La acupuntura del cuero cabelludo combinada con ejercicio induce la activación de PI3K/akt y mejora la plasticidad sináptica en ratas espásticas tras un ictus

Resumen

Este estudio tiene como objetivo investigar los efectos de la acupuntura del cuero cabelludo combinada con ejercicio sobre la plasticidad sináptica de la corteza motora en un modelo de rata de espasticidad de extremidad tras un ictus, y explorar la asociación entre la actividad de la vía PI3K/Akt y los efectos terapéuticos.

Resumen

Los tratamientos eficaces para la espasticidad post-ictus (PSS) siguen siendo limitados, y el mecanismo por el cual la acupuntura del cuero cabelludo combinada con el ejercicio (SAE) alivia el PSS no se entiende completamente. Este estudio investigó los efectos de la EAE en ratas con PSS y exploró si la EAE regula la plasticidad sináptica a través de la vía PI3K/Akt. Se estableció un modelo de ratas con oclusión de la arteria cerebral media (MCAO), y las ratas se asignaron aleatoriamente a cinco grupos: Blank, Sham, MCAO, SAE y Baclofeno. Todas las intervenciones se administraron durante 7 días consecutivos. A continuación, se evaluaron la función neurológica, el volumen del infarto cerebral, la histopatología, la ultraestructura sináptica y la expresión proteica relacionada. En comparación con el grupo MCAO, la SAE mejoró los déficits neurológicos, redujo la hipertonía muscular, disminuyó el volumen del infarto, alivió la lesión neuronal, aumentó el número de sinapsis y mejoró la morfología sináptica. La SAE también subreguló el factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GDNF), PI3K fosforilado (p-PI3K), Akt fosforilado (p-AKT) y proteínas sinápticas, incluyendo la sinaptofisina (SYN), la proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95) y la proteína asociada al crecimiento 43 (GAP-43). La tinción por inmunofluorescencia sugirió además una mayor expresión de SYN y p-Akt en la corteza motora tras el tratamiento con SAE. Estos hallazgos sugieren que la SAE podría estar correlacionada con la activación de la señalización PI3K/Akt mediante la regulación alcista de GDNF, mejorando así la plasticidad sináptica y aliviando los síntomas del PSS. Este estudio investigó los efectos de la EAE en ratas con PSS y exploró la posible asociación entre la intervención en la EAS, la actividad de las vías PI3K/Akt y la plasticidad sináptica.

Introducción

El infarto cerebral sigue siendo una de las principales causas de muerte y discapacidad a nivel mundial. La isquemia y la hipoxia dañan las neuronas, alteran el equilibrio excitación-inhibición en los circuitos motores y conducen a la disfunción^{motora 1}. La espasticidad postictus se manifiesta en un aumento del tono muscular y una reducción de la movilidad articular, lo que afecta las actividades diarias y aumenta la carga del^{cuidador 2}. Aunque agentes antiespásticos como el baclofeno pueden proporcionar alivio sintomático temporal, el uso prolongado puede provocar tolerancia al fármaco y efectos adversos, y no restaura la función neural^{deteriorada 3}. La rehabilitación motora convencional también está limitada por un inicio lento del beneficio y una duración prolongada del tratamiento. Por ello, se necesitan urgentemente estrategias terapéuticas más seguras y efectivas, y los mecanismos subyacentes merecen una investigación más profunda. La neuroplasticidad es un mecanismo central de recuperación funcional tras un ictus e implica la remodelación sináptica, la regeneración axonal y la supervivencia^{neuronal 4}. Tras un ictus isquémico, las neuronas del núcleo del infarto sufren una muerte rápida, mientras que las respuestas inflamatorias locales agravan la lesión tisular en la penumbra isquémica; Juntos, estos procesos provocan la lesión cerebral ^5,6. La plasticidad sináptica, un componente clave de la neuroplasticidad, puede evaluarse mediante proteínas relacionadas con la sinapsis, incluyendo marcadores presinápticos como la sinaptofisina (SYN) y la proteína asociada al crecimiento 43 (GAP-43), así como la proteína de densidad postsináptica 95 (PSD-95)^7,8,9.

