sus principios fundamentales de anclaje de ARN, expansión de hidrogeles y amplificación de señales basada en HCR. El protocolo actual amplía y perfecciona este enfoque integrando inmunohistoquímica antes de la expansión para permitir mediciones emparejadas de ARN y proteínas en las mismas neuronas, revisando múltiples pasos de procesamiento y manejo a lo largo del flujo de trabajo para mejorar la robustez y reproducibilidad, proporcionando estrategias prácticas de montaje e imagen tanto para microscopios de lámina de luz como para microscopios confocales invertidos convencionales, e incorporando segmentación automatizada de soma y cuantificación de transcripciones con separación explícita de reservas de ARN nuclear y citoplasmático.

Este flujo de trabajo es más adecuado para experimentos específicos cuyo objetivo es cuantificar lecturas definidas de ARN y proteínas en neuronas genéticamente identificadas, preservando el contexto anatómico. Es especialmente útil para validar perturbaciones moleculares cuando el objetivo es medir la regulación al alza o a la baja de un gen definido o de un pequeño conjunto de genes candidatos, comparar la expresión entre genotipos o etapas de desarrollo, o evaluar el estado transcripcional mediante localización de transcritos nucleares frente a citoplasmáticos. Es menos adecuado para el descubrimiento de transcripciones sesgadas o para el mapeo de expresión cerebral completa con alto plex, donde la secuenciación de células únicas, la transcriptómica espacial o los enfoques iterativos multiplexados de FISH pueden ser más apropiados.

Protocolo

Declaración ética

Este protocolo utiliza Drosophila melanogaster. No se utilizaron animales vertebrados ni sujetos humanos. Por ello, no se requería la aprobación del comité institucional de cuidado y uso animal.

NOTA: Utiliza la técnica de limpieza RNasa en todo momento. Lleva guantes, limpia las superficies y herramientas con solución de descontaminación RNasa, y prepara todas las soluciones con agua libre de RNasa.

Figura 1. Flujo de trabajo paso a paso del protocolo de preparación de muestras (A) Cronología esquemática del protocolo, que indica la progresión aproximada día a día y los pasos de incubación nocturnos. (B–J) Visión esquemática de los principales pasos de preparación de la muestra, desde la disección y fijación cerebral hasta inmunohistoquímica, entrecruzamiento ARN/proteína, incrustación de hidrogel, digestión, hibridación de sonda y amplificación de señales de HCR. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

1. Disección cerebral, fijación e inmunohistoquímica (Días 1–3)

NOTA: Realizar todos los pasos en una placa de varios pozos estilo Terasaki, salvo que se indique lo contrario. Usa 10 μL por pozo para incubaciones y lavados. Mantén la humedad colocando una toallita de laboratorio húmeda en una esquina de la placa.

PRECAUCIÓN: Los paraformaldehídos y los fijadores glioxales son tóxicos/irritantes. Maneja la manga en una campana extractora y usa el EPI adecuado.

1. Diseccionar cerebros en medio de insectos S2 helado. Transfiere cerebros a pozos, hasta 10 cerebros por pozo (Figura 1B–C).
   NOTA: Para los experimentos representativos aquí mostrados, se utilizaron 72 cerebros pupales de h-00.
2. Sustituye el medio S2 por un fijador de 10 μL por pozo, cámbialo una vez.
3. Fix con Addax glyoxal sin ácido con un 5% (p/v) de sacarosa durante la noche a 4 °C (Figura 1C).
4. Lava cerebros 3× en 10 μL PBST (0,5% Triton X-100 en PBS) durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: El Triton X-100 es un irritante; Evita el contacto visual con la piel y los ojos.
5. Incubar cerebros en una solución primaria de anticuerpos de 10 μL (en PBST, a las diluciones indicadas en la Tabla de Materiales) durante 24 horas a 4 °C. (Figura 1D).
6. Lava el cerebro 3× durante 10 minutos con 10 μL PBST a 4 °C. Para cada lavado, reemplaza la solución una vez a mitad de la incubación (dos intercambios por lavado).
7. Incubar cerebros en una solución secundaria de anticuerpos de 10 μL (en PBST, a las diluciones indicadas en la Tabla de Materiales) durante 24 horas a 4 °C (Figura 1D).
   NOTA: Protege las muestras de la luz.
8. Lava el cerebro 3× durante 10 minutos con 10 μL PBST a 4 °C. Para cada lavado, reemplaza la solución una vez a mitad de la incubación (dos intercambios por lavado).
   NOTA: Utilizar concentraciones de anticuerpos primarios y secundarios 2–3 veces superiores a las concentraciones estándar de inmunohistoquímica de montaje completo
   PUNTO DE PAUSA: Almacenar cerebros en 10 μL 1× PBS a 4 °C durante hasta 96 horas.

2. Anclaje covalente de ARN y proteínas (Día 4) (Figura 1E)

PRECAUCIÓN: Los alquiladores ancladores de ARN y los AcX son peligrosos (tóxicos/irritantes; algunos se sospecha que son carcinógenos). Prepara y manipula las soluciones en una campana extractora química con el EPP adecuado. Recoge todos los residuos como residuos químicos peligrosos.

1. Incubar cerebros en 10 μL de tampón MOPS de 20 mM (pH 7,7) durante 20 minutos a 37 °C.
2. Preparar la solución de anclaje mezclando 49,5% (v/v) de MOPS de 20 mM, 49,5% (v/v) de Melphalan (2,5 mg·^mL-1 en DMSO) y 1% (v/v) de AcX (10 mg·^mL-1 en DMSO). Esto produce concentraciones finales de 1,24 mg·^mL-1 melfalano y 0,10 mg·^mL-1 AcX.
3. Sustituye los MOPS por una solución de anclaje de 7–8 μL por pozo, intercambia la solución una vez y incuba durante la noche a 37 °C en la oscuridad.
   NOTA: Utilice 7–8 μL para minimizar el desbordamiento y la mezcla entre pozos, manteniendo la cobertura total de la muestra.

3. Gelificación (incrustación de cerebros en un hidrogel) y digestión de la proteinasa K (Día 5)

PRECAUCIÓN: Los monómeros acrílicos, APS y TEMED son irritantes/tóxicos. Manejo con equipo de protección personal; Prepara componentes volátiles/exotérmicos en una campana extractora.

