Un modelo de enterocolitis acelerada por piroxicam en ratones knockout interleucina-10 para estudiar alteraciones metabólicas inducidas por inflamación

Resumen

Este protocolo utiliza piroxicam para acelerar el desarrollo de colitis en el modelo murino knockout de interleucina (IL-10). El protocolo garantiza la sincronización de la colitis, lo que resulta en resultados rigurosos y reproducibles, independientes del sexo, la tensión de fondo o las condiciones del vivario. Sirve como un modelo útil para estudiar alteraciones metabólicas durante la inflamación intestinal.

Resumen

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un trastorno inflamatorio crónico del tracto digestivo que afecta a más de 10 millones de personas en todo el mundo. Aunque una investigación sustancial se ha centrado en los mecanismos inmunológicos y las consecuencias subyacentes a la EII, se sabe menos sobre cómo la inflamación mucosa contribuye a la desregulación metabólica, incluyendo la pérdida de peso y la reducción del apetito. Aquí, los autores describen un modelo murino de enterocolitis acelerada por piroxicam en ratones con interleucina-10-knockout (IL-10-KO) para estudiar la desregulación metabólica inducida por la inflamación. Se sabe que los ratones IL-10-KO desarrollan enterocolitis espontánea y tienen una mayor susceptibilidad a la enterocolitis provocada por infecciones o medicamentos. Sin embargo, se han reportado condiciones de vivario y antecedentes de la cepa como factores de confusión en el desarrollo de la colitis en este modelo. Se ha demostrado que el Piroxicam, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), desencadena o acelera la enterocolitis en modelos animales al aumentar la exposición mucosa a bacterias luminales. En este protocolo, los ratones machos y hembras de IL-10-KO fueron alimentados con una dieta fortificada con piroxicam en lugar de la dieta habitual de comida. Se midieron diariamente la ingesta de alimentos y el peso corporal para reflejar alteraciones metabólicas en todo el cuerpo, junto con manifestaciones clínicas de enterocolitis como diarrea y sangrado rectal. El protocolo es eficiente y reproducible, induciendo enterocolitis simultáneamente en varios ratones, y permite evaluar la desregulación metabólica en un modelo de enfermedad inflamatoria intestinal. Estudios posteriores que utilicen este protocolo podrían investigar los efectos de la enterocolitis sobre otros componentes de la desregulación metabólica, como el gasto energético y la composición corporal, revelando conexiones más amplias entre la enfermedad inflamatoria intestinal y el metabolismo del huésped.

Introducción

La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, conocidas colectivamente como enfermedad inflamatoria intestinal (EII), son trastornos autoinmunes crónicos del tracto gastrointestinal caracterizados por inflamación mucosa con manifestaciones clínicas que incluyen dolor abdominal, pérdida de peso, hematoquecia y diarrea. La EII afecta a millones de personas en todo el mundo, con la mayor prevalencia en las sociedades^{occidentalizadas 1}. En Estados Unidos, se estima que más de 3 millones de personas se ven^{afectadas 2,3}, con un aumento de la incidencia y prevalencia, especialmente entre niños y jóvenes ^4,5.

Los mecanismos exactos que subyacen a la patogénesis de la EII siguen siendo incompletamente comprendidos, pero se piensa ampliamente que la enfermedad resulta de una respuesta inmune exagerada a la microbiota intestinal en individuos genéticamente susceptibles. Las citocinas que modulan las respuestas inflamatorias desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis intestinal y en el desarrollo de la EII. Entre ellas, la interleucina-10 (IL-10) es una citoquina antiinflamatoria bien estudiada que ayuda a mantener la homeostasis inmunológica en humanos regulando tanto los brazos innatos como adaptativos de la respuesta^{inmunitaria 6,7}. Cabe destacar que se han identificado polimorfismos en IL-10 y su receptor (IL-10RA/B) en lactantes con EII de inicio muy temprano (VEO-IBD), presentándose clásicamente con enfermedad perianal en los primeros meses de^vida. Esta asociación se ve reforzada por la secuenciación a gran escala del exoma en pacientes adultos con enfermedad de Crohn, que identificó la IL-10RA como un locus de susceptibilidad a la enfermedad en la^{EII 9} no monogénica. Además, se ha descrito una vía no genética que involucra anticuerpos neutralizantes de IL-10 en pacientes con EII-VEO, lo que subraya aún más la importancia de esta vía para mantener la homeostasis inmune^{mucosa 10}.

