Protocolo para el seguimiento y cuantificación automática del comportamiento en Drosophila melanogaster

Summary

Este protocolo utiliza la estimación de poses por Python para rastrear puntos clave del cuerpo en Drosophila emparejada, facilitando la cuantificación automatizada de comportamientos sociales sutiles, especialmente en la interacción social, así como mapas de calor y trayectorias locomotoras.

Abstract

Para desarrollar una herramienta analítica de código abierto que supere las limitaciones de los métodos tradicionales de seguimiento basados en centroides, presentamos un protocolo para analizar con precisión las interacciones sociales en parejas de Drosophila que se comportan libremente. Específicamente, este protocolo se inspira en el marco de redes de alta resolución (HRNet) para rastrear simultáneamente cinco puntos clave anatómicos —cabeza, tórax, abdomen y puntas de las alas izquierda y derecha— con el objetivo de generar datos de coordenadas de alta resolución para el análisis cuantitativo posterior de los comportamientos sociales. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo completo basado en Python y una interfaz gráfica de usuario (GUI) que diseñamos, incluyendo construcción de conjuntos de datos, entrenamiento de modelos y extracción automatizada de coordenadas, junto con módulos integrados para generar mapas de calor de ocupación espacial, trayectorias locomotoras y proporciones de interacción social en moscas. Para validar este marco, se probó utilizando dos cepas ampliamente utilizadas, w1118 y Canton-S (CS). Nuestros resultados demostraron la estabilidad de la detección de puntos clave y revelaron diferencias específicas del genotipo en la utilización espacial y la estructura de la locomotora. Esta metodología proporciona una base escalable para la etología cuantitativa y el análisis automatizado de las interacciones sociales en Drosophila, al tiempo que reduce el esfuerzo de anotación manual y mejora la reproducibilidad.

Introduction

Drosophila melanogaster es un organismo modelo ampliamente utilizado con potentes herramientas genéticas y circuitos neuronales bien mapeados que permiten la disección mecanicista del comportamiento¹. Tiene una amplia gama de comportamientos sociales, incluyendo cortejo y agresión, y una fuerte capacidad de aprendizaje 2,3,4,5,6,7,8. Cada uno está compuesto por elementos motores distintos controlados por un sistema nervioso compacto pero extremadamente bien organizado. Es importante destacar que la medición precisa de la postura corporal es esencial para comprender los fundamentos neurológicos de la selección de acciones, ya que muchos de estos comportamientos contienen motivos posturales finos que codifican información contextual e interna ^9,10.

A pesar de la necesidad de resolución de una sola mosca para capturar diferencias individuales, muchos ensayos conductuales de alto rendimiento en Drosophila aún dependen de índices a nivel^{de grupo 11}. Los ensayos conductuales de alto rendimiento incluyen pruebas T-maze para preferencia^{social 12,13}, ensayos de espaciamiento social que cuantifican la distancia entre moscas, o paradigmas de agregación/evitación bajo estimulación sensorial¹⁴ que pueden capturar eficientemente tendencias poblacionales. Sin embargo, implican inherentemente promediar entre individuos, oscureciendo así la heterogeneidad en las secuencias de acción y la estructura temporal de los intercambios sociales. A lo largo de los años, los intentos de avanzar hacia la identificación por mosca se han basado en métodos funcionalmente restringidos, como la detección de eventos basada en reglas usando umbrales cinemáticos, la resta de fondo con seguimiento de centroides y la anotación manual^{de vídeo 15, 16, 17, 18}. Como resultado, comportamientos discretos como lanzarse, golpetear o amenazas en las alas a menudo se ignoran o etiquetan erróneamente, lo que requiere una corrección manual significativa. Estas limitaciones han restringido los estudios mecanicistas que requieren una alineación temporal precisa entre la actividad neuronal y las acciones individuales.

Ahora existe una solución revolucionaria gracias a los recientes avances en visión por ordenador y estimación de poses basada en aprendizaje automático. Frameworks de código abierto como DeepLabCut¹⁹ y SLEAP²⁰ permiten la detección de partes del cuerpo sin marcadores, la clasificación escalable de acciones discretas y la preservación de la identidad individual incluso durante interacciones cercanas. Estas características superan las desventajas de enfoques previos basados en grupos y reglas y permiten una cuantificación repetible de comportamientos sociales complejos.

