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Artículo de método

Un modelo de enterocolitis acelerada por piroxicam en ratones knockout interleucina-10 para estudiar alteraciones metabólicas inducidas por inflamación

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DOI:

10.3791/71448

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11 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, The University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Pathology, University of Texas Southwestern Medical Center, 3Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center

En este artículo

Resumen

Este protocolo utiliza piroxicam para acelerar el desarrollo de colitis en el modelo murino knockout de interleucina (IL-10). El protocolo garantiza la sincronización de la colitis, lo que resulta en resultados rigurosos y reproducibles, independientes del sexo, la tensión de fondo o las condiciones del vivario. Sirve como un modelo útil para estudiar alteraciones metabólicas durante la inflamación intestinal.

Resumen

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un trastorno inflamatorio crónico del tracto digestivo que afecta a más de 10 millones de personas en todo el mundo. Aunque una investigación sustancial se ha centrado en los mecanismos inmunológicos y las consecuencias subyacentes a la EII, se sabe menos sobre cómo la inflamación mucosa contribuye a la desregulación metabólica, incluyendo la pérdida de peso y la reducción del apetito. Aquí, los autores describen un modelo murino de enterocolitis acelerada por piroxicam en ratones con interleucina-10-knockout (IL-10-KO) para estudiar la desregulación metabólica inducida por la inflamación. Se sabe que los ratones IL-10-KO desarrollan enterocolitis espontánea y tienen una mayor susceptibilidad a la enterocolitis provocada por infecciones o medicamentos. Sin embargo, se han reportado condiciones de vivario y antecedentes de la cepa como factores de confusión en el desarrollo de la colitis en este modelo. Se ha demostrado que el Piroxicam, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), desencadena o acelera la enterocolitis en modelos animales al aumentar la exposición mucosa a bacterias luminales. En este protocolo, los ratones machos y hembras de IL-10-KO fueron alimentados con una dieta fortificada con piroxicam en lugar de la dieta habitual de comida. Se midieron diariamente la ingesta de alimentos y el peso corporal para reflejar alteraciones metabólicas en todo el cuerpo, junto con manifestaciones clínicas de enterocolitis como diarrea y sangrado rectal. El protocolo es eficiente y reproducible, induciendo enterocolitis simultáneamente en varios ratones, y permite evaluar la desregulación metabólica en un modelo de enfermedad inflamatoria intestinal. Estudios posteriores que utilicen este protocolo podrían investigar los efectos de la enterocolitis sobre otros componentes de la desregulación metabólica, como el gasto energético y la composición corporal, revelando conexiones más amplias entre la enfermedad inflamatoria intestinal y el metabolismo del huésped.

Introducción

La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, conocidas colectivamente como enfermedad inflamatoria intestinal (EII), son trastornos autoinmunes crónicos del tracto gastrointestinal caracterizados por inflamación mucosa con manifestaciones clínicas que incluyen dolor abdominal, pérdida de peso, hematoquecia y diarrea. La EII afecta a millones de personas en todo el mundo, con la mayor prevalencia en las sociedadesoccidentalizadas 1. En Estados Unidos, se estima que más de 3 millones de personas se venafectadas 2,3, con un aumento de la incidencia y prevalencia, especialmente entre niños y jóvenes 4,5.

Los mecanismos exactos que subyacen a la patogénesis de la EII siguen siendo incompletamente comprendidos, pero se piensa ampliamente que la enfermedad resulta de una respuesta inmune exagerada a la microbiota intestinal en individuos genéticamente susceptibles. Las citocinas que modulan las respuestas inflamatorias desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis intestinal y en el desarrollo de la EII. Entre ellas, la interleucina-10 (IL-10) es una citoquina antiinflamatoria bien estudiada que ayuda a mantener la homeostasis inmunológica en humanos regulando tanto los brazos innatos como adaptativos de la respuestainmunitaria 6,7. Cabe destacar que se han identificado polimorfismos en IL-10 y su receptor (IL-10RA/B) en lactantes con EII de inicio muy temprano (VEO-IBD), presentándose clásicamente con enfermedad perianal en los primeros meses devida. Esta asociación se ve reforzada por la secuenciación a gran escala del exoma en pacientes adultos con enfermedad de Crohn, que identificó la IL-10RA como un locus de susceptibilidad a la enfermedad en laEII 9 no monogénica. Además, se ha descrito una vía no genética que involucra anticuerpos neutralizantes de IL-10 en pacientes con EII-VEO, lo que subraya aún más la importancia de esta vía para mantener la homeostasis inmunemucosa 10.

