Producción a gran escala de vesículas extracelulares a partir de cultivos celulares 3D de alta densidad en biorreactores de perfusión de fibras huecas

Resumen

Se proporcionan instrucciones para montar y utilizar un biorreactor de fibras huecas de perfusión 3D para la producción de vesículas extracelulares a partir de MSC y otros tipos celulares. Este protocolo describe un método para producir vesículas extracelulares a altas concentraciones de forma continua, mientras se controla la densidad celular en biorreactores de fibras huecas.

Resumen

El progreso en el campo de la investigación de exosomas se ve obstaculizado por el bajo número celular y la baja productividad de los exosomas secretados en cultivos celulares tradicionales 2D. Los cultivos celulares de alta densidad en biorreactores de fibras huecas (HFBRs) permiten la producción continua de biomoléculas secretadas y vesículas extracelulares (EVs), a partir de un gran número de células, durante períodos prolongados y a altas concentraciones en cultivos 3D. Este protocolo describe la recopilación de exosomas secretados concentrados manteniendo la masa celular óptima y las condiciones de cultivo de perfusión 3D que apoyan el crecimiento celular de alta densidad durante varias semanas o meses de producción continua en un HFBR disponible comercialmente. El sistema es compacto, cerrado, de un solo uso, puede cumplir con cGMP, es sencillo de usar y cabe en una incubadora estándar de CO2. Ciertas células, como las células madre mesenquimales (MSC) y las células madre del líquido amniótico humano (HAFSCs), pueden mostrar una proliferación reducida bajo estas condiciones, lo que puede influir en la diferenciación y el fenotipo a lo largo del tiempo. Los resultados representativos demuestran rendimientos típicos de los EV y la viabilidad de las células durante semanas o más de producción continua. Este método proporciona cosechas reproducibles y de alta calidad de vehículos eléctricos, adecuadas tanto para aplicaciones de investigación como clínicas.

Introducción

Las vesículas extracelulares son cada vez más reconocidas por su papel en la comunicación intercelular y aplicaciones terapéuticas, incluida la medicina regenerativa. Los métodos tradicionales de cultivo celular 2D requieren mucho trabajo y tienen un rendimiento limitado, requiriendo a veces cientos de frascos de cultivo para obtener suficientes EVs para experimentos o estudios^{con animales 1,2}. La ampliación de la traducción clínica generalmente utiliza biorreactores tradicionales agitados que utilizan microportadores u otros soportes. Estos sistemas son inherentemente no fisiológicos, ineficientes y pueden tener resultados variables. Los biorreactores de fibras huecas proporcionan un entorno tridimensional basado en perfusión que soporta cultivos celulares de alta densidad dentro de una huella compacta y a una escala potencialmente adecuada para aplicaciones^{clínicas 3,4}.

Los HFBR ofrecen un sistema compacto de cultivo celular de alta densidad que permite la producción continua de vehículos eléctricos concentrados con menos mano de obra, tiempo y espacio en comparación con el cultivo tradicional^{2D 5}. Permiten cultivos celulares de alta densidad en un espacio compacto, apoyando la producción a gran escala de vehículos eléctricos en cualquier laboratorio. Los HFBR cultivan un gran número de células (1X10⁹ a 1×10¹⁰) en un volumen pequeño (20–60 mL), en una incubadora estándar de_CO2 , y no requieren ningún equipo especializado. Estos sistemas permiten cosechas continuas y concentradas de VE durante semanas o meses, al tiempo que facilitan el uso de sueros reducidos o medios definidos químicamente. En un HFBR, las células se retienen en el pequeño volumen del espacio capilar extra (ECS) separadas del medio recirculante por una membrana de fibra hueca semipermeable con un corte de peso molecular definido (MWCO) (Figura 1). Moléculas pequeñas como la glucosa y el lactato pueden cruzar fácilmente las fibras, mientras que elementos más grandes como anticuerpos o vesículas extracelulares se retienen y concentran en el SEC, donde pueden ser extraídos.