1. Coloca una junta adhesiva de silicona de 0,5 mm de grosor a una lámina de microscopio de cristal sin carga (Figura 1F, abajo a la izquierda), presiona firmemente para asegurar el contacto y el sellado completos.
2. Añade 200 μL de solución de poli-L-lisina a la cámara y extiende uniformemente para recubrir la superficie, incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos y retira la solución con una pipeta.
3. Deja que la poli-L-lisina se evapore completamente hasta que la superficie esté visiblemente seca.
   NOTA: La evaporación de la poli-L-lisina es lenta. Para obtener resultados fiables, prepara las cámaras con antelación y déjalas secar durante la noche en un ambiente libre de polvo. Alternativamente, secan cámaras en una incubadora a 37 °C durante ≥ 1 hora el día de uso.
4. Lava los cerebros 2× en 10 μL 1× PBS durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente.
5. Prepara la solución de monómeros en gel y añade reactivos de polimerización inmediatamente antes de su uso, mezclando la solución de monómeros con 4HT, TEMED y APS (hacer fresco) en una proporción de 47:1:1:1. La solución final de gelificación contiene 1 M de acrilato sódico, 14% de acrilamida, 0,1% de bisacrilamida, 1× de PBS, 0,01% de 4HT, 0,2% de TEM y 0,2% de APS.
6. Haz un vórtice breve y deja la solución final de gelificación en hielo. Usa la solución inmediatamente.
7. Incubar cerebros en una solución de gel fría de 10 μL durante 15 minutos sobre hielo.
8. Durante la pre-equilibración, usando una cuchilla de afeitar nueva, corta un canal estrecho a cada lado de la junta de silicona para permitir que el aire escape durante el llenado (Figura 1F, arriba a la izquierda)
9. Utilizando una punta de pipeta, transfiere los cerebros a la cámara de gelificación preparada, asegurando que cada cerebro permanezca sumergido en la solución de gel en todo momento.
   PRECAUCIÓN: Tras el anclaje y el equilibrio, los cerebros se vuelven muy adhesivos y se adhieren fácilmente a las superficies plásticas. Para evitar la pérdida de muestras, utiliza puntas de pipeta de gran calibre o recorta el extremo de una punta estándar para ensanchar la abertura.
10. Retira el revestimiento protector del adhesivo de silicona de la superficie y coloca suavemente una cubierta limpia de cristal de 1,5 horas sobre la cámara, evitando burbujas de aire atrapadas.
11. Pipetear lentamente 200 μL de solución gelificante recién elaborada en la cámara a través de uno de los canales laterales, hasta que la cámara esté completamente llena.
12. Coloca la cámara sellada en un recipiente oscuro e incuba a 37 °C durante 2 horas.
    NOTA: Coloque toallitas de laboratorio humedecidas con agua) dentro del recipiente. Asegúrate de que el lavabos no entre en contacto directo con agua líquida.
13. Preparar un tampón de digestión compuesto por 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM de NaCl, 1 mM de EDTA y 0,5% (v/v) de Triton X-100 en agua libre de RNasa.
14. Inmediatamente antes de su uso, añadir la Proteinasa K a 1:100 desde un caldo de 20 mg·^mL-1 hasta una concentración final de 0,2 mg·^mL-1.
    PRECAUCIÓN: La proteinasa K es un irritante y debe tratarse con guantes; Evita inhalar y el contacto con la piel.
15. Deja que la corredera se enfríe a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de quitar la cubierta. Recorta el gel con un bisturí hasta que tenga una forma rectangular usando cortes simples y rectos. Minimiza el exceso de volumen de gel que rodea cada cerebro (Figura 1F, arriba a la derecha).
16. Colocar cada gel recortado en un pozo individual de una placa de 24 pozos que contiene una solución digestiva de 1000 μL. Asegúrate de que los geles estén completamente sumergidos.
17. Sella la placa con Parafilm e incuba durante la noche a temperatura ambiente en un agitador orbital a 0,11 g (Figura 1G).

4. Digestión de DNasa e hibridación con sonda HCR-smFISH (Día 6)

1. Aspira cuidadosamente la solución digestiva utilizando una pipeta situada en el borde del pozo para evitar el contacto o la deformación del gel.
2. Lava geles 3× con 500 μL 1× PBS durante 15 minutos cada uno a temperatura ambiente sobre un agitador orbital a 0,11 g.
   PUNTO DE PAUSA: Almacenar geles sumergidos en 500 μL 1× PBS a 4 °C durante hasta 7 días antes de proceder.
3. Preparar 500 μL de solución de trabajo de DNasa por gel diluyendo el stock de DNasa I del conjunto QIAGEN RNas-Free DNase 1:10 en el tampón RDD. La solución final de trabajo contiene aproximadamente 0,27 unidades de Kunitz·^μL-1.
4. Incubar geles en una solución de trabajo de DNasa de 500 μL durante 2 horas a 37 °C con un suave balanceo (Figura 1H).
5. Geles de lavado 4× con 500 μL de 1× PBS sin RNasa durante 15 minutos cada una a temperatura ambiente.
6. Equilibrar geles en un tampón de hibridación de sonda precalentado de 500 μL durante 30 minutos a 37 °C
7. Inventario de sonda HCR smFISH diluido (1 μM; Molecular Instruments) 1:300 en el buffer de hibridación de la sonda hasta una concentración final de ~3,3 nM. Mezcla por vórtice
8. Sustituye el buffer de equilibrio por una mezcla de 500 μL de sonda por gel e incuba durante la noche a 37 °C en un agitador orbital a 0,11g (Figura I).
   PRECAUCIÓN: Los buffers de hibridación de la sonda contienen formamida, que es tóxica. Usa guantes y evita inhalar.

