Farmacología de redes y validación por punción caudal de disco de rata de la decocción Yi Qi Huo Xue para la degeneración del disco lumbar

Resumen

Este estudio utilizó farmacología de redes, acoplamiento molecular y un modelo de punción caudal de disco en ratas para investigar los posibles efectos preclínicos de la Decocción Yi Qi Huo Xue sobre la degeneración del disco lumbar, centrándose en objetivos candidatos, incluyendo AKT1, BCL2 y STAT3, y vías como la señalización PI3K-AKT.

Resumen

En este estudio, se utilizaron farmacología de redes, acoplamiento molecular, simulación de dinámica molecular y validación experimental para investigar la base farmacológica y los posibles mecanismos moleculares de la Decocción Yi Qi Huo Xue (YQHXD) en la degeneración del disco lumbar (LDD). Se identificaron un total de 678 objetivos activos relacionados con compuestos de YQHXD y 296 posibles objetivos terapéuticos asociados a LDD. El análisis de redes de interacción proteína-proteína y el análisis topológico identificaron varios objetivos candidatos, incluyendo AKT1, IL6, TNF, BCL2 y STAT3. Los análisis de enriquecimiento utilizando Gene Ontology y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes indicaron que los objetivos candidatos estaban vinculados a funciones como la unión a proteínas y la unión a ATP, con enriquecimiento de vías que incluía señalización PI3K-AKT. El acoplamiento molecular predijo interacciones entre compuestos activos seleccionados, como quercetina, tetraneurina A e isorhamnetina, y los objetivos centrales. Las simulaciones de dinámica molecular sugerían además que los complejos de menor energía permanecían estables. Setenta ratas macho de Sprague-Dawley fueron asignadas aleatoriamente a los grupos control, simulado, modelo, control positivo y YQHXD de dosis baja, media y alta. Tras el establecimiento de un modelo de punción discal intervertebral coccígea en los grupos modelo, control positivo y YQHXD, se administró YQHXD o celecoxib por gavage oral a las ratas durante 8 semanas, mientras que los grupos control y operados con simulación recibieron solución fisiológica normal. La evaluación histopatológica mostró que el tratamiento con YQHXD se asoció con una reducción de la degeneración del disco intervertebral en este modelo. El ensayo inmunoenzimático vinculado, la reacción en cadena de la polimerasa y los análisis de western blot mostraron cambios en los niveles de expresión de ARNm y proteínas de objetivos seleccionados, incluyendo AKT1, BCL2 y STAT3. Estos hallazgos sugieren que YQHXD puede ejercer efectos protectores preclínicos en el LDD mediante la regulación multicomponente y multi-diana que involucra mecanismos relacionados con la inflamación y la apoptosis. Este estudio proporciona evidencia preclínica preliminar que respalda una investigación adicional de YQHXD para el LDD.

Introducción

La degeneración discal lumbar (TDL) es una afección ortopédica común relacionada con la edad, caracterizada por un inicio tardío, dificultad de tratamiento, alta recurrencia y discapacidad. La LDD implica cambios patológicos degenerativos asociados a un desequilibrio entre el metabolismo catabólico y anabólico de la matriz extracelular (ECM) en el disco intervertebral (IVD) y está estrechamente asociada con el dolor lumbar (LBP⁾¹. Los estudios epidemiológicos muestran que la LBP es una de las principales causas de discapacidad en la práctica^{clínica 2}.

De 1990 a 2017, el número de casos globales aumentó de 42,5 millones a 64,9^{millones 3,} afectando la vida diaria e imponiendo una carga social y económica considerable. Por lo tanto, el tratamiento eficaz del TDL sigue siendo clínicamente importante. En la práctica clínica, el LDD suele tratarse con tratamientos sintomáticos conservadores o quirúrgicos, que pueden aliviar los síntomas pero generalmente no revertir la degeneración del disco intervertebral (IVDD). Los antiinflamatorios orales no esteroideos comúnmente utilizados para el tratamiento conservador también pueden estar asociados con efectos adversos renales, gastrointestinales y cardiovasculares.

La Medicina Tradicional China (MTC) se ha utilizado durante mucho tiempo en el manejo de enfermedades⁴. Se ha informado que compuestos herbales y componentes individuales retrasan la progresión de la IVDD y promueven la regeneración^{tisular 5}. En la práctica clínica, las fórmulas de MTC también se utilizan como parte de estrategias conservadoras de manejo de enfermedades degenerativas óseas y articulares. La escuela de medicina familiar Wu en la zona de Suzhou ha utilizado la decocción Yi Qi Huo Xue (YQHXD) como receta principal para trastornos de la MIV lumbar; sin embargo, se necesita más evidencia mecanicista para aclarar su posible papel en el LDD.

Estudios previos han sugerido que YQHXD puede retrasar la IVDD al promover la autofagia celular y ejercer efectos antienvejecimiento ^6,7. Sin embargo, los mecanismos farmacológicos por los cuales YQHXD puede afectar al LDD siguen sin estar claros, y aún falta un análisis sistemático de su modo de acción. En este estudio, se utilizó la farmacología de redes para analizar las características multicomponente y multi-objetivo de YQHXD en relación con la LDD. Se utilizó el acoplamiento molecular para evaluar las interacciones entre compuestos y proteínas objetivo, seguido de simulaciones de dinámica molecular. Estas predicciones se evaluaron posteriormente utilizando un modelo de punción caudal y disco de rata para investigar los posibles mecanismos de YQHXD en LDD⁸. Como se muestra en la Figura 1, este estudio proporciona evidencia preclínica de que YQHXD puede afectar procesos relacionados con el LDD modulando genes y proteínas como AKT1, BCL2 y STAT3, con enriquecimiento de vías que involucran señalización PI3K-Akt y otras categorías de vías relacionadas con enfermedades.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Medicina China de Nankín (Código de Protocolo: 202501A018) y se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Todos los procedimientos experimentales se ajustaron a las directrices de ARRIVE.