Basándose en estudios humanos que implican la IL-10 en la EII, se han desarrollado ratones interleucina-10-knockout (IL-10-KO) como modelo para estudiar el papel de la IL-10 en la EII. Se sabe que los ratones IL-10-KO desarrollan enterocolitis espontánea con una respuesta exagerada de CD4+ Th1 a estímulos, que suele comenzar entre las 8 y 12 semanas de edad alos 11 años. Sin embargo, el desarrollo de enterocolitis espontánea en ratones IL-10-KO puede ser impredecible en ausencia de un agenteacelerador 12,13,14, dependiendo de la cepa genética, la composición de la microbiota y las condiciones de vivienda 15,16. El uso de un protocolo fiable para inducir la colitis es fundamental para que el modelo IL-10-KO sea prácticamente útil. Estudios previos han utilizado antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) como el piroxicam para inducir enterocolitis en ratones IL-10-KO17,18. Sin embargo, estos estudios se han centrado principalmente en alteraciones inmunológicas, con relativamente poco énfasis en los efectos de la enterocolitis sobre el metabolismo o en el papel del sexo en la gravedad de lacolitis 19. Los autores aquí describen el uso de una dieta fortificada con piroxicam para inducir enterocolitis en ratones IL-10-KO y caracterizan la desregulación metabólica y las respuestas inflamatorias mucosas en este modelo utilizando tanto ratones machos como hembras. Este protocolo mide el peso corporal y la ingesta de alimentos para reflejar alteraciones metabólicas en todo el cuerpo, así como manifestaciones clínicas de colitis y cambios histológicos y transcriptómicos que reflejan inflamación mucosa. Este modelo eficiente y reproducible proporciona una herramienta valiosa para investigar la conexión entre la EII y el metabolismo del huésped.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron cumpliendo con el protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas, de acuerdo con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" [Número de aprobación: 2017-102011]. La eutanasia se realizó conforme a las directrices institucionales. No se requirió anestesia para los procedimientos realizados. Los detalles específicos de los materiales se describen en la Tabla de Materiales.

1. Establecimiento del modelo de enterocolitis acelerada con piroxicam en ratones IL-10-KO

  1. Mantener ratones IL-10-KO en una instalación específica libre de patógenos (SPF) en un ciclo de luz de 12 horas con acceso improvisado a comida y agua.
  2. Alojan individualmente ratones de 7 a 8 semanas, de edad y sexo emparejados en jaulas de microaisladores. Permite que los ratones se aclimaten a alojamientos individuales y a la manipulación diaria durante al menos una semana antes del inicio del experimento.
    NOTA: Asegúrese de que el peso corporal sea de >20 g en los machos o >17 g en las hembras, y que los ratones estén libres de heridas de pelea.
  3. Asigna ratones a un grupo experimental y a un grupo de control. Para el grupo experimental, sustituir la comida estándar por comida fortificada con piroxicam. Para el grupo de control, proporciona comida estándar fresca. Añade 50 g de comida a cada tolva de jaula.
    NOTA: Asigna al menos cinco ratones por sexo a cada grupo. El alimento fortificado con piroxicam (200 ppm) fue preparado por Teklad usando piroxicam suministrado por los investigadores para la elaboración de una dieta personalizada para animales de laboratorio. Para minimizar la variabilidad de un lote a otro, se recomienda que todos los animales dentro de un experimento reciban comida del mismo lote de producción. Cuando sea posible, el mismo lote también debe usarse en experimentos para mejorar la reproducibilidad.