5. Reacción en cadena de hibridación (día 7) (Figura 1J)

1. Lavar geles 3× con un tampón de prueba precalentado de 500 μL durante 30 minutos cada uno a 37 °C sobre un agitador orbital a 0,11 g.
   PRECAUCIÓN: Los buffers de lavado de sonda contienen formamida, que es tóxica. Usa guantes y evita inhalar.
2. Lava geles 3× con 500 μL 1× PBS durante 30 minutos cada uno a temperatura ambiente sobre un agitador orbital a 0,11 g.
3. Deja los geles en 1 mL 1× PBS durante la noche a temperatura ambiente sobre un agitador orbital a 0,11 g.
   NOTA: Un lavado prolongado durante la noche mejora la relación señal-ruido al reducir la unión de la sonda fuera del objetivo y los puntos de fondo. Para el procesamiento en el mismo día, procede directamente a la amplificación HCR.
   PUNTO DE PAUSA: Tras lavados post-hibridación, almacenar los geles en 1 mL de 1× PBS a temperatura ambiente o 4 °C durante hasta 96 horas antes de la amplificación por HCR.
4. Sustituye PBS por un buffer de amplificación de 500 μL (previamente equilibrado a temperatura ambiente) por pozo e incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital a 0,11 g.
5. Para cada conjunto de sondas, diluir las horquillas h1 y h2 (material de 3 μM; Instrumentos moleculares) en buffer de amplificación 1:100 (concentración final de 30 nM). Prepara 350 μL de mezcla de horquilla diluida por pozo.
6. Soluciones de horquilla diluidas por calor en tubos de PCR a 95 °C durante 90 s en un ciclador térmico o bloque térmico. Utiliza un volumen total de 100 μL por tubo para asegurar un calentamiento uniforme y un equilibrio de temperatura.
   NOTA: Las directrices de HCR suelen recomendar calentar rápidamente las horquillas H1 y H2 por separado y combinarlas solo después de enfriarlas; alternativamente, combinar H1 y H2 antes del calentamiento inmediato cuando se requiera un manejo simplificado.
7. Deja que las horquillas se enfríen a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad sin interrupciones.
8. Quita el buffer de amplificación y añade una mezcla horquilla de 350 μL por pozo.
9. Incubar geles durante 2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad sobre un agitador orbital a 0,11 g.
10. Lavar geles 3× con 500 μL 5× SSCT durante 10 minutos cada una a temperatura ambiente sobre un agitador orbital a 0,11 g.
11. Recupera las soluciones de horquilla tras la amplificación, protégelas de la luz y guárdalas a -20 °C para su reutilización.
12. Transfiere los geles a 500 μL 1× PBS y lava 3× durante 30 minutos a temperatura ambiente.
13. Conserva los geles en 500 μL 1× PBS a 4 °C, protegidos de la luz.
    PUNTO DE PAUSA: Los geles amplificados pueden almacenarse hasta 2 semanas antes de la imagen con una pérdida mínima de señal.

6. Preparación, montaje e imagen de muestras expandidas (Día 8) (Figura 2)

1. Incubar geles en 1× PBS que contienen DAPI (1:1000) durante la noche a 4 °C sobre un agitador orbital a 0,11 g.
2. Utiliza una breve iluminación UV para visualizar el cerebro dentro del gel. Orienta la muestra y recorta el exceso de gel según sea necesario.
   PRECAUCIÓN: Se utiliza iluminación UV durante la colocación y montaje de la muestra. Usa protección ocular adecuada.
3. Montar muestras en 1× PBS complementadas con DAPI (1:1000) usando la configuración adecuada para la plataforma de imagen seleccionada (véase Tabla 1).
4. Permitir que las muestras se equilibren durante al menos 1 hora antes de la adquisición.
5. Utiliza objetivos de inmersión en agua con suficiente distancia de trabajo para obtener imágenes a través del gel expandido.
6. Muestras de imagen usando microscopía de lámina, microscopía confocal de escaneo láser o microscopía confocal de disco giratorio. Los parámetros representativos específicos de montaje y adquisición utilizados en este estudio se resumen en la Tabla 1.
   NOTA: Tras la imagen, las sondas y las horquillas HCR pueden ser extraídas mediante digestión de DNasa como se ha descrito anteriormente. Los geles pueden entonces ser sometidos a rondas adicionales de hibridación de sonda y amplificación por HCR.

Andén	Visualización de ejemplos, montaje y localización	Objetivo / detector	Entornos de adquisición representativa
Zeiss Lightsheet 7	Utiliza una breve iluminación UV para visualizar la posición del cerebro en el gel. Recorta el exceso de gel y orienta cada cerebro hacia el objetivo de detección. Colocar 5–6 geles sobre una capa cubierta de poli-L-lisina de 1 × 1 cm con geles orientados hacia fuera (Figura 2A). Fija el engobe de cubierta al portamuestras LS7 usando una pequeña gota de adhesivo curable por UV; apaga la lámpara UV antes de aplicar adhesivo. Monta en la cámara LS7 y localiza las regiones cerebrales usando la vista en vivo en ZEN Black.	Objetivo de detección de inmersión en agua 20×/1.0 NA; 2,5× zoom óptico (aumento total del 50×).	Z-step, 0,4 μm a 2,5× de zoom y 2× de expansión. Escaneo pivote activado. Exposición, 50 ms para todos los canales. Láseres: 405 nm al 5%, 488 nm al 2%, 561 nm al 8%. Emisión: 420–470 nm, 505–545 nm, 570–620 nm.
			(Figura 2C, izquierda)
Confocal de escaneo láser Nikon Ti2-E AXR NSPARC	Utiliza una breve iluminación UV para visualizar el cerebro dentro del gel. Orienta un solo gel de modo que el cerebro mire hacia abajo hacia el objetivo invertido. Transfiere a una placa de imagen con fondo de vidrio llena de 1× PBS + DAPI (Figura 2B). Localiza el cerebro con un objetivo de 4×, identifica los ROI con un objetivo del 20× y registra posiciones X-Y en los elementos NIS. Añade un medio de inmersión, revisa los retornos de inversión registrados y ponlos en perspectiva.	Objetivo de inmersión en agua a larga distancia de trabajo del 40× (Nikon CFI APO LWD 40× WI, 1,15 NA Lambda S, distancia de trabajo de 0,61 mm); Detector NSPARC en modo superresolución.	Escaneo de galvanómetro, 2048 × 2048 píxeles, 1,6 μs/píxel, zoom 8,0×. Láseres: 488 nm al 2%, 640 nm al 20%. Emisiones: 502–546 nm y 666–732 nm.
			(Figura 2C, centro)
Confocal de disco giratorio Evident Scientific IXplore IX85 / Yokogawa CSU-W1	Montar muestras como en la imagen confocal invertida: orientar el gel con el cerebro orientado hacia el objetivo y colocarlo en una placa de imagen con fondo de cristal con 1× PBS + DAPI (Figura 2B). Identificar las regiones de interés tal como se describe para la microscopía confocal de escaneo láser usando el software cellSens.	objetivo de inmersión en agua a larga distancia de trabajo del 60× (Olympus LUMFLN60XW LWD, 1,10 NA, 1,5 mm de distancia de trabajo); Cámara Hamamatsu ORCA-Fusion BT GenIII (2304 × 2304 píxeles; 6,5 × 6,5 μm de tamaño de píxeles).	488 nm de excitación al 75% de potencia, exposición de 200 ms; Excitación de 640 nm al 100% de potencia, 800 ms de exposición. Emisiones: 500–550 millas náuticas y 665–705 millas náuticas.
			(Figura 2C, derecha)

Tabla 1: Montaje representativo, localización de muestras y parámetros de imagen entre plataformas de microscopía. Resumen de las estrategias de montaje de muestras, enfoques de localización, objetivos y parámetros de adquisición utilizados en plataformas de microscopía de lámina de luz y confocales.

