Este estudio investigó si la acupotomía promueve la reparación del cartílago en un modelo de conejo de osteoartritis de rodilla. Cincuenta conejos fueron asignados a cinco grupos. Se administró acupotomía semanalmente durante 4 semanas. Se evaluaron el hinchazón articular, la histopatología, los citoquinas inflamatorias y los marcadores relacionados con el eje circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK para explorar el mecanismo subyacente.
Artículo de investigación
La acupotomía regula el eje RIC8A/P38 MAPK basándose en el andamiaje de circRNA para promover la reparación del cartílago en la osteoartritis de rodilla
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La osteoartritis de rodilla (KOA) se caracteriza por la degeneración progresiva del cartílago y la inflamación. Este estudio investigó los efectos terapéuticos de la acupotomía en un modelo de conejo de KOA y su relación con el eje de señalización del ARN circular fosfodiesterasa 4B (circPDE4B)/resistencia a inhibidores de la colinesterasa 8A (RIC8A)/cinasa p38 activada por mitógenos (MAPK). Cincuenta conejos blancos de Nueva Zelanda se asignaron aleatoriamente a cinco grupos (n = 10 por grupo): control, modelo de KOA, celecoxib, acupotomía y acupotomía simulada. La KOA se indujo mediante el método modificado de Videman. A partir de las 6 semanas posteriores a la inducción del modelo, se administró acupotomía una vez por semana durante 4 semanas, mientras que el celecoxib se administró diariamente por vía de gavaje a una dosis de 24 mg/kg durante 4 semanas. Se evaluó la hinchazón de la rodilla y la histopatología del cartílago. Los niveles de interleucina-1β (IL-1β), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6) en homogeneizados de tejido cartilaginoso se midieron mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA). La expresión génica y proteica asociada al metabolismo del cartílago y al eje circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK se evaluó mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa y transferencia Western. En comparación con el grupo modelo de KOA, la acupotomía redujo la hinchazón de la rodilla, mejoró los puntajes histopatológicos, disminuyó los niveles de citocinas inflamatorias, redujo la expresión de la metaloproteasa de la matriz-3 (MMP-3), metaloproteasa de la matriz-13 (MMP-13), RIC8A y p38 MAPK fosforilada, y aumentó la expresión del factor de transcripción SRY-box 9 (SOX9), agregrecano y circPDE4B relativo. Sus efectos fueron comparables a los del celecoxib, mientras que la acupotomía simulada no produjo mejoría significativa. Estos hallazgos indican que la acupotomía alivia la inflamación y la degeneración del cartílago en la KOA del conejo y está asociada con la modulación del eje circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK.
Introducción
La osteoartritis de rodilla (KOA) es una enfermedad articular degenerativa prevalente caracterizada por la degradación progresiva del cartílago, inflamación sinovial, esclerosis del hueso subcondral y formación de osteofitos1,2,3. Con el envejecimiento de la población mundial, la incidencia de KOA continúa aumentando, convirtiéndola en una de las principales causas de disfunción articular y dolor crónico entre adultos de mediana edad y mayores a nivel mundial4,5,6. Los tratamientos clínicos actuales se centran principalmente en el alivio sintomático mediante agentes farmacológicos, como los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y las inyecciones intraarticulares de corticosteroides. Sin embargo, las terapias modificadoras de la enfermedad capaces de detener la progresión de la enfermedad o de promover la reparación del cartílago siguen siendo limitadas7,8.
Evidencia emergente ha destacado los importantes papeles reguladores de los ARN no codificantes (ncARN) en la patogénesis y progresión de la OA9,10,11. Entre estos ncARN, los ARN circulares (circARN) han atraído una atención creciente debido a su estructura única en bucle covalentemente cerrado, que les confiere mayor estabilidad que a los ARN lineales, así como a sus diversas funciones biológicas12,13. Shen et al. informaron que circPDE4B actúa como un andamio molecular que regula la resistencia a los inhibidores de la vía de señalización de la proteína reguladora de la resistencia a la colinesterasa 8A (RIC8A)/p38 quinasa activada por mitógenos (MAPK), influyendo así en el metabolismo de la matriz extracelular y en las respuestas inflamatorias de los condrocitos14. La vía RIC8A/p38 MAPK desempeña un papel importante en la regulación de la inflamación, el catabolismo, la apoptosis y la senescencia en los condrocitos, todos los cuales contribuyen a la patogénesis de la osteoartritis15.
La acupotomía es un enfoque terapéutico mínimamente invasivo que integra la teoría de la medicina tradicional china con principios anatómicos modernos y ha demostrado una eficacia prometedora en el manejo clínico de la OA de rodilla16,17. Esta técnica utiliza un dispositivo especializado de aguja-cuchillo para liberar adherencias del tejido blando, mejorar la circulación local y restablecer el equilibrio biomecánico alrededor de las articulaciones afectadas, aliviando así el dolor y mejorando la función en pacientes con OA de rodilla18. A pesar de estos beneficios clínicos reportados, los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos terapéuticos de la acupotomía, particularmente su posible regulación de las vías de señalización mediadas por circARN implicadas en la reparación del cartílago, permanecen en gran parte inexplorados.
Mecánicamente, la acupotomía genera estímulos mecánicos locales mediante la liberación del tejido blando periartricular. Los condrocitos son células mecanosensibles que responden a señales biomecánicas, y se ha demostrado que los circARN participan en las respuestas de transducción mecánica de los condrocitos19,20. Aunque falta evidencia directa que vincule la acupotomía con la regulación de circARN específicos del cartílago articular, es biológicamente plausible que las señales mecánicas generadas por la acupotomía puedan modular circARN mecanosensibles como circPDE4B. Esta posibilidad constituyó la base de la presente investigación.
Basándose en hallazgos previos sobre el papel regulador de circPDE4B en el eje de señalización RIC8A/p38 MAPK, el presente estudio utilizó un modelo de conejo de OA de rodilla inducida mediante el método modificado de Videman para probar la hipótesis de que la acupotomía promueve la reparación del cartílago mediante la modulación de la vía de señalización circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK. Se seleccionó la acupotomía para este estudio en lugar de otras intervenciones para la OA de rodilla por varias razones. Primero, en comparación con agentes farmacológicos como los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y el celecoxib, que principalmente proporcionan alivio sintomático y se han asociado con efectos limitados sobre la modificación de la enfermedad y posibles eventos adversos a largo plazo7,8, la acupotomía ofrece un enfoque no farmacológico que aborda tanto factores mecánicos locales como vías de señalización biológica. Segundo, a diferencia de las inyecciones intraarticulares de corticosteroides o ácido hialurónico, que requieren administración intraarticular repetida y conllevan riesgos de infección y daño articular, la acupotomía se dirige a los tejidos blandos periariculares y puede ejercer efectos biomecánicos y bioquímicos sostenidos21. Tercero, evidencia clínica ha demostrado que la acupotomía produce resultados comparables o superiores a las terapias convencionales en la reducción del dolor y la mejora de la función articular en pacientes con OA de rodilla, y estudios experimentales han sugerido que la acupotomía modula las respuestas inflamatorias y el metabolismo de los condrocitos21,22. Sin embargo, las vías moleculares específicas mediante las cuales la acupotomía ejerce sus efectos condroprotectores permanecen poco caracterizadas, particularmente en lo que respecta a la señalización mediada por circARN. Por lo tanto, investigar la asociación entre la acupotomía y el eje circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK podría proporcionar nuevas perspectivas mecanicistas y respaldar el uso de la acupotomía como intervención modificadora de la enfermedad para la OA de rodilla16,18. Los puntos finales primarios fueron la hinchazón de la articulación de la rodilla, la degeneración cartilaginosa histopatológica (puntuaciones de Mankin y Moran), los niveles de citocinas inflamatorias (interleucina-1β, factor de necrosis tumoral-α e interleucina-6), la expresión de marcadores relacionados con el metabolismo del cartílago (metaloproteasa de matriz-3, metaloproteasa de matriz-13, factor de transcripción SRY-box 9 y agregcano), así como la expresión de circPDE4B y RIC8A y la fosforilación de p38 MAPK. La acupotomía se administró una vez por semana durante 4 semanas en puntos periariculares seleccionados utilizando la técnica de cuatro pasos (liberación longitudinal, separación transversal y corte de nódulos). Se utilizaron evaluación histopatológica, medición de citocinas inflamatorias y análisis de expresión génica y proteica para caracterizar los efectos de la acupotomía y explorar su posible base molecular en la OA de rodilla.