2. Monitorización del peso corporal y del comportamiento alimentario

  1. Usando una báscula analítica, registra el peso corporal de cada ratón. Pesa cada ratón individualmente a la misma hora cada día, diariamente durante 7 días consecutivos. Informa el peso corporal diario como porcentaje del peso base en el día 0 (fijado en 100%).
    NOTA: Una pérdida de peso superior al 20% indica un estrés excesivo y riesgo de muerte inminente. Los ratones deben ser sacrificados si se alcanza este umbral.
  2. Utilizando una báscula analítica, registra el peso inicial del chow fortificado con piroxicam y del chow estándar en cada jaula.
  3. Luego, mide el resto de la comida en cada tolva de jaula a la misma hora cada día, diariamente durante 7 días consecutivos.
  4. Calcula el consumo diario de comida restando el peso del resto del que queda el día anterior.
    NOTA: Comprueba rutinariamente la cantidad de comida y rellena si está por debajo de 10 g. La palatabilidad del chow de piroxicam no influye en su ingesta y debería parecerse mucho a la de la comida estándar.

3. Monitorización de la actividad de la enfermedad

  1. En los días 0 y 7, inspecciona visualmente los pellets fecales de ratones individuales y determina la presencia de sangre en las heces.
  2. Si no se ve sangre, realiza una prueba de sangre oculta fecal untando un pellet sobre la tarjeta de prueba y luego añadiendo el reactivo revelador suministrado. Resultados de puntuación según la Tabla 1.
  3. En los días 0 y 7, inspecciona visualmente los pellets fecales recién expulsados para evaluar la consistencia de las heces. Usa pinzas planas para ayudar a determinar la consistencia. Resultados de puntuación según la Tabla 1.
  4. En los días 0 y 7, determinar el grado de prolapso rectal inspeccionando la región perianal. Resultados de puntuación según la Tabla 1.
  5. Mide el peso corporal como se ha descrito antes. Resultados de puntuación según la Tabla 1.
    NOTA: La puntuación del índice de actividad de la enfermedad (DAI) debe realizarse de forma ciega por el mismo investigador durante todo el experimento para garantizar la consistencia, minimizar el sesgo del observador y mejorar la fiabilidad de la evaluación.

4. Extracción de tejido colónico

  1. Eutanasiar ratones por asfixia por CO2 y luxación cervical según se informó enotros lugares 20.
  2. Coloca al ratón en posición supina y rocía un 70% de etanol en el abdomen ventral.
  3. Levanta la piel con pinzas y usa tijeras quirúrgicas para cortar a lo largo de la línea media. Expone la cavidad peritoneal y localiza el colon.
  4. Expone el colon y el ceco mediante una disección contundente. Extirpa el colon en bloque, incluyendo el ceco y el manguito anal.
  5. Coloca el colon sobre una superficie plana y retira cualquier tejido conectivo.
  6. Mide y registra la longitud de los dos puntos.
  7. Tras medir la longitud del colon, retirar el ceco cortando en la unión ceco-colon.
  8. Prepara una jeringuilla de 10 mL llena de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con una aguja de acero reutilizable de punta de bola calibre 22 acoplada. Introduce la aguja en el colon y elimina el contenido intestinal.
  9. Coloca el colon enjuagado en una placa de Petri que contiene PBS y enjuaga para eliminar el contenido residual. Una vez aprobado, úsalo para ensayos posteriores.