Fármacos experimentales
La solución de muestra YQHXD contenía 20 g de raíz de Astragalus membranaceus , 20 g de raíz de Angelica sinensis , 15 g de rizoma Ligusticum chuanxiong , 6 g de raíz de Stephania tetrandra , 15 g de fruto de Chaenomeles speciosa y 10 g de semillas maduras de Sinapis alba , con un peso total bruto de 86 g por receta. Todos los materiales herbales fueron autenticados según la Farmacopea China (edición 2020) por el Departamento de Farmacia del Hospital Ruikang afiliado a la Universidad de Medicina China de Guangxi. La solución de muestra YQHXD se preparó mediante un método de decocción en agua. Se añadió agua destilada estéril a 8 veces el volumen total de fármacos crudos, y las hierbas se remojaron durante 30 minutos hasta quedar completamente sumergidas. La mezcla se hervía y se decoctaba a fuego bajo durante 30 minutos antes de la filtración. Los residuos se extrajeron de nuevo con el mismo volumen de agua destilada estéril siguiendo el mismo procedimiento. Los filtrados de ambas extracciones se combinaron y concentraron hasta 55,5 mL bajo presión reducida mediante evaporación rotativa para obtener la solución original YQHXD. Según el peso total del medicamento crudo, la concentración final de fármaco crudo fue de 1,55 g/mL, con un rendimiento de extracción de aproximadamente el 64,5%. La dosis administrada a ratas experimentales se convirtió a partir de la dosis clínica adulta utilizando el método de normalización del área superficial corporal. El coeficiente de conversión entre humanos y ratas era aproximadamente 6,3; Por lo tanto, la dosis en rata (mg/kg) se calculó como la dosis humana (mg/kg) × 6,3. El grupo de dosis alta recibió 15,48 g/kg/día como dosis de referencia, mientras que los grupos de dosis media y baja recibieron 7,74 g/kg/día y 3,87 g/kg/día, respectivamente. Para un volumen de gavage de 10 mL/kg, las concentraciones de trabajo correspondientes fueron 1,548, 0,774 y 0,387 g/mL para los grupos de dosis alta, media y baja, respectivamente. La solución de reserva se diluyó en consecuencia para alcanzar la dosis objetivo de cada grupo experimental antes de su administración. Tras la preparación, las decocciones se enfriaban, se alicotaban en condiciones estériles y se almacenaban a −40 °C hasta su uso.

Análisis de farmacología de redes

Predicción de proteínas objetivo de ingredientes activos
El 24 de noviembre de 2025, se recuperaron compuestos activos de la base de datos TCMSP utilizando los términos de búsqueda "Huangqi, Angelica, Chuanxiong, Stephania, Mugua y Jiezi." Los compuestos se evaluaron en función de la biodisponibilidad oral (OB ≥ 30%) y la semejanza del fármaco (DL ≥ 0,18)⁹. La justificación de estos umbrales es la siguiente: la base de datos TCMSP integra datos de compuestos de fuentes autorizadas como PubChem, ChEMBL y ChemSpider y proporciona parámetros relacionados con ADME, incluida la biodisponibilidad oral. La biodisponibilidad oral se refiere a la proporción de una dosis administrada por vía oral que llega a la circulación sistémica sin cambios, y un alto nivel de obstetricia es esencial para identificar moléculas bioactivas. La similitud de fármacos es un indicador utilizado para evaluar la capacidad de consumir fármacos de compuestos y predecir su solubilidad y estabilidad. En este estudio, se aplicó un umbral OB más estricto (≥30%), que superaba el valor recomendado en la base de datos (≥20%), para identificar compuestos candidatos con absorción oral favorable y perfiles farmacocinéticos. Mientras tanto, se utilizó DL para estimar el potencial similar a fármacos de los compuestos, y se adoptó un corte de DL ≥ 0,18 basado en el valor medio de DL observado en compuestos de medicina tradicional china. Los compuestos activos seleccionados se recuperaron en formato SMILES de la base de datos PubChem e importaron a la base de datos SwissTargetPrediction para la predicción de objetivos, con la especie configurada como Homo sapiens. Las proteínas objetivo se estandarizaron usando símbolos genéticos oficiales, y solo se conservaron objetivos con valores de probabilidad superiores a 0 para mejorar la fiabilidad de la predicción. Los compuestos sin objetivos predichos fueron excluidos del análisis posterior de la red. Tras fusionar todos los objetivos, las entradas duplicadas se eliminaban usando software de hojas de cálculo para asegurar que cada objetivo solo estuviera representado una vez en el conjunto de datos final.

Colección de objetivos clave
Los genes relacionados con enfermedades se extrajeron de las bases de datos^{GeneCards 10}, OMIM¹¹ y TTD¹² utilizando la palabra clave "degeneración del disco lumbar". Los dianas génicas recogidas se fusionaron y se eliminaron entradas duplicadas para obtener un conjunto final de dianas asociadas a la enfermedad.

Posibles objetivos de YQHXD para tratar el LDD
La plataforma Venny 2.1.0 se utilizó para determinar los posibles objetivos de YQHXD en LDD. A continuación, se generó una red para mostrar las asociaciones entre los componentes activos y sus objetivos predichos. Los componentes activos principales se seleccionaron según sus valores de grado en la red.

Construcción de redes de componentes de fármacos y objetivos de intersección de enfermedades
Se importaron los ingredientes activos, proteínas objetivo y genes relacionados con el LDD de la fórmula MTC YQHXD al software¹³ de Cytoscape para construir un diagrama de red fármaco-componente-objetivo-enfermedad.