Los factores neurotróficos proporcionan una base molecular para la plasticidad sináptica. El factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GDNF) es especialmente importante porque promueve la supervivencia y reparación neuronal, suprime la inflamación y mejora el microambiente^{sináptico 10}. Al unirse al receptor Ret, GDNF puede activar la señalización PI3K/^{Akt 11}. La cascada PI3K/Akt es una vía principal a favor de la supervivencia en el sistema nervioso, y su activación inhibe la apoptosis mientras apoya la síntesis de proteínas necesaria para la remodelación^{sináptica 12,13}. La acupuntura del cuero cabelludo combinada con ejercicio (SAE) es una estrategia integrativa de rehabilitación que combina la estimulación por acupuntura del cuero cabelludo con entrenamiento motor activo. El objetivo general de este método es modular simultáneamente la actividad neural central y promover la recuperación motora relacionada con la tarea, reduciendo así la hipertonía muscular y mejorando los resultados funcionales tras un ictus. La SAE se utiliza ampliamente en China para el tratamiento de la espasticidad post-ictus (PSS). La razón de este enfoque combinado es que la acupuntura del cuero cabelludo puede modular la excitabilidad cortical y la perfusión cerebral, mientras que la terapia de ejercicio proporciona entrenamiento motor dependiente de la actividad que promueve la recuperación funcional y la remodelación sináptica. En comparación con la terapia de ejercicio sola, la evidencia clínica previa ha demostrado que la acupuntura del cuero cabelludo en los puntos del cuero cabelludo combinada con la terapia de ejercicio reduce aún más la espasticidad de las extremidades y mejora la función motora y las actividades diarias en pacientes con espasmo de extremidad tras un^{ictus 14}.

Una revisión sistemática y metaanálisis reciente también sugirió que la acupuntura de cuero cabelludo de estilo movimiento o intervenciones concurrentes relacionadas con acupuntura y ejercicio aportan mayores mejoras en la espasticidad, función motora, equilibrio y actividades de la vida diaria que las intervenciones monocomponentes o secuenciales, apoyando la posible ventaja de la neuromodulación concurrente y el entrenamiento motor¹⁵. Los estudios preclínicos han demostrado que los protocolos de acupuntura en el cuero cabelludo de estilo SAE o de movimiento relacionado pueden mejorar el flujo sanguíneo cerebral y atenuar la espasticidad mediante la reactivación espinal KCC2 mediada por el receptor^{5-HT₂A 16,17}. Un estudio reciente sugiere además que la acupuntura promueve la neuroplasticidad mediante la señalización PI3K/^{Akt 18}. Por lo tanto, la EAE puede ser especialmente adecuada para contextos experimentales y clínicos en los que la modulación de la plasticidad neural postic, la recuperación motora y la reducción de la espasticidad son objetivos terapéuticos clave. Sin embargo, la posible asociación entre SAE, señalización GDNF/PI3K/Akt y plasticidad sináptica para aliviar la PSS sigue siendo poco comprendida. El presente estudio estableció un modelo de rata de PSS para evaluar los efectos de la SAE sobre déficits neurológicos y espasticidad muscular, y para caracterizar cambios en la expresión de GDNF, la actividad de las vías PI3K/Akt y proteínas relacionadas con la plasticidad sináptica tras la intervención. Este estudio puede aportar evidencia experimental para determinar si la SAE es una estrategia rehabilitadora adecuada para el PSS y para aclarar su posible mecanismo de acción.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina China de Changchun (Aprobación nº 20251038) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de Investigación Animal: Reporte de Experimentos In Vivo (ARRIVE 2.0), así como con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los materiales utilizados en este estudio se muestran en la Tabla de Materiales.

Procedimientos experimentales
Animales experimentales y agrupación
Se adquirieron ochenta machos adultos de Sprague–Dawley libres de patógenos específicos (SPF) (220–250 g) en la Granja de Cría Animal de Hongda (distrito de Kuancheng, Changchun, China). Los animales se alojaban en el Centro Experimental de Animales de la Universidad de Medicina China de Changchun bajo condiciones controladas de 22–25 °C, humedad relativa del 50–60% y un ciclo de 12 horas luz/oscuridad, con libre acceso a comida y agua. Tras una semana de aclimatación, las ratas fueron asignadas aleatoriamente a un grupo en blanco (n = 12), un grupo Sham (n = 12) y un grupo modelo-reserva (n = 56). El grupo en blanco se incluyó como control normal y no tratado para proporcionar valores de referencia para el desempeño conductual, características histopatológicas y expresión de marcadores moleculares en ratas sanas. El grupo Sham fue sometido a la misma anestesia y exposición quirúrgica que el grupo MCAO, salvo que no se realizó oclusión arterial; Por lo tanto, este grupo servía como control de los posibles efectos de la anestesia y la manipulación quirúrgica. La inclusión tanto de los grupos Blank como Sham permitió distinguir los efectos de la lesión isquémica de los relacionados con el procedimiento quirúrgico en sí.