Basándose en estudios humanos que implican la IL-10 en la EII, se han desarrollado ratones interleucina-10-knockout (IL-10-KO) como modelo para estudiar el papel de la IL-10 en la EII. Se sabe que los ratones IL-10-KO desarrollan enterocolitis espontánea con una respuesta exagerada de CD4+ Th1 a estímulos, que suele comenzar entre las 8 y 12 semanas de edad a^{los 11} años. Sin embargo, el desarrollo de enterocolitis espontánea en ratones IL-10-KO puede ser impredecible en ausencia de un agente^acelerador 12,13,14, dependiendo de la cepa genética, la composición de la microbiota y las condiciones de vivienda ^15,16. El uso de un protocolo fiable para inducir la colitis es fundamental para que el modelo IL-10-KO sea prácticamente útil. Estudios previos han utilizado antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) como el piroxicam para inducir enterocolitis en ratones IL-10-KO^17,18. Sin embargo, estos estudios se han centrado principalmente en alteraciones inmunológicas, con relativamente poco énfasis en los efectos de la enterocolitis sobre el metabolismo o en el papel del sexo en la gravedad de la^{colitis 19}. Los autores aquí describen el uso de una dieta fortificada con piroxicam para inducir enterocolitis en ratones IL-10-KO y caracterizan la desregulación metabólica y las respuestas inflamatorias mucosas en este modelo utilizando tanto ratones machos como hembras. Este protocolo mide el peso corporal y la ingesta de alimentos para reflejar alteraciones metabólicas en todo el cuerpo, así como manifestaciones clínicas de colitis y cambios histológicos y transcriptómicos que reflejan inflamación mucosa. Este modelo eficiente y reproducible proporciona una herramienta valiosa para investigar la conexión entre la EII y el metabolismo del huésped.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron cumpliendo con el protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas, de acuerdo con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" [Número de aprobación: 2017-102011]. La eutanasia se realizó conforme a las directrices institucionales. No se requirió anestesia para los procedimientos realizados. Los detalles específicos de los materiales se describen en la Tabla de Materiales.

1. Establecimiento del modelo de enterocolitis acelerada con piroxicam en ratones IL-10-KO

1. Mantener ratones IL-10-KO en una instalación específica libre de patógenos (SPF) en un ciclo de luz de 12 horas con acceso improvisado a comida y agua.
2. Alojan individualmente ratones de 7 a 8 semanas, de edad y sexo emparejados en jaulas de microaisladores. Permite que los ratones se aclimaten a alojamientos individuales y a la manipulación diaria durante al menos una semana antes del inicio del experimento.
   NOTA: Asegúrese de que el peso corporal sea de >20 g en los machos o >17 g en las hembras, y que los ratones estén libres de heridas de pelea.
3. Asigna ratones a un grupo experimental y a un grupo de control. Para el grupo experimental, sustituir la comida estándar por comida fortificada con piroxicam. Para el grupo de control, proporciona comida estándar fresca. Añade 50 g de comida a cada tolva de jaula.
   NOTA: Asigna al menos cinco ratones por sexo a cada grupo. El alimento fortificado con piroxicam (200 ppm) fue preparado por Teklad usando piroxicam suministrado por los investigadores para la elaboración de una dieta personalizada para animales de laboratorio. Para minimizar la variabilidad de un lote a otro, se recomienda que todos los animales dentro de un experimento reciban comida del mismo lote de producción. Cuando sea posible, el mismo lote también debe usarse en experimentos para mejorar la reproducibilidad.

2. Monitorización del peso corporal y del comportamiento alimentario

1. Usando una báscula analítica, registra el peso corporal de cada ratón. Pesa cada ratón individualmente a la misma hora cada día, diariamente durante 7 días consecutivos. Informa el peso corporal diario como porcentaje del peso base en el día 0 (fijado en 100%).
   NOTA: Una pérdida de peso superior al 20% indica un estrés excesivo y riesgo de muerte inminente. Los ratones deben ser sacrificados si se alcanza este umbral.
2. Utilizando una báscula analítica, registra el peso inicial del chow fortificado con piroxicam y del chow estándar en cada jaula.
3. Luego, mide el resto de la comida en cada tolva de jaula a la misma hora cada día, diariamente durante 7 días consecutivos.
4. Calcula el consumo diario de comida restando el peso del resto del que queda el día anterior.
   NOTA: Comprueba rutinariamente la cantidad de comida y rellena si está por debajo de 10 g. La palatabilidad del chow de piroxicam no influye en su ingesta y debería parecerse mucho a la de la comida estándar.