Construcción de la red PPI e identificación de objetivos clave
Se enviaron objetivos que se intersectaban a la plataforma^{STRING 14} para su análisis, con el organismo configurado como Homo sapiens. Para construir la red de interacción proteína-proteína (PPI), el umbral de puntuación de interacción se estableció en >0,4, los nodos desconectados quedaron ocultos y todos los demás ajustes se dejaron por defecto. Los datos resultantes se importaban al software, donde se utilizaba la herramienta NetworkAnalyzer para evaluar propiedades topológicas y calcular los grados de los nodos. Los cinco nodos más altos, clasificados por grado, fueron identificados como objetivos clave del centro.

Análisis de enriquecimiento de objetivos principales
Los objetivos intersectantes se subieron a la base de datos^{DAVID 15} para la anotación funcional de Ontología Génica (GO) y el análisis de enriquecimiento de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG). El trasfondo del organismo se estableció como Homo sapiens, con el corte de enriquecimiento definido según los parámetros DAVID por defecto, incluyendo un umbral de EASE < 0,1 y un umbral de recuento ≥ 2. El universo génico se basaba en el fondo genómico completo por defecto proporcionado por DAVID. Se corrigieron pruebas múltiples utilizando el método de Benjamini-Hochberg para controlar la tasa de falsos descubrimientos (FDR), y los resultados DAVID se ajustaron sobre esta base. Las vías enriquecidas se ordenaron por valor de conteo en orden descendente. Las parcelas de barras de enriquecimiento GO y KEGG se produjeron utilizando una plataforma de bioinformática en línea.

Acoplamiento molecular
Para predecir las interacciones entre los componentes activos clave de YQHXD y los objetivos principales de LDD, se realizó un análisis de acoplamiento molecular en este estudio. Los cinco compuestos activos clave, clasificados según los valores de grado topológico de la red y la relevancia del objetivo, fueron seleccionados como ligandos, mientras que las proteínas objetivo principales correspondientes se usaron como receptores. Se recuperaron archivos SDF de ligandos de PubChem, y las estructuras tridimensionales de las proteínas objetivo se descargaron del Banco de Datos de Proteínas (PDB). El análisis de acoplamiento se realizó en la plataforma CB-Dock2 utilizando su protocolo de acoplamiento ciego totalmente automatizado. Tras subir las estructuras proteicas, la plataforma eliminó automáticamente los heteroátomos, incluyendo moléculas pequeñas, iones y moléculas de agua, y posteriormente reparó átomos y átomos de hidrógeno que faltaban. Se utilizó el modo de acoplamiento automático a ciegas. En este modo, CB-Dock2 identifica posibles bolsas de unión proteína-superficie con un algoritmo de detección de cavidades basado en curvatura y luego realiza cálculos de acoplamiento usando el motor integrado AutoDock^{Vina 16}. Durante el proceso de acoplamiento, las proteínas se trataron como estructuras rígidas, mientras que los ligandos se consideraron flexibles y todos los parámetros de acoplamiento se establecieron a los valores predeterminados de la plataforma. Los resultados del acoplamiento se sometieron a visualización tridimensional y análisis de interacción utilizando las herramientas integradas de CB-Dock2¹⁷, y se calcularon energías de unión para estimar las afinidades de unión previstas entre los compuestos activos y las proteínas objetivo.

Simulación de dinámica molecular
Se realizaron simulaciones de dinámica molecular para el complejo proteína-ligando objetivo utilizando GROMACS 2022.2. La proteína se modeló con el campo de fuerza Amber14SB, y el sistema de disolventes se representó usando el modelo acuático TIP3P. Las cargas atómicas de ligandos se calcularon usando el método AM1-BCC implementado en Antechamber, seguido de la asignación de tipos de átomos GAFF2. Los archivos de topología resultantes se convirtieron a un formato compatible con GROMACS usando ACPYPE. Se asignaron parámetros iónicos consistentes con el modelo de agua TIP3P basándose en el conjunto de parámetros de Joung-Cheatham. El complejo inicial se colocó en una caja de simulación dodecaédrica truncada con al menos 1,2 nm entre la superficie de la proteína y el borde de la caja. Se añadieron moléculas de agua TIP3P para solventar el sistema, y se introdujeron iones Na⁺ y Cl⁻ para neutralizar la carga del sistema y establecer la fuerza iónica en 0,15 M. La minimización de energía se realizó con el algoritmo de descenso más pronunciado hasta que la fuerza máxima fue inferior a 1.000 kJ·mol⁻¹·nm⁻¹. El sistema se equilibró entonces para 100 ps bajo el conjunto NVT a 298 K y 1 bar. Tras la equilibración, se ejecutó una simulación de producción de 100 ns bajo el conjunto NPT con un paso de tiempo de 2 fs. Las interacciones no vinculadas se gestionaban con el esquema de corte Verlet. Las interacciones electrostáticas se calcularon usando el método de malla de partículas (PME), y se utilizó un corte de 1,2 nm tanto para las interacciones de van der Waals como para las de Coulomb. Los enlaces que contienen hidrógeno estaban restringidos con el algoritmo LINCS. La temperatura se controlaba con el termostato Nosé-Hoover y la presión con el barostato Parrinello-Rahman, manteniendo el sistema en 298 K y 1 bar. Las trayectorias se guardaban cada 10 ps. Se analizaron la dinámica estructural y las interacciones intermoleculares utilizando herramientas integradas de GROMACS, VMD y PyMOL. Se estimó la energía libre de enlace con gmx_MMPBSA cuando era aplicable.

