Artículo de método

Edición genómica en células primarias de mamíferos mediante electroporación del ARN editor

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DOI:

10.3791/71449

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31 de julio de 2026

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1Department of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Institute for NanoBioTechnology, Johns Hopkins University

En este artículo

Resumen

La entrega de editores genómicos como ARN es un medio particularmente potente para modificar los genomas de las células y líneas celulares primarias de mamíferos. El objetivo de este protocolo es entregar editores genómicos como ARNm a células y líneas celulares primarias de mamíferos, seguido de secuenciación y análisis dirigidos de Illumina para cuantificar los resultados de edición.

Resumen

Los editores CRISPR, incluyendo nucleasas, editores de bases y editores principales, pueden corregir eficazmente variantes genéticas causantes de enfermedades o alterar genes objetivo. Los resultados de la edición se evalúan comúnmente en células primarias cultivadas, células derivadas del paciente o líneas celulares modificadas para estudiar el impacto de la variación genética o como primer paso antes de iniciar estudios en animales o la traducción clínica. La administración de editores como ARNm junto con ARN guía sintéticos en células de mamíferos puede mejorar la eficiencia de edición en comparación con enfoques basados en plásmidos y prevenir problemas como la integración del ADN o la edición fuera de objetivo por una expresión sostenida. Este artículo presenta un flujo de trabajo para preparar el ARNm del editor genómico mediante transcripción in vitro (IVT), que incluye co-transcripción y nucleótidos modificados químicamente, ARNm editor electroporado y ARN guía en fibroblastos humanos primarios, células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) o líneas celulares linfoblastoides (LCLs), y cuantificar los resultados de la edición mediante secuenciación dirigida de amplicones en una plataforma Illumina seguida de un análisis con CRISPResso2. Este flujo de trabajo permite la comparación cuantitativa de ARN guía, parámetros de electroporación y variantes del editor, y apoya aplicaciones posteriores como clonación unicelular, ensayos fenotípicos, estudios preclínicos con animales y desarrollo terapéutico.

Introducción

La edición eficiente del genoma en células primarias de mamíferos apoya la generación de modelos genéticos y la evaluación preclínica de estrategias terapéuticas candidatas. Los avances recientes en tecnologías basadas en CRISPR, incluyendo la edición de bases y la edición primaria, permiten modificaciones precisas de nucleótidos sin introducir rupturas de ADN de doble hebra, mejorando así la pureza de los resultados deedición 1,2. Estas tecnologías se han aplicado con éxito en estudios de modelización de enfermedades y edición terapéutica del genoma, incluyendo estrategias para corregir variantes que conducen a la enfermedad de célulasfalciformes 3 y fibrosisquística 4.

Una estrategia especialmente eficaz para suministrar componentes de edición genómica a células de mamíferos es la electroporación de ARNm transcrito in vitro (IVT) que codifica la enzima de edición combinada con ARN guía sintéticos (gRNAs). La administración de ARNm permite la expresión transitoria de los editores genómicos, minimizando la actividad prolongada de nucleasas y reduciendo la probabilidad de eventos de edición fuera del objetivo. Los avances en la tecnología de IVT han mejorado la eficiencia, el rendimiento y la calidad de la síntesis deARNm 4,5,6. Las plantillas de ADN plasmidal y las plantillas de ADN derivadas de PCR se utilizan comúnmente para la transcripción in vitro y cada una presenta ventajas y limitaciones distintas. En este protocolo, se prefieren plantillas generadas por PCR para evitar problemas asociados a la propagación de tractos poly(A) largos en plásmidos, que son propensos a la recombinación y a la variabilidad de longitud. Sin embargo, el uso de plantillas de PCR como se describe en este protocolo requiere un cebador inverso costoso que albergue la cola poli(A) de 120 nucleótidos, y la PCR puede ser más propensa a errores que la propagación bacteriana de plásmidos para secuencias no codificadas en los cebadores. Como alternativa, proveedores comerciales como Elegen y 4basebio pueden ofrecer plantillas de ADN de alta fidelidad, ofreciendo una opción fiable, aunque más costosa, para generar plantillas de transcripción.