Las interacciones individuales en Drosophila se caracterizan por características motoras únicas que indican la progresión de las interacciones sociales. La agresión, por ejemplo, incluye comportamientos típicos como lanzarse, amenazas de alas y agarrar, todos ellos representando etapas de conflicto^{crecientes 21,22}. El cortejo se define de manera similar por la orientación, la extensión unilateral de las alas con la producción de canto, el golpeteo e intento de cópula, que se unen para formar la secuencia temporal de interacciones^{de apareamiento 23}. Capturar estos motivos depende del reconocimiento preciso de la postura corporal y los movimientos^{articulares 24,25}. En la práctica, el muestreo requiere una alta resolución espacial y temporal durante periodos prolongados de registro para asegurar que patrones motores sutiles puedan detectarse y alinearse con precisión con la actividad^{neuronal 25,26}.

Aquí presentamos un marco de código abierto basado en la visión para la identificación automatizada de cinco puntos anatómicos clave: cabeza, tórax, abdomen, puntas del ala izquierda y^{derecha 27}. El sistema comprende un flujo de trabajo completo para la construcción de conjuntos de datos, entrenamiento de modelos y extracción de coordenadas, y genera datos de series temporales de alta resolución adecuados para una clasificación conductual personalizable. Al automatizar los procesos de anotación manual y estandarizar los flujos de trabajo analíticos, nuestro método permite un análisis cuantitativo a gran escala de los comportamientos de interacción social, aumentando la eficiencia y la reproducibilidad mientras reduce significativamente el tiempo y la mano de obra necesarios para el análisis.

Para validar la fiabilidad del sistema, lo aplicamos a dos cepas de laboratorio comúnmente utilizadas, w1118 y Canton-S (CS), y observamos una detección estable de puntos clave a través de los marcos, así como diferencias específicas de genotipo en ocupación espacial, características de trayectoria e indicadores de interacción social basados en la distancia de la cabeza y el ángulo de orientación. Los investigadores pueden evaluar la idoneidad de este protocolo basándose en la resolución espaciotemporal requerida (≥30 fps, ≤0,5 mm/píxel) y las condiciones de grabación de vídeo (iluminación y contraste). El tamaño del píxel se puede determinar directamente a partir de la configuración de la cámara. Una mosca de la fruta con una longitud corporal medida puede colocarse dentro del campo de visión de imagen para su calibración. Este protocolo es especialmente adecuado para los siguientes escenarios: la necesidad de rastrear simultáneamente a dos Drosophilas que interactúan libremente y distinguir sus identidades individuales; centrándose en posturas finas (por ejemplo, ángulo y distancia de cabeza) en lugar de solo en las posiciones del centroide; la duración de la grabación superior a 10 minutos cuando la anotación manual no es factible; requiriendo una alineación temporal a nivel de milisegundos entre eventos conductuales y actividad neuronal (por ejemplo, imágenes de calcio o electrofisiología) en análisis posteriores.

Protocol

1. Preparación de la mosca

1. Recoge y seadora las moscas de unos 3–4 días bajo breve anestesia de CO₂ antes de los experimentos.
   NOTA: La duración de la anestesia y el caudal de CO₂ pueden variar según las especificaciones y la presión del cilindro de dióxido de carbono utilizado en cada laboratorio. Las moscas deben ser monitorizadas continuamente durante la anestesia, y la exposición al CO₂ debe mantenerse solo hasta que estén completamente anestesiadas y muestren una suspensión total de movimiento.
2. Coloque cada mosca individualmente en un tubo Falcon de 50 mL que contiene un medio estándar de harina de maíz, agar, glucosa y levadura.
3. Mantener las moscas a 25 °C bajo un ciclo de 12 horas luz/oscuridad hasta su uso.

2. Construcción de la arena

1. Prepara dos placas acrílicas transparentes de 3 mm y una de polietileno de 3 mm.
2. Corta cuatro cámaras circulares (de 35 mm de diámetro cada una) en el centro de la placa de polietileno.
3. Utiliza clips para unir una placa de acrílico a la placa de polietileno y formar la base de la cámara; Guarda la segunda placa de acrílico como tapa extraíble.