7. Análisis cuantitativo de la expresión de ARN y proteínas

NOTA: Elige el flujo de trabajo de análisis según el objetivo experimental. Una comparación de estos enfoques se ofrece en la Tabla Suplementaria 1.

1. Cuantificación de transcripciones a escala poblacional usando FlySeg.
   NOTA: El análisis se basa en la versión actualizada de la tubería FlySeg²⁹ . Una visión general esquemática del flujo de trabajo de análisis se muestra en la Figura 3A–B
   1. Instala FlySeg, un paquete basado en Python, creando un entorno Conda usando:
      conda env create -f environment.yml
   2. Activa el entorno antes del análisis utilizando:
      conda activar flyseg
   3. Comienza el análisis utilizando:
      Python main.py --archivo >
      Utiliza formatos de entrada compatibles, incluyendo archivos CZI o NPY.
   4. Personaliza el análisis utilizando argumentos opcionales según sea necesario, incluyendo:
      Número de canales (--canales)
      Canal de núcleos (--nuclei_ch o --nuclei_wavelength)
      Canal citoplasmático (--cytoplasm_ch o --cytoplasm_wavelength)
      Parámetros de detección de núcleos (--nuclei_sigma_range, --nuclei_threshold)
      Factor de dilatación nuclear (--nuclei_dilation)
      Umbrales de detección FISH (--fish_threshold_range)
      Directorio de salida (--output_dir)
      Visualización vía Napari (--visualize)
   5. Mostrar todas las opciones disponibles usando:
      Python main.py – ayuda
   6. Inspeccionar los metadatos de imagen utilizando:
      Python main.py --metadata_only.
      Confirma el tamaño del voxel, el número de canales y la identidad del canal.
   7. Ejecuta el análisis usando parámetros ajustados adecuadamente para el conjunto de datos. Normalmente, se especifica el número total de canales, canal de núcleos, canal de citoplasma (si está disponible) y factor de dilatación nuclear.
      NOTA: Establezca el valor --nuclei_dilation apropiado para el límite nuclear/citoplasmático deseado. Véase la Figura 3C–D como ejemplo.
   8. Monitoriza el registro de procesamiento. Todas las salidas se guardan en una carpeta llamada como el archivo de entrada.
   9. Identificar los resultados principales para el análisis posterior, incluyendo:
      1. -Nuclei-df.csv
         que contiene mediciones de características por núcleo y conteos de puntos asociados para cada canal FISH y proporciona datos cuantitativos para análisis estadístico.
      2. -Nuclei-equivalent-diameter-area-scatter.png
         Que es un diagrama de dispersión utilizado para identificar valores atípicos de segmentación basados en el tamaño e intensidad nuclear; excluye los núcleos señalados como valores atípicos de análisis posteriores.
   10. Utiliza salidas intermedias adicionales (por ejemplo, máscaras de segmentación, tablas de detección de puntos y archivos resumen FISH fusionados) para un postprocesamiento avanzado si es necesario.
2. Recuento de transcritos en células identificables individualmente usando Imaris
   1. Utilizando la herramienta Surfaces, segmenta la neurona de interés en función de un canal marcador citoplasmático o de membrana.
   2. Ajusta los parámetros de suavizado superficial y umbral de intensidad para asegurar que la superficie resultante abarque con precisión el soma, excluyendo las estructuras vecinas.
   3. Utilizando la herramienta de detección de manchas, identifica puntos de transcripción en el canal FISH. Establezca el diámetro y umbral de intensidad estimados del punto en función del tamaño del punto y la intensidad de la señal (por ejemplo, 0,25 μM para expansión tisular 2x).
   4. Restringir la detección puntual a la superficie generada previamente para asegurar que solo se cuenten los puntos dentro de la neurona.
   5. Extrae el número total de puntos detectados dentro de la superficie neuronal usando el panel de Estadísticas.
   6. Recuentos puntuales de exportación y mediciones asociadas para análisis posteriores.
3. Cuantificación de fluorescencia basada en ROI usando FIJI/ImageJ
   1. Abrir pilas de imágenes en FIJI y generar proyecciones de máxima intensidad usando pilas de > de imágenes > Z Project > Maximum Intensity Projection. Utiliza los mismos ajustes de proyección para todas las muestras dentro de un experimento.
   2. Identifica la estructura neuronal de interés utilizando un canal marcador anatómico (por ejemplo, GFP membrana o citoplasmática). Utilizando la herramienta de selección de polígonos o a mano alzada, describe manualmente el ROI correspondiente a la estructura (por ejemplo, dendrita de fibra gigante).
   3. Cambia al canal proteico y mide la intensidad de fluorescencia dentro del ROI definido usando Analizar > Medida. Registrar los siguientes parámetros: intensidad media de fluorescencia; Densidad integrada; Área de retorno de la inversión.
   4. Mide la intensidad de fluorescencia en un ROI de fondo cercano de tamaño similar que careza de señal específica y esté fuera de la estructura neuronal marcada. Utiliza la misma estrategia de ROI de fondo para todas las muestras dentro del experimento y resta el valor de fondo de la medición de ROI.
   5. Utiliza valores integrados de densidad o intensidad media corregidos por antecedentes para la comparación cuantitativa entre genotipos o condiciones experimentales. Asegúrate de que se utilicen configuraciones de imagen idénticas para todas las muestras que se comparen.

Resultados

Para validar el flujo de trabajo de HCR-smFISH asistido por expansión e inmunohistoquímica en un entorno biológicamente relevante, nos centramos en el inminente circuito de escape del sistema visual de Drosophila. Este circuito consiste en neuronas de proyección visual LC4 definidas^{genéticamente 30,31} que detectan estímulos inminentes y una fibra gigante (GF) bien caracterizada y neuronas descendentes de fibra gigante (GF) que impulsan despegues^{rápidos 32,33}, proporcionando un sistema anatómicamente estereotipado para mediciones moleculares específicas por tipo celular en cerebros intactos.