Estudios con animales

Cría de animales
Setenta ratas machos de Sprague-Dawley (SD) de entre 3 y 8 semanas fueron asignados aleatoriamente a siete grupos experimentales (n = 10 por grupo) utilizando números aleatorios generados por ordenador, asegurando que no hubiera diferencias estadísticamente significativas en el peso corporal inicial entre los grupos. Todos los animales fueron alojados bajo condiciones controladas (22 ± 1 °C, 55 ± 10% de humedad relativa, 12 horas en ciclo luz/oscuridad) con libre acceso a alimento y agua. Las posiciones de las jaulas se aleatorizaron en cada cambio de jaula para minimizar el sesgo ambiental. Tras una semana de aclimatación, las ratas de los grupos modelo fueron sometidas a punción caudal con IVD para inducir la degeneración. Se administró anestesia local de infiltración con bupivacaína preoperatoria para reducir el dolor. Los animales fueron monitoreados de cerca durante la cirugía y durante la recuperación postoperatoria. Las observaciones postoperatorias incluyeron tiempo de recuperación, restauración de la actividad espontánea, ingesta de comida y agua, y cambios en el peso corporal. Una semana después de la creación del modelo, se seleccionaron aleatoriamente dos ratas de cada grupo para la imagen postoperatoria de radiografía digital (DR) y la tinción de hematoxilina y eosina (HE). El análisis radiográfico mostró una reducción de la altura del IVD caudal, mientras que la tinción con HE reveló una marcada reducción en las células notocordiales del núcleo pulposo (NP) y la desorganización de la estructura laminar del anillo fibroso¹⁸, confirmando el establecimiento exitoso del modelo. Ocho semanas después de la cirugía, las ratas fueron eutanasiadas por inhalación de una sobredosis de isoflurano, y se recogieron muestras de tejido caudal y sangre. Tras la validación preliminar, se utilizaron tres muestras independientes por grupo que cumplieran criterios de calidad predefinidos para los análisis finales de histología, ELISA, PCR y western blot. Las secciones histológicas se evaluaron bajo condiciones de ciego simple, con las láminas etiquetadas solo con números de identificación animal. Para ensayos ELISA, PCR y western blot, se aplicó codificación ciega durante la alicuación y etiquetado de muestras, y el orden de pruebas de todas las muestras se aleatorizó antes de los experimentos. Los datos en bruto, incluidos los valores de absorbancia, valores C_t e intensidades de bandas, fueron decodificados en identidades de grupo por un estadístico no involucrado en agrupaciones experimentales o procesamiento de muestras y posteriormente analizados por personal estadístico. Todos los análisis estadísticos fueron realizados por estadísticos que no participaron en agrupaciones experimentales ni en el procesamiento de muestras. Cualquier evento adverso, incluyendo infección de heridas, dehiscencia, sangrado o letargo severo, se registró y evaluó inmediatamente. Las condiciones leves se monitorizaron de cerca con cuidados de apoyo reforzados. Se aplicaron criterios humanitarios si las ratas presentaban pérdida de peso corporal superior al 20% del valor inicial, dolor intenso no aliviado con analgésicos, pérdida de movilidad, incapacidad para acceder a alimentos o agua, infecciones, necrosis, otras complicaciones postoperatorias graves, dificultad respiratoria o cualquier condición potencialmente mortal. En estos casos, los animales fueron sacrificados humanamente mediante inhalación de una sobredosis de isoflurano.

Modelado experimental
Las ratas fueron anestesiadas con isoflurano inhalado y colocadas boca abajo. Las IVD de cola Co6/7, Co7/8 y Co8/9 estaban localizadas bajo guía fluoroscópica de rayos X. Una aguja de 21 G se avanzaba verticalmente hacia el IVD hasta alcanzar el lado opuesto de la piel, tras lo cual la punta de la aguja se retiraba hacia el centro de la cola. Una segunda aguja servía como referencia posicional. Para inducir una degeneración sostenida de la IVD, la aguja se giraba 360°, se mantenía en su lugar durante 30 segundos y luego se retiraba. En el grupo simulado, la profundidad de la perforación a través de la piel y el músculo fue de aproximadamente 2 mm, sin dañar la IVD. En los otros grupos, la aguja se insertó 5 mm hacia el centro de la DIV, evitando los vasos sanguíneos. Tras la inserción, la aguja se giraba 360° y se dejaba en su lugar durante 30 segundos. El lugar de la punción fue desinfectado, marcado y protegido con gasas estériles. Una semana después de la modelización, las radiografías de la columna caudal mostraron una disminución en la altura de la difusión intravenosa. La tinción con HE reveló una reducción significativa en las células notocordiales NP y la desorganización de la estructura de la lámina anular, confirmando el establecimiento exitoso del modelo. Tras un modelado exitoso, a los grupos que recibieron tratamientos con MTC y al grupo control positivo (PC) se les administraron las dosis adecuadas, calculadas en función de la relación de superficie corporal entre humanos y ratas.

Agrupación e intervención
En este experimento se utilizaron un total de 70 ratas SD machos de entre 3 y 8 semanas, divididos en siete grupos:
(1) Grupo de control (Ctrl): Las ratas de este grupo fueron asignadas aleatoriamente al mismo tiempo y bajo las mismas condiciones que los grupos experimentales. Se alojaban en jaulas individuales en una instalación animal de nivel SPF, con acceso gratuito a comida y agua potable estándar.
(2) Grupo simulado: Las ratas fueron anestesiadas por inhalación de isoflurano. Tras establecer la anestesia, la piel de la cola se desinfectó con povidona-yodo y las ratas se colocaron en posición propensa. Los IVD de Co6/7 y Co7/8 estaban localizados bajo guía fluoroscópica de rayos X. La aguja se adelantó aproximadamente 2 mm a través de la piel y el músculo sin dañar la IVD. El agua destilada (10 mL/kg) se administró una vez al día por gavage durante 8 semanas.