3. Monitorización de la actividad de la enfermedad

1. En los días 0 y 7, inspecciona visualmente los pellets fecales de ratones individuales y determina la presencia de sangre en las heces.
2. Si no se ve sangre, realiza una prueba de sangre oculta fecal untando un pellet sobre la tarjeta de prueba y luego añadiendo el reactivo revelador suministrado. Resultados de puntuación según la Tabla 1.
3. En los días 0 y 7, inspecciona visualmente los pellets fecales recién expulsados para evaluar la consistencia de las heces. Usa pinzas planas para ayudar a determinar la consistencia. Resultados de puntuación según la Tabla 1.
4. En los días 0 y 7, determinar el grado de prolapso rectal inspeccionando la región perianal. Resultados de puntuación según la Tabla 1.
5. Mide el peso corporal como se ha descrito antes. Resultados de puntuación según la Tabla 1.
   NOTA: La puntuación del índice de actividad de la enfermedad (DAI) debe realizarse de forma ciega por el mismo investigador durante todo el experimento para garantizar la consistencia, minimizar el sesgo del observador y mejorar la fiabilidad de la evaluación.

4. Extracción de tejido colónico

1. Eutanasiar ratones por asfixia por CO₂ y luxación cervical según se informó en^{otros lugares 20}.
2. Coloca al ratón en posición supina y rocía un 70% de etanol en el abdomen ventral.
3. Levanta la piel con pinzas y usa tijeras quirúrgicas para cortar a lo largo de la línea media. Expone la cavidad peritoneal y localiza el colon.
4. Expone el colon y el ceco mediante una disección contundente. Extirpa el colon en bloque, incluyendo el ceco y el manguito anal.
5. Coloca el colon sobre una superficie plana y retira cualquier tejido conectivo.
6. Mide y registra la longitud de los dos puntos.
7. Tras medir la longitud del colon, retirar el ceco cortando en la unión ceco-colon.
8. Prepara una jeringuilla de 10 mL llena de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con una aguja de acero reutilizable de punta de bola calibre 22 acoplada. Introduce la aguja en el colon y elimina el contenido intestinal.
9. Coloca el colon enjuagado en una placa de Petri que contiene PBS y enjuaga para eliminar el contenido residual. Una vez aprobado, úsalo para ensayos posteriores.

5. Análisis histológico

1. Coloca el colon plano sobre una lámina de cristal. Utiliza pinzas para envolver el tejido alrededor de sí mismo, empezando por el extremo distal, formando un "Swiss roll". De este modo, el extremo distal/anal permanecerá en el rollo interno, mientras que las regiones más proximales se extenderán hasta el rollo externo.
2. Usando una aguja calibre 27, sujeta el colon enrollado para mantener el rollo y colócalo dentro de un casete de tejido incrustado.
3. Para fijar tejidos, sumergir los casetes de tejido en una solución de formalina tamponada al 10% durante 16 horas a 4 °C.
   PRECAUCIÓN: El 10% de formalina es perjudicial si está en contacto con la piel y puede causar quemaduras graves y daños oculares. Maneja con precaución con guantes protectores y gafas científicas. El formol residual debe eliminarse correctamente siguiendo las directrices institucionales.
4. Tras la fijación de formalina, procesa los tejidos para incrustar parafina y seccionalos para montarlos en portaobjetos de vidrio.
   NOTA: Las muestras deben enviarse a un laboratorio de histología con el equipo necesario para procesar casetes de tejido en parafina, sección en voluta, montaje en portaobjetos y tinción de hematoxilina y eosina.
5. Laminas de tejido tinte con hematoxilina y eosina (HE), según los protocolos^{establecidos 21}.
6. Utilizando el sistema de puntuación histológica descrito en la Tabla 2, evalúe las siguientes características histológicas en cada sección: daño tisular por enterocolitis, infiltración celular inflamatoria de la lámina propia y porcentaje de área afectada. Combina las puntuaciones de cada sección para generar una puntuación total (Tabla 2).
   Puntuación total = Afectación × características (daño tisular) + Afectación × características (infiltración celular inflamatoria de la lámina propia) (1)
7. Imágenes histopatológicas representativas del daño tisular y la infiltración celular pueden encontrarse en la publicación de Erben et^{al 22}.
   NOTA: La puntuación histológica debe realizarse de forma ciega, preferiblemente por un patólogo formado, para garantizar la consistencia y fiabilidad de la evaluación.