La proteína de unión gap de Drosophila Shaking-B (ShakB)³⁴ ha sido implicada en la transmisión eléctrica dentro de múltiples componentes del circuito GF, incluyendo las sinapsis de salida axonales³⁵ y las entradas^{auditivas 35}. Aunque la evidencia directa de acoplamiento eléctrico en las dendritas GF durante la detección de amenazas es limitada, trabajos recientes indican que las neuronas LC4 expresan altos niveles de shakB³⁶. Estas observaciones motivaron el uso de estrategias de knockdown y etiquetado de shakB como caso de prueba para evaluar si el protocolo puede evaluar cuantitativamente perturbaciones moleculares dirigidas tanto a nivel de ARN como de proteínas en tipos neuronales genéticamente definidos.

Primero evaluamos la eficiencia del knockdown por shakB en GF y LC4 utilizando HCR-smFISH combinado con tinción por anticuerpos ShakB. La GF, una sola neurona por hemiséptero, fue marcada con un marcador de membrana (Figura 4A). LC4, una población de aproximadamente 60 neuronas por hemiséptico, fue etiquetada con un marcador nuclear para permitir la cuantificación a nivel poblacional (Figura 4B). En cerebros control, los transcritos de shakB se detectaron claramente tanto en las neuronas GF como en las LC4. La expresión de ARNi shakB resultó en una reducción significativa de los puntos de ARNm shakB en neuronas objetivo de ambos tipos celulares (Figuras 4C–D). En coherencia con el sitio citoplasmático de interferencia de ARN, la depleción de transcritos fue más pronunciada en el compartimento citoplasmático. La separación de puntos nucleares y citoplasmáticos mediante la cuantificación basada en FlySeg reveló una reducción selectiva de los transcritos de shakB citoplasmático en la población de LC4, mientras que los puntos nucleares se vieron significativamente menos afectados (Figura 4D, reducción del 69% frente a la del 22%, respectivamente).

Encontramos tinción por anticuerpos ShakB localizada en áreas donde las dendritas GF se solapan con los axones de las Interneuronas Comisurales Gigantes (GCI), que conectan las dos Fibras Gigantes y permiten respuestas visuales^{contralaterales 37} (Figura 4E). Estas observaciones son coherentes con estudios^{previos 35} que demuestran un acoplamiento eléctrico dependiente de ShakB entre el GF y el GCI. También se observó tinción por anticuerpos ShakB en regiones donde los axones LC4 contactan con las dendritas GF, aunque la localización en esta región se resolvió con menos claridad. Independientemente de la localización subcelular precisa, la señal de anticuerpos ShakB asociada a la región dendrítica GF se redujo notablemente tras la expresión de ARNi (Figura 4F).

Sin embargo, la detección basada en anticuerpos no permite asignar de forma inequívoca la proteína ShakB a los terminales presinápticos LC4 frente a las dendritas GF postsinápticas en los lugares de contacto. Además, la expresión generalizada de shakB en todo el sistema^{visual 34,36} limita la cuantificación específica de tipo celular en neuronas LC4 mediante inmunotinción anti-ShakB. Para superar estas limitaciones y evaluar directamente la localización específica de ShakB por tipo celular, empleamos un alelo ShakB marcado endógenamente que previamente^{generamos 36,38}. Esto permitió la visualización selectiva de la proteína ShakB específicamente dentro de las neuronas LC4. ShakB marcado con SmGdP-10×V5 se enriqueció tanto en dendritas (correspondientes a regiones de entrada de neuronas visuales aguas arriba) como en terminales axonicas que contactan con las dendritas GF (Figura 4G). La expresión de ARN shakB resultó en una desaparición casi completa de la señal V5 tanto en los compartimentos dendrítico como axonal (Figura 4H). Estos resultados demuestran que el protocolo permite la resolución específica y subcelular de la localización de proteínas endógenas dentro de neuropil densamente inervados.

Como control cualitativo adicional, probamos FISH no expandido combinado con inmunohistoquímica en poblaciones neuronales identificadas (Figura suplementaria 1). La señal FISH de la grd coincidió con la de LC22 somata, consistente con la expresión predicha de datos de SCRNA-seq del lóbulo óptico (Figura suplementaria 1A–C)¹³. En las neuronas Tm3 que expresan tdTomato, el ARNm de tdTomato se solapó con la proteína tdTomatoes, mientras que el ARNm de VGlut1 no se solapó con Tm3 somata, lo cual es compatible con la identidad colinérgica de las neuronas Tm3 (Figura suplementaria 1)¹³. Estos ejemplos ilustran que el FISH + IHC no expandido es suficiente para la evaluación cualitativa de presencia/ausencia, mientras que la expansión es necesaria para una cuantificación fiable de un solo punto.

La implementación exitosa de este protocolo se indica por un marcado claro específico de cada tipo celular, puntos discretos de smFISH con bajo fondo, segmentación fiable de núcleos individuales o volúmenes celulares definidos manualmente, y reducción constante de la señal de ARN o proteína objetivo tras la perturbación. También deben interpretarse resultados negativos o de baja señal: por ejemplo, el RNAi de ShakB produjo señal reducida de ARNm de ShakB y de proteína de ShakB, mientras que el FISH no expandido mostró falta de señal de VGlut1 en la somata de Tm3 a pesar de la detección clara de ARNm de tdTomate. Los resultados subóptimos incluyen señal débil de anticuerpos o smFISH, puntos de fondo altos, segmentación incompleta, asignación incorrecta de puntos o deriva de la muestra durante la imagen, todos los cuales pueden afectar la cuantificación posterior.