Tres características fundamentales diferencian el cultivo celular de fibras huecas de cualquier otro método: 1) la alta relación superficie-volumen (200 cm²/mL) permite densidades celulares in vivo, 1–2 × 10⁸células por mL. 2) Las células están unidas a un soporte poroso, no a un plato plástico no poroso. No es necesario dividir las^{celdas 3}. El corte de peso molecular (MWCO) de la fibra puede ser controlado. Los productos secretados se retienen y concentran entre 10 y 100 veces más en comparación con el cultivo de matrazas 2D dentro del ECS del cartucho. Además, matrices proteicas específicas, como la fibronectina o el colágeno, pueden aplicarse fácilmente a la superficie de la fibra sin afectar el flujo a través de las fibras.

HFBR proporciona un entorno de cultivo basado en perfusión 3D que es más similar al in vivo que el^{cultivo 2D 6} y reduce de forma única la dependencia de las células del soporte sérico y simplifica sus necesidades de medio. Este entorno de cultivo de alta densidad puede favorecer diferencias en el procesamiento de proteínas en comparación con el cultivo 2D, junto con una bioactividad aumentada ^{reportada 7,8,9}. Los biorreactores de fibra hueca son "histocéntricos"; Intentan imitar las propiedades tisulares de la fisiología celular in ^{vivo 10}. Las dos características clave de un biorreactor istocéntrico son 1) alta densidad celular, que permite a las células generar su propio microambiente específico, y 2) no se requiere la división ni el paso de las células, lo que permite que las interacciones célula a célula y las estructuras 3D como los esferoides se desarrollen orgánicamente con el tiempo. Este método permite densidades celulares difíciles de alcanzar con sistemas convencionales de cultivo 2D y puede facilitar el uso de medios simplificados, libres de proteínas y definidos químicamente.

Cualquier tipo de célula que pueda cultivarse en matrazas puede cultivarse en un biorreactor de fibras huecas. Las líneas celulares transformadas serán^{proliferativas 11}. El parámetro clave a monitorizar es la tasa de captación de glucosa. El monitoreo de glucosa proporciona una medida directa de la actividad metabólica, permitiendo optimizar el momento de la cosecha y controlar la densidad celular¹². Es importante controlar la masa celular dentro del cartucho para que la tasa de captación de glucosa no supere la capacidad del sistema para suministrar oxígeno y eliminar el^CO2. Esto se hace simplemente eliminando la masa celular durante la cosecha. Los MSC y HAFSC no proliferan en el biorreactor de fibra hueca, pero permanecen en reposo. Estas células requieren expansión antes de ser sembradas en el biorreactor. Sin embargo, una vez establecida la cultura, los VE pueden cosecharse continuamente durante semanas o meses. El fenotipo de la MSC no cambia durante 30 días de cultivo, salvo quizás la expresión de CD105, que disminuye durante este tiempo. Cuando los MSC del biorreactor fueron posteriormente placados en un matraz con un medio que contiene suero, la expresión de CD105 volvió a los niveles^{iniciales 13}. La expresión de CD105 puede servir como marcador para el cultivo de vs. 3D 2D. También se pueden utilizar técnicas de transfección transitoria para crear un¹⁴ transfectante cuasi-estable.

Ejemplos de las condiciones y ventajas más in vivo del cultivo celular de fibras huecas 3D incluyen modificaciones posttraduccionales completas y uniformes a lo largo del^{tiempo 15,16}, formación de vellosidades por epitelio gástrico para el cultivo de^{cryptosporidio 17}, hígado^{3D 18}, modelo¹⁹ de barrera hematoencefálica 3D, formación de esporozoíto de^{plasmodium 20} y co-cultivo de médula ósea/células^{madre 21}.