El grupo de reservas modelo fue sometido a modelado MCAO. Los primeros 3 días tras la cirugía se definieron como el periodo de inducción del modelo. Durante este periodo, 8 de cada 56 ratas murieron, lo que corresponde a una tasa de mortalidad del 14,29%, y 12 ratas fueron excluidas porque la modelización no tuvo éxito. Las 36 ratas restantes con establecimiento exitoso del modelo fueron asignadas aleatoriamente, usando una tabla de números aleatorios, a los grupos MCAO, SAE y Baclofeno, con 12 ratas en cada grupo. Las intervenciones grupales fueron las siguientes: (I) Grupo en blanco: alimentación rutinaria únicamente, sin intervención. (II) Grupo simulado: exposición quirúrgica de la arteria carótida común, arterias carótidas internas y externas, y nervio vago, sin ligadura ni inserción de filamento. (III) Grupo MCAO: MCAO se estableció bajo anestesia intraperitoneal con pentobarbital sódico al 3%, sin tratamiento posterior. (IV) Grupo SAE: tras un modelado y validación exitosos de MCAO, las ratas recibieron acupuntura del cuero cabelludo combinada con ejercicio. La anestesia inhalada de isoflurano al 1,5%–2,0% solo se utilizó durante la breve fase de inserción de la aguja. El entrenamiento en cinta de correr se inició solo tras la recuperación completa de la conciencia y la restauración de la capacidad de caminar espontáneamente. La acupuntura se realizó en GV20 y EX-HN1 bilateral. Se insertaban agujas hasta una profundidad de 1 mm y se conservaban durante el periodo de entrenamiento en cinta. El periodo estandarizado de retención/entrenamiento de aguja de 30 minutos se definió como el periodo de entrenamiento en cinta y consistió en 6 m/min durante 10 minutos seguidos de 12 m/min durante 20 minutos con inclinación 0°. La intervención se administró una vez al día durante 7 días consecutivos. (V) Grupo Baclofeno: tras un modelado y validación exitosos del MCAO, las ratas recibieron baclofeno por gavage intragástrico a 0,4 mg/kg una vez al día durante 7 días consecutivos.

Establecimiento del modelo MCAO
El modelo MCAO de ratas se estableció utilizando un método modificado de filamento^{intraluminal 19}. Tras 12 horas de ayuno y privación de agua, las ratas fueron anestesiadas mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 3% y colocadas en posición supina. Tras la desinfección cutánea, se realizó una incisión cervical en la línea media para exponer la arteria carótida común derecha (CCA) y los nervios y músculos adyacentes. Se identificó y ligó la arteria carótida externa (ECA), y se aisló la arteria carótida interna (ICA). Se colocaron ligaduras en el ACI y el ACC proximales, y el ACC distal se pinzó temporalmente. A continuación, se realizó una pequeña arteriotomía en el CCA proximal a la pinza. Se insertó un filamento de nailon de 0,26 mm que avanzó 18–20 mm a través de la ACI para ocultar el origen de la arteria cerebral media. Posteriormente se ligaron el ACI y el CCA, y se suturó la incisión. Tras la cirugía, las ratas se mantuvieron calientes durante la recuperación y recibieron una inyección intraperitoneal de penicilina (40.000 U) para prevenir infecciones. En el grupo simulado, solo se realizó exposición vascular, sin inserción de filamento; el cierre de heridas y el cuidado postoperatorio fueron idénticos a los del grupo MCAO. El establecimiento exitoso del modelo se definió como una puntuación Zea Longa ≥ 2 a los 3 días de la cirugía¹⁹ y una puntuación de tono muscular modificada de la Escala Ashworth (MAS) ≥ grado^{1 20}.