Protocolo
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina China de Anhui (número de aprobación: AHUCM-rabbits-2023195). Los reactivos, productos químicos, software y herramientas utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de materiales.
1. Animales experimentales y agrupación
Cincuenta conejos machos adultos sanos de raza New Zealand White (6 meses de edad, con peso de 2,0 a 2,5 kg) fueron obtenidos de la Granja de Cría Laifu del Distrito Pukou de Nanjing (Licencia de Producción de Animales: SCXK (Su) 2024-0007). Todos los animales pasaron por un período de aclimatación de 1 semana antes del experimento. La rodilla derecha fue designada para la evaluación de hinchazón y la rodilla izquierda para la recolección de tejido cartilaginoso, según una convención procedural consistente, y no basada en una hipótesis experimental específica. Tras la aclimatación, los conejos fueron asignados aleatoriamente a cinco grupos (n = 10 por grupo): un grupo control, que no recibió procedimiento de modelado ni tratamiento; un grupo modelo de AOM, en el que se indujo la AOM mediante el método modificado de Videman; un grupo de celecoxib, en el que se inició el tratamiento con fármacos a las 6 semanas posteriores al modelado; un grupo de acupotomía, en el que se inició el tratamiento con acupotomía a las 6 semanas posteriores al modelado; y un grupo de acupotomía simulada, en el que se realizó la inserción de aguja sin corte ni aflojamiento, iniciado a las 6 semanas posteriores al modelado.
2. Establecimiento del modelo de OAQ
Todos los conejos, excepto los del grupo control, fueron sometidos al procedimiento modificado de Videman para inducir OAQ. Los animales fueron sometidos a ayuno durante 12 h antes de la cirugía. La anestesia se indujo mediante administración intravenosa de pentobarbital sódico al 3 % a una dosis de 30 mg/kg a través de la vena marginal de la oreja. Tras la preparación rutinaria del sitio quirúrgico, desinfección y colocación de campos estériles, se realizó una incisión longitudinal a lo largo de la cara medial de la articulación de la rodilla. Se seccionaron sucesivamente el ligamento colateral medial y el ligamento cruzado anterior, y se extirpó completamente el menisco medial. Luego, la incisión se cerró por capas.
Para reducir el riesgo de infección posoperatoria, se administró penicilina por vía intramuscular a una dosis de 40.000 U/kg/día durante 3 días consecutivos. Después de la cirugía, los conejos fueron devueltos a sus jaulas y se les permitió moverse libremente sin inmovilización articular.
3. Tratamiento con acupotomía simulada
A las 6 semanas posteriores al modelado de OA, los conejos del grupo de acupotomía simulada fueron sometidos a los mismos procedimientos de palpación y marcación de puntos utilizados en el tratamiento activo con acupotomía. Se insertó perpendicularmente una aguja estéril desechable de acupotomía de 0,35 mm × 25 mm a través de la piel en cada punto marcado hasta alcanzar el tejido subcutáneo. No se realizó corte, aflojamiento, manipulación transversal ni ninguna otra maniobra mecánica de liberación. La aguja se retiró inmediatamente después de la inserción, sin manipulación del tejido. El tratamiento simulado se administró una vez por semana durante 4 semanas consecutivas.
4. Tratamiento con acupotomía
A las 6 semanas después de la modelación de la OA rodilla, los conejos del grupo de acupotomía fueron inmovilizados sobre una mesa de tratamiento. Se palparon los tejidos periarticulares alrededor de la rodilla afectada, especialmente alrededor de la rótula y los espacios articulares medial y lateral, para identificar estructuras en forma de cuerda o nódulos duros. Se seleccionaron de cuatro a seis puntos de tratamiento según los hallazgos de la palpación y se marcaron sobre la piel.
El área de tratamiento se afeitó y desinfectó utilizando procedimientos estériles de rutina. Se insertó lentamente y de forma perpendicular una aguja desechable estéril de acupuntomía de 0,35 mm × 25 mm en cada punto marcado hasta alcanzar la superficie ósea. El procedimiento se realizó según la técnica de acupuntomía en cuatro pasos. Primero se realizó la liberación longitudinal, seguida de la separación transversal. Cuando se encontró un nódulo duro, se incidió hasta que se percibió una sensación de liberación clara a través del cuchillo-aguja. Después del procedimiento, se retiró la aguja y cada sitio de inserción se comprimió brevemente con gasa estéril y se cubrió con un apósito adhesivo. El tratamiento se administró una vez por semana durante 4 semanas consecutivas.
5. Tratamiento con fármacos
A las 6 semanas después del modelado de OA, los conejos del grupo de celecoxib recibieron una suspensión de celecoxib por sonda oral a una dosis de 24 mg/kg una vez al día durante 4 semanas consecutivas. La suspensión se preparó fresca cada día en solución salina fisiológica. La información del proveedor y del catálogo se proporciona en la Tabla de Materiales.
6. Evaluación de la hinchazón de la articulación de la rodilla
Al final del período de intervención, correspondiente a las 10 semanas posteriores a la modelización de la OA de rodilla, se evaluó la hinchazón de la articulación de la rodilla. Un hilo de seda suave se enrolló alrededor de la región más hinchada de la articulación de la rodilla derecha, generalmente a la altura de la meseta tibial. El hilo se retiró y se midió al milímetro más cercano con una regla, y la longitud registrada se definió como la circunferencia de la rodilla.
La proporción relativa de hinchamiento se calculó utilizando la siguiente ecuación:
7. Recolección de muestras
Al final del período de intervención, los conejos fueron anestesiados mediante administración intravenosa de pentobarbital sódico al 3 % a una dosis de 30 mg/kg a través de la vena marginal de la oreja. Se abrió la articulación de la rodilla izquierda utilizando una hoja de bisturí n.º 23 para exponer las superficies articulares del plateau tibial y los cóndilos femorales. Se recolectó tejido de cartílago articular de estas regiones.