En HFBR, los EVs están altamente concentrados, con una contaminación reducida por proteínas intracelulares y fragmentos de membrana, ya que la lisis celular es limitada. Los biorreactores de fibras huecas son compatibles con cualquier medio, siempre que no haya componentes de alto peso molecular que no crucen las fibras. Si es necesario, estas moléculas grandes pueden añadirse directamente al ECS del biorreactor. Se prefieren medios con alta glucosa, como el DMEM. Medios de cultivo celular menos complejos y libres de proteínas pueden simplificar la purificación al reducir la carga proteica. Las células madre mesenquimales y las células madre del líquido amniótico humano se han cultivado en medios basales estándar y FBS, así como en varias formulaciones comerciales de medios MSC. HFBR puede producir cantidades de gramos de exosomas utilizando cartuchos comerciales. Un biorreactor de fibra hueca es un método útil para la producción a gran escala de exosomas bajo condiciones potenciales de cGMP y representa un cambio de paradigma en el avance tanto de la investigación de exosomas como de la traducción clínica.

El uso exitoso de un biorreactor de fibra hueca para la producción de vesículas extracelulares es altamente específico del protocolo. La manipulación del biorreactor, la densidad de siembra celular, la frecuencia de cosecha y el medio utilizado pueden contribuir a un funcionamiento exitoso del biorreactor. Este protocolo describe un método estandarizado para utilizar un biorreactor de fibra hueca para producir y recoger vesículas extracelulares de cultivos celulares de alta densidad. El objetivo es proporcionar un enfoque reproducible para la extracción de VE, incluyendo orientación sobre la configuración del sistema, inoculación celular, mantenimiento de cultivos y procedimientos de extracción. El método está destinado a apoyar una producción consistente de VE para aplicaciones de investigación y a proporcionar un marco que pueda adaptarse a diferentes tipos celulares y objetivos experimentales.

Protocolo

Todos los procedimientos cumplen con las directrices estándar de Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP) y Buenas Prácticas de Cultivo Celular y Tejido.

NOTA: El cartucho está preensamblado y esterilizado por gamma. Está en doble bolsa, y cada conexión tiene condensadores de luer, por lo que está completamente sellado y permanecerá estéril fuera de las bolsas. Véase la Figura 2 para la identificación del puerto del cartucho. Todos los pasos se realizaron a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar.

1. Preparación y esterilización de la tapa del embalse.

1. Retira los dos trozos cortos de tubo del cartucho con doble bolsa.
2. Sujeta la tubería a las púas de la manguera en la tubería de acero inoxidable de la tapa del depósito.
3. Envuelva el tubo corto y los extremos expuestos del tubo de acero inoxidable con papel de aluminio para mantener la esterilidad tras el autoclavado. Coloca los componentes ensamblados en una bolsa de autoclave.
4. Autoclave usando un ciclo seco a 121 °C durante 15–30 minutos. Deja que la tapa se enfríe a temperatura ambiente antes de usarlo.

2. Acopla el cartucho hueco de fibra a la botella del depósito

1. Transfiere 50 mL de PBS de una botella de 1 L a un tubo cónico de 50 mL para su uso posterior.
2. Quita la tapa del depósito de la bolsa del autoclave y quita el papel protector de los tubos largos de acero.
3. Quita la tapa de la botella PBS y atornilla la tapa del depósito en su lugar. Saca el cartucho de la bolsa interior estéril.
4. Quita el papel de aluminio de una de las piezas de tubo en la parte superior del tapón del depósito.
5. Quita la tapa luer de uno de los tubos largos del cartucho y colócala al tubo del depósito en la tapa del depósito. Usa un poco de efecto hacia atrás para evitar que se doblegue.
6. Repite para la segunda conexión de la tubería.
7. Aprieta suavemente el tubo marrón de la bomba para que el PBS se haga pasar por el sistema hasta que se eliminen todas las burbujas de aire.