Métodos de intervntion
La acupuntura del cuero cabelludo se combina con intervención de ejercicio
Estudios previos muestran que en ratas MCAO, los déficits neurológicos alcanzan su punto máximo en el día 3 y permanecen elevados en los 10 días posteriores a la cirugía, mientras que la resistencia muscular periférica aumenta progresivamente desde el día 6 hasta el^{día 9 (21}). Por ello, el tratamiento se inició en el tercer día postoperatorio y se continuó una vez al día durante 7 días consecutivos para minimizar el impacto de la recuperación espontánea. Antes de modelar, las ratas asignadas al grupo SAE pasaron 3 días de entrenamiento adaptativo en cinta a 5 m/min durante 10 min/día²². Este entrenamiento adaptativo se utilizó para familiarizar a las ratas con la carrera en cinta y reducir la probabilidad de luchar, caer, negarse a correr o detenerse durante el periodo formal de intervención. Durante el entrenamiento adaptativo y la intervención formal, los eventos anómalos relacionados con la cinta se definieron como lucha persistente, caídas del carril de carrera, negativa a correr más de 1 minuto o detención durante más de 1 minuto durante el entrenamiento en cinta. Estos eventos se registraron en registros experimentales cuando se observaron. Una breve vacilación o una parada transitoria no resultaban excluidas si se podía reanudar la carrera en cinta tras una suave indicación. Los datos solo se excluyeron si un animal no podía completar la sesión diaria asignada en cinta debido a caídas repetidas, negativa persistente a correr o un malestar severo. Tras la validación exitosa del modelo en el tercer día, la intervención SAE se administró una vez al día durante 7 días consecutivos.

En cada sesión de tratamiento, las ratas fueron anestesiadas con isoflurano entre un 1,5% y un 2,0%. La anestesia se suspendió inmediatamente después de la inserción de la aguja. En la práctica experimental, las ratas normalmente recuperaban la conciencia completa en aproximadamente 1–2 minutos tras la retirada del isoflurano. El entrenamiento en cinta no comenzó mientras las ratas estaban anestesiadas. Los puntos de acupuntura fueron localizados por acupunturores animales experimentados según la Nomenclatura y Localización de Puntos de Acupuntura Comunes en Animales Experimentales emitida por la Asociación China de Acupuntura-Moxibustión en 2020. GV20 se definió como el punto medio de la línea que conecta las fontanelas anterior y posterior en la línea media craneal. Los puntos bilaterales EX-HN1 estaban ubicados 2 mm laterales respecto a GV20. Se insertaron agujas desechables de 0,25 mm × 13 mm verticalmente hasta una profundidad de 1 mm y se conservaron durante el periodo estandarizado de entrenamiento en cinta de correr de 30 minutos. Las agujas se aseguraban con cinta médica transpirable para evitar desplazamientos, y la penetración del cráneo se excluía por palpación para asegurar la consistencia del procedimiento. La posición de la aguja y la fijación de la cinta se revisaban antes del entrenamiento en cinta, durante breves pausas si se producía un comportamiento anormal al correr, y justo después de completar el entrenamiento. Además, la posición de la aguja se revisaba visualmente cada 5 minutos durante el entrenamiento en cinta, independientemente del comportamiento animal. El desplazamiento de la aguja se definía como un aflojamiento visible, un cambio en el ángulo de la aguja, un retiro parcial o un desprendimiento total durante la operación en cinta. Si se producía un ligero aflojamiento sin pérdida de la posición de la aguja, la cinta se reforzaba suavemente mientras la cinta se pausaba brevemente. Si una aguja se retiraba parcialmente o se desalojaba por completo, la aguja no se volvía a insertar durante esa sesión; La rata completó el resto del entrenamiento en cinta sin manipulación adicional de aguja, y el evento quedó documentado en el registro experimental. Los animales no fueron excluidos únicamente por un único evento de desplazamiento de aguja, a menos que el evento estuviera acompañado de una incapacidad para completar el entrenamiento en cinta o signos de malestar severo.