Cada muestra de cartílago se dividió en dos porciones. Una porción se fijó en paraformaldehído al 4 % para el examen histopatológico. La segunda porción se colocó en tubos criogénicos, se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a −80 °C hasta que se realizaran los análisis moleculares. Inmediatamente después de finalizar todos los procedimientos de recolección de tejidos, los conejos fueron sacrificados mediante embolia aérea mediante inyección intravenosa rápida de aire a través de la vena marginal de la oreja.
Se realizaron tinciones histológicas y puntuaciones de Mankin y Moran utilizando muestras de cartílago de los 10 conejos por grupo (n = 10). Se seleccionaron imágenes representativas de hematoxilina y eosina y de Safranina O–Verde rápido de tres conejos seleccionados al azar por grupo. Se realizaron inmunohistoquímica y inmunotransferencia (Western blotting) utilizando muestras de tres conejos seleccionados al azar por grupo (n = 3). La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa y el ensayo inmunoenzimático (ELISA) se realizaron utilizando muestras de seis conejos seleccionados al azar por grupo (n = 6). Todas las selecciones de subgrupos se realizaron al azar sin conocimiento previo de las asignaciones de grupo.
8. Tinción con hematoxilina y eosina
El tejido de cartílago fijado en paraformaldehído al 4% se descalcificó en una solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 10% a pH 7,4 durante 4 a 6 semanas. La solución descalcificante se reemplazó cada 3 días. Una vez confirmada la descalcificación mediante la penetración con aguja, el tejido se deshidrató mediante una serie graduada de etanol del 70%, 80%, 90%, 95% y 100%, se aclaró en xileno e incluyó en parafina. El tejido incluido se seccionó a un grosor de 5 µm utilizando un microtomo, y las secciones se montaron sobre portaobjetos de vidrio.
Para la tinción con hematoxilina y eosina, los cortes se calentaron a 60 °C durante 60 min, se desparafinizaron en xilol con tres cambios de 5 min cada uno y se rehidrataron secuencialmente en etanol al 100%, 95%, 80% y 70%, seguido de agua destilada. Los cortes se tiñeron con hematoxilina durante 5 min, se enjuagaron bajo agua corriente durante 10 min, se diferenciaron en ácido clorhídrico al 1% preparado en etanol al 70% durante 2–3 s y luego se enjuagaron con agua destilada. A continuación, los cortes se tiñeron con eosina durante 2 min, se enjuagaron con agua destilada, se deshidrataron mediante etanol al 70%, 80%, 90%, 95% y 100%, se aclararon en xilol y se montaron con resina neutra. Se examinó la morfología del cartílago y se obtuvieron imágenes representativas utilizando un microscopio óptico.
9. Tinción con Safranina O–Verde rápido
Las secciones de cartílago embebidas en parafina se desparafinizaron e hidrataron como se describió en la sección 8. Las secciones se tiñeron con hematoxilina férrica de Weigert durante 5 min y se enjuagaron con agua destilada. A continuación, las secciones se tiñeron con solución de Verde rápido al 0,05 % durante 3 min, se enjuagaron brevemente en ácido acético al 1 % durante 10–15 s y se tiñeron con solución de Safranina O al 0,1 % durante 5 min.
Después de la tinción, las secciones se deshidrataron rápidamente en etanol al 95 % y al 100 %, se aclararon en xileno y se montaron con resina neutra. Las secciones teñidas se examinaron mediante microscopio óptico. La intensidad de la tinción con Safranina O, que refleja el contenido de proteoglicanos, se analizó de forma semicuantitativa utilizando software de análisis de imágenes.
10. Puntuación histológica
Dos patólogos, que desconocían las asignaciones a los grupos experimentales, evaluaron de forma independiente las secciones teñidas utilizando los sistemas de puntuación de Mankin y Moran para evaluar el grado de degeneración del cartílago. Antes de la evaluación, a todas las secciones se les asignaron códigos de identificación aleatorios. Las asignaciones de tratamiento no se revelaron a los patólogos hasta que se completó toda la puntuación23.
11. Ensayo inmunoenzimático
Se pesó el tejido de cartílago congelado, se combinó con solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4 y se homogenizó completamente sobre hielo. El homogenato se centrifugó a 3.000 × g durante 20 min a 4 °C, y se recogió el sobrenadante para su análisis. Las concentraciones de interleucina-1β (IL-1β), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6) en el sobrenadante tisular se midieron utilizando kits de ensayo inmunoenzimático específicos para conejo, según las instrucciones del fabricante.
12. Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa
Se extrajo ARN total del tejido cartilaginoso mediante un método basado en fenol–cloroformo. En resumen, el tejido se lisó en un reactivo de extracción de ARN, y se añadió cloroformo para separar las fases acuosa y orgánica. Se recolectó la fase acuosa, y el ARN se precipitó con isopropanol, se lavó con etanol al 75 %, se secó al aire y se disolvió en agua tratada con pirocarbonato de dietilo. La concentración y pureza del ARN se midieron utilizando un espectrofotómetro.
Antes de la transcripción inversa, se eliminó el ADN genómico residual utilizando un reactivo de eliminación de ADN genómico. Luego se sintetizó el ADN complementario utilizando un kit de transcripción inversa según las instrucciones del fabricante. Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa utilizando un método de detección basado en SYBR Green en un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 °C durante 1 min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 20 s y hibridación y extensión a 60 °C durante 1 min. Se realizó un análisis de la curva de disociación para evaluar la especificidad de la amplificación.
Se midieron los niveles de expresión de la metaloproteasa de la matriz-3 (MMP-3), metaloproteasa de la matriz-13 (MMP-13), factor de transcripción SRY-caja 9 (SOX9), agregacano, RIC8A y circPDE4B. Se utilizó β-actina como gen de referencia interno. La expresión relativa se calculó utilizando el método. Las secuencias de los cebadores se proporcionan en la Tabla 1.
13. Análisis por inmunotransferencia (Western blot)
El tejido cartilaginoso se lisó en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación suplementado con fluoruro de fenilmetilsulfonilo. El lisado se centrifugó a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C, y se recogió el sobrenadante como fracción total de proteína. La concentración de proteína se determinó mediante un ensayo de ácido bicinconínico.
Se separaron cantidades iguales de proteína (30 µg por carril) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10 % y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno previamente activadas en metanol. La transferencia se realizó a 300 mA y 4 °C. Los tiempos de transferencia fueron los siguientes: aggrecan (250 kDa) durante 90 min; MMP-3 (60 kDa), RIC8A (59 kDa), SOX9 (56 kDa) y MMP-13 (52 kDa) durante 50 min; y p38 MAPK (41 kDa) y GAPDH (36 kDa) durante 40 min. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5 % en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20, durante 2 h a temperatura ambiente. Luego, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra MMP-3 (1:2.000), MMP-13 (1:1.000), SOX9 (1:1.000), aggrecan (1:1.000), RIC8A (1:1.500), p38 MAPK fosforilada (1:1.000) y p38 MAPK total (1:2.000). GAPDH (1:2.000) se utilizó como control de carga. Tras tres lavados con solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 (10 min cada uno), las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (1:20.000) durante 1,2 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados adicionales, las bandas proteicas se visualizaron mediante un sustrato de quimioluminiscencia mejorada y se capturaron imágenes usando un sistema de documentación de geles. Las intensidades de las bandas se cuantificaron mediante el software ImageJ y se normalizaron respecto a GAPDH.