El diseño cuidadoso del ARN guía es otro componente fundamental para el éxito en experimentos de edición genómica. Se han desarrollado varias herramientas computacionales para ayudar a los investigadores a identificar secuencias óptimas de gRNA basándose en la eficiencia predicha en el objetivo y la mínima actividad fuera del objetivo. Las plataformas más utilizadas incluyen CHOPCHOP y CRISPOR, que permiten identificar secuencias guía compatibles con los requisitos de motivo adyacente al protoespaciador (PAM) de las enzimas Cas y proporcionan métricas de puntuación para priorizar guías candidatas con alta actividad y especificidadpredichas 7,8. Los principios fundamentales y las mejores prácticas para el diseño de ARN guía han sido ampliamente descritos en la literaturaCRISPR 9,10,11,12,13.

La electroporación se utiliza comúnmente para administrar reactivos de edición genómica a células de mamíferos porque puede lograr una alta eficiencia de administración en tipos celulares que suelen ser resistentes a enfoques de transfección basados en lípidos. La electroporación permeabiliza transitoriamente la membrana celular, permitiendo que ácidos nucleicos exógenos como el ARNm y los ARNgs entren en el citoplasma. Se han desarrollado protocolos optimizados de electroporación para múltiples tipos celulares de mamíferos, incluyendo células primarias, fibroblastos, líneas celulares linfoblastoides y células madre pluripotentesinducidas 14. Plataformas comerciales de electroporación como los sistemas Lonza 4D y Amax ofrecen programas y reactivos específicos para cada tipo de célula diseñados para mejorar la eficiencia de entrega manteniendo la viabilidad celular. Sistemas de electroporación de alto rendimiento, como la plataforma Shuttle de 96 pozos Amaxa, permiten además experimentos escalables de edición genómica en múltiples condiciones experimentales. El sistema de electroporación Neón también es comúnmente utilizado, pero no es el foco de este protocolo.

Tras la entrega de los componentes de edición genómica, los resultados de edición suelen evaluarse utilizando secuenciación de nueva generación (NGS) dirigida de la región genómica que rodea el sitio de edición. Las bibliotecas de secuenciación se generan mediante amplificación por PCR del locus objetivo, seguida de indexación y secuenciación de alto rendimiento. Las lecturas de secuenciación resultantes se analizan utilizando canaletas bioinformáticas especializadas diseñadas para experimentos de edición genómica. En este protocolo, los resultados de la edición se cuantifican utilizando CRISPResso2, una plataforma computacional ampliamente utilizada que permite un análisis detallado de los resultados de la edición genómica a partir de datos desecuenciación 15. CRISPResso2 alinea las lecturas de secuenciación a una secuencia de referencia y cuantifica los resultados de edición, incluyendo la eficiencia global de edición, frecuencias de inserción-eliminación (indel), sustituciones precisas de nucleótidos y distribuciones de edición en la región objetivo. El software también proporciona visualizaciones gráficas y resúmenes estadísticos que facilitan la comparación entre condiciones experimentales y la optimización de los parámetros de edición.

En conjunto, la integración de la producción de ARNm de IVT de alta calidad, la entrega optimizada por electroporación y el análisis de secuenciación de alta resolución proporcionan un flujo de trabajo robusto para evaluar estrategias de edición genómica en células cultivadas (Figura 1). Este enfoque permite optimizar iterativamente la eficiencia de la edición, la especificidad y los parámetros experimentales antes de avanzar en estrategias de edición genómica hacia estudios in vivo y posibles aplicaciones terapéuticas.

Protocolo

Declaración ética:
Todos los procedimientos que involucraron líneas celulares de origen humano se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales y los protocolos aprobados.

1. Generar plantilla lineal de ADN usando PCR

Precaución: Realiza todos los pasos del ARN utilizando consumibles y superficies de trabajo libres de RNasa. Considere los editores de ARNm listados y sus diferentes variantes al seleccionar el editor adecuado para la modificación genómica prevista (Tabla 1).