Figura 1: Esquema del ámbito conductual y configuración de imágenes. (A) La construcción de una cámara de observación personalizada se representa en el diagrama. La cámara consta de tres capas principales: una base de acrílico transparente de 3 mm; una placa de polietileno de 3 mm con cuatro recortes circulares de 35 mm de diámetro que servían como pozos individuales de cámara; y una segunda placa de acrílico que funciona como tapa extraíble. (B) Se utiliza una abrazadera adaptadora de 90° para instalar la cámara verticalmente sobre un poste óptico de 40 cm. Para la imagen de arriba hacia abajo, la cámara se posiciona directamente sobre la arena de observación multicapa con su eje óptico perpendicular a la superficie de la cámara. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Montaje de imágenes

1. Montar dos postes ópticos de 20 cm y uno de 40 cm con abrazaderas adaptadoras de 90°.
2. Monta la cámara (1280 × 1024 píxeles) verticalmente sobre el poste de 40 cm, alineada perpendicularmente a la superficie de la arena, y ajusta la tasa de fotogramas a 150 fps.
3. Coloca la arena sobre un panel LED regulable de 25 cm × 25 cm de color blanco diurno cubierto con una lámina de difusión.
4. Ajusta la iluminación a unos 1500 lux en la superficie de la arena.
   NOTA: Asegúrese de que los bordes de las alas permanezcan visibles en la vista previa binaria. Evita >2000 lux para evitar artefactos inducidos por el calor, ya que las moscas pueden cambiar su locomoción o distribución natural debido al estrés térmico de la fuente de luz.

4. Procedimiento de registro

1. Coloca almohadillas de espuma de 3 cm bajo cada esquina de la arena para estabilizarla.
2. Transfiere pares de moscas bajo anestesia CO₂ a las cámaras; Sella con la placa acrílica superior.
3. Deja que las moscas se aclimaten durante 40 minutos antes de grabar.
4. Inicia la adquisición de vídeo usando MIAS.exe²⁷: pulsa q para comenzar y c para parar.
   NOTA: Esto da lugar a grabaciones de vídeo continuas de parejas de moscas interactuando libremente bajo condiciones estandarizadas.

5. Definir el panel de actividades sociales

1. Ejecuta el script de preprocesamiento: python SoAL_PreProcess.py [video_file_path]
   NOTA: Todos los scripts de codificación se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.
2. Anota el área de la cámara y asigna metadatos en forma de Genotype_age (días) × 1 (número de cámaras). (por ejemplo, CS_3 × 1)
3. Ajusta el deslizador del umbral de detección hasta que las alas sean casi invisibles en la imagen binaria para asegurar una subtracción óptima del fondo y visibilidad de las alas.

6. Preparación del conjunto de datos

1. Crea una nueva carpeta de conjunto de datos ejecutando:
   Herramientas de python/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME 10 (intervalo de muestreo de tramas)
   NOTA: El parámetro de intervalo de muestreo de tramas ("10") fue adaptado de un protocolo²⁷ previamente publicado. Valores más bajos aumentan la densidad de muestreo y la carga computacional, mientras que valores más altos reducen la demanda computacional y pueden ajustarse en función del rendimiento disponible del hardware y los requisitos experimentales.
2. Configura la ruta de vídeo y la ruta del conjunto de datos en 'herramientas/SoAL_DatasetUtils.py'.
3. Interfaz de etiquetado manual de lanzamiento:
   >herramientas de python/SoAL_LabelUI.py NOMBRE DE DATOS
   1. Navegación por fotogramas: Pulsa la tecla Espacio o la tecla Z para navegar al siguiente o al anterior, respectivamente. Alternativamente, usa el deslizador de línea temporal para navegar.
   2. Etiquetado de puntos clave: Haz clic en la posición correcta de una mosca en cada imagen (en una secuencia específica: cabeza, tórax, abdomen, ala izquierda y ala derecha) para marcar los 5 puntos clave.
   3. Selección de puntos clave: Pulsa las teclas numéricas para seleccionar un punto clave (indicado por un círculo blanco). El siguiente clic reasignará un nuevo número al punto clave seleccionado.
   4. Guardar: Cierra la ventana o pulsa la tecla D para guardar los resultados de la anotación.
      NOTA: Un archivo completo de conjunto de entrenamiento consta de dos componentes: un directorio de imágenes y un archivo annotation.json.