(3) Grupo modelo: Las ratas fueron anestesiadas con isoflurano inhalado. Tras establecer la anestesia, la piel de la cola se desinfectó con povidona-yodo y las ratas se colocaron en posición propensa. Bajo la guía fluoroscópica de rayos X, se localizaron los IVD de Co6/7, Co7/8 y Co8/9. Una aguja de 21 G se introducía verticalmente en el IVD hasta alcanzar el lado opuesto de la piel, y la punta de la aguja se retiraba hacia el centro de la cola.

Se utilizó una segunda aguja como referencia posicional. La aguja se giraba 360° y se mantenía en su lugar durante 30 segundos para inducir una degeneración continua de la IVD antes de su retirada. Se administró agua destilada (10 mL/kg) diariamente por gavage durante 8 semanas, y la recuperación de las ratas se monitorizó de cerca tras la cirugía.
(4) Grupo PC: El grupo control positivo fue sometido al mismo procedimiento de modelado que el grupo modelo y posteriormente recibió gavage oral de celecoxib (20 mg/kg/día), preparado en suspensión en carboximetilcelulosa al 0,5% de sodio (CMC-Na), durante 8 semanas consecutivas, con un volumen de gavage de 10 mL/kg de peso corporal.
(5) YQHXD grupo de baja dosis [YQHXD(L)]: Se realizó la modelización como en el grupo modelo. Las ratas recibieron YQHXD a 3,87 g/kg/día por gavage durante 8 semanas, con un volumen gavage de 10 mL/kg y una concentración de trabajo de 0,387 g/mL.
(6) Grupo de dosis media YQHXD [YQHXD(M)]: Se realizó la modelización como en el grupo modelo. Las ratas recibieron YQHXD a 7,74 g/kg/día por gavage durante 8 semanas, con un volumen de gavage de 10 mL/kg y una concentración de trabajo de 0,774 g/mL.
(7) YQHXD grupo de alta dosis [YQHXD(H)]: Se realizó la modelización como en el grupo modelo. Las ratas recibieron YQHXD a 15,48 g/kg/día por gavage durante 8 semanas, con un volumen de gavage de 10 mL/kg y una concentración de trabajo de 1,548 g/mL.

Cambios patológicos
El tejido caudal de la IVD de la rata fue aislado quirúrgicamente, y se observaron cambios en la IVD y en los músculos circundantes. El tejido recolectado se procesó entonces en secciones patológicas, con muestras preparadas en secciones longitudinales para su observación morfológica. La IVD vertebral caudal, fijada en formaldehído durante 96 horas, fue descalcificada rápidamente usando una solución descalcificante, deshidratada mediante una serie de alcohol graduada y eliminada con xileno. Tras la incrustación en parafina, se prepararon secciones de parafina de 5 μm. Tras la deparafinización con xileno y la deshidratación mediante una serie de gradientes de alcohol, las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina. Luego fueron deshidratados, despejados y montados. Las muestras se observaron bajo un microscopio óptico para examinar los cambios morfológicos en la estructura de la difusión caudal intravental entre los grupos. Posteriormente, se realizó la tinción tricroma de Masson. Las secciones se teñieron secuencialmente con solución de dicromato de potasio y hematoxilina durante 3 minutos cada una, seguidas de diferenciación con etanol ácido y luego teñidas con Rojo de Picrosirio durante 10 minutos. Tras el tratamiento con ácido fosfotongstico durante 10 minutos, las secciones se teñieron con azul de toluidina durante 5 minutos. Tras la deshidratación, las secciones se limpiaron con xileno, se montaron y se observaron al microscopio para examinar los cambios en la difusión caudal intravenosa.

Detección por ELISA de proteínas diana séricas
Ocho semanas después de la cirugía, las ratas fueron anestesiadas con isoflurano inhalado y se recogió sangre de la aorta abdominal. Las muestras de sangre periférica se mantuvieron a temperatura ambiente durante 1 hora y centrifugaron a 1.400 × g durante 10 minutos. El suero se separaba y almacenaba a −80 °C hasta su uso. Los niveles séricos de AKT1, STAT3 y Bcl-2 se cuantificaron mediante un ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA). Los ensayos se realizaron según los protocolos de los fabricantes. La absorbancia se leyó a 450 nm y las concentraciones se determinaron a partir de curvas estándar. Los rangos de detección para AKT1, STAT3 y BCL-2 fueron de 0,625–40 ng/mL, 31,25–1000 pg/mL y 0,16–10 ng/mL, respectivamente, con sensibilidades de 0,1 ng/mL, 10 pg/mL y 0,1 ng/mL. Todas las muestras de suero se analizaron sin dilución y todos los resultados se situaron dentro de los rangos de curva estándar correspondientes. Todas las muestras y estándares se analizaron en duplicado, y la normalización se realizó en función de volúmenes séricos iguales.

Detección por PCR de los niveles de expresión génica
Se diseccionaron tejidos discales intervertebrales de vértebras caudales de rata y se recogieron aproximadamente 20 mg de cada muestra. Los tejidos se pulverizaron en nitrógeno líquido y se lisaron en 500 μL de tampón de lisis no enzimático durante 15 minutos. Luego se extraía ARN total y se medía su concentración y pureza con un espectrofotómetro. Se aceptaron muestras con valores de A₂₆₀/_{A 280} de 1,8–2,0 para el análisis y las concentraciones de ARN se ajustaron a 500 ng/μL. Se realizó transcripción inversa según el protocolo del fabricante. La PCR cuantitativa (qPCR) se realizó en un sistema de PCR en tiempo real para medir la expresión de ARNm de Akt1, Bcl-2 y Stat3 . Las secuencias de cebadores se proporcionan en la Tabla 1. El programa de PCR consistió en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 s, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s. Se realizó un análisis de curva de fusión tras la amplificación para verificar la especificidad del producto. Se utilizó el Gapdh como gen de referencia, y todas las muestras se analizaron en triplicado. La eficiencia de amplificación de cebadores fue del 90% al 110%. La expresión génica relativa se calculó utilizando el método 2^−ΔΔCt .