El periodo estandarizado de 30 minutos de retención/entrenamiento con agujas comenzó cuando la rata comenzó a correr en cinta tras recuperarse completamente de la anestesia con isoflurano y terminó inmediatamente después de completar el entrenamiento en cinta, cuando se retiraron las agujas. El breve intervalo de recuperación tras la suspensión del isoflurano no se incluyó en el periodo estandarizado de entrenamiento de 30 minutos. Como se insertaban las agujas antes de la recuperación, el tiempo físico real de permanencia era aproximadamente 1–2 minutos más largo que el periodo de entrenamiento en cinta de correr de 30 minutos. Esta definición se aplicó de forma consistente en todas las ratas del grupo SAE. Se consideraba que una rata estaba suficientemente recuperada para comenzar el entrenamiento en cinta de correr cuando se cumplían los siguientes criterios: recuperación completa de la conciencia, capacidad para mantenerse de pie de forma independiente, capacidad para caminar de forma estable sobre una superficie plana y respuesta normal a una estimulación externa suave. Estos criterios se comprobaban antes de colocarse en la cinta.

Durante la retención de agujas, las ratas realizaron ejercicio en cinta a 0° de inclinación: 6 m/min durante 10 min, seguido de 12 m/min durante 20 min. No se utilizó descarga eléctrica en ningún momento durante el estudio. Si una rata dejaba de correr o se negaba a correr más de 1 minuto durante el entrenamiento formal, se utilizaba estimulación auditiva suave y no aversiva, como golpear ligeramente la pared de la cinta, para fomentar el movimiento. El uso de dicha indicación, así como cualquier dificultad, caída, detención, negativa a correr o desplazamiento de la aguja, fue documentado en el registro experimental cuando se observó. Estos eventos se monitorizaron de forma descriptiva y se documentaron en el registro experimental cuando se observaron. La intensidad del ejercicio se ajustó de forma integral basándose en protocolos previamente reportados que combinaban acupuntura del cuero cabelludo con entrenamiento en cinta^{de correr 16,23}. La intervención SAE se administró una vez al día durante 7 días consecutivos (Figura 1A).

Intervención con baclofeno
Tras la validación exitosa del modelo, las ratas del grupo Baclofeno recibieron solución de baclofeno por gavage intragástrico a una dosis de 0,4 mg/kg. El medicamento se administró una vez al día a las 9:00 durante 7 días consecutivos.

Resultado medio
Observación general
La condición general se monitorizó diariamente en todos los grupos, incluyendo peso corporal, estado mental, ingesta de comida y agua, y actividad espontánea.

Evaluación de la función neurológica y el tono muscular
Los déficits neurológicos y la espasticidad de las extremidades se evaluaron en los días 1, 3, 5 y 7 tras la validación del modelo utilizando la puntuación Zea Longa, la puntuación de severidad neurológica modificada (mNSS) y la escala de Ashworth modificada. Todas las evaluaciones conductuales en todos los momentos fueron realizadas de forma independiente por dos investigadores que estuvieron ciegos ante la asignación de grupos durante todo el periodo de observación. Se muestran criterios de puntuación detallados (Tablas 1–3).

Determinación del volumen del infarto cerebral
El volumen del infarto cerebral se evaluó mediante tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC). Tras 7 días de intervención, tres ratas de cada grupo fueron seleccionadas aleatoriamente y eutanasiadas mediante sobredosis intraperitoneal de pentobarbital sódico, seguida de una rápida decapitación para la recogida total del cerebro. Los cerebros se congelaron primero a −20 °C y luego se cortaron en secciones coronales de 2 mm de grosor. Las secciones se incubaron en una solución de 2% de TTC a 37 °C durante 30 minutos en la oscuridad, y luego se fijaron durante la noche en paraformaldehído al 4% a 4 °C. Al día siguiente, todas las secciones fueron fotografiadas con una cámara digital. El tejido cerebral normal estaba teñido de rojo oscuro, mientras que el tejido infarto se veía blanco pálido. Las áreas del infarto se cuantificaron con ImageJ, y el volumen del infarto se expresó como porcentaje usando la fórmula:

Volumen del infarto (%) = área del infarto / área total de la sección cerebral X 100%.   (1)