7. Entrenamiento con modelos

1. Divide el conjunto de datos en conjuntos de entrenamiento y validación:
   Herramientas de Python/SoAL_DatasetGen.py División de nombres de DATASET
   Se crearán dos carpetas nuevas en 'dataset/.'
2. Configurar parámetros de entrenamiento en hrnet/fly_w32.yaml:
   Factor de rotación: 15°
   Factor de escala: 0,35
   Factor de brillo: 0,25
   Tamaño del lote: 24
   Épocas: 200
3. Realiza el programa de formación:
   Python hrnet/tools/train.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Terminar los conjuntos de entrenamiento cuando la precisión media (AP) se estanca; retener el mejor modelo (AP > 90%).
4. Validar el modelo usando:
   Python hrnet/tools/test.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Resultado: Modelo robusto basado en HRNet para la detección de puntos clave con múltiples vuelos.

8. Ejecutar el programa de detección

1. Copia los archivos de vídeo nuevos en el directorio de vídeo.
2. Anota los metadatos como se muestra en el paso 5.
3. Ejecutar programa de detección: python SoAL_KptDetect.py todo
4. Inspeccionar los resultados de la detección:
   Herramientas/SoAL_ViewKptUI.py excel_file_path de Python (.CVS/XSLX)
   Resultado: Coordenadas bidimensionales de cinco hitos anatómicos por mosca a través de los marcos.

9. Cuantificación conductual

1. Inicia una aplicación GUI independiente para análisis (Archivo Suplementario 2) e importa archivos de coordenadas en la interfaz.
2. Genera mapas de calor de ocupación espacial (densidad de probabilidad de posiciones en la arena).
3. Reconstruir trayectorias locomotoras a partir de series temporales de coordenadas.
4. Crea datos de interacción social, incluyendo la distancia de la cabeza, la orientación y el estado social derivado.
   Resultado: Visualización estandarizada del uso espacial específico del genotipo y la dinámica del movimiento.

Results

La Figura 1 ilustra la geometría de la arena, la configuración de iluminación y la colocación de la cámara utilizadas para registrar las interacciones sociales naturales en Drosophila. El montaje garantiza una iluminación uniforme y condiciones de imagen estables, adecuadas para la estimación de poses y la extracción de coordenadas.

Se aplicó estimación automática de poses a todos los vídeos grabados para extraer coordenadas bidimensionales de los puntos anatómicos clave predefinidos de cada mosca. El modelo identificó consistentemente las articulaciones de la cabeza, el tórax, el abdomen y las alas a lo largo del cuerpo, incluso durante interacciones a corta distancia. La Figura 2 muestra un fotograma representativo con puntos clave superpuestos, demostrando un seguimiento preciso de múltiples moscas y una detección estable de puntos clave a lo largo de la grabación. La fiabilidad de este paso garantiza que la serie temporal de coordenadas extraída pueda servir como una base sólida para análisis cuantitativos posteriores. La Figura 3 ilustra el flujo de trabajo analítico.

Utilizando las coordenadas extraídas y la proporción de fotogramas para cada coordenada, generamos mapas de calor de ocupación espacial para visualizar la distribución acumulativa de las posiciones de las moscas dentro de la arena. Estos mapas de calor resumen la densidad de probabilidad de ubicaciones de las moscas a lo largo del tiempo y destacan regiones de ocupación preferencial. Las Figuras 4 y 5 presentan mapas de calor representativos para las moscas w1118 y Canton-S (CS). Las diferencias en los patrones de uso espacial entre las zonas central y periférica de ambos genotipos son fácilmente observables, reflejando tendencias distintas en la exploración de arenas y la preferencia de zonas.