14. Inmunohistoquímica
Los cortes de cartílago embebidos en parafina se desparafinizaron y rehidrataron mediante una serie de etanol de concentración decreciente (tres cambios de xileno, 5 min cada uno; seguidos de etanol al 100%, 95% y 80%, 3 min cada uno). La recuperación de antígenos se realizó calentando los cortes en tampón de EDTA (pH 9,0) en una olla a presión. El tampón se calentó hasta ebullición y, tras la presurización, la recuperación continuó durante 2 min, seguido de enfriamiento a temperatura ambiente. La actividad peroxidasa endógena se bloqueó con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min a temperatura ambiente. Tras el lavado, la unión inespecífica se bloqueó con suero de cabra durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios contra p38 MAPK fosforilada (1:800) y factor nuclear kappa B (NF-κB) fosforilado (1:300) durante 60 min a 37 °C. Después de tres lavados con solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 20, las secciones se incubaron con los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante apropiados durante 30 min a 37 °C. Tras tres lavados adicionales, se utilizó diaminobencidina para el desarrollo del color (controlado bajo microscopio), seguido de contratincción con hematoxilina (2 min), diferenciación en ácido clorhídrico al 1% en etanol al 70% y revelado en solución de carbonato de litio (30 s). Luego, las secciones se deshidrataron, aclararon, montaron y examinaron mediante microscopía óptica. La tinción se evaluó utilizando el software ImageJ, y se calculó la densidad óptica integrada para el análisis semicuantitativo.
15. Análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± EE. Las comparaciones entre múltiples grupos se realizaron utilizando un análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey. Se consideró estadísticamente significativo un valor de P < 0,05.
Resultados
La acupotomía alivia las alteraciones histológicas en el cartílago articular
Como se muestra en la Figura 1A,B, la circunferencia de la rodilla y la proporción relativa de hinchazón aumentaron significativamente en el grupo modelo de OA comparado con el grupo control. Ambas medidas se redujeron significativamente tras el tratamiento con acupotomía o celecoxib, mientras que la acupotomía simulada no produjo una mejora significativa en comparación con el grupo modelo de OA.
Como se muestra en las Figuras 1C y 1D, el puntaje de Mankin fue significativamente mayor en el grupo modelo de OAQ que en el grupo control, y se redujo significativamente después del tratamiento con acupuntomía o celecoxib. No se observó una reducción significativa en el grupo de acupuntomía simulada. El puntaje de Moran mostró un patrón opuesto.
Las tinciones con hematoxilina y eosina y Safranina O–Verde rápido mostraron adelgazamiento e interrupción de la superficie del cartílago articular, con erosión localizada, en el grupo modelo de OA rodilla en comparación con el grupo control (Figura 1E,F). La acupotomía y la celecoxib mejoraron estos cambios patológicos, como lo indica un contorno del cartílago más definido y una reducción del daño estructural. En contraste, el grupo de acupotomía simulada mostró características patológicas similares a las del grupo modelo de OA rodilla. Estos hallazgos indican que la acupotomía produjo efectos comparables a los de la celecoxib en la reducción de la hinchazón articular y la degeneración del cartílago, y en la mejora de los puntajes histológicos en el modelo de OA rodilla.
La acupotomía reduce los niveles de citocinas inflamatorias
Como se muestra en la Figura 2A–C, las concentraciones de interleucina-1β (IL-1β), factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) e interleucina-6 (IL-6) en homogeneizados de tejido cartilaginoso fueron significativamente más altas en el grupo modelo de OAQ que en el grupo control. El tratamiento con acupotomía o celecoxib redujo significativamente los niveles de las tres citocinas inflamatorias. En contraste, el grupo de acupotomía simulada no mostró una reducción significativa en comparación con el grupo modelo de OAQ.
La acupotomía modula la vía de señalización RIC8A/p38 MAPK a nivel proteico
El análisis inmunohistoquímico mostró que la expresión de la proteína quinasa activada por mitógenos p38 fosforilada (p-p38 MAPK) y del factor nuclear kappa B fosforilado (NF-κB) era significativamente menor en los grupos de acupotomía y celecoxib en comparación con el grupo modelo de artrosis de rodilla (KOA) (Figura 3A). No se observó diferencia significativa entre los grupos de acupotomía simulada y el grupo modelo de KOA.
El análisis por inmunotransferencia mostró que los niveles proteicos de la metaloproteasa matricial-3 (MMP-3), metaloproteasa matricial-13 (MMP-13), resistencia a inhibidores de colinesterasa 8A (RIC8A) y p-p38 MAPK fueron significativamente más altos en el grupo modelo de OA de rodilla (KOA) que en el grupo control, mientras que los niveles de las proteínas relacionadas con la síntesis del cartílago, factor de transcripción SRY-box 9 (SOX9) y agregcan, fueron significativamente más bajos. En comparación con el grupo modelo de OA de rodilla, los grupos tratados con acupotomía y celecoxib mostraron una expresión reducida de MMP-3, MMP-13, RIC8A y p-p38 MAPK, y un aumento en la expresión de SOX9 y agregcan. El grupo de acupotomía simulada presentó patrones de expresión proteica similares a los del grupo modelo de OA de rodilla, sin cambios significativos en las proteínas analizadas (Figura 3B–I). Estos hallazgos indican que los efectos de la acupotomía y del celecoxib sobre la OA de rodilla estuvieron asociados con la modulación de la vía de señalización RIC8A/p38 MAPK.
La acupotomía modula la vía de señalización RIC8A/p38 MAPK a nivel transcripcional
Como se muestra en la Figura 4A–G, los niveles de expresión de MMP-3, MMP-13 y RIC8A fueron significativamente más altos en el grupo modelo de OA de rodilla que en el grupo control, mientras que la expresión de SOX9 y agregrecano fue significativamente más baja. En comparación con el grupo modelo de OA de rodilla, la acupotomía y la celecoxib redujeron la expresión de MMP-3, MMP-13 y RIC8A, y aumentaron la expresión de SOX9 y agregrecano. El grupo de acupotomía simulada no mostró diferencias significativas respecto al grupo modelo de OA de rodilla en los niveles transcripcionales medidos.
El acupotomía también aumentó la expresión relativa de circPDE4B, lo que indica que sus efectos terapéuticos se asociaron con la modulación del eje de señalización circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK y con una reducción de la señalización inflamatoria y catabólica.
DISPONIBILIDAD DE LOS DATOS :
Los datos brutos que respaldan los hallazgos de este estudio, incluidos los datos de ELISA, tinción H&E, inmunohistoquímica, RT‑qPCR, tinción Safranina O–Verde rápido y western blot, están disponibles públicamente en el repositorio Figshare en https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33090935.