3. Rellenar el espacio capilar extra (ECS)

1. Extrae 20 mL de PBS en una jeringuilla estéril usando una aguja de calibre grande de al menos 1,5" de longitud; Se prefiere una aguja roma por seguridad.
2. Desinfecta ambos accesorios de luer laterales con alcohol y déjalos secar.
3. Coloca la jeringuilla llena de PBS en un puerto lateral y una jeringuilla estéril vacía en el puerto opuesto. Cierra ambos puertos finales y abre ambos puertos laterales.
4. Inyecta PBS lentamente en el ECS manteniendo el cartucho en un ángulo leve para minimizar las burbujas de aire. La jeringuilla vacía en el puerto opuesto se llenará de aire.
5. Si hay aire en el ECS, abre el puerto final derecho y extrae líquido en la jeringuilla vacía hasta que el ECS se llene de líquido (esto extrae PBS del depósito, a través de las fibras y hacia el ECS).
6. Cierra las abrazaderas de los correderos de ambos puertos laterales, abre las abrazaderas de los dos extremos y verifica el flujo comprimiendo suavemente el tubo de la bomba con los dedos.
7. Deja las jeringuillas vacías sujetas a los puertos laterales para que sirvan como tapóns. Cambia las jeringuillas por otras nuevas cada vez que las hayan sacado de la campana de flujo laminar.

4. Recubriendo fibras e inoculación celular

NOTA: Los procedimientos para recubrir fibras con una proteína matriz específica y para inocular células son esencialmente los mismos. El exceso de líquido fluirá a través de las fibras y llegará al depósito, mientras que las células o el material de recubrimiento permanecerán en el exterior de las fibras en el ECS. Se recomienda 1 × 10^{8 celdas} para la siembra. Se recomienda 100–500 μg de proteína matriz en 20 mL de PBS para el HFBR de 4.000^cm. Las proteínas matricial unidas a superficies de fibra no afectan a MWCO

1. Preparar solución de recubrimiento o suspensión de celdas en un tubo cónico estéril de 50 mL. 1 x 108 células en un medio condicionado por expansión en matraz o proteína matriz de 100–500 ug en PBS. Volumen 20 mL.
2. Extrae 20 mL de células o solución de recubrimiento en una jeringuilla estéril usando una aguja de gran calibre.
3. Coloca la jeringuilla que contiene la solución en un puerto lateral y una jeringuilla estéril vacía en el otro puerto lateral.
4. Cierra ambos puertos finales y abre ambos puertos laterales.
5. Mezcla suavemente la solución transfiriendo el líquido entre las dos jeringuillas. Deja la mitad de la solución en cada jeringuilla. Cierra ambos puertos laterales.
6. Abre el puerto del extremo derecho y afloja la tapa del depósito 1/4 de vuelta.
7. Inyecta la solución de una jeringuilla en el ECS. Cierra el puerto lateral conectado.
8. Inyecta la solución de la otra jeringuilla. Cierra el puerto lateral conectado. Abre ambos puertos extremos.
9. Si se inocular las células, deja el cartucho en posición horizontal durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego gira 180° a lo largo del eje largo y déjalo reposar 30 minutos adicionales.
   1. Si recubres las fibras con proteína matricial, déjala pasar la noche a temperatura ambiente.
10. Coloca el cartucho en el sistema de bomba Duet e inicia el flujo a 25.

5. Preparación para la cosecha (véase la Figura 2)

1. Coloca una jeringuilla estéril vacía con una grifo de paso de 3 vías y un filtro estéril en el puerto lateral derecho.
2. Ajusta la llave de paso de 3 vías para permitir la ventilación a través del filtro estéril. Coloca una segunda jeringuilla estéril vacía en el puerto lateral izquierdo.