6. Tinción inmunofluorescente de tejido incrustado en parafina fijada en formalina

1. Coloca las lamas de papel en una rejilla de correderos y en un secador de correderos a 55 °C durante 1 hora para fundir parafina.
2. Coloca las láminas en una rejilla de tinción y sumerge la rejilla secuencialmente durante 3 minutos en tarros de teñido con xileno. Repite este paso en 3 ocasiones.
3. Sumerge la rejilla de tinción durante 3 minutos en tarros con etanol al 100%. Repite este paso en 3 ocasiones.
4. Sumerge la rejilla de tinción durante 3 minutos en el tarro con etanol al 95%.
5. Sumerge la rejilla de tinción durante 3 minutos en el tarro con etanol al 80%.
6. Sumerge la rejilla de tinción durante 5 minutos en tarros de tinción con agua desionizada (DI).
   NOTA: Todos los pasos previos deben realizarse en una campana ventilada debido a los vapores de xileno. Maneja con precaución con guantes protectores y gafas científicas. El xileno residual debe eliminarse adecuadamente conforme a las directrices institucionales.
7. Transfiere los portaobjetos a una rejilla para correderos y sumergiértelos en un tarro de tinción con una solución de extracción de citrato de 1×.
8. Coloca el tarro de tinción en el soporte del plato de tinción.
9. Coloca el soporte para el plato de tinte en la olla a presión.
10. Cocina durante 15 minutos en una olla a presión.
11. Recupera las láminas de la olla a presión y déjalas enfriar hasta la temperatura ambiente.
12. Incubar las láminas con un tampón bloqueador de 300 μL (suero de cabra al 3,5% diluido en PBS) durante 1 hora en una cámara humidificada. Asegúrate de que el tejido esté completamente cubierto por el buffer bloqueante.
13. Exponer las láminas a 300 μL de anticuerpo primario diluido en un tampón bloqueador durante 16 horas a 4 °C, dentro de una cámara humidificada. Asegúrate de que el tejido esté completamente cubierto por el anticuerpo primario. Se utilizó el siguiente anticuerpo primario: Anti-S100A8/S100A9 (1:500).
    NOTA: Las diluciones de anticuerpos serán específicas del reactivo y deben seguir las recomendaciones del proveedor.
14. Enjuaga las diapositivas sumergiéndolas en serie en PBS durante 5 minutos en 3 ocasiones en un tarro de tinción.
15. Exponer las láminas a 300 μL de un anticuerpo secundario fluorescente diluido en un tampón bloqueador durante 1 hora a temperatura ambiente, en una cámara humidificada. Asegúrate de que el tejido esté completamente cubierto por el anticuerpo secundario. Se utilizó el siguiente anticuerpo secundario fluorescente: anti-conejo Alexa Fluor 555 (dilución 1:150).
    NOTA: A partir de este momento, las láminas deben protegerse de la luz para evitar el fotoblanqueamiento de los fluoróforos. Las diluciones de anticuerpos secundarios serán específicas de cada reactivo y deben seguir las recomendaciones del proveedor.
16. Enjuaga las diapositivas sumergiéndolas en serie en PBS durante 5 minutos en 3 ocasiones en un tarro de tinción.
17. Expone las láminas a la tinción nuclear sumergiéndolas en una solución de Hoechst diluida 1:5000 en PBS durante 20 minutos en un tarro de tinción.
18. Enjuaga las diapositivas sumergiéndolas en serie en PBS durante 5 minutos en 3 ocasiones en un tarro de tinción.
19. Limpia cuidadosamente cualquier PBS de las láminas usando un papel de seda no abrasivo. Añade 50 μL de medio antifade y un deslizante de cobertura.

7. Extracción de ARN

1. Congela bruscamente todo el colon o un fragmento en nitrógeno líquido y luego almacena a -80 °C. Alternativamente, sumergirse en 1,5 mL de solución preservadora de RNALater y almacenarla según las instrucciones del fabricante.
2. Descongela colon previamente congelado y colócala sobre una superficie plana. Altera y homogeneiza el tejido con un homogeneizador portátil.
3. Aísla ARN usando el kit, siguiendo las instrucciones del fabricante.
4. Mide la concentración de ARN usando un espectrofotómetro. Las proporciones A₂₆₀/_{A 280} > 1,8 y A₂₆₀/_{A 230} de 2,0–2,2 indican una pureza aceptable del ARN.
5. Procede a la transcripción inversa, seguida de qPCR con tinte intercalante verde SYBR.
6. Analiza los resultados utilizando la plataforma de cuantificación o un instrumento similar.