Western blot para los niveles de expresión de proteínas
Se aisló proteína total de los tejidos caudales de los discos intervertebrales de rata de cada grupo. Los tejidos se lisaron en un tampón RIPA suplementado con inhibidores de proteasa. La concentración de proteínas se midió utilizando un kit de análisis de proteínas BCA y se ajustó a 2 μg/μL. Cantidades iguales de proteína (15 μg por muestra) se separaron mediante un 10% de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) a una corriente constante de 300 mA durante 90 minutos mediante un sistema de transferencia húmeda. Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra AKT1 (1:5.000), STAT3 (1:6.000), Bcl-2 (1:1.500) y β-actina (1:4.000). Tras el lavado con TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) en una dilución de 1:5.000 durante 1 hora a temperatura ambiente. Se detectaron bandas proteicas utilizando un reactivo de quimioluminiscencia (ECL) mejorada, y se obtuvieron imágenes con un sistema de imagen en gel bajo condiciones de exposición idénticas. Las intensidades de las bandas se midieron usando ImageJ y se normalizaron a β-actina para determinar la expresión relativa de proteínas. Cada experimento se realizó de forma independiente en triplicado, obteniendo cada muestra de un animal diferente.

Estadísticas
Los resultados se expresan como media ± desviación estándar (DS). Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante análisis unidireccional de varianza (ANOVA), seguido por la prueba post hoc de diferencia mínima significativa (LSD). La significación estadística se definió como P < 0,05.

Resultados

Conclusiones derivadas del estudio
Este estudio integró farmacología de redes, acoplamiento molecular, simulaciones de dinámica molecular y experimentos in vivo para investigar los posibles efectos protectores de YQHXD contra el LDD. Los resultados sugieren que YQHXD puede actuar, al menos en parte, mediante la regulación del eje de señalización AKT1/STAT3/BCL-2, caracterizado por una reducción en la expresión de STAT3 y un aumento en la expresión de AKT1 y B...