Examen histopatológico del tejido cerebral
Tinción de hematoxilina–eosina (HE)
Se utilizó la tinción de hematoxilina y eosina para evaluar cambios histopatológicos en la corteza periinfarto. Tras 7 días de intervención, las ratas fueron eutanasiadas por sobredosis intraperitoneal de pentobarbital sódico. A continuación, se realizó una perfusión transcárdica rápida con 0,01 M de suero salino tamponado con fosfato (PBS) para extraer sangre, seguida de 250 mL de paraformaldehído frío al 4% (4 °C) para la fijación. Se recogieron cerebros completos y se aisló tejido cortical periinfarcto y se fijó en un 4% de paraformaldehído a 4 °C durante 24 horas. Los tejidos estaban incrustados en parafina y seccionados coronalmente a 5 μm. Las secciones se montaban sobre correderas, se horneaban a 60 °C durante 30 minutos y se desparafinaban en xileno I–III (10 minutos cada una). Luego se realizó una tinción con HE, seguida de deshidratación y limpieza. Finalmente, las secciones se cubrieron con bálsamo neutro y se obtuvieron imágenes usando un microscopio óptico Nikon.

Tinción de Nissl
Se utilizó la tinción con Nissl para evaluar la supervivencia neuronal y la densidad corporal de Nissl en la región periinfarto. Tras 7 días de intervención, las ratas fueron eutanasiadas y perfundidas transcárdicamente con 0,01 M PBS (37 °C), seguidas de 250 mL de paraformaldehído al 4% (4 °C). Se extirparon cerebros completos y se diseccionaron y fijaron los tejidos corticales periinfartos y contralaterales durante la noche con paraformaldehído al 4% a 4 °C. Tras la incrustación de parafina, se prepararon secciones de 5 μm. Las secciones se desparafinizaron en xileno durante 10 minutos, se rehidrataron mediante una serie de soluciones de etanol graduadas (95%, 90%, 80%, 70% y 50%; 5 minutos por concentración), y teñidas con solución de trabajo Nissl durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras un breve enjuague con agua destilada, las secciones se deshidrataban con etanol clasificado, se limpiaban en xileno durante 2 minutos y finalmente se montaban con cubiertas. Se capturaron y analizaron imágenes bajo un microscopio óptico.

Análisis de Western blot en la exploración de proteínas
Se realizó Western blot para evaluar proteínas implicadas en la señalización PI3K/Akt y la plasticidad sináptica. Tras 7 días de intervención, las ratas fueron eutanasiadas con una sobredosis de pentobarbital sódico y se recogió tejido de corteza motora peri-infarto. Los tejidos se homogeneizaron completamente en un tampón de lisis con ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) sobre hielo y centrifugados a 1610 × g a 4 °C durante 30 minutos para extraer la proteína total. La concentración de proteínas se cuantificó utilizando un kit comercial de ensayo de ácido bicincónico (BCA). Cantidades iguales de proteína (50 μg por carril) se separaron mediante electroforesis en gel de dodecilo sulfato de sodio y poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron eléctricamente a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon con solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente para eliminar la unión inespecífica, y luego se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Tras tres rondas de lavado con solución salina tamponada con Tris y Tween-20 (TBST), las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios (relación de dilución 1:1000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas proteicas se visualizaron usando quimioluminiscencia mejorada (ECL), y la intensidad de la banda se cuantificó con ImageJ. La expresión relativa de proteínas se calculó como la proporción entre la proteína objetivo y el control interno. Los anticuerpos primarios fueron los siguientes: GAPDH (1:1000), PI3K (1:1000), fosfo-PI3K (1:1000), Akt (1:1000), fosfo-Akt (1:1000), GAP-43 (1:1000), SYN (1:1000), PSD-95 (1:1000) y GDNF (1:1000).

Observación de ultraestructuras sinápticas
Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para evaluar el número de sinapsis y la integridad estructural. Tras 7 días de intervención, las ratas fueron anestesiadas y perfundidas transcárdicamente con un fijador mixto que contenía un 4% de paraformaldehído y un 2,5% de glutaraldehído. Se recogieron bloqueos corticales periinfarctos (1 mm × 1 mm × 1 mm) y se fijaron en glutaraldehído al 2,5% durante 2 horas, seguidos de una postfijación con tetróxido de osmio al 1% durante 1 hora. Las muestras se procesaron después con deshidratación graduada de etanol, incrustación de resina epoxi, seccionamiento ultrafino (50 nm de espesor) y doble tinción con acetato de uranilo y citrato de plomo. La ultraestructura sináptica se examinó utilizando un microscopio electrónico de transmisión. Se adquirieron imágenes al 8.000× para la evaluación estructural, y las sinapsis se contaron a 5.000×. Se analizaron tres campos neuropil aleatorios por grupo para calcular el número medio de sinapsis, y los datos se compararon utilizando ANOVA unidireccional.