Además de los patrones de ocupación, reconstruimos trayectorias locomotoras a partir de las series temporales de coordenadas para capturar dinámicas de movimiento a escala fina. Las trayectorias se generaban conectando las coordenadas bidimensionales de las moscas de cada fotograma sucesivo sin ningún suavizado. Las trayectorias mostradas en las Figuras 4 y 5 ilustran las trayectorias de movimiento individuales de las moscas w1118 y CS, revelando diferencias específicas del genotipo en rango de movimiento, complejidad de caminos y transiciones entre zonas de alta ocupación. En conjunto, los resultados de detección de puntos clave, los mapas de calor y las reconstrucciones de trayectorias demuestran que la cadena combinada de estimación de poses y análisis basado en coordenadas captura y diferencia eficazmente la estructura conductual de Drosophila que interactúa libremente entre genotipos.

También definimos la interacción social en cada marco basándonos en las coordenadas bidimensionales de cinco puntos clave anatómicos. Una pareja se consideraba socialmente comprometida cuando ambos criterios se cumplían simultáneamente: una distancia cabeza a cabeza de más de 0,5 mm pero menos de 20 mm, y una diferencia de orientación superior a 30°28,29,30,31. En consecuencia, medimos la proporción de tiempo dedicado a la interacción social para cada pareja (seis parejas por genotipo). Nuestro método puede medir de forma fiable el comportamiento social en las moscas, como se muestra en la Figura 6. Las proporciones sociales medias para las moscas W1118 y CS fueron de 0,270 ± 0,001 y 0,252 ± 0,005, respectivamente, en seis experimentos de réplica independientes, lo que sugiere una fuerte reproducibilidad entre diferentes grupos experimentales. También es coherente con el resultado de que no hay una diferencia significativa en la proporción social entre las dos cepas de moscas de tipo salvaje.

Figura 2: Resultados representativos de detección de puntos clave. La estimación automática de la pose identificó todos los puntos anatómicos clave predefinidos para cada mosca a través de los cuadros. Los marcadores superpuestos ilustran el seguimiento preciso de múltiples moscas durante interacciones sociales naturales. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Flujo de trabajo de análisis. El flujo de trabajo principal comprende preprocesamiento, preparación de datos, entrenamiento de modelos y validación, y finalmente produce coordenadas bidimensionales de Drosophila, seguidas de análisis basados en interfaz gráfica. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Mapa de calor representativo de actividad y trayectorias locomotoras de las moscas de w1118. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

El mapa de calor muestra la ocupación espacial acumulada dentro de la arena durante 10 minutos, revelando las zonas de actividad preferidas para cada mosca w1118. Las trayectorias superpuestas ilustran trayectorias de movimiento individuales reconstruidas a partir de series temporales de coordenadas.

Figura 5: Mapa de calor representativo de actividad y trayectorias locomotoras de las moscas Canton-S (CS). Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

El mapa de calor muestra la distribución de ocupación espacial de cada mosca CS durante la interacción libre durante 10 minutos. Las trayectorias reconstruidas destacan el rango de movimiento y la estructura de caminos, permitiendo comparar con los patrones de comportamiento de w1118.

Figura 6: Proporción social en moscas salvajes. Cuantificación del comportamiento social tras 10 minutos en la cámara. Para seis emparejamientos de cada genotipo en un pequeño espacio, para determinar el porcentaje de contacto social. Los valores de la razón social para las moscas W1118 y CS fueron 0,270 ± 0,001 y 0,252 ± 0,005, respectivamente. Los datos se presentan en media ± DS. Se realizaron comparaciones estadísticas utilizando una prueba t de Student de dos colas sin pareja. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Archivo suplementario 1. Todos los archivos de codificación necesarios para ejecutar el protocolo.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2. Aplicación GUI independientePor favor haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3. Requisitos de PythonPor favor haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Nuestro estudio muestra que la estimación de postura basada en aprendizaje automático proporciona un método escalable y fiable para medir interacciones sociales detalladas en Drosophila. Supera las limitaciones de los enfoques basados en^centroides 15,16,17,18 siguiendo cinco puntos clave anatómicos en pares que interactúan libremente, permitiendo la adquisición de información angular proporcionada por el eje corporal y la distancia cabeza a cabeza inferida de los puntos de la cabeza. Nuestra técnica puede reconstruir patrones de ocupación espacial y trayectorias de movimiento siguiendo las coordenadas del centroide de las moscas en cada fotograma de vídeo para obtener rutas de movimiento y utilizando puntos de referencia de cinco puntos para estimar la orientación de la cabeza. La detección estable de puntos clave observada tanto en las cepas w1118 como en Canton-S indica que la tubería es robusta a la variación natural en la dinámica del movimiento, proporcionando una base reproducible para la clasificación conductual posterior. Estas capacidades son esenciales para diseccionar los elementos motores de grano fino que codifican estados internos e información contextual en comportamientos^{sociales 8,9}.