Figura 2. Montar e imaginar muestras ampliadas utilizando plataformas de microscopía confocal y láminas. (A) Visualización y recorte de hidrogeles expandidos (1–2), comunes a todas las plataformas de imagen, seguidas de montaje para microscopía de lámina de luz (3–4; Zeiss Lightsheet 7). (B) Fotografía de una muestra expandida montada en un microscopio confocal de escaneo láser invertido (Nikon Ti2-E AXR). (C) Secciones ópticas individuales representativas (planos Z simples) de una muestra ampliada del sistema visual de Drosophila (neuronas LC4 marcadas con un marcador nuclear fluorescente) sondeadas en busca de ARNm de shakB (véase Figura 4), adquiridas en tres plataformas de imagen. Escamas de 10 μm (tejido postexpansión). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3. Análisis cuantitativo de smFISH puncta usando FlySeg. (A) Visión esquemática del flujo de trabajo de análisis FlySeg para segmentación automatizada y cuantificación de puntos dentro de celdas identificadas. (B) Teselación Voronoi tridimensional que ilustra la lógica central de segmentación de FlySeg. El volumen de imagen se divide en dominios espaciales (cada uno mostrado en un color distinto), con cada partición restringida a contener como máximo un núcleo, asegurando la asignación de una sola celda. Dentro de cada dominio de Voronoi, el núcleo se segmenta mediante un procedimiento de optimización funcional que determina la superficie nuclear óptima en función tanto de los valores de intensidad nuclear como de los de la intensidad citoplasmática circundante. (C) Demostración de la nuclei_dilation opción para distinguir transcritos nucleares y citoplasmáticos Una única sección óptica que muestra un núcleo marcado con GFP rodeado por puntos smFISH, con una señal difusa DAPI que delimita el compartimento citoplasmático tras el tratamiento con DNasa. Las líneas indican 0 y 0,5 factores de dilatación, correspondientes a volúmenes nucleares y citoplasmáticos, respectivamente. (D) Proyección de máxima intensidad de (C), ilustrando que los puntos localizan tanto los compartimentos nucleares como los citoplasmáticos. Escamas de 10 μm (tejido postexpansión). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4. Validación del flujo de trabajo cuantitativo utilizando proyecciones de perturbación molecular (A) mediada por ARNi (10 μm de grosor, sin cubrir todo el volumen celular) del soma de Fibra Gigante (GF) marcado con un marcador de membrana y sondeado para detectar ARNm shakB en condiciones de control (arriba) y ARN shakB (inferior). Los contornos verdes discontinuos indican los bordes de los soma para resaltar el agotamiento del depósito citoplasmático pero no del ARNm nuclear. N, cerebros (un lado por animal). (B) igual que (A) para las neuronas LC4 marcadas con un marcador nuclear. (C) Cuantificación de puntos FISH de shakB en neuronas GF (piscinas combinadas nucleares y citoplasmáticas) bajo condiciones de control y ARN de shakB. Los puntos representan neuronas individuales (una neurona por cerebro, un lado por animal). (D) Igual que (C) para las neuronas LC4. Los puntos representan cerebros individuales (un lado por animal; recuento de puntos por célula promediado por cerebro). (E) Proyecciones confocales de las dendritas GF etiquetadas con un marcador de membrana y teñidas para ShakB en condiciones de control (arriba) y RNAi shakB (inferior). (F) Cuantificación de los niveles de proteínas ShakB en las dendritas GF medida como intensidad media de fluorescencia bajo control y condiciones de ARN GF>shakB. N, cerebros (un lado por animal). (G) Proyecciones confocales de neuronas LC4 marcadas con un marcador de membrana y que expresan ShakB marcado con smGdP-10xV5 en condiciones de control (arriba) y RNAi shakB (abajo). Los contornos verdes discontinuos indican áreas de dendritas LC4 y terminales axonicas en las que se evaluó la densidad de ShakB-V5 (H). La cuantificación de los niveles de proteína ShakB-smGdP-V5 en las dendritas y terminales axonales LC4 se midió como intensidad media de fluorescencia bajo control y LC4 > condiciones de RNAi de ShakB. N, cerebros (un lado por animal). Las barras de error indican la media ± SEM. Todas las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando pruebas t de Welch de dos caras. Barras de escamas, 10 μm en todas las imágenes (tejido post-expansión). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

Este protocolo combina HCR-smFISH asistido por expansión, inmunohistoquímica previa a la expansión y cuantificación de transcritos basada en segmentación para permitir mediciones emparejadas de ARN y proteínas en las mismas neuronas genéticamente definidas. Al integrar estos componentes en un único flujo de trabajo, este método debería facilitar un análisis molecular cuantitativo y específico de cada tipo celular en el cerebro intacto de Drosophila .

Varias modificaciones prácticas introducidas aquí representan pasos críticos para combinar la inmunohistoquímica con HCR-smFISH asistida por expansión en el cerebro^{de Drosophila 24}. Primero, debe realizarse inmunohistoquímica antes de la expansión tisular y el smFISH. Dado que el protocolo incluye un paso de digestión de la Proteinasa K, realizar inmunohistoquímica tras la expansión puede reducir la integridad del epítopo. Es importante destacar que la incubación de anticuerpos pre-expansión (primaria de 24 h + 24 h secundaria) no reduce notablemente la intensidad de la señal de ARN cuando se emplean técnicas de limpieza por RNasa y anclaje covalente de ARN. En segundo lugar, las concentraciones de anticuerpos primarios y secundarios deben aumentarse, típicamente entre 2 y 3× respecto al IHC estándar de montaje completo, para compensar la pérdida de señal asociada a la digestión y expansión tisular de la Proteinasa K. Tercero, las condiciones de fijación son importantes para preservar tanto la señal de proteínas como de ARN. La fijación glioxal libre de ácidos mejora la preservación de la localización de proteínas sinápticas puntadas, mantiene la integridad estructural de los procesos neuronales y no compromete la detección cuantitativa de puntos de ARNm. También observamos que el anclaje simultáneo de ARN y proteína es compatible tanto con la detección posterior de HCR-smFISH como con la inmunofluorescencia. En conjunto, estos ajustes mejoran la compatibilidad entre inmunohistoquímica y detección de transcritos asistida por expansión.