Ensayo de doble marcaje de inmunofluorescencia
Se realizó una tinción de doble marcaje por inmunofluorescencia para evaluar la expresión y distribución de SYN y p-Akt en la corteza periinfarto. Tras 7 días de intervención, las ratas fueron eutanasiadas por sobredosis intraperitoneal de pentobarbital sódico, y el tejido cortical periinfarto fue diseccionado rápidamente. Las muestras se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 24 horas, se incrustaron en un compuesto a temperatura óptima de corte (OCT) y se cortaron en secciones de 10 μm de grosor. Las secciones se secaron al aire a temperatura ambiente durante 1 hora y se lavaron tres veces con tampón TBST para eliminar el compuesto residual de OCT. Las secciones se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,3% durante 20 minutos a temperatura ambiente, se enjuagaron con PBS y se bloquearon con solución de BSA al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente. En condiciones de oscuridad, se incubaron secciones durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios anti-SYN de conejo (dilución 1:200) y anti-p-Akt de conejo (dilución 1:200). Al día siguiente, se lavaron las secciones tres veces con PBS e incubaron en la oscuridad con anticuerpos secundarios (dilución 1:400) durante 50 minutos a temperatura ambiente. Tras seis lavados adicionales con tampón TBST, los núcleos celulares se contra-teñieron con solución de trabajo 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las imágenes se adquirieron bajo idénticos ajustes de exposición y fondo utilizando un microscopio de fluorescencia. Se utilizaron imágenes representativas para evaluar los patrones de expresión de SYN y p-Akt en la corteza motora entre grupos.

Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 10.1.2 e IBM SPSS Statistics 25. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DS). Los datos conductuales recogidos en varios momentos, incluyendo la puntuación Zea Longa, la puntuación de severidad neurológica modificada y la escala de Ashworth modificada, se analizaron utilizando una ANOVA de medidas repetidas bidireccionales, con el grupo como factor entre sujetos y el tiempo como factor dentro de los sujetos. Cuando se detectaron efectos principales o interacciones significativas, se utilizó la prueba de comparaciones múltiples de Sidack para análisis post hoc. Otros datos se analizaron utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Sidack para comparaciones post hoc. Se consideró estadísticamente significativo un p. < de dos colas. 0,05. En los gráficos de barras, la significación estadística se indica mediante asteriscos tal y como se define en las leyendas de las figuras correspondientes.

Resultados

La SAE mejora la función neurológica y reduce la espasticidad muscular en ratas PSS
Los efectos terapéuticos de la SAE sobre la disfunción conductual en ratas con espasticidad post-ictus se evaluaron utilizando la puntuación Zea Longa, la Puntuación de Severidad Neurológica modificada y la Escala de Ashworth modificada en los días 1, 3, 5 y 7 tras la validación del modelo (n = 12 por grupo). La puntuación Zea Longa y la mNSS se utilizaron para evaluar déficits neuroló...