Resultados

Ratones machos y hembras IL-10-KO desarrollan enterocolitis tras una breve exposición a una dieta fortificada con piroxicam (Figura 1A–E). Para el segundo día, los ratones expuestos al piroxicam mostraron una pérdida de peso estadísticamente significativamente mayor que sus controles regulares alimentados con comida del mismo sexo, y se observó una pérdida de peso comparable entre sexos (Figura 1B). La ingesta diaria aparente de alimentos se mantuvo sin cambios durante la exposición al piroxicam y el desarrollo de enterocolitis, y se asemejó a la ingesta de comida estándar, lo que indica que la pérdida de peso en este modelo no está impulsada principalmente por una reducción en la ingesta, sino por otros factores que favorecen el gasto metabólico (Figura 1C).

Para investigar más a fondo la progresión de la inflamación intestinal, la actividad de la enfermedad se evaluó mediante una puntuación combinada de pérdida de peso, sangre en las heces, consistencia de las heces y grado de prolapso rectal. El índice de actividad de la enfermedad modificada (DAI) se evaluó al inicio y al día 7; las puntuaciones del día 7 se muestran en la Figura 1D. Además, el desarrollo de enterocolitis observado en ratones expuestos al piroxicam se asoció con una fuerte tendencia al aumento de la mortalidad, aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p = 0,12; Figura 1E). En este modelo, la mortalidad temprana es secundaria a que los ratones alcanzan objetivos humanos (pérdida de peso > 20%) y afecta preferentemente a los hombres (Figura 1E). Si la mortalidad es un punto experimental muy buscado, se puede considerar un mayor número de animales experimentales que los utilizados aquí. En este estudio, los autores utilizaron el número mínimo de animales necesario para lograr potencia estadística mediante la finalización del estudio, teniendo en cuenta la mortalidad esperada.

El acortamiento del colon es una característica asociada con la gravedad de la colitis en modelos murinos. En la cosecha, tanto ratones machos como hembras alimentados con dieta con piroxicam tenían colon más corto que aquellos alimentados con comida normal (Figuras 2A–B). Tras la evaluación histológica, los colones del grupo alimentado con piroxicam mostraron daño epitelial y aumento de la infiltración de células inmunitarias, cambios asociados a colitis (Figura 2C). Estos hallazgos se tradujeron en una puntuación histológica más alta (Figura 2D). Además, se evaluaron los niveles transcripcionales de citocinas proinflamatorias implicadas en modelos de EII humana y murinos de colitis^. De acuerdo con informes previos, colons de ratones alimentados con piroxicam con IL-10-KO mostraron una regulación alcista significativa de las citocinas proinflamatorias a nivel de transcripción (Figura 3A–D). Cabe destacar que este cambio transcripcional no se observó en ratones IL-10-KO que recibieron comida regular ni en ratones WT que recibieron dieta fortificada con piroxicam, lo que indica que la firma transcripcional fue impulsada por una combinación de deficiencia de IL-10 y piroxicam, y no solo por cualquiera de los factores. Finalmente, los autores confirmaron que la firma transcripcional observada en el colon en ratones tratados con piroxicam se asociaba con un aumento de la tinción de calprotectina en la mucosa del colon (Figura 3E)^24,25.