5. Análisis histológico

  1. Coloca el colon plano sobre una lámina de cristal. Utiliza pinzas para envolver el tejido alrededor de sí mismo, empezando por el extremo distal, formando un "Swiss roll". De este modo, el extremo distal/anal permanecerá en el rollo interno, mientras que las regiones más proximales se extenderán hasta el rollo externo.
  2. Usando una aguja calibre 27, sujeta el colon enrollado para mantener el rollo y colócalo dentro de un casete de tejido incrustado.
  3. Para fijar tejidos, sumergir los casetes de tejido en una solución de formalina tamponada al 10% durante 16 horas a 4 °C.
    PRECAUCIÓN: El 10% de formalina es perjudicial si está en contacto con la piel y puede causar quemaduras graves y daños oculares. Maneja con precaución con guantes protectores y gafas científicas. El formol residual debe eliminarse correctamente siguiendo las directrices institucionales.
  4. Tras la fijación de formalina, procesa los tejidos para incrustar parafina y seccionalos para montarlos en portaobjetos de vidrio.
    NOTA: Las muestras deben enviarse a un laboratorio de histología con el equipo necesario para procesar casetes de tejido en parafina, sección en voluta, montaje en portaobjetos y tinción de hematoxilina y eosina.
  5. Laminas de tejido tinte con hematoxilina y eosina (HE), según los protocolosestablecidos 21.
  6. Utilizando el sistema de puntuación histológica descrito en la Tabla 2, evalúe las siguientes características histológicas en cada sección: daño tisular por enterocolitis, infiltración celular inflamatoria de la lámina propia y porcentaje de área afectada. Combina las puntuaciones de cada sección para generar una puntuación total (Tabla 2).
    Puntuación total = Afectación × características (daño tisular) + Afectación × características (infiltración celular inflamatoria de la lámina propia) (1)
  7. Imágenes histopatológicas representativas del daño tisular y la infiltración celular pueden encontrarse en la publicación de Erben etal 22.
    NOTA: La puntuación histológica debe realizarse de forma ciega, preferiblemente por un patólogo formado, para garantizar la consistencia y fiabilidad de la evaluación.

6. Tinción inmunofluorescente de tejido incrustado en parafina fijada en formalina

  1. Coloca las lamas de papel en una rejilla de correderos y en un secador de correderos a 55 °C durante 1 hora para fundir parafina.
  2. Coloca las láminas en una rejilla de tinción y sumerge la rejilla secuencialmente durante 3 minutos en tarros de teñido con xileno. Repite este paso en 3 ocasiones.
  3. Sumerge la rejilla de tinción durante 3 minutos en tarros con etanol al 100%. Repite este paso en 3 ocasiones.
  4. Sumerge la rejilla de tinción durante 3 minutos en el tarro con etanol al 95%.
  5. Sumerge la rejilla de tinción durante 3 minutos en el tarro con etanol al 80%.
  6. Sumerge la rejilla de tinción durante 5 minutos en tarros de tinción con agua desionizada (DI).
    NOTA: Todos los pasos previos deben realizarse en una campana ventilada debido a los vapores de xileno. Maneja con precaución con guantes protectores y gafas científicas. El xileno residual debe eliminarse adecuadamente conforme a las directrices institucionales.
  7. Transfiere los portaobjetos a una rejilla para correderos y sumergiértelos en un tarro de tinción con una solución de extracción de citrato de 1×.
  8. Coloca el tarro de tinción en el soporte del plato de tinción.
  9. Coloca el soporte para el plato de tinte en la olla a presión.
  10. Cocina durante 15 minutos en una olla a presión.
  11. Recupera las láminas de la olla a presión y déjalas enfriar hasta la temperatura ambiente.
  12. Incubar las láminas con un tampón bloqueador de 300 μL (suero de cabra al 3,5% diluido en PBS) durante 1 hora en una cámara humidificada. Asegúrate de que el tejido esté completamente cubierto por el buffer bloqueante.
  13. Exponer las láminas a 300 μL de anticuerpo primario diluido en un tampón bloqueador durante 16 horas a 4 °C, dentro de una cámara humidificada. Asegúrate de que el tejido esté completamente cubierto por el anticuerpo primario. Se utilizó el siguiente anticuerpo primario: Anti-S100A8/S100A9 (1:500).
    NOTA: Las diluciones de anticuerpos serán específicas del reactivo y deben seguir las recomendaciones del proveedor.
  14. Enjuaga las diapositivas sumergiéndolas en serie en PBS durante 5 minutos en 3 ocasiones en un tarro de tinción.
  15. Exponer las láminas a 300 μL de un anticuerpo secundario fluorescente diluido en un tampón bloqueador durante 1 hora a temperatura ambiente, en una cámara humidificada. Asegúrate de que el tejido esté completamente cubierto por el anticuerpo secundario. Se utilizó el siguiente anticuerpo secundario fluorescente: anti-conejo Alexa Fluor 555 (dilución 1:150).
    NOTA: A partir de este momento, las láminas deben protegerse de la luz para evitar el fotoblanqueamiento de los fluoróforos. Las diluciones de anticuerpos secundarios serán específicas de cada reactivo y deben seguir las recomendaciones del proveedor.
  16. Enjuaga las diapositivas sumergiéndolas en serie en PBS durante 5 minutos en 3 ocasiones en un tarro de tinción.
  17. Expone las láminas a la tinción nuclear sumergiéndolas en una solución de Hoechst diluida 1:5000 en PBS durante 20 minutos en un tarro de tinción.
  18. Enjuaga las diapositivas sumergiéndolas en serie en PBS durante 5 minutos en 3 ocasiones en un tarro de tinción.
  19. Limpia cuidadosamente cualquier PBS de las láminas usando un papel de seda no abrasivo. Añade 50 μL de medio antifade y un deslizante de cobertura.