Discusión

Estudios clínicos previos han demostrado que la acupuntura del cuero cabelludo combinada con ejercicio puede aliviar los síntomas espásticos en pacientes con espasticidad post-ictus, al tiempo que mejora la función motora y las actividades de la vida diaria (AVD^)14,24. Estos hallazgos respaldan su valor clínico. El presente estudio confirmó además el beneficio terapéutico de la EAS en un modelo de rata utilizando tres medidas con...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining solution	Beyotime	C0651	TTC staining
3MM Filter Paper	Whatman, UK	3030861	Western blot transfer
AKT Antibody	Affinity	AF0836	Primary antibody
Acetone	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10000418	Infiltration of electron microscopy specimens
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	Version 29.5 (64-bit), https://www.adobe.com/products/illustrator.html	64-bit version, used for graphic editing and scientific figure preparation
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	100092683	Deparaffinization of paraffin sections
Anti-fade mounting medium	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1020	coverslipping
BCA Protein Assay Kit	MDL	MD913053	Protein concentration determination
Bluishing solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	Hematoxylin staining
Chemiluminescence Imaging System	CLINX, China	ChemiScope6100	System Detect target protein
Concentrated normal goat serum	Boster Biological Technology	AR1009	serum blocking
DAPI	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1030	nuclear staining
Diamond Knife	Daitome	Ultra 45°	Slice ultrathin specimens
Differentiation solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	HE staining
Drying Oven	Tianjin Labory Instruments Equipment Co., Ltd.	GFL-230	Bake fixed tissue slices
EDTA (pH 9.0) antigen retrieval solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1052	Antigen retrieval
Electron microscopy fixative	ASPEN	AS1063	Fixation of electron microscopy specimens
Electrophoresis Power Supply	Longfang	LF-2000	Provide electrophoresis voltage
Embed 812 embedding medium	SPI	90529-77-4	Infiltration of electron microscopy specimens
EndNote X9	Clarivate Analytics (US) LLC	Version X9, https://endnote.com/	Used for reference management and academic citation formatting
Freezing Stage	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-L5	Freeze frozen tissue blocks
GAP-43 Antibody	Affinity	Df7766	Primary antibody
GAPDH Antibody	Affinity	AF7021	Primary antibody
GDNF Antibody	Biosynthesis	Bs-1024r	Primary antibody
Glacial acetic acid	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2138	Nissl staining
Glass Slides and Coverslips	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10212432C	Mount tissue sections
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Version 10.1.2 (324) for Windows 64-bit, https://www.graphpad.com/	64-bit version, used for statistical analysis and scientific plotting
Grinding machine	Beijing Herde	N.9548	Grind tissue samples
HE staining solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2103	HE staining
HRP-Conjugated Goat Anti-Mouse Secondary Antibody	Servicebio	C030205	Secondary Antibody
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody	SeraCare	5220-0336	Secondary antibody
Hydrogen peroxide (H2O2)	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C5101	preparation of TSA reagents
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	Version 25, 64-bit, https://www.ibm.com/products/spss-statistics	64-bit version, used for statistical data analysis and processing
Imaging System	Nikon, Japan	Nikon DS-U3	Capture microscopic images
Metal Bath	COYOTE	H203-H	Constant temperature incubation
Microwave Oven	Galanz Microwave Electrical Appliance Co., Ltd.	P70D20TL-P4	Antigen retrieval
NC Membrane (0.22 μm)	GVS, USA	ISEQ00010	Protein blot transfer
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10004160	dehydration and coverslipping
PBS buffer	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C0003	decolorization and washing
PI3K Antibody	Affinity	AF6241	Primary antibody
PSD-95 Antibody	Affinity	Af5283	Primary antibody
Pathological Microtome	Leica Instruments (Shanghai) Co., Ltd.	RM2016	Cut paraffin sections
Phospho-AKT Antibody	Affinity	Af0832	Primary antibody
Phospho-PI3K Antibody	Affinity	Af3241	Primary antibody
Pipette	Dragonlab	KE0003087/KA0056573	Quantitative liquid transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Beyotime	P1005	Protease inhibition
RIPA Lysis Buffer (Medium)	Beyotime	P0013C	Tissue lysis
Refrigerated Centrifuge	SEILOGEX, China	CF1524R	Low-speed sample separation
SDS-PAGE Electrophoresis System	Beyotime	MiniProGel™ Gel Casting, Electrophoresis and Western Blot Transfer System	Protein electrophoretic separation
SDS-PAGE Precast Gel Kit	MDL	MD911919	SDS-PAGE electrophoresis
SYN (Synapsin) Antibody	Biosynthesis	bs-3501R	Primary antibody
Shaker	Qilinbeier	TS-8	Sample oscillation washing
Tissue Dehydrator	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JJ-12J	Dehydrate paraffin tissue
Tissue Embedding Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-P5	Embed tissue in paraffin
Tissue Spreading Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	KD-P	Unfold paraffin slices
Toluidine blue staining solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2131	Nissl staining
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G2 20 TWIN	Observe ultrastructure
Tri-Color Pre-Stained Broad Range Protein Molecular Weight Marker (10–180 kDa)	Servicebio	G2091	SDS-PAGE electrophoresis
Tyramide-488	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C6002	TSA reagents
Tyramide-CY3	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C6003	TSA reagents
Ultramicrotome	Leica	Leica UC7	Cut ultrathin EM sections
Ultrasonic Cell Disruptor