Figura 1: Enterocolitis acelerada con Piroxicam en ratones IL-10-KO. (A) Visión esquemática del protocolo experimental. (B) Peso corporal, (C) ingesta de alimentos, (D) índice de actividad de la enfermedad (DAI) del día 7, (E) curva de supervivencia en ratones machos de 8 semanas y hembras IL-10-KO de 8 semanas que reciben una dieta fortificada con piroxicam o una dieta regular. Hombre control: n = 5, macho piroxicam: n = 5, femenino control: n = 6, hembra piroxicam: n = 6 en (B), (C) y (D). Hombre control: n = 6, macho piroxicam: n = 10, femenino control: n = 6, hembra piroxicam: n = 7 in (E). * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 por comparación por pares de ratones machos (asteriscos superiores) y hembras (asteriscos inferiores) en (B). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando una prueba t no emparejada de dos colas en (B), (C) y (D), y una prueba logarítmica en (E). Se representan valores de medias y barras de error que representan el error estándar de la media (SEM). En los gráficos de barras, las mediciones individuales se representan mediante gráficos de jitter. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Acortamiento del colon y evaluación histológica. (A) Muestras representativas de colon de ratones machos y hembras de 8 semanas de interleucina-10-knockout (IL-10-KO) recibiendo una dieta con piroxicam (arriba) o una dieta regular (abajo) durante 7 días. Barra de báscula = 1 cm. (B) Longitud del colon en el día 7 (control masculino: n = 5, piroxicam masculino: n = 5, control femenino: n = 6, piroxicam femenino: n = 6). (C) Imágenes representativas de colon teñido con HE. Barra de la escala = 100 μm. (D) Puntuación histológica en el día 7. Prueba t sin pareja de dos colas en (B) y (D). Se representan valores medios y barras de error que representan el SEM. En los gráficos de barras, las mediciones individuales se representan mediante gráficos de jitter. No significativo (NS), * p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001 en comparación por pares. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Cambios inflamatorios en enterocolitis acelerada por piroxicam. Resultados cuantitativos de RT-PCR de (A) Tnf, (B) Il6, (C) Il1b y (D) Ifng en tejido colónico de ratones machos tipo salvaje (WT) e interleucina-10-knockout (IL-10-KO) de 8 semanas en el momento de la cosecha. Para paneles A–D, WT piroxicam n = 7, KO piroxicam n = 6, KO control n = 3. (E) Tinción representativa de inmunofluorescencia con calprotectina en tejido colónico de ratones IL-10-KO de 8 semanas en el momento de la cosecha. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando una prueba t sin pareja de dos colas. Se representan valores de medias y barras de error que representan el error estándar de la media (SEM). En los gráficos de barras, las mediciones individuales se representan mediante gráficos de jitter. Barra de escala en (E) = 200 μm. No significativo (NS), * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 en comparación por pares. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Dominio	Partitura
Peso	0 – Sin cambios
	1 – Pérdida del 1–5%
	2 – Pérdida de 6–10%
	3 – Pérdida de 11–20%
	4 – ; Pérdida superior al 20%
Consistencia de las heces	0 – Normal ;
	1 - Blanda pero formada
	2 – Heces blandas (no acuosas)
	4 – Diarrea (heces líquidas)
Sangrado	0 – Ninguno
	2 – Heces hematoocultas positivas
	3 – Sangre visible en las heces
	4 – Sangrado macroscópico por recto
Prolapso rectal	0 – Ausente
	1 – Presente
Puntuación total	Puntuación total: Suma de (puntuaciones de dominio) para cada dominio

Tabla 1: Puntuación de actividad de la enfermedad (DAI). Un sistema de puntuación para determinar la actividad de la enfermedad según la pérdida de peso, la consistencia de las heces, la sangre en las heces y el prolapso rectal. Adaptado de Sifuentes-Domínguez, et^{al 26}.

Daño tisular					Infiltración de células inflamatorias de la lámina propia
Características		Participación			Características		Participación
0	Ninguno	1	Entre el 1 y el 25% de la superficie		0	Poco frecuente	1	Entre el 1 y el 25% de la superficie
1	Poco frecuentes;	2	26–50% de la superficie		1	Aumentó, algunos neutrófilos	2	26–50% de la superficie
2	Erosiones y úlceras mucosas	3	51–75% de la superficie		2	Presencia submucosa de grupos celulares inflamatorios	3	51–75% de la superficie
3	Daño extenso en la pared intestinal profunda	4	76–100% de la superficie		3	Infiltraciones celulares transmurales	4	76–100% de la superficie

Tabla 2: Sistema de puntuación histológica. Sistema de puntuación para determinar cambios histológicos y daños. Adaptado de Sifuentes-Domínguez, et^{al 26}.

Discusión

La enfermedad inflamatoria intestinal es un trastorno poligénico complejo en el que los modelos preclínicos sirven como herramientas invaluables para diseccionar vías que contribuyen a la patogénesis de la EII y desarrollar nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas. Actualmente, muchos modelos preclínicos de EII dependen de la exposición química, como el dextrán sulfato sódico (DSS), la oxazolona y el ácido sulfónico trinitrobenceno (TNBS), debido a su facilidad de uso. También existen modelos genéticos que desarrollan colitis espontánea. Entre ellos, el modelo IL-10-KO es especialmente valioso porque se sabe que las variaciones genéticas en la vía IL-10 causan inflamación intestinal en humanos, y los ratones IL-10-KO desarrollan enterocolitis crónica espontánea que se asemeja a una enfermedad humana. Sin embargo, una limitación importante de este modelo es su incapacidad para explicar la variabilidad fenotípica. Aunque la enterocolitis se desarrolla espontáneamente, su inicio puede variar dependiendo del fondo de la cepa y las condiciones del^{vivario 27}.