6. Recogida de medio acondicionado (Cosecha)

1. Abre el puerto derecho y mantén la ventilación estéril a través del filtro.
2. Inclina el extremo derecho del cartucho hacia arriba y retira el medio acondicionado (producto) hacia la jeringuilla izquierda. Drena completamente el contenido del ECS en la jeringuilla izquierda.
3. Cierra el puerto derecho. Cierra el puerto lateral izquierdo, retira la jeringuilla y recoge la cosecha en un tubo cónico de 50 mL.
4. Cambia la jeringuilla en el puerto izquierdo. Abre el puerto izquierdo. Abre el puerto derecho.
   Desatornilla la tapa del depósito 1/4 de vuelta.
5. Inclina el extremo izquierdo del cartucho hacia arriba y llena el ECS retirando la jeringuilla conectada al puerto lateral izquierdo. Llena completamente el ECS hasta que el menisco líquido esté en el centro del tubo del puerto lateral.
6. Cierra el puerto del extremo derecho. Abre el puerto derecho y ajusta la llave de paso de 3 vías para ventilar a través del filtro.
7. Abre el puerto izquierdo. Inclina el cartucho hacia la derecha y drena completamente el ECS en la jeringuilla izquierda.
8. Cierra el puerto izquierdo. Retira la jeringuilla y recoge el ECS extraído en el tubo cónico de 50 mL.
9. Coloca la jeringuilla en el puerto lateral izquierdo. Cierra el puerto derecho. Abre el puerto del extremo derecho
10. Inclina el lado izquierdo del cartucho hacia arriba y llena el ECS retirando la jeringuilla izquierda. Llena completamente el ECS hasta que el menisco líquido esté en el centro del tubo del puerto lateral.
11. Cierra el puerto izquierdo. Abre el puerto izquierdo. Aprieta la tapa del depósito.
12. Confirma el flujo del sistema comprimiendo manualmente la tubería de la bomba antes de devolver el cartucho a la bomba Duet.

7. Insertar el biorreactor en el sistema de bombeo.

1. Ajusta el caudal de la bomba a 25 en la caja de control. El cartucho es más fácil de instalar mientras la bomba está en marcha.
2. Agarra el borde derecho del soporte del camino de flujo. Deslízate el tubo de la bomba dentro del tubo de la bomba.
3. Deslica la base del camino de flujo hacia la ranura de la base de la bomba. Asegúrate de que la rejilla rectangular encaje en el recorte del soporte del camino de flujo.
4. Coloca la botella del depósito en la hendidura lateral de la base de la bomba.
5. El cable fino para la alimentación encaja entre la junta de la incubadora. La caja de control tiene un imán para fijarla en el lateral de la incubadora.

8. Monitorizar los niveles de glucosa

1. Con una pipeta de 1 mL, extrae una muestra de 1 mL de medio del frasco del depósito.
2. Mide la concentración de glucosa usando un medidor compatible colocando una pequeña gota del medio muestreado sobre la tira reactiva del medidor.

9. Cálculo de la tasa de captación de glucosa

NOTA: La tasa de captación de glucosa se calcula restando la medición de glucosa 24 horas después de la medición inicial. Dado que la tasa depende del volumen del yacimiento, multiplica la caída de la concentración de glucosa por el volumen del reservorio en litros. Por ejemplo, si hay 250 mL en la botella del depósito, multiplica por 0,25 (25%). (Glucosa1-Glucosa2) X (botella de depósito en litros). 250 mL son 0,25 L. Si ha transcurrido más de un día, divídelo por el número de días. Por ejemplo: Empezar con una glucosa de 4,5 g/L; Medir la glucosa 24 horas después: 2,7 g/L; botella del depósito: 250 mL. 4,5-2,7=1,8 g. 1,8X.25 (botella del depósito es 0,25 L), 0,45 g de glucosa consumida. La tasa de captación de glucosa es de 450 mg/día.

10. Comprobación de viabilidad

1. Recoge una pequeña muestra de células utilizando el protocolo de extracción.
2. Placar las células en un matraz de cultivo de T 25 con un suero fresco al 10% de suero. Evalúa visualmente el apego y la viabilidad.