Discusión

Se ha reportado que las medicinas herbales tradicionales chinas ejercen efectos farmacológicos, incluyendo actividades antiinflamatorias, analgésicas y de promoción de la circulación^{sanguínea 19}. Estudios previos han sugerido que la decocción Xiaosui Huahe, la fórmula precursora de YQHXD, podría promover la reabsorción de herniaciones masivas de IVD afectando la reabsorción del núcleo pulposo (NP) y la absorción^{de la IVD 20}; sin embargo, lo...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,5% carboximetilcelulosa sódica (CMC-Na)	No especificado		Vehículo utilizado para preparar la suspensión de celecoxib para el gavage.
Aguja de 21 g	No especificado		Se usa para la punción caudal del disco intervertebral.
2 y veces; Mezcla Master Universal Blue SYBR Verde qPCR	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan	G3326	reactivo de amplificación qPCR.
Solución de gel de acrilamida/bis-acrilamida al 30% (29:1)	Solarbio Co., Ltd.		Solución de preparación en gel para SDS-PAGE; Listados en la tabla original de materiales como solución gel 30%/29:1.
Máquina de moler congelada 3D	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		Se usa para homogeneización/molienda de tejidos.
4 y días; Buffer de gel concentrador SDS-PAGE (pH 6,8)	Solarbio Co., Ltd.		Reactivo de preparación en gel Western Blot.
Etanol ácido	No especificado		Se utiliza para la diferenciación histológica de tinción.
ACPYPE	Proyecto ACPYPE		Se utiliza para convertir archivos de topología de ligandos a un formato compatible con GROMACS.
Kit AKT1 ELISA	Hangzhou UpingBio Technology Co., Ltd.	SYP-R1928	Se utiliza para medir los niveles séricos de AKT1; rango de detección 0,625– 40 ng/mL.
Método de carga AM1-BCC	Herramientas de antecámara/ámbar		Se utiliza para el cálculo de carga atómica de ligandos.
Campo de fuerza Amber14SB	Campo de fuerza AMBAR		Campo de fuerza proteico utilizado en simulación de dinámica molecular.
Raíz de Angelica sinensis	Farmacia Jianshou, Nanning, Guangxi, China	Lote nº 20250503	YQHXD componente botánico; 20 g por receta.
Etanol anhidro	Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.		Se utiliza en el procesamiento y deshidratación de tejidos.
Antesala	Herramientas AMBER		Se utiliza para el cálculo de carga de ligandos y la tipificación de átomos.
Anticuerpo anti-AKT1	Wuhan Sanying Co., Ltd.		Anticuerpo primario para la coagulación occidental; dilución 1:5.000.
Anticuerpo anti-Bcl-2	Wuhan Sanying Co., Ltd.		Anticuerpo primario para la coagulación occidental; dilución 1:1.500.
Anticuerpo anti-STAT3	Wuhan Sanying Co., Ltd.	10253-2-AP	Anticuerpo primario para la coagulación occidental; dilución 1:6.000.
Reactivo APS	Beyotime/Biyuntian Co.		Reactivo de polimerización en gel Western Blot.
Raíz de Astragalus membranaceus	Farmacia Jianshou, Nanning, Guangxi, China	Lote nº 20250405	YQHXD componente botánico; 20 g por receta.
Autoclave	SANYO, Japón		Equipo de esterilización.
Motor AutoDock Vina	Proyecto AutoDock/Vina		Motor de acoplamiento utilizado en CB-Dock2.
Kit de ensayo de proteínas BCA	Solarbio Co., Ltd.		Se utiliza para determinar la concentración de proteínas antes del Western bloting.
Kit ELISA Bcl-2	Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.	PMK1545	Se usa para medir los niveles séricos de Bcl-2; rango de detección 0,16– 10 ng/mL.
Bupivacaína	No especificado		Anestésico de infiltración local utilizado preoperatoriamente.
CB-Dock2	Servidor web CB-Dock2		Plataforma automatizada de acoplamiento molecular ciego.
Celecoxib	Sichuan New Ston Pharmaceutical Co., Ltd.	H20233911	Fármaco de control positivo; 20 mg/kg/día por Gavage.
Fruto de Chaenomeles speciosa	Farmacia Jianshou, Nanning, Guangxi, China	Lote nº 231001	YQHXD componente botánico; 15 g por receta.
Cytoscape	Consorcio Cytoscape	Versión 3.9.0	Se utiliza para construir y analizar diagramas de red.
Kit de reactivo cromogénico DAB (20 y más veces)	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.		Listados en la tabla de materiales existentes.
DAVID	Instituto Nacional del Cáncer	Versión 6.8	base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado; utilizado para análisis de enriquecimiento GO y KEGG.
Solución de descalcificación	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.		Se utiliza para la descalcificación del tejido de la difusión vertebral caudal.
Agitador de decoloración	Liu Yi Biotechnology Co., Ltd., Pekín		Agitador de laboratorio.
Agua del DEPC	Wuhan Sanying Co., Ltd.		Trabajo de ARN/preparación de reactivos.
Sistema de imagen digital por radiografía	No especificado		Utilizado para la validación de modelos radiográficos postoperatorios.
Agua destilada	No especificado		Preparación de vehículo/control y decocción YQHXD.
Sustrato quimioluminiscente ECL	Biosharp Co.		Reactivo de detección de señales de Western Blot.
Solución de extracción de antígenos EDTA (pH 8,0)	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.		Listados en la tabla de materiales existentes.
Aparato de electroforesis	No especificado		Utilizado para la electroforesis SDS-PAGE.
Amortiguador de electroforesis	Servicebio Co.		Solución de electroforesis western blot.
Máquina de hielo FM40	Changliu Scientific Instruments Co., Ltd., Pekín		Máquina de hielo.
Formaldehído	No especificado		Fijador utilizado para tejido intraveinte vertebral caudal.
Tipos de átomos GAFF2	Herramientas AMBER		Tipos de átomos de ligando usados para simulaciones de dinámica molecular.
Sistema de imagen en gel	Tianen Scientific, Shanghái		Se usaba para capturar imágenes de manchas occidentales.
GeneCards	Instituto Weizmann de Ciencias	Versión 5.26	Base de datos genética humana utilizada para recuperar objetivos asociados a enfermedades.
gmx_MMPBSA	gmx_MMPBSA proyecto		Se utiliza para la estimación de energía libre de unión MM-PBSA cuando corresponde.
GraphPad Prism	GraphPad Software	Versión 8.0	Software estadístico/gráfico listado en la versión anterior del manuscrito de los autores.
Esferas de molienda	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		Se utiliza para el molimiento/homogeneización de tejidos.
GROMACS	Equipo de desarrollo de GROMACS	Versión 2022.2	Usado para simulaciones de dinámica molecular.
Reactivos de coloración de hematoxilina y eosina	No especificado		Se usa para la tinción con HE de secciones caudal de IVD.
Centrífuga de alta velocidad	Eppendorf, Alemania		Centrífuga de laboratorio.
Trituradora de tejido de alta velocidad y baja temperatura	Servicebio, China		Se utiliza para el molimiento de tejidos a baja temperatura.
Agitador horizontal	Compañía Chirinbell		Agitador de laboratorio.
Anticuerpo anticonejo marcado por HRP	Servicebio Co.		Anticuerpo secundario para la sección Western; dilución 1:5.000.
HyperScript III RT SuperMix para qPCR con removedor de gDNA	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		Reactivo de transcripción inversa listado en la tabla de materiales existentes.
Máquina de hielo	SIMAG, China		Máquina de hielo.
ImageJ	Institutos Nacionales de Salud		Usado para la cuantificación de la intensidad de bandas Western Blot.
Microscopio biológico invertido	Olympus, Japón		Usado para microscopía de secciones teñidas.