7. Extracción de ARN

  1. Congela bruscamente todo el colon o un fragmento en nitrógeno líquido y luego almacena a -80 °C. Alternativamente, sumergirse en 1,5 mL de solución preservadora de RNALater y almacenarla según las instrucciones del fabricante.
  2. Descongela colon previamente congelado y colócala sobre una superficie plana. Altera y homogeneiza el tejido con un homogeneizador portátil.
  3. Aísla ARN usando el kit, siguiendo las instrucciones del fabricante.
  4. Mide la concentración de ARN usando un espectrofotómetro. Las proporciones A260/A 280 > 1,8 y A260/A 230 de 2,0–2,2 indican una pureza aceptable del ARN.
  5. Procede a la transcripción inversa, seguida de qPCR con tinte intercalante verde SYBR.
  6. Analiza los resultados utilizando la plataforma de cuantificación o un instrumento similar.

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Resultados

Ratones machos y hembras IL-10-KO desarrollan enterocolitis tras una breve exposición a una dieta fortificada con piroxicam (Figura 1A–E). Para el segundo día, los ratones expuestos al piroxicam mostraron una pérdida de peso estadísticamente significativamente mayor que sus controles regulares alimentados con comida del mismo sexo, y se observó una pérdida de peso comparable entre sexos (Figura 1B). La ingesta d...

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Discusión

La enfermedad inflamatoria intestinal es un trastorno poligénico complejo en el que los modelos preclínicos sirven como herramientas invaluables para diseccionar vías que contribuyen a la patogénesis de la EII y desarrollar nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas. Actualmente, muchos modelos preclínicos de EII dependen de la exposición química, como el dextrán sulfato sódico (DSS), la oxazolona y el ácido sulfónico trinitrobenceno (TNBS), debido a su facilidad de uso. También exis...

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Divulgaciones

Los autores no declaran ninguna divulgación pertinente.