Figura 1. La acupotomía reduce la hinchazón de la rodilla y la degeneración del cartílago articular en conejos con osteoartritis de rodilla. (A) Circunferencia de la rodilla. (B) Relación relativa de hinchazón de la rodilla. (C) Puntuación histológica de Mankin. (D) Puntuación histológica de Moran. (E) Secciones representativas teñidas con hematoxilina y eosina del cartílago articular de los grupos control, modelo de OA de rodilla (KOA), celecoxib, acupotomía y acupotomía simulada. (F) Secciones representativas teñidas con Safranina O–Verde rápido de los cinco grupos experimentales. La puntuación histológica (Mankin y Moran) se realizó utilizando muestras de los 10 conejos por grupo (n = 10), mientras que las imágenes representativas de las tinciones con H&E y Safranina O–Verde rápido se obtuvieron de 3 conejos seleccionados al azar por grupo. Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante análisis de varianza de un solo factor seguido de la prueba post hoc de Tukey. Las barras horizontales indican los grupos comparados. P < 0,05, P < 0,01 y P < 0,001. Barras de escala: 100 µm. Abreviaturas: KOA = osteoartritis de rodilla; SEM = error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La acupotomía reduce los niveles de citocinas inflamatorias en conejos con osteoartritis de rodilla. (A) Concentración de interleucina-1β. (B) Concentración de interleucina-6. (C) Concentración de factor de necrosis tumoral-α. Las concentraciones de citocinas se midieron mediante ensayo inmunoenzimático en muestras de seis conejos por grupo (n = 6). Los datos se presentan como media ± error estándar de la media. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey. Las barras horizontales indican los grupos comparados. P < 0,05, P < 0,01 y P < 0,001. Abreviaturas: IL-1β = interleucina-1β; IL-6 = interleucina-6; KOA = osteoartritis de rodilla; SEM = error estándar de la media; TNF-α = factor de necrosis tumoral-α. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La acupotomía modula proteínas relacionadas con la inflamación y el metabolismo del cartílago en conejos con osteoartritis de rodilla. (A) Imágenes inmunohistoquímicas representativas que muestran la expresión de factor nuclear kappa B fosforilado y proteína quinasa activada por mitógenos p38 fosforilada en el cartílago articular de los grupos control, modelo de OA de rodilla, celecoxib, acupotomía y acupotomía simulada. Barras de escala, 100 µm. (B) Inmunotransferencias representativas que muestran la expresión de SOX9, RIC8A, MMP-13, p38 MAPK fosforilada, p38 MAPK total, MMP-3, agregcan y GAPDH. (C) Cuantificación densitométrica de agregcan normalizada respecto a GAPDH. (D) Cuantificación de MMP-13 normalizada respecto a GAPDH. (E) Cuantificación de MMP-3 normalizada respecto a GAPDH. (F) Cuantificación de p38 MAPK total normalizada respecto a GAPDH. (G) Cuantificación de p38 MAPK fosforilada normalizada respecto a GAPDH. (H) Cuantificación de SOX9 normalizada respecto a GAPDH. (I) Cuantificación de RIC8A normalizada respecto a GAPDH. Los análisis por inmunotransferencia se realizaron utilizando muestras de tres conejos por grupo (n = 3). Los datos se presentan como media ± EE. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey. Las barras horizontales indican los grupos comparados. P < 0,05, P < 0,01 y P < 0,001. Abreviaturas: GAPDH = deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato; KOA = osteoartritis de rodilla; MAPK = proteína quinasa activada por mitógenos; MMP-3 = metaloproteasa de la matriz 3; MMP-13 = metaloproteasa de la matriz 13; NF-κB = factor nuclear kappa B; p-NF-κB = factor nuclear kappa B fosforilado; p-p38 MAPK = p38 MAPK fosforilada; RIC8A = resistencia a inhibidores de colinesterasa 8A; EE = error estándar de la media; SOX9 = factor de transcripción SRY-caja 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. La acupotomía modula los transcritos relacionados con el metabolismo del cartílago y la expresión de circPDE4B en conejos con osteoartritis de rodilla. (A) Expresión relativa de agrecano. (B) Expresión relativa de MMP-3. (C) Expresión relativa de MMP-13. (D) Expresión relativa de p38 MAPK. (E) Expresión relativa de SOX9. (F) Expresión relativa de circPDE4B. (G) Expresión relativa de RIC8A. La expresión se midió mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa y se normalizó respecto al gen de referencia. Los análisis se realizaron utilizando muestras de seis conejos por grupo (n = 6). Los datos se presentan como media ± EE. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey. Las barras horizontales indican los grupos comparados. P < 0,05, P < 0,01 y P < 0,001. Abreviaturas: circPDE4B = ARN circular fosfodiesterasa 4B; KOA = osteoartritis de rodilla; MAPK = quinasa activada por mitógenos; MMP-3 = metaloproteasa de la matriz 3; MMP-13 = metaloproteasa de la matriz 13; RIC8A = resistencia a inhibidores de colinesterasa 8A; EE = error estándar de la media; SOX9 = factor de transcripción SRY-caja 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Gen | Tamaño del amplicón | Primer sentido | Primer antisentido |
| (pb) | (5'→3') | (5'→3') | |
| β-actin | 113 | CAGCCCTCCTTCATCGGTAT | GACATGACGTTGTTGGCGTA |
| MMP-3 | 108 | TGTGAGTTGAAGTGGCTCAT | CCTGTTTGAACACCCGTAAC |
| MMP-13 | 119 | GGCTCCTAGGCAAGTACAAT | GTGTACGCCCATCAGGATAA |
| SOX9 | 85 | GGAGGAAGTCGGTGAAGAAT | GCCTTGAAGATGGCGTTG |
| Aggrecan | 70 | TTGATGAGTGCCTTTCAAGC | CATGTGAAAGAGTCGATGGC |
| RIC8A | 100 | ATAAACTTTCCAGAGAGGAGTTGC | TCGATGACAGAGTACTGGTTG |
| p38 MAPK | 103 | TGTTCAAGGTCTCCCACAAG | TGCAGCTCCCTTATGATCTG |
| CircPDE4B | 174 | GTCATTTTGCCGAACTCCC | CATTATCATCTGCCGTCACTG |
Tabla 1: Secuencias de cebadores utilizadas para la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa. La tabla enumera los genes diana, los tamaños esperados de los amplicones, y las secuencias de los cebadores directo e inverso en la dirección 5′ a 3′. Abreviaturas: bp = pares de bases; circPDE4B = ARN circular fosfodiesterasa 4B; MAPK = cinasa activada por mitógenos; MMP-3 = metaloproteasa de matriz-3; MMP-13 = metaloproteasa de matriz-13; RIC8A = resistencia a inhibidores de colinesterasa 8A; SOX9 = factor de transcripción caja SRY 9.
Discusión
Este estudio evaluó los efectos terapéuticos de la acupotomía en un modelo de conejo de osteoartritis de rodilla (KOA) e identificó una asociación entre la expresión de circPDE4B y el eje de señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos RIC8A/p38 (MAPK). La acupotomía mejoró la hinchazón articular y los cambios histopatológicos, y alteró los marcadores relacionados con la inflamación y el metabolismo del cartílago a nivel transcripcional y proteico.
La reducción de interleucina-1β, factor de necrosis tumoral-α e interleucina-6 tras el tratamiento con acupuntomía fue consistente con los efectos inmunomoduladores previamente descritos de la acupuntomía21. Estas citocinas contribuyen a la degeneración del cartílago al promover enzimas degradadoras de la matriz y suprimir la síntesis de la matriz extracelular22,24,25. Las reducciones simultáneas de metaloproteasa de la matriz-3 (MMP-3) y metaloproteasa de la matriz-13 (MMP-13) a nivel de transcritos y proteínas sugieren además que la acupuntomía suprime la actividad catabólica asociada con la OA.