Al combinar la exposición química con un modelo genético, el protocolo descrito aquí proporciona un modelo murino fiable y reproducible de colitis experimental. La enterocolitis se acelera en ratones IL-10-KO por piroxicam, con inicio de la enfermedad en un plazo de 7 días tras la exposición a la dieta enriquecida con piroxicam. Este protocolo permite la sincronización del desarrollo de la colitis. El modelo recapitula características observadas en otros modelos murinos comúnmente usados de colitis, incluyendo pérdida de peso, sangre en heces, diarrea, acortamiento del colon, daño histológico y cambios transcripcionales. Además, este modelo es reproducible en la cepa ampliamente utilizada C57Bl/6J, lo que facilita la exploración de defectos génicos adicionales asociados a la EII gracias a la relativa facilidad de generación de ratones con mutaciones adicionales en esta cepa.

El modelo descrito aquí proporciona una herramienta útil para estudiar los cambios metabólicos durante la inflamación intestinal. En este modelo, los ratones expuestos al piroxicam que desarrollan enterocolitis acelerada continúan alimentándose normalmente sin una disminución significativa en la ingesta diaria. Esto indica que la pérdida de peso en este modelo no se debe a una alimentación deficiente, sino a factores adicionales. Se necesitan más estudios para determinar si estos resultados se deben a un aumento del gasto calórico debido a la inflamación, una pérdida calórica excesiva por diarrea o una termogénesis alterada. Además, ratones machos y hembras muestran patrones similares de gravedad de la enfermedad, un hallazgo que contrasta con observaciones previas realizadas en los modelos IL-10-KO y^DSS 28,29,30.

Existen varios pasos importantes para la resolución de problemas que aseguran la reproducibilidad de este modelo. Primero, los ratones deben estar acostumbrados a la manipulación y observación diaria durante una semana antes de la exposición al piroxicam. Esto previene la pérdida de peso asociada al estrés. En segundo lugar, las jaulas no deben contener más de tres ratones, y solo deben incluirse en el experimento los ratones que estén alojados armoniosamente. Los ratones que presentan comportamiento de lucha o heridas de pelea son más susceptibles al desarrollo de colitis y pueden sucumbir antes de la captura^31,32. Tercero, si se va a monitorizar la ingesta de alimentos durante todo el experimento, los ratones deberían alojarse individualmente para permitir una medición precisa del consumo de comida. Además, solo deben colocarse pellets grandes e intactos en los tolvas de alimentación para evitar que se desmoronen en la cama, lo que puede afectar a las mediciones. Los métodos para cuantificar la ingesta de alimentos descritos aquí están en línea con las directrices publicadas para el consumo de alimentos^{para roedores 33}. Por último, los cambios en la jaula deben evitarse durante el experimento, ya que cambios ambientales repentinos pueden reducir la ingesta de alimento durante 1–2 días, especialmente en ratones jóvenes.

Este protocolo tiene varias limitaciones. En primer lugar, la evaluación de las alteraciones metabólicas se limita al peso corporal y la ingesta de alimentos, mientras que otras medidas del metabolismo sistémico, como la relación de intercambio respiratorio (RER), el gasto energético y la actividad física, no se evaluaron. Además, no se investigaron los mecanismos subyacentes a la pérdida de peso; Por lo tanto, las contribuciones relativas de la reducción en la ingesta de alimentos, alteración del gasto energético, malabsorción y otros factores asociados a la inflamación intestinal siguen siendo inciertas. En segundo lugar, solo se recogió y analizó tejido colónico, mientras que otros órganos implicados en la regulación metabólica, incluyendo tejido adiposo, hígado y músculo esquelético, no se examinaron. Tercero, este protocolo se desarrolló utilizando ratones C57BL/6 IL-10-KO, que pueden mostrar una susceptibilidad diferente a la colitis en comparación con otros antecedentes genéticos. A pesar de estas limitaciones, el protocolo puede adaptarse fácilmente para incorporar fenotipado metabólico adicional y análisis de tejidos extraintestinales, permitiendo investigar los mecanismos subyacentes a la pérdida de peso, así como la relación entre la inflamación intestinal y alteraciones metabólicas^{sistémicas 34}, o la evaluación de nanomateriales antiinflamatorios^{novedosos 35}. Además, el enfoque debería ser aplicable a otras cepas de ratón IL-10-KO, aunque se justifican estudios adicionales de validación.