11. Mantenimiento diario del cartucho y la primera semana de cultivo.

NOTA: Durante la primera semana de cultivo, las células proliferativas se expandirán hasta alcanzar su tasa objetivo de 1–2 gramos de glucosa consumida al día.

1. Día 0: Inocular las células, determinar la concentración inicial de glucosa a partir de la formulación del medio. Volumen inicial del depósito: 125 mL.
2. Día 1-2: Mide la glucosa cada día. Cuando la glucosa inicial esté agotada al 50%, sustituye el depósito de 125 mL por 250 mL de medio fresco y reduce el suero al 7,5%.
3. Días 3-4: Mide la glucosa. Cuando la glucosa inicial esté agotada en un 50%, sustituye el depósito de 250 mL por un medio fresco de 500 mL y reduce el suero al 5%.
4. Días 4-5: Mide la glucosa. Cuando la glucosa inicial esté agotada al 50%, sustituye 500 mL por 1 litro de medio fresco. Reduce el suero al 2,5% y cambia a medios definidos químicamente si lo deseas.
5. Día 6+: Mide la glucosa, cosecha de ECS. Controla la densidad celular cosechando para mantener la captación de glucosa entre 1 y 2 gramos al día.
6. Para las células no proliferativas, comienza con 125 mL en la botella del depósito y cambia el medio cada 3 días.
7. Si hay un consumo significativo de glucosa, aumenta el depósito a 250 mL. Retira el suero del ECS en los días 3-4 y retitúyelo por medio basal.

Resultados

Siguiendo este protocolo, un cartucho^{de 4.000 cm} 2 sembrado con líneas celulares proliferantes suele consumir entre 1 y 2 g de glucosa al día. Esto se traduce en 1 L de medio cada 2–3 días cuando se utiliza un medio de alta glucosa como el DMEM. Las células alcanzan la densidad máxima en menos de una semana tras la siembra. La extracción debe comenzar después de 5–7 días o cuando la tasa de captación de glucosa alcance 1 g por día y debería realizarse cada día, si es posible. Durante esta primera semana de cultivo, el medio que contiene suero en el ECS puede sustituirse por un medio basal libre de suero, manteniendo el suero en el medio circulante, si se requiere suero. Una vez que la tasa de captación de glucosa alcanza 1 g/día, puedes cambiar fácilmente a medios con reducción sérica u otros medios definidos químicamente. Los MSC y HAFSC consumen glucosa a un ritmo mucho menor que las líneas celulares transformadas, como CHO, 293 o híbridomas. La formación de esferoides es típica de MSC y HAFSC, junto con otros tipos celulares (Figura 3). El control diario de la glucosa proporciona una medida fiable de la salud del cultivo y la actividad metabólica. Se han utilizado con éxito medios estándar y comercialmente libres de xenos con MSC y HAFSC. Los volúmenes de cosecha son de unos 20 mL. Los intervalos de 24 horas entre cosechas son óptimos, ya que las concentraciones de EV alcanzan un máximo tras 24 horas (Figura 4). Las concentraciones típicas de exosomas en el medio cosechado oscilan entre 1–5 ×^10-12 partículas/mL, dependiendo del tipo de célula, el número de siembra celular y otros factores, y pueden dar lugar a pellets visibles tras la centrifugación (Figura 5). Se pueden sembrar grandes cantidades de células y deben basarse en el número de células, no en el área de cultivo (Figura 6).

Los resultados demuestran que la producción de VE se correlaciona con la actividad metabólica medida por el consumo de glucosa, proporcionando un parámetro práctico para monitorizar y optimizar el rendimiento del cultivo. La cosecha diaria a intervalos de 24 horas maximiza la concentración de EV manteniendo la estabilidad del cultivo. Estos hallazgos apoyan el uso de la monitorización de la glucosa y la frecuencia controlada de extracción como parámetros clave para la producción reproducible de VE en biorreactores de fibra hueca.