La expansión añade un solo paso nocturno y no es técnicamente compleja, pero su uso depende del objetivo experimental. Como se demuestra en la Figura Suplementaria 1, la FISH no expandida combinada con inmunohistoquímica es suficiente para evaluar si un gen se expresa en un tipo celular dado, mientras que la expansión es necesaria cuando los puntos individuales de smFISH deben ser resueltos de forma fiable, asignados a cada somata y analizados cuantitativamente, debido al aumento sustancial en la resolución espacial efectiva. De manera similar, las placas multipozo al estilo Terasaki no son estrictamente necesarias, pero reducen el uso de reactivos, permiten procesar múltiples condiciones en paralelo y ayudan a mantener la identidad de la muestra en pequeños lotes; Los tubos estándar de microcentrífuga también pueden usarse cuando el volumen de reactivo es menos limitante. Aunque la microscopía de lámina de luz permite la imagen volumétrica rápida de tejido expandido, demostramos que los sistemas confocales estándar de escaneo láser invertido y disco giratorio son suficientes para la obtención completa de imágenes de poblaciones neuronales seleccionadas en el cerebro expandido de Drosophila . Una limitación común de la microscopía confocal es la corta distancia de trabajo. Sin embargo, dado que el cerebro de la mosca es pequeño y las muestras se expanden aproximadamente un 2× en PBS, los objetivos de inmersión en agua a larga distancia proporcionan una profundidad de penetración adecuada. Para comparaciones cuantitativas, los ajustes de adquisición deben mantenerse idénticos entre muestras, evitar píxeles saturados y el tamaño del vóxel debe ser suficiente para resolver puntos individuales de smFISH. Esto amplía la accesibilidad del protocolo a los laboratorios sin instrumentación dedicada a la lámpada.

La implementación actualizada de FlySeg se basa en el marco FlySeg previamente publicado e introduce dos añadidos principales para este protocolo. Primero, un parámetro configurable de dilatación nuclear permite clasificar puntos smFISH como nucleares o citoplasmáticos en función de su relación espacial con núcleos segmentados. La tinción DAPI citoplasmática tras el tratamiento con DNasa es importante para este paso, ya que proporciona una señal difusa que delimita el cuerpo celular y apoya una segmentación nuclear fiable, facilitando la separación de los grupos de transcritos nucleares y citoplasmáticos. En segundo lugar, la detección automática de valores atípicos identifica núcleos mal segmentados, que pueden excluirse de la cuantificación posterior. Más allá de evaluar los efectos moleculares del knockdown génico específico de cada tipo celular, separar los transcritos nucleares y citoplasmáticos puede ser informativo cuando la localización de los transcripciones refleja la actividad transcripcional continua. En el cerebro de los mamíferos, los transcritos génicos tempranos inducidos por la actividad aparecen primero en el núcleo y posteriormente se acumulan en el citoplasma a medida que los ARNm se procesan y^{exportan 39}, un principio utilizado en el análisis catFISH⁴⁰ de los tiempos de activación neuronal. Se desconoce actualmente si dinámicas transcripcionales comparables ocurren en el cerebro de Drosophila , pero esto puede explorarse en principio utilizando el flujo de trabajo actual. En cualquier otro experimento de persecución de pulsos, distinguir puntos nucleares de citoplasmáticos puede proporcionar información temporal más allá del recuento total de transcritos. Al mismo tiempo, el flujo de trabajo no se limita a la segmentación nuclear y puede adaptarse a la segmentación celular whole-soma (es decir, definida por membrana). El flujo de trabajo cuantitativo actual está optimizado para los somata neuronales; aunque las regiones neuropil pueden ser obtenidas por imagen, la asignación cuantitativa de puntos de ARNm a axones o dendritas individuales requeriría estrategias adicionales de segmentación específicas de cada compartimento. FlySeg es más útil para cuantificación automatizada y de alto rendimiento en poblaciones neuronales densas donde se requieren estadísticas a nivel poblacional. Para neuronas identificables individualmente o compartimentos definidos manualmente, otras herramientas como Imaris o FIJI/ImageJ pueden ser más adecuadas. Un resumen de estas estrategias de cuantificación, incluyendo sus principales aplicaciones, ventajas y limitaciones, se ofrece en la Tabla Suplementaria 1.

Los puntos comunes de solución de problemas incluyen señal débil de anticuerpos, alto fondo de smFISH, daño en gel o pérdida de muestra, deriva de la muestra durante la imagen y segmentación deficiente. La señal débil de anticuerpos a menudo puede mejorarse aumentando aún más la concentración de anticuerpos o extendiendo las incubaciones primarias y/o secundarias de anticuerpos de 24 a 48 horas. El fondo alto en smFISH a menudo puede reducirse extendiendo los lavados post-hibridación y evitando entornos saturados de adquisición. El daño por gel y la pérdida de muestras se minimizan utilizando puntas de ánima ancha, recortando geles con cortes rectos y cortando canales de ventilación para evitar burbujas durante el llenado de la cámara. La deriva de la muestra durante la imagen se reduce equilibrando los geles montados durante al menos 1 hora antes de la adquisición; si la deriva persiste, el equilibrio puede extenderse a 2 horas o más. Una segmentación deficiente puede deberse a una tinción citoplasmática débil de DAPI o a un equilibrio incompleto de muestras, lo que puede reducir la señal de frontera celular o causar desplazamientos X-Y-Z durante la adquisición; estos deben comprobarse antes de ajustar los parámetros de FlySeg. En este protocolo, los geles se mantienen en 1× PBS, lo que resulta en aproximadamente 2× expansión isotrópica. Si se requiere una mayor resolución espacial, se puede lograr una mayor expansión en PBS diluido o agua desionizada. Por el contrario, cuando el objetivo es solo evaluar la presencia o ausencia de expresión en un tipo celular definido, la FISH no expandida combinada con inmunohistoquímica puede ser suficiente, como se demuestra en la Figura Suplementaria 1. El protocolo sigue siendo compatible con los flujos de trabajo iterativos de FISH. Las sondas y las horquillas HCR pueden eliminarse mediante tratamiento con DNasa, permitiendo rondas adicionales de hibridación y amplificación en la misma muestra. Las futuras extensiones técnicas podrían incluir HCR-smFISH iterativo de mayor nivel de plex, registro automatizado entre rondas de imagen, segmentación mejorada de células completas o neuritas, y canales de análisis más estandarizados para comparar señales de ARN y proteínas entre experimentos. El desarrollo adicional de estrategias de segmentación específicas de compartimentos podría extender el análisis cuantitativo más allá de los sómatas neuronales hacia axones y dendritas. En conjunto, la lectura combinada ARN–proteína, la cuantificación de transcritos resueltos en compartimentos y la compatibilidad con plataformas de imagen estándar hacen que este flujo de trabajo sea adecuado para experimentos de validación molecular dirigida en neuronas genéticamente definidas del cerebro intacto de Drosophila .