Un hallazgo notable fue la asociación entre los cambios inducidos por la acupotomía en la expresión de circPDE4B y la modulación de la vía RIC8A/p38 MAPK. La activación anormal de esta vía se asocia con inflamación, estrés oxidativo y degradación de la matriz extracelular. Las reducciones en la expresión de RIC8A y la fosforilación de p38 MAPK tras la acupotomía sugieren que el tratamiento podría ayudar a restablecer el equilibrio de señalización dentro de esta vía. Los cambios coordinados en los marcadores relativos de circPDE4B y de la vía RIC8A/p38 MAPK son coherentes con la hipótesis de que circPDE4B podría funcionar como un andamiaje molecular, como se ha propuesto previamente26,27. Sin embargo, los hallazgos actuales son correlativos y no establecen que circPDE4B medié los efectos terapéuticos de la acupotomía. Se requieren estudios de pérdida y ganancia de función para determinar la causalidad.
La posible asociación entre acupuntomía y la regulación de circARN es un aspecto importante de este estudio. Se ha demostrado que la estimulación mecánica influye en la expresión de circARN en varios tejidos28,29,30,31. Sin embargo, la evidencia directa que vincule la estimulación mecánica inducida por acupuntomía con la regulación de circARN específicos del cartílago articular sigue siendo limitada. El cambio observado en la expresión relativa de circPDE4B tras el tratamiento podría reflejar ya sea una respuesta directa a la estimulación mecánica o una respuesta indirecta a la reducción de la inflamación. Estudios futuros que combinen una estimulación mecánica controlada con la manipulación específica de circPDE4B en condrocitos ayudarían a distinguir entre estas posibilidades.
La acupotomía y el celecoxib produjeron tendencias similares en muchos resultados medidos a pesar de sus modos de acción distintos. Varias explicaciones pueden justificar esta convergencia. Primero, ambos tratamientos podrían actuar sobre vías compartidas descendentes, incluyendo el eje RIC8A/p38 MAPK y la señalización del factor nuclear kappa B. Segundo, las similitudes observadas podrían reflejar características comunes de la protección del cartílago más que efectos específicos de una vía determinada. Tercero, los marcadores seleccionados podrían representar puntos finales comunes de la inflamación y del metabolismo del cartílago, y por lo tanto podrían ser insuficientes para distinguir entre mecanismos ascendentes diferentes. Una eficacia similar no implica mecanismos idénticos, pero sugiere que ambas intervenciones podrían afectar componentes comunes de la red patológica de la osteoartritis26,32,33. Enfoques imparciales, como el perfilado transcriptómico o proteómico, podrían ayudar a definir firmas moleculares específicas del tratamiento.
Los efectos comparables del acupotomía y el celecoxib también podrían tener relevancia clínica. La acupotomía podría ofrecer una opción de tratamiento no farmacológica que aborde factores mecánicos periartriculares, al tiempo que evita algunos efectos adversos asociados con el uso prolongado de medicamentos. Sin embargo, esta interpretación debe abordarse con precaución, ya que el modelo de conejo no captura completamente la complejidad de la OA de rodilla humana. Se necesitan más estudios traslacionales y clínicos antes de que estos hallazgos preclínicos puedan respaldar una aplicación clínica más amplia.
Se deben reconocer varias limitaciones. Primero, no se evaluó mediante experimentos de pérdida o ganancia de función la asociación entre circPDE4B y el eje RIC8A/p38 MAPK. Segundo, el modelo en conejo y el período de tratamiento de 4 semanas limitan las conclusiones respecto a la enfermedad humana y los resultados a largo plazo. Tercero, los ensayos moleculares utilizaron subconjuntos relativamente pequeños de animales, lo cual pudo haber limitado la detección de diferencias sutiles entre los grupos. Cuarto, el panel de marcadores seleccionado podría no distinguir mecanismos upstream específicos del tratamiento. Finalmente, las respuestas similares a la acupotomía y a la celecoxib requieren mayor investigación para determinar si ambas intervenciones actúan a través de vías convergentes o independientes.
Conclusión
La acupotomía redujo la hinchazón articular, los niveles de citocinas inflamatorias, la degeneración del cartílago y la expresión de marcadores catabólicos en un modelo de conejo de OA de rodilla. Estos efectos se asociaron con cambios en la expresión relativa de circPDE4B y la modulación del eje de señalización RIC8A/p38 MAPK. Dado que los hallazgos actuales son correlativos, se requieren estudios mecanicistas adicionales para determinar si circPDE4B media directamente los efectos terapéuticos de la acupotomía.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros competitivos ni relaciones personales que pudieran haber influido en el trabajo descrito en este artículo.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.º de beca 81774436), el Proyecto de Transformación de Investigación Clínica de la Provincia de Anhui (n.º de beca 202427b10020136), el Proyecto de Investigación Científica del Departamento de Educación de la Provincia de Anhui (n.º de beca 2023AH050824), el Programa de Investigación en Salud de Anhui (n.º de beca AHWJ2023A30123) y el Proyecto de Investigación de Herencia e Innovación de la Asociación de Medicina Tradicional China de Anhui (n.º de beca 2024ZYYXH153).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Peróxido de hidrógeno al 3% | Fuzhou Maixin Biotech | SP kit-A3 | Inhibe la actividad de peroxidasa endógena durante la inmunohistoquímica. |
| Paraformaldehído al 4% | Biosharp | BL539A | Fija el tejido cartilaginoso antes de la descalcificación y el procesamiento histológico. |
| Ácido acético | Merck | A6283 | Utilizado para preparar ácido clorhídrico al 1% en etanol al 70% |
| Curitas adhesivas | Zhejiang Renkang | RK-8802 | Utilizadas tras la acupotomía. |
| Anticuerpo contra agregcano | Proteintech | 13880-1-AP | Anticuerpo primario utilizado para detectar agregcano en extractos proteicos de cartílago. |
| Etileno anhidro | Sinopharm Chemical Reagent | 10009228 | Utilizado para la deshidratación del tejido y la rehidratación de cortes durante el procesamiento histológico. |
| Kit de ensayo de proteínas BCA | Thermo Fisher Scientific | A55860 | Utilizado para determinar la concentración de proteína. |
| Celecoxib | Biochempartner | BCP02156 | Tratamiento farmacológico de referencia administrado por gavaje oral. |
| Centrífuga | Anhui Jiawen Instruments | JW-3021HR | Utilizada para clarificar lisados y homogeneizados de tejido mediante separación centrífuga. |
| Cloroformo | Nanjing Reagent | 67-66-3 | Utilizado para la separación de fases durante la extracción total de ARN. |
| Tampón de citrato, pH 6,0 | ZSGB-BIO | ZLI-9065 | Utilizado para la recuperación de antígenos inducida por calor antes de la inmunohistoquímica. |
| Criotubos | NEST Biotechnology | 607001 | Utilizados para el almacenamiento de muestras congeladas |
| Sustrato DAB | Fuzhou Maixin Biotech | Kit-5230 | Sustrato cromogénico utilizado para la visualización de señales inmunohistoquímicas marcadas con HRP. |
| Agua tratada con DEPC | Generay Biotech | D1007 | Agua libre de RNasas utilizada para la disolución de ARN y procedimientos de biología molecular. |