En resumen, los autores informan de un protocolo eficiente y reproducible que induce enterocolitis simultáneamente en varios ratones IL-10-KO y permite evaluar el comportamiento alimentario. Se necesitan más estudios para investigar los efectos de la enterocolitis en el gasto energético y la composición corporal en este modelo, revelando así conexiones más amplias entre la EII y el metabolismo del huésped.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10% buffered formalin	StatLab	28600-1	1 Galllon
27 G needles	BD	305109
Anti-S100A8 + S100A9 antibody	Abcam	AB288715
Balance	Fisher scientific	S94792D	Fisher Science Education Portable Balances, 300 g
Citrate buffer	Sigma Aldrich	C9999-1000mL
DI water	Fisher scientific	STLSL301
Dissecting forceps	Fisher scientific	22-327379
Ethanol, 100% 200 proof	Fisher scientific	NC1675398	Pharmco Products ETHYL ALCOHOL 200 PROOF
Ethanol, 190 proof, 95%	Fisher scientific	AC615110010
Ethanol, 80%	Fisher scientific	T08204K7
EZ-Quick Slide Staining Dish	IHC world	IW-2511	Staining jar
EZ-Quick Slide Staining Rack	IHC world	IW-2512	Slide rack
Feeding needle	Fisher scientific	NC9924986	22 gauge, 25 mm
Fine scissors	Fisher scientific	14060-11
Flat forceps	Fisher scientific	21-125-109
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 555	Thermo Fisher	AB_2535849
Handheld homogenizer	Fisher scientific	15-340-167
HemoCue	Danlee Medical Products, Inc.	BCK 64151A	Hemoccult Dev/ Single Slide Test Cards - CLIA Waived
Hoechst 33342	Invitrogen	62249
IL-10 KO Mice	The Jason Laboratory	Strain #: 002251	IL10-KO mice, genotype: B6.129P2-IL-10tm1Cgn/J
IVC mouse caging	Allentown	Mouse 500
Liquid nitrogen	Airgas	NI UHP300
Microscope cover glass	Fisher scientific	12541033
Nanodrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Normal Goat serum	Vector labs	S-1000-20
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Petri dishes	Fisher scientific	FB0875713
Piroxicam	Sigma Aldrich	P0847	supply to inotiv for preparation of custom animal diet
Piroxicam-fortified chow	Inotiv	Custom	200 ppm
Primer: Mouse GAPDH forward	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3' forward
Primer: Mouse GAPDH reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3' reverse
Primer: Mouse IFN-G forward	Sigma Aldrich	N/A	5' ACTGGCAAAAGGATGGTGAC 3' forward
Primer: Mouse IFN-G reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGAGCTCATTGAATGCTTGG 3' reverse
Primer: Mouse IL-10 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' CTTGCACTACCAAAGCCACA 3' (common)
Primer: Mouse IL-10 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTATTGTCTTCCCGGCTGT 3' (Wild type reverse)
Primer: Mouse IL-10 reverse (2)	Sigma Aldrich	N/A	5' CCACACGCGTCACCTTAATA 3' (Mutant reverse)
Primer: Mouse IL-1B forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCTGAAAGCTCTCCACCTCA 3' forward
Primer: Mouse IL-1B reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGCCACAGGTATTTTGTCG 3' reverse
Primer: Mouse IL-6 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTCTCTGGGAAATCGTGGA 3' forward
Primer: Mouse IL-6 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TTTCTGCAAGTGCATCATCG 3' reverse
Primer: Mouse TNF forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCAGGTTCTGTCCCTTTCAC 3' forward
Primer: Mouse TNF reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGTGCCTCTTCTGCCAGTTC 3' reverse
QuantStudio 7 Pro	Thermo Fisher	A43183
RNAlater solution	Invitrogen	AM7020	RNA Stabilization Solution, 100 mL
Rneasy mini kit	Qiagen	74104
SHURDry SD-II Slide Dryer	General data	SD-ll-120
Simport Scientific EasyDip Slide Staining Rack	Fisher scientific	22-038-494	Staining rack
SlowFade Gold antifade reagent	Invitrogen	S36936
Staining dish support	BioSB	BSB7086
Staintray IHC slide staining system	IHC world	M918-1	Humidified chamber for IHC
SuperScript VILO	Invitrogen	11755050
SYBR Green Master mix	Applied Biosystems	A46109
Tintoretriever pressure cooker	BioSB	BSB7008
Tissue cassettes	Fisher scientific	50-197-8152	Research Products International Corp Tissue Processing Cassette, Pink, 500 per Case
Xylene	Pharmco	399000000	1 Gallon