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de hidróxido de sodio 10N	Fisher Scientific	Cat# SS255-1
Solución de hidróxido de sodio 1N	Fisher Scientific	Cat# SS266-1
20X Buffer de Soro y Citrato de Sodio	Invitrogen	Cat# AM9763
4-Hidroxi-TEMPO	Sigma-Aldrich & nbsp;	Cat# 176141
Solución de cloruro de sodio 5M	Sigma-Aldrich & nbsp;	Cat# S5150
Acrilamida	Sigma-Aldrich & nbsp;	Cat# A9099
Ácido acrílico y nbsp;	Sigma-Aldrich & nbsp;	Cat# 147230
Acryloil-X, SE & NBSP;	Invitrogen	Cat# A20770
Adobe Illustrator	Adobe	N/A
Alexa Fluor 488 Anti-Pollo para Cabra (1:200)	Laboratorios de Inmunoinvestigación Jackson	Cat# 103-545-155, RRID:AB_2337390
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG1 (1:200)	Invitrogen	Cat# A-21124, RRID:AB_2535766
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG1 (1:200)	Invitrogen	Cat# A-11011, RRID:AB_143157
Persulfato de amonio	Sigma-Aldrich & nbsp;	Cat# A3678
DMSO  anhidro;	Sigma-Aldrich & nbsp;	Cat# 900645-4X2ML
Adhesivo de curado UV bondic	Bondic	Kit de inicio Bondic
software de imagen cellSens v4.4.1	Evidente Científico	N/A
Pollo policlonal anti-GFP (1:400)	Abcam	Cat# ab13970, RRID:AB_300798
Conda (gestor de medio ambiente)	Anaconda, Inc	N/A
Corning y comercio; Portaobjetos de microscopio esmerilado	Corning	Cat# 2948-75X25
Portamuestras LS7 diseñado a medida	Janelia Tech	ID 2021-021
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat# D9542
Bisturí estéril de acero inoxidable desechable	MedPride	MPR-47101
Ácido etilendediaminético tetraacético	Sigma-Aldrich	Cat# EDS-100G
Software de análisis de imágenes Fiyi (ImageJ) v2.14.0	Consorcio ImageJ	N/A
FlySeg (pipeline personalizado)	https://github.com/avaccari/DrosophilaFISH	N/A
Solución fijadora GAF	Addax Biosciences	Cat# VI25
GenClone® Placas de cultivo celular de 24 pozos, no tratadas	Genesee Scientific	Cat# 25-102
GMR-86D05-Gal4 (LC4)	Centro de Ganado de Bloomington	#41315
Rebaño de Donante de Suero de Cabra	Sigma-Aldrich & nbsp;	Cat# G6767
HCR y comercio; Buffer amplificador RNA-FISH(v3.0)	Instrumentos moleculares	N/A
HCR y comercio; Amplificadores RNA-FISH(v3.0): AF546, JF669	Instrumentos moleculares	N/A
HCR y comercio; Buffer de hibridación de sonda RNA-FISH(v3.0)	Instrumentos moleculares	N/A
HCR y comercio; Buffer de lavado de sonda RNA-FISH(v3.0)	Instrumentos moleculares	N/A
HCR y comercio; Sonda ShakB RNA-FISH(v3.0)	Instrumentos moleculares	N/A
Imaris 10.1	Oxford Instruments	N/A
Microscopio confocal de disco giratorio IXPlore IX85 SpinSR	Evidente Científico	N/A
Microscopio de lámina de luz LS7	Carl Zeiss	N/A
Melphalan	Cayman Chemical	Cat# 16665
MOPS Buffer	Fisher Scientific	Cat# BP308-100
Anti-V5 monoclonal de ratón (SV5-Pk1) (1:100)	Abcam	Cat# ab27671, RRID:AB_471093
N,N,N',N'--Tetrametiletilenediamina	Sigma-Aldrich & nbsp;	Cat# T7024
N,N'-Metilenebisacrilamida	Sigma-Aldrich & nbsp;	Cat# M7279
Napari	Comunidad de código abierto	N/A
Software de imagen de investigación avanzada de NIS-Elements	Nikon Corporation	N/A
Agua libre de nucleasas	Qiagen	Cat# 129114
Nunc™ MiniTrays con Nunclon y comercio; Delta superficie	Invitrogen	Cat# 163118
PBS (10X), pH 7,4 y nbsp;	Gibco	Cat# 70011044
Detergente Photo-Flo	Ciencias de la Microscopía Electrónica	Cat# 74257
Solución de poli-L-lisina	Ted Pella	Cat# 18026
Gafas de cubierta de precisión, grosor #1,5H	Thorlabs	Cat# CG15CH2
Prensa-a-Sellado y comercio; Aislador de silicona con adhesivo, un pozo, 20 mm de diámetro, 0,5 mm de profundidad	Invitrogen	Cat# P24740
Proteinasa K	Nueva Inglaterra y la Inglaterra; Biolabs	Cat# P8107S
Conejo Anti-ShakB (1:400)	Regalo de Geord Ammer	N/A
RNase AWAY™ Descontaminante superficial	Invitrogen	Cat# 7002
Conjunto de DNasa Libre de RNasa	Qiagen	Cat# 79256
Schneider' s Drosophila Medium	Gibco	Cat# 21720001
shakB-KDRT-stop-KDRT-smGdP-V5;;	Frighetto et al., 2025	PMID: 41278920
Azida de sodio	Sigma-Aldrich & nbsp;	Cat# S8032
Microscopio estereoscópico Stemi 508	Carl Zeiss	N/A
SYTO y COMERCIO; Tinción de 41 Ácido Nucleico Fluorescente Azul	Invitrogen	Cat# S11352
Microscopio Confocal de Escaneo Láser Ti2E AXR NSPARC	Nikon Corporation	N/A
Tris Base	Fisher Scientific & nbsp;	Cat# BP152-500
Tritón y comercio; X-100	Sigma-Aldrich & nbsp;	Cat# T8787
UAS-GFP-2A-KDR;	Sanfilippo et al. 2024	PMID: 38262414
UAS-his2A-GFP;	Dombrovski et al., 2025	PMID: 40468081
UAS-mCherry RNAi	Centro de Ganado de Bloomington	#35785
UAS-myr::GFP;	Centro de Ganado de Bloomington	#32198
UAS-shakB RNAI	Ammer et al., 2022	PMID: 35385694
UltraPure™ 1 hombre Tris-HCI, pH 8,0 y nbsp;	Invitrogen	Cat# 15568025
VT042336-Gal4 (fibra gigante)	Dombrovski et al., 2025	PMID: 40468081
Zen Black 3.1	Carl Zeiss	N/A