  1. Ensambla la reacción PCR sobre ADN plasmídico extraído de bacterias usando un miniprep o kit de midiprep. Utiliza 20 ng de ADN plasmídico por reacción PCR de 50 μL con la enzima NEBNext Ultra II Q5 Master Mix, ensamblando la PCR como se describe en la Tabla 2.
    1. Utiliza un cebador frontal que corrija el promotor T7 inactivo en el plásmido, lo que impide la transcripción circular.
    2. Utiliza un cebador inverso que introduce una cola poly(A)₁₂₀ de 120 nt para favorecer una transcripción eficiente y la estabilidad del ARNm.
    3. Utilizar N1-metil-pseudouridina en lugar de uracilo e incluir CleanCap AG para mejorar la traducción del ARNm y reducir la activación inmunitariainnata 1,2,3,4 (Figura 1).
      NOTA: Existen otros análogos nucleótidicos y reactivos de tapamiento, pero estos han mostrado de forma constante una alta actividad en ARNm de edición genómica. La entrega basada en nanopartículas es una alternativa adecuada, pero no se discute en este protocolo.
  2. Amplificar la secuencia de codificación del editor mediante PCR durante 30 ciclos usando cebadores que introducen un promotor T7 funcional aguas arriba de la región codificante y una secuencia poly(A) aguas abajo (Tabla 2 y Tabla 3).
    NOTA: La secuencia de nucleótidos de la plantilla de IVT está subrayada en la tabla 4.
  3. Verifica y purifica el producto de PCR
    1. Procesar 5 μL del producto PCR sobre un gel de agarosa al 1% en un tampón TE a 180 V durante 30 minutos. Confirma la presencia de una sola banda aproximadamente a 4000-6500 pb (dependiendo del editor transcrito) antes de proceder a la purificación del producto por PCR.
    2. Purifica el producto de PCR usando un kit de limpieza de PCR (Tabla de Materiales).
      NOTA: Si se observan múltiples bandas o mala calidad del producto PCR, optimiza las condiciones de termociclo (Tabla 5 – Tabla de solución de problemas).
    3. Cuantifica el ADN purificado usando un ensayo fluorométrico de ADNDds. Para el análisis de dsDNA de Qubit, se prepara la mezcla maestra de tampón combinando 796 μL de la solución de trabajo de Qubit de alta sensibilidad con 4 μL de tinte, ambos proporcionados en el kit.
    4. En tubos separados, mezcla 198 μL de la mezcla maestra de tampón con 2 μL del estándar de baja concentración S1, el estándar de alta concentración S2 y la muestra. Inserta cada estándar y muestra según lo indicado en el instrumento fluorómetro Qubit para medir la concentración de stock.
      NOTA: Si las muestras están por encima del rango de análisis, puede ser necesario preparar diluciones.

2. Transcribir el ARNm

  1. Preparar la reacción IVT sobre hielo utilizando ARN polimerasa T7, NTPs, un análogo de la cápsula para el recubrimiento co-transcripcional, y N1-metil-pseudouridina trifosfato como sustituto de la uridina para reducir la activación inmunitariainnata 1˒5˒6.
  2. Prepara la mezcla de reacción de la TVI según la Tabla 4. Utiliza la secuencia de plantillas anotada proporcionada en la Tabla 4. Ensamblar cada reacción de transcripción en un volumen final de 40 μL.
  3. Preparar entre 5 y 10 tubos de reacción para generar suficiente ARNm para múltiples experimentos. Cada reacción de 40 μL genera aproximadamente 100 μg de ARNm. Con 1 μg de ARNm usado para electroporación de edición primaria y 3 μg de ARNm para electroporación de edición de bases, esto es suficiente para ~33–100 electroporaciones.
  4. Transcribe el ARN
    1. Mezcla bien la reacción de la IVT pipeteando. Incuba la reacción a 37 °C durante 2 horas.
  5. Purificar el ARN
    1. Transfiere a un tubo de 1,5 mL y añade una solución de cloruro de litio (LiCl) de 7,5 M a la reacción de la TVI a un volumen igual a la mitad del volumen total de la reacción para lograr una concentración final de LiCl de 2,5 M. Para una reacción IVT de 40 μL, añade 20 μL de 7,5 M LiCl. Mezcla bien con pipeteo suave.
    2. Incuba la reacción a -20 °C durante 30 minutos. Centrifugar la muestra a 16.000 × g a 4 °C durante 15 minutos.
    3. Quita el sobrenadante con una pipeta y deséchalo. Lava el pellet con 1 mL de etanol al 70% a 4 °C. No es necesario alterar el perdigón. Centrifugar a 16.000 × g a 4 °C durante 5 minutos.
    4. Retira completamente el etanol y deja que el pellet se seque al aire durante 1-2 minutos en un armario de bioseguridad libre de RNasa. No seques demasiado los pellets o puede ser difícil volver a suspenderlos.
  6. Volver a suspender y cuantificar el ARN
    1. Resuspende el ARN en agua libre de nucleasa. Inicialmente resuspende cada reacción en 50 μL de agua libre de nucleasa y diluye aún más tras medir la concentración de ARN. Cuantifica el ARN usando un ensayo fluorométrico de ARN como el nanodrop.
      Punto de pausa: Tras la cuantificación del ARN y la alicuación, almacenar las alicuotas del ARNm a -80 °C hasta la electroporación. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación; Descongela cada alicuota solo una vez antes de usarla.
    2. Confirma que el rendimiento de ARNm purificado es aproximadamente de 100-400 μg por reacción de IVT de 40 μL. Diluir el ARNm a 2 μg·μL-1 con agua libre de nucleasas antes de alicuar. Guarda las alicuotas a −80 °C.
      NOTA: Evita ciclos repetidos de congelación y descongelación. Prepara alicotas de un solo uso y desecha el material descongelado sin usar. Preparar 12,5 μL de alicotas en tiras de PCR para 8–20 electroporaciones por alitera.
  7. Evaluar la integridad del ARN
    1. Evaluar el tamaño e integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa o electroforesis automatizada (Figura 2)
    2. Prepara un gel de agarosa al 0,8% que contenga 10.000 veces SYBR Gold diluido. Utiliza una escalera de ARN monocatenario, como el marcador de ARN NEB (ssRNA).
    3. Desnaturaliza el ARNm usando 2x Gel Loading Dye de ARN y calienta las muestras a 65 °C durante 10 minutos antes de cargar las muestras sobre el gel.
    4. Confirma que el ARNm aparece como una banda predominante aproximadamente entre 4000 y 6500 nt, dependiendo del editor transcrito, con un mínimo difuminamiento o productos de bajo peso molecular. Descarta muestras de ARN que presenten una degradación sustancial, difuminación o múltiples bandas inesperadas.