Figura 1: Sección transversal del biorreactor de fibra hueca. El medio fluye a través del interior de las fibras, y las células se adhieren a sus exteriores. Componentes de pequeño peso molecular, como la glucosa y el lactato, pueden cruzar fácilmente las fibras. Los productos secretados, como los EVs, no pueden cruzar las fibras y se concentran mucho en la zona exterior de las fibras, llamada ECS (espacio extracapilar). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Foto del cartucho con los puertos y abrazaderas identificados. Las válvulas de retención unidireccionales en el camino de flujo generan un flujo de recirculación del medio. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Las células madre mesenquimales, las células madre del líquido amniótico humano, los progenitores cardíacos y algunos otros tipos celulares formarán esferoides cuando se siembran en el cartucho en cantidades suficientes. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Medición de las concentraciones de EV tras diferentes cosechas en intervalos de tiempo. Tras 24 horas, la concentración de EV alcanza una concentración máxima. La cosecha óptima es después de 24 horas. (Datos cortesía de Paolo Neviani, núcleo EV, Hospital Infantil de Los Ángeles). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Extracción de una semana de vehículos eléctricos de células DIFI cultivadas en el biorreactor de fibra hueca C2011. EVs aislados por centrifugación diferencial. (datos cortesía de Jeff Franklin, Universidad de Vanderbilt)^18,19. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Un número sorprendentemente grande de células puede sembrarse en el biorreactor de fibra hueca. Los MSC ocupan gran parte de la cultura 2D; cuando se cultivan como esferoides en la cultura 3D, ocupan menos espacio. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

Los biorreactores de fibra hueca no pueden fabricar razonablemente proteínas o anticuerpos en cantidades comerciales reales. Sin embargo, tienen una capacidad única para cultivar un número relativamente grande de células a alta densidad y secretar un producto de EV concentrado a una escala clínicamente relevante. Solo en los últimos años se han reconocido las verdaderas ventajas de un biorreactor histocéntrico. Las condiciones de cultivo de perfusión de alta densidad resultan en EVs concentrados, utilizando medios compatibles con cGMP, en cantidades que pueden ser adecuadas para la investigación y posibles aplicaciones clínicas. Una sola cosecha de un 4.000^{cm 2} puede contener 5 × 10¹² a 1 × 10¹⁴ EVs en un volumen de 10–20 mL. Estos rendimientos están dentro del rango reportado en estudios que evalúan la dosificación de EV²².

El seguimiento diario de la tasa de captación de glucosa es un parámetro importante para evaluar el rendimiento del cultivo y es un indicador directo del metabolismo celular, el número celular y la salud. Generalmente, se prefieren medios de glucosa más altos, como el DMEM, que tiene una concentración inicial de glucosa de 4,5 g/L. El medio debe cambiarse a medio fresco cuando la glucosa esté consumida al 50%. Ciertas células, como las MSC, parecen consumir glucosa y producir lactato a concentraciones superiores a 3 g/L, para luego pasar a consumir glutamina y producir amoníaco a concentraciones inferiores a 3 g/L. Aún no se ha realizado un perfil metabólico completo de las MSC en cultivo 3D.

El parámetro más crítico para un cultivo exitoso de biorreactor es el número de inoculación celular. El número mínimo de células de inoculación para un biorreactor C2011 de 4.000 cm 2 es de 1 × 10⁸ celdas. Para células no proliferantes como MSC o HAFSC, se prefiere un número mayor, hasta 1 × 10^{9 células en} total. El volumen del depósito debe ser proporcional al número de celdas en el cartucho. 1 × 10^{8 celdas} deben usar un depósito no mayor que 125 ml. 1 × 10^{9 celdas} deben tener un depósito no mayor de 1 L. Un reservorio demasiado grande puede llevar a las células a la fase de retardo. Esto se caracteriza por la ausencia de consumo de glucosa por parte de las células, aunque estas son viables según la tinción con Trippan Blue. En este caso, reduce el volumen del reservorio o siembra más células. Puede ser necesario realizar inoculaciones múltiples para obtener suficientes números celulares para un cultivo biorreactor eficaz. Simplemente siembra más celdas encima de las que ya están en el cartucho. Al evaluar el rendimiento del biorreactor, observa el tamaño del inoculo celular. Un aumento de 10 veces en la siembra de celdas puede resultar en una producción de EV 10 veces mayor.