| Aguja desechable de acupotomía, 0,35 mm × 25 mm | Ma'anshan Bond Medical Equipment | GB3525R | Aguja-cuchillo estéril utilizada para procedimientos de acupotomía y acupotomía simulada. |
| EDTA | biosharp | BL617A | Utilizado para preparar la solución de descalcificación para tejidos que contienen cartílago. |
| Sustrato de quimioluminiscencia mejorado | Thermo 340958 | 340958 | Utilizado para visualizar bandas de inmunotransferencia (Western blot). |
| Solución de eosina | Zhuhai Beso | BA4022 | Contratinción utilizada en la tinción con hematoxilina y eosina. |
| Solución de verde rápido | Solarbio | G1371 | Contratinción utilizada en la tinción de Safranina O–Verde rápido. |
| Anticuerpo contra GAPDH | Zsbio | TA-08 | Utilizado como control de carga en inmunotransferencia (Western blot), aunque actualmente no está listado. |
| Sistema de imagen de geles | Shanghai Peiqing Technology | JS-1070P | Captura imágenes quimioluminiscentes de inmunotransferencias (Western blot). |
| Portaobjetos de vidrio | CITOTEST | 188105 | Utilizados para montar cortes |
| Anticuerpo secundario conjugado con HRP, anti-IgG de cabra procedente de ratón | ZSGB-BIO | ZB-2305 | Anticuerpo secundario conjugado con HRP para anticuerpos primarios de ratón. |
| Anticuerpo secundario conjugado con HRP, anti-IgG de cabra procedente de conejo | ZSGB-BIO | ZB-2301 | Anticuerpo secundario conjugado con HRP para anticuerpos primarios de conejo. |
| Suero de cabra | ZSGB-BIO | ZLI-9056 | Inhibe la unión inespecífica de anticuerpos durante la inmunohistoquímica. |
| GraphPad Prism, versión 10 | GraphPad Software | No aplicable | Utilizado para análisis estadístico y preparación de gráficos. |
| Solución de hematoxilina | Zhuhai Beso | BA4041 | Tinción nuclear utilizada en la tinción con hematoxilina y eosina y en la contratinción inmunohistoquímica. |
| Homogeneizador | Witeg | SGCR-5-553-722 | Homogeneiza tejido cartilaginoso para ensayos ELISA y moleculares. |
| Ácido clorhídrico | Merck | 7607 | Utilizado para preparar ácido clorhídrico al 1% en etanol al 70% |
| Software Image Lab | Bio-Rad | No aplicable | Utilizado para el análisis densitométrico de bandas de inmunotransferencia (Western blot). |
| Image-Pro Plus, versión 6.0 | Media Cybernetics | No aplicable | Utilizado para el análisis semicuantitativo de la intensidad de tinción con Safranina O. |
| Isopropanol | Sinopharm Chemical Reagent | SCR40007960 | Utilizado para precipitar ARN durante la extracción total de ARN. |
| Microscopio óptico | Olympus | CX41 | Utilizado para examinar e imaginar cortes de cartílago teñidos. |
| Rotulador médico | edding | 497985 | Utilizado para marcar puntos de tratamiento |
| Metanol | Shanghai Suyi | 20180427 | Utilizado para activar la membrana de PVDF |
| Microtomo | Leica | RM2016 | Corta tejido embebido en parafina en secciones de 5 µm. |
| Anticuerpo contra MMP-13 | Bioss | bs-0575R | Anticuerpo primario utilizado para detectar metaloproteasa de matriz-13. |
| Anticuerpo contra MMP-3 | Bioss | bs-43017R | Anticuerpo primario utilizado para detectar metaloproteasa de matriz-3. |
| Resina neutra | Wuxi Jiangyuan | ZLI-9516 | Medio de montaje utilizado para la preparación permanente de cortes teñidos de tejido. |
| Conejos blancos de Nueva Zelanda (machos, 6 meses de edad, peso entre 2,0–2,5 kg) | Granja de cría de Pukou, Distrito de Nanjing | SCXK (Su) 2024-0007 | Animales experimentales utilizados para la modelización de osteoartritis de rodilla y evaluación del tratamiento. |
| Cuchilla de bisturí número 23 | Caisson | SCX08-100PC | Utilizada durante la recolección de muestras. |
| Leche en polvo descremada | Gene | 9999S | Utilizada como reactivo bloqueante. |
| Anticuerpo contra p38 MAPK | Bioss | bs-0637R | Anticuerpo primario utilizado para detectar p38 MAPK total. |
| Parafina | Thermo | 8330 | Utilizada para el embebido de tejidos |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | Utilizado para la homogeneización del tejido, lavado y preparación de reactivos. |
| Penicilina | Jilin Huamu Animal Health Products | No aplicable | Utilizada postoperatoriamente a 40.000 U/kg/día |
| Pentobarbital sódico | Beijing Chemical Reagents | 61222 | Utilizado para anestesia al 3%, 30 mg/kg. |
| Solución salina tamponada con fosfato | beyotime | ST448 | Utilizada para la homogeneización del tejido y el lavado durante la inmunohistoquímica. |
| Solución salina fisiológica | servicevio | G4702 | Utilizada para preparar la suspensión de celecoxib |
| PMSF | Beyotime | ST506 | Inhibidor de proteasas añadido al tampón de lisis durante la extracción de proteínas. |
| Anticuerpo contra p-NF-κB | Santa | sc-136548 | Anticuerpo primario utilizado para detectar p-NF-κB en análisis inmunohistoquímicos. |
| Anticuerpo contra p-p38 MAPK | Bioss | bs-5476R | Anticuerpo primario utilizado para detectar p38 MAPK fosforilada. |
| Kit de reactivos PrimeScript RT con eliminador de ADN genómico | TaKaRa | RR047A | Utilizado para la eliminación de ADN genómico y la transcripción inversa de ARN a ADNc. |
| Membrana de PVDF | Millipore | IPVH00010 | Membrana utilizada para la transferencia de proteínas durante la inmunotransferencia (Western blot). |
| Kit ELISA de IL-1β de conejo | Jiyinmei | JYM0011Rb | Cuantifica la interleucina-1β de conejo en la muestra analizada. |
| Kit ELISA de IL-6 de conejo | Jiyinmei | JYM0006Rb | Cuantifica la interleucina-6 de conejo en la muestra analizada. |
| Kit ELISA de TNF-α de conejo | Jiyinmei | JYM0003Rb | Cuantifica el factor de necrosis tumoral-α de conejo en la muestra analizada. |
| Sistema de PCR en tiempo real | Thermo Fisher Scientific | PIKOREAL 96 | Realiza amplificación de PCR cuantitativa basada en fluorescencia. |
| Anticuerpo contra RIC8A | Bioss | bs-11355R | Anticuerpo primario utilizado para detectar RIC8A. |
| Tampón de lisis RIPA | Beyotime | P0013B | Extrae proteína total del tejido cartilaginoso. |
| Solución de Safranina O | Solarbio | G1371 | Tiñe proteoglicanos del cartílago en la histología de Safranina O–Verde rápido. |
| Reactivos o geles precolados de SDS-PAGE | Solarbio | S8010 | Incluyen porcentaje del gel o producto. |
| Anticuerpo contra SOX9 | Bioss | bs-4177R | Anticuerpo primario utilizado para detectar SOX9. |
| Espectrofotómetro | Nanjing Wuyi Technology | OD1000+ | Mide la concentración y pureza del ARN. |
| Gasa estéril | Zhende | V505463 | Utilizada para compresión tras la retirada de la aguja. |
| Mezcla maestra SYBR Green | Novoprotein | E096-01B | Reactivo fluorescente utilizado para PCR cuantitativa. |
| Solución salina tamponada con Tris | Solarbio | T8060 | Utilizada para preparar el tampón de lavado y bloqueo para inmunotransferencia (Western blot). |
| Reactivo TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Reactivo fenol–guanidinio utilizado para la extracción total de ARN. |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | Detergente no iónico añadido a las soluciones de lavado de solución salina tamponada con Tris y solución salina tamponada con fosfato. |
| Solución de hematoxilina férrica de Weigert | Merck | 1.15973 | Utilizada en la tinción de Safranina O–Verde rápido. |
| Xileno | Sinopharm Chemical Reagent | 10023428 | Utilizado para la desparafinización y la clarificación del tejido. |
Referencias
- Mobasheri A, Batt M. An update on the pathophysiology of osteoarthritis. Ann Phys Rehabil Med. 2016;59(5):333-339.