3. Diseño y preparación de ARN guía

NOTA: Identificar secuencias de motivos adyacentes al protoespaciador (PAM) dentro del locus genómico objetivo y seleccionar ARN guía que sean compatibles con el editor elegido y la modificación genómica prevista. Plataformas de diseño de ARN guía como CHOPCHOP, CRISPOR, CRISPRware, IDT Cas9 Checker, Benchling y VectorBuilder pueden utilizarse para priorizar ARN guía con actividad y especificidad predichasfavorables 6,7,8,9,10,11,12,13.

  1. Identificar sitios PAM dentro del locus genómico objetivo que sean compatibles con la variante nucleasa seleccionada, incluidas las compatibles con NGN, utilizando herramientas de diseño de ARN guía.
  2. Selecciona ARN guía con alta actividad predicha en el objetivo y baja actividad predicha fuera del objetivo. Confirma la ventana de edición para el ARN guía.
  3. Para aplicaciones de edición base o edición principal, selecciona ARN guía que posicionen la edición deseada dentro de la ventana de actividad óptima del editor seleccionado.
  4. Orden sgRNA o pegARN que contiene análogos de la base 2'-O-metil para los primeros 3 y últimos 3 nucleótidos, así como un enlace de fosforotioato 3' entre las primeras 3 y las últimas 2 bases de las guías.
  5. Resuspende los ARNōs guía en agua libre de nucleasa o en un tampón TE (100μM). Preparar alicotas de 5 μL y almacenar las alicuotas a −80 °C. En el momento de su uso, descongela y diluye en el buffer de electroporación antes de electroporar.

4. Preparación de cultivos celulares

NOTA: Evalúa la integridad celular mediante microscopía y ensayos de viabilidad antes de la electroporación.