Las modificaciones al protocolo pueden incluir cambios en las formulaciones del medio, recubrimientos superficiales, número de células, volumen de cosecha, frecuencia de extracción o tamaño de la jeringa, dependiendo del tipo de célula y el rendimiento deseado. La cultura continua permite una optimización fácil y en tiempo real de las condiciones, ya que se pueden realizar cambios durante la cultura y obtener resultados en tiempo^{real 21}. La resolución de problemas debe centrarse en mantener la esterilidad y monitorizar la actividad metabólica. Asegúrate de que no haya obstrucciones ni pliegues en la tubería, especialmente alrededor de las abrazaderas de la corredera. La contaminación bacteriana provocará un consumo rápido de glucosa y turbia en la botella del depósito. La contaminación por hongos se indica mediante una acumulación blanca y esponjosa en el extremo izquierdo del cartucho, bloqueando el flujo. El uso del sistema de biorreactor de fibra hueca requiere un manejo hábil y una estricta adhesión a los protocolos. Los pasos críticos incluyen sembrar el número correcto de células, mantener la esterilidad durante la cosecha y controlar cuidadosamente el consumo de glucosa para evitar un crecimiento excesivo o el agotamiento de nutrientes. La mayoría de las células se unen a las fibras, a veces dependiendo de la matriz proteica recubierta de fibronectina, lo que facilita la rápida unión celular. Algunas células, como las MSC, HAFSC y progenitores cardíacos, permanecen unidas a fibras y forman esferoides 3D.

El sistema HFBR soporta cultivos de alta densidad, definidos químicamente y libres de xeno de la mayoría de los tipos celulares, facilitando la producción a gran escala de EV²³. El monitoreo diario de glucosa proporciona una métrica fiable para el rendimiento del biorreactor. El sistema cerrado, basado en perfusion, es compatible con los estándares cGMP, y es posible ampliar el tamaño usando cartuchos más grandes o incluso varios cartuchos. La producción de vehículos eléctricos a escala de gramo puede ser posible en condiciones óptimas. El biorreactor de fibra hueca proporciona una plataforma reproducible para la producción y recogida sostenida de vehículos eléctricos bajo condiciones controladas. El protocolo aquí descrito enfatiza consideraciones prácticas, incluyendo la configuración del sistema, el manejo aséptico y el monitoreo metabólico, para apoyar un funcionamiento consistente y resultados fiables. Podrían ser necesarios estudios adicionales para evaluar las características y propiedades funcionales de los VE bajo diferentes condiciones de cultivo y para comparar el rendimiento con sistemas de producción alternativos.

Este método es ampliamente aplicable para la investigación y la producción clínica de vehículos eléctricos, incluyendo medicina regenerativa y aplicaciones terapéuticas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
aguja de calibre 16 de 1.5"	Stellar Scientific	SOLM-111615
Válvula de tres vías, estéril	Cole-Parmer	UX-48523-28
jeringa con bloqueo luer de 20 ml	Becton Dickenson	302830
pipeta serológica de 25 ml, estéril	Stellar Scientific	TC50-TAU-25
Filtro de jeringa de 25 mm, estéril	Thomas Scientific	1162B74
Tapa de reservorio de 38 mm	FiberCell Systems	A1006
Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml	Stellar Scientific	T50-101-PK
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco de 500 mL	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Almohadillas de preparación de alcohol estéril CVS, 480 CT	CVS Pharmacy	Número de artículo 376560
Biorreactor de fibra hueca	FiberCell Systems	C2011
Fibronectina humana, 1 mg	Corning	354008