- Forestier R, et al. Prevalence of generalized osteoarthritis in a population with knee osteoarthritis. Joint Bone Spine. 2011;78(3):275-278.
- Motta F, Barone E, Sica A, Selmi C. Inflammaging and osteoarthritis. Clin Rev Allergy Immunol. 2023;64(2):222-238.
- Ghouri A, Conaghan PG. Prospects for therapies in osteoarthritis. Calcif Tissue Int. 2021;109(3):339-350.
- Roseti L, et al. Articular cartilage regeneration in osteoarthritis. Cells. 2019;8(11):1305. https://doi.org/10.3390/cells8111305
- Fujii Y, et al. Cartilage homeostasis and osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2022;23(12):6330. https://doi.org/10.3390/ijms23126330
- Kreutzinger V, et al. Limited effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) on imaging outcomes in osteoarthritis: observational data from the osteoarthritis initiative (OAI). BMC Musculoskelet Disord. 2025;26. https://doi.org/10.1186/s12891-025-08245-0
- Migliore A, et al. Low dose NSAIDs and sysadoas in the management of knee osteoarthritis. Aging Clin Exp Res. 2025;37(1):121. https://doi.org/10.1007/s40520-025-03015-6
- Fu M, et al. Expression profile of long noncoding RNAs in cartilage from knee osteoarthritis patients. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(3):423-432.
- Jiang SD, et al. Long noncoding RNAs in osteoarthritis. Joint Bone Spine. 2017;84(5):553-556.
- Xing D, et al. Identification of long noncoding RNA associated with osteoarthritis in humans. Orthop Surg. 2014;6(4):288-293.
- Wu W, Zou J, Yang Y. Studies on the role of circRNAs in osteoarthritis. BioMed Res Int. 2021;2021:6672322. https://doi.org/10.1155/2021/6672322
- Liu X, et al. Identification and comprehensive analysis of circRNA–miRNA–mRNA regulatory networks in osteoarthritis. Front Immunol. 2022;13:1018820. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1018820
- Shen S, et al. circPDE4B prevents articular cartilage degeneration and promotes repair by acting as a scaffold for RIC8A and MID1. Ann Rheum Dis. 2021;80(9):1209-1219.
- Cao M, et al. A peroxiredoxin-P38 MAPK scaffold increases MAPK activity by MAP3K-independent mechanisms. Mol Cell. 2023;83(17):3140-3154.
- Lu M, et al. Promotion and mechanism of acupotomy on chondrocyte autophagy in knee osteoarthritis rabbits. Chin J Integr Med. 2024;30(9):809-817.
- Chen C, et al. Clinical effects of ultrasound-guided acupotomy in knee osteoarthritis treatment. J Vis Exp. 2024;(208):e66587. https://doi.org/10.3791/66587
- Wang Y, et al. Effect of acupotomy modulation of NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway on chondrocyte pyroptosis in knee osteoarthritis. J Pain Res. 2025;18:4935-4945.
- Zhang J, et al. Whole transcriptome mapping identifies an immune- and metabolism-related non-coding RNA landscape remodeled by mechanical stress in IL-1β-induced rat OA-like chondrocytes. Front Genet. 2022;13:843187. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.843187
- Liu Q, et al. Emerging roles of circRNA related to the mechanical stress in human cartilage degradation of osteoarthritis. Mol Ther Nucleic Acids. 2017;7:223-230.
- Guo Y, et al. Acupotomy improves synovial hypoxia, synovitis and angiogenesis in KOA rabbits. J Pain Res. 2023;16:749-760.
- Ma Y, et al. Acupotomy ameliorates KOA related chondrocyte premature senescence through YAP/FOXD1 pathway. J Pain Res. 2025;18:2011-2023.
- Wang Z,et al. Electroacupuncture ameliorates cartilage damage in a rat model of knee osteoarthritis and regulates expression of miRNAs and the TLR4/NF-κB pathway, Acupuncture in Medicine. 2025, 43(2025), 164-173.
- Feng S, Cong H, Ji L. Salvianolic acid A exhibits anti-inflammatory and antiarthritic effects via inhibiting NF-κB and p38/MAPK pathways. Drug Des Devel Ther. 2020;14:1771-1778.
- Abdallah AM, et al. Pyrazole derivatives ameliorate synovial inflammation in collagen-induced arthritis mice model via targeting p38 MAPK and COX-2. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(1):819-832.
- Alaaeldin E, et al. Topical nano-vesicular spanlastics of celecoxib: enhanced anti-inflammatory effect and down-regulation of TNF-α, NF-кB and COX-2 in complete Freund's adjuvant-induced arthritis model in rats. Int J Nanomedicine. 2021;16:133-145.
- Pamudurti NR, et al. Translation of CircRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.
- Wang Z, et al. Electroacupuncture ameliorates cartilage damage in a rat model of knee osteoarthritis and regulates expression of miRNAs and the TLR4/NF-κB pathway. Acupunct Med. 2025;43(3):164-173.
- Shen J, et al. Circular RNA sequencing reveals the molecular mechanism of the effects of acupuncture and moxibustion on endometrial receptivity in patients undergoing infertility treatment. Mol Med Rep. 2019;20(2):1623-1633. https://doi.org/10.3892/mmr.2019.10386
- Wang Y, et al. Electroacupuncture alleviates perioperative hypothalamus-pituitary-adrenal axis dysfunction via circRNA-miRNA-mRNA networks. Front Mol Neurosci. 2023;16:1152861. https://doi.org/10.3389/fnmol.2023.1152861
- Xiao X, et al. Transcription profiling of a revealed the potential molecular mechanism of Governor Vessel electroacupuncture for spinal cord injury in rats. Neurospine. 2022;19(3):757-769.
- Xu C, Gu K, Yasen Y, Hou Y. Efficacy and safety of celecoxib therapy in osteoarthritis: a meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2016;95(20):e3585. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000003585
- 33. Jiang D, et al. Efficacy of intra-articular injection of celecoxib in a rabbit model of osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2010;11(10):4106-4113.