Agradecimientos

Queremos agradecer a las instalaciones principales de UTSW que contribuyeron al trabajo presentado aquí. Este trabajo contó con el apoyo de las siguientes fuentes de financiación: NIH a través de K08DK127197 (LS-D), T32DK007745 (JW) y la Southwestern Foundation a través de la beca Docstars (LS-D).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10% buffered formalinStatLab28600-11 Galllon
27 G needlesBD305109
Anti-S100A8 + S100A9 antibodyAbcamAB288715
BalanceFisher scientificS94792DFisher Science Education Portable Balances, 300 g
Citrate bufferSigma AldrichC9999-1000mL
DI waterFisher scientificSTLSL301
Dissecting forcepsFisher scientific22-327379
Ethanol, 100% 200 proofFisher scientificNC1675398Pharmco Products ETHYL ALCOHOL 200 PROOF
Ethanol, 190 proof, 95%Fisher scientificAC615110010
Ethanol, 80%Fisher scientificT08204K7
EZ-Quick Slide Staining DishIHC worldIW-2511Staining jar
EZ-Quick Slide Staining RackIHC worldIW-2512Slide rack
Feeding needleFisher scientificNC992498622 gauge, 25 mm
Fine scissorsFisher scientific14060-11
Flat forcepsFisher scientific21-125-109
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 555Thermo FisherAB_2535849
Handheld homogenizerFisher scientific15-340-167
HemoCueDanlee Medical Products, Inc.BCK 64151AHemoccult Dev/ Single Slide Test Cards - CLIA Waived
Hoechst 33342Invitrogen62249
IL-10 KO MiceThe Jason LaboratoryStrain #: 002251IL10-KO mice, genotype: B6.129P2-IL-10tm1Cgn/J
IVC mouse cagingAllentownMouse 500
Liquid nitrogenAirgasNI UHP300
Microscope cover glassFisher scientific12541033
NanodropThermo FisherND-ONE-W
Normal Goat serumVector labsS-1000-20
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma AldrichD8537
Petri dishesFisher scientificFB0875713
PiroxicamSigma AldrichP0847supply to inotiv for preparation of custom animal diet
Piroxicam-fortified chowInotivCustom200 ppm
Primer: Mouse GAPDH forwardSigma AldrichN/A5' AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3' forward
Primer: Mouse GAPDH reverseSigma AldrichN/A5' TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3' reverse
Primer: Mouse IFN-G forwardSigma AldrichN/A5' ACTGGCAAAAGGATGGTGAC 3' forward
Primer: Mouse IFN-G reverseSigma AldrichN/A5' TGAGCTCATTGAATGCTTGG 3' reverse
Primer: Mouse IL-10 forwardSigma AldrichN/A5' CTTGCACTACCAAAGCCACA 3' (common)
Primer: Mouse IL-10 reverseSigma AldrichN/A5' GTTATTGTCTTCCCGGCTGT 3' (Wild type reverse)
Primer: Mouse IL-10 reverse (2)Sigma AldrichN/A5' CCACACGCGTCACCTTAATA 3' (Mutant reverse)
Primer: Mouse IL-1B forwardSigma AldrichN/A5' GCTGAAAGCTCTCCACCTCA 3' forward
Primer: Mouse IL-1B reverseSigma AldrichN/A5' AGGCCACAGGTATTTTGTCG 3' reverse
Primer: Mouse IL-6 forwardSigma AldrichN/A5' GTTCTCTGGGAAATCGTGGA 3' forward
Primer: Mouse IL-6 reverseSigma AldrichN/A5' TTTCTGCAAGTGCATCATCG 3' reverse
Primer: Mouse TNF forwardSigma AldrichN/A5' GCAGGTTCTGTCCCTTTCAC 3' forward
Primer: Mouse TNF reverseSigma AldrichN/A5' AGTGCCTCTTCTGCCAGTTC 3' reverse
QuantStudio 7 ProThermo FisherA43183
RNAlater solutionInvitrogenAM7020RNA Stabilization Solution, 100 mL
Rneasy mini kitQiagen74104
SHURDry SD-II Slide DryerGeneral dataSD-ll-120
Simport Scientific EasyDip Slide Staining RackFisher scientific22-038-494Staining rack
SlowFade Gold antifade reagentInvitrogenS36936
Staining dish supportBioSBBSB7086
Staintray IHC slide staining systemIHC worldM918-1Humidified chamber for IHC
SuperScript VILOInvitrogen11755050
SYBR Green Master mixApplied BiosystemsA46109
Tintoretriever pressure cookerBioSBBSB7008
Tissue cassettesFisher scientific 50-197-8152Research Products International Corp Tissue Processing Cassette, Pink, 500 per Case
XylenePharmco3990000001 Gallon

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