Se comprobaron que varios factores metodológicos son esenciales para garantizar resultados consistentes. El calor e intensidad de iluminación del sistema de iluminación afectó significativamente la expresión conductual, coherente con hallazgos previos de factores ambientales que afectan la actividad social y locomotora de^{las moscas 32,33}. Los parámetros de imagen, incluyendo la distancia focal, el contraste y el gamma, que se ajustan empíricamente en nuestros experimentos, también afectaron la precisión de la estimación de la pose, alineándose con hallazgos previos de que los registros conductuales a alta velocidad requieren una calibración óptica cuidadosa para capturar movimientos^{rápidos 34,35}. La variabilidad conductual también se vio influenciada por los procedimientos de manipulación: la anestesia CO₂ resultó en cambios cuantificables en la interacción social y la locomoción, coherentes con publicaciones anteriores que mostraron cambios conductuales inducidos por^{la anestesia} 36,37,38. Este paso es especialmente crítico porque, cuando la anestesia es insuficiente, las moscas pueden recuperar la conciencia y escapar tras ser colocadas en la cámara; Por el contrario, con una anestesia adecuada, las moscas deben tener tiempo suficiente para recuperarse, ya que una aclimatación insuficiente reduce su motivación para moverse más tarde, lo que afectará gravemente a los análisis posteriores.

Incluso con la fortaleza del oleoducto, persisten varias limitaciones. La precisión de la estimación de pose es sensible a la calidad de las anotaciones, por lo que incluso pequeños errores de etiquetado pueden propagarse en distorsiones en trayectorias reconstruidas. Este problema ya se ha observado previamente en otros marcos de estimación de la^{pose 20,34}. Los cambios de dominio causados por cambios en la iluminación, la textura de fondo o la tensión de mosca pueden reducir el rendimiento del modelo, requiriendo reentrenamiento periódico o expansión del conjunto de datos. Además, los experimentos en los que no se detectan más del 5% de los marcos de puntos clave deben excluirse o incorporarse al refinamiento iterativo del modelo. También es necesario un control estricto de versiones (como se describe en el Archivo Suplementario 3) para la reproducibilidad computacional, ya que las salidas pueden resultar de diferencias en las dependencias del programa.

Las mejoras futuras pueden incluir procedimientos de calibración automatizados, estrategias de adaptación de dominios para mejorar la generalización del modelo en condiciones experimentales e integración de aprendizaje autosupervisado para reducir la necesidad de anotaciones manuales. La reproducibilidad entre laboratorios mejoraría aún más al estandarizar la notificación de parámetros de imagen, factores ambientales y entornos de entrenamiento de modelos. En conjunto, estos factores ponen de relieve las ventajas y desventajas de la cuantificación conductual basada en aprendizaje automático y ofrecen una hoja de ruta para mejorar aún más los enfoques de estimación de postura en los estudios de comportamiento social de Drosophila .

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	BioFroxx	8211GR500
cámara(MV-CU013-A0UC)	Hikvision	MV-CU013-A0UC
Dióxido de Carbono	Messer	124-38-9
D(+)-Glucosa anhidra	BioFroxx	1179GR500
Viales Estrechos Drosophila (tubo Falcon)	Biolgix	51-0500
Etanol	Chron Chemicals	64-17-5
Panel LED	/	/	hecho a medida
Metilparabeno	Sigma	99-76-3
placa de polietileno	/	/	hecho a medida
Python	/	versión 3.6
Sacarosa	DaMao	57-50-1
placas de acrílico transparente	/	/	hecho a medida
Levadura	Angel	100004237033