Isoflurano	No especificado		Anestésico inhalado/agente de eutanasia.
Reactivo de isopropanol	Grupo Nacional Farmacéutico de China Chemical Reagents Co., Ltd.		Reactivo de extracción de ARN.
Parámetros de iones de Joung-Cheatham	No aplicable		Conjunto de parámetros iónicos usados para simulaciones de dinámica molecular.
Rizoma de Ligusticum chuanxiong	Farmacia Jianshou, Nanning, Guangxi, China	Lote nº 20250301	YQHXD componente botánico; 15 g por receta.
Nitrógeno líquido	No especificado		Se utiliza para el molimiento de tejidos antes de la extracción de ARN.
Centrífuga de baja velocidad	Eppendorf, Alemania		Se utiliza para separación sérica y otros pasos de centrifugación a baja velocidad.
Solución de tinción tricroma de Masson	No especificado		Se usa para el tinción Masson de secciones de IVD caudal.
Lector de microplacas (TECAN)	TECAN, Suiza		Utilizado para la medición de la absorbancia a 450 nm; listados en la tabla de materiales existentes.
Lector de microplacas (Thermo Fisher Scientific)	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.		Lector de microplacas multifuncional listado en la tabla de materiales existentes.
Software de Microsoft Excel/hojas de cálculo	Microsoft		Se utiliza para eliminar entradas duplicadas de destino y gestionar datos tabulares.
Espectrofotómetro NanoDrop 2000	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.		Se usa para medir la concentración y pureza del ARN.
Tampón de lisis no enzimático	No especificado		Se usa para la lisis tisular antes de la extracción de ARN.
OMIM	Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins		Herencia mendeliana en línea en el hombre; Utilizado para extraer objetivos asociados a enfermedades.
Plataforma online de trazado de bioinformática	No especificado		Se usa para generar gráficos de barras GO y KEGG.
Agente de polimerización en gel PAGE	Solarbio Co., Ltd.		Reactivo de preparación en gel Western Blot.
Parafina	No especificado		Medio de incrustación para secciones histológicas.
Cebadores PCR para Akt1, Bcl-2, Stat3 y Gapdh	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.		Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 1.
PDB	RCSB PDB		Base de Datos de Proteínas; se utiliza para obtener estructuras 3D de proteínas objetivo.
Inhibidores fosforilados/proteasas	Servicebio Co.		Añadido al tampón de lisis RIPA para la extracción de proteínas.
Ácido fosfotongstico	No especificado		Usado en tinte de Masson.
Picrosirius Red	No especificado		Usado en tinte de Masson.
Membrana de difluoruro de polivinilideno (0,45 & mu; m)	Servicebio Co.		Membrana PVDF utilizada para la transferencia de Western blot.
Vehículo de control positivo de drogas	No especificado		Vehículo con suspensión CMC-Na al 0,5% para celecoxib.
Povidona-yodo	No especificado		Se usa para la desinfección del sitio quirúrgico.
Marcador proteico	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.		Marcador de peso molecular para Western bloting.
Aparato de transferencia de proteínas	Bio-Rad, EE. UU.		Equipo de transferencia húmeda para Western bloting.
Módulo de transferencia de proteínas (transferencia húmeda)	Bio-Rad, EE. UU.		Módulo de transferencia húmeda Western Blot.
PubChem	Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI)		Se utiliza para obtener archivos SMILES/SDF de estructuras compuestas.
Sistema de preparación de agua pura	Le Feng Biotechnology Co., Ltd., Shanghái		Se usa para la preparación de agua pura.
PyMOL	Schrö dinger, LLC		Se utiliza para la visualización y análisis de dinámicas moleculares/salidas de acoplamiento.
Sistema de PCR en tiempo real qPCR	Applied Biosystems QuantStudio, EE. UU.		Se utiliza para amplificación cuantitativa por PCR.
Tampón de lisis de tejido/célula RIPA	Solarbio Co., Ltd.		Se usa para la extracción total de proteínas.
Solución para la disolución de ARN	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		Reactivo de manipulación de ARN.
Evaporador rotatorio	No especificado		Se utiliza para concentrar los filtrados combinados YQHXD bajo presión reducida.
Semillas maduras de Sinapis alba	Farmacia Jianshou, Nanning, Guangxi, China	Lote nº 20240801	YQHXD componente botánico; 10 g por receta.
Ratas Sprague-Dawley	Shanghai Slack Experimental Animal Co., Ltd.	SCXK (Shanghái) 2022-0004	Setenta ratas machos, de 3 años y de guiño; 8 semanas, usado para el modelo de punción caudal con disco.
SPSS	IBM, EE.UU.	Versión 21.0	Software estadístico listado en la versión anterior del manuscrito de los autores.
Kit STAT3 ELISA	Hangzhou UpingBio Technology Co., Ltd.	SYP-R1555	Se usa para medir los niveles séricos de STAT3; rango de detección 31.25– 1000 pg/mL.
Raíz de Stephania tetrandra	Farmacia Jianshou, Nanning, Guangxi, China	Lote nº 230301	YQHXD componente botánico; 6 g por receta.
Gasa estéril	No especificado		Se usan para proteger el lugar de la punción después de modelar.
STRING	Consorcio STRING	Versión 12.0	Plataforma de red de interacción proteína-proteína.
SweScript All-in-One RT SuperMix para qPCR	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan	G3337	Reactivo de transcripción inversa listado en la tabla de materiales existentes.
SwissTargetPrediction	Instituto Suizo de Bioinformática SIB		Se utiliza para predecir posibles objetivos de los compuestos.
Búfer TBST	No especificado		Se utiliza para lavar membranas durante el Western bloting.
TCMSP	Centro de Bioinformática, Facultad de Ciencias de la Vida, Noroeste A y Universidad F	Versión 2.3	Base de Datos de Farmacología de Sistemas de Medicina Tradicional China; se utiliza para obtener ingredientes activos de compuestos herbales chinos.
Modelo acuático TIP3P	No aplicable		Modelo de agua utilizado en simulaciones de dinámica molecular.
Azul toluidina	No especificado		Usado en tinte de Masson.
Búfer de transferencia	Servicebio Co.		Amortiguador de transferencia de manchas occidentales.
Reactivo TriQuick	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		Reactivo de extracción de ARN.
Reactivo de Trizol	No especificado		Reactivo de extracción total de ARN mencionado en el manuscrito.
TTD	La Universidad China de Hong Kong (IDRBLab)		Base de Datos de Objetivos Terapéuticos; Utilizado para extraer objetivos asociados a enfermedades.
Venny	BioinfoGP, CNB-CSIC	Versión 2.1.0	Se utiliza para identificar objetivos superpuestos entre YQHXD y LDD.
Esquema de corte de Verlet	GROMACS		Esquema de interacción no enlazado utilizado en simulaciones de dinámica molecular.
Aparato de electroforesis vertical	Bio-Rad, EE. UU.		Usado para SDS-PAGE.
VMD	Universidad de Illinois en Urbana-Champaign		Utilizado para la visualización y análisis de salidas de dinámica molecular.
Sistema de transferencia húmeda	Bio-Rad, EE. UU.		Se utiliza para la transferencia de proteínas en Western bloting.
Sistema de fluoroscopia de rayos X	No especificado		Se utiliza para identificar los niveles de IVD caudal durante el modelado por punción.
Xileno	No especificado		Se usa para la deparafinización/limpieza durante la histología.
Anticuerpo primario de β-actina	Wuhan Sanying Co., Ltd.		Anticuerpo primario de control de carga para la blotting occidental; dilución 1:4.000.