  1. Cultivar fibroblastos primarios o células HEK293T en DMEM suplementados con FBS al 10%, 4,5 g· L-1 glucosa, GlutaMAX y 110 mg· L-1 piruvato sódico. Placar las células en matrazas estériles de T75 (superficie de TC) con un 20% de confluencia por matraz. Mantén las células entre los conductos 1-20. Dividir las células al 80% de confluencia y usar celdas al 70-80% de confluencia para electroporación.
  2. Cultivar células madre pluripotentes en medios mTeSR Plus. Placar las células en matrazas estériles de T75 recubiertas con Geltrex con un 20% de confluencia por matraz. Cambia el medio diariamente y mantén las células entre los conductos 1-20. Añade cóctel CEPT al soporte durante las 24 horas siguientes a cada pasaje. Dividir las células al 80% de confluencia y usar celdas al 70-80% de confluencia para electroporación.
  3. Mantener las celdas a 37 °C en un 5% de CO₂ hasta que alcancen la densidad adecuada para la electroporación, típicamente una confluencia del 70%–80%.
  4. Retirar el medio cuando las células estén en un número y confluencia adecuados para la electroporación.
  5. Añade la enzima TrypLE Express a las células (1 mL para un matraz de T75) e incuba a 37 °C durante 5 minutos. Haz una pipete suave de las células contra el matraz para obtener una suspensión de célula única. Detener la disociación añadiendo 3 mL de medio de cultivo celular y confirmar la ausencia de grandes grumos celulares antes de contar.
  6. Pelleta las células a 1.000 × g durante 5 minutos, lava las células una vez con 15 mL de solución salina con fosfato tamponado (DPBS) de Dulbecco, y centrifuga de nuevo las células.
  7. Evalúa la concentración y viabilidad celular utilizando un ensayo de viabilidad automatizado como el Nucleocontador NC-3000 con la Solución 13. Combina 11,4 μL de células con 0,6 μL de Solución 13 antes de medirlas en el Nucleocontador. Proceder con la electroporación solo cuando la viabilidad de la célula sea al menos del 85%, y descartar o volver a preparar muestras por debajo de este umbral.
  8. Resuspende las células a una densidad de aproximadamente 0,5 × 106–2 × 106 celdas·mL-1 en DPBS. Cuenta las células y evalúa la viabilidad usando un hemocitómetro o contador celular.
  9. Procede solo si la viabilidad de la célula es ≥ 85%.
  10. Resuspende las células en el buffer de electroporación. Resuspender 2 × 105 celdas en 5 μL de tampón de electroporación fría por reacción.
  11. Prepara el tampón de electroporación con la solución suplementaria según las instrucciones del fabricante inmediatamente antes de usarlo y mantén el tampón sobre hielo.
  12. Mantén las células frías y procede con rapidez. Mantén las células en hielo y procede inmediatamente a la instalación de electroporación.

5. Electroporación

NOTA: Prepare la carga de edición en tubos de tira PCR para facilitar el pipeteado multicanal. Tras la electroporación, resuspende las células en un medio suplementado con cóctel CEPT para mejorar la supervivenciacelular 12.

  1. Prepara la carga de ARN.
    1. Prepara la carga de ARN sobre hielo combinando el ARNm editor y ARN(es) guía en un buffer de electroporación.
    2. Para editores de bases y nucleasas, preparar una solución final de electroporación que contenga 1,5 μL (3 μg) de ARNm, 0,5 μL (50 pmol) de ARN guía y 15 μL de tampón de electroporación por muestra.
    3. Para los editores principales, preparar una solución final de electroporación que contenga 0,5 μL (1 μg) de ARNm, 1,5 μL (150 pmol) de ARN guía y 15 μL de tampón de electroporación por muestra.
    4. Preparar las soluciones de carga de ARN como una mezcla maestra de 1,2× para compensar la pérdida de volumen durante la transferencia y el manejo de la muestra. Optimiza los volúmenes y proporciones de reactivos para cada sitio objetivo y variante del editor según sea necesario.
  2. Dispensa las celdas, carga y electropora.
    1. Añade 5 μL de la suspensión de la celda a cada pozo de electroporación.
    2. Añadir 17 μL de carga de ARN en un tampón de electroporación a 5 μL de celdas. Mezcla la suspensión pipeteando dos veces.
      Precaución: Procede rápidamente tras combinar las células y la carga de ARN porque las RNasas secretadas por las células pueden degradar rápidamente el ARNm editor. Completa la electroporación en 2 minutos tras mezclar las células y la carga de ARN.
    3. Ejecuta el programa de electroporación optimizado para el tipo de celda seleccionado (Tabla 6; Figura 2; Figura 3).
      1. Para fibroblastos primarios de la piel humana o células HEK293T, utiliza el sistema de electroporación Lonza 4D con SF tampón. Añade 200.000 células por reacción a una cuveta de electroporación de 20 μL. Ejecuta el programa CM-130. Añadir inmediatamente 80 μL de DMEM precalentado + 10% FBS, 4,5 g· L-1 glucosa, 4 mM de L-glutamina y 110 mg· L-1 piruvato sódico. Recuperar las células durante 10 minutos antes de diluirlas en placas de 96 o 24 pozos.
      2. Para células madre pluripotentes, se utiliza el sistema de electroporación Lonza 4D con el tampón P3. Añadir 200.000 celdas por reacción a una cubetas de electroporación de 20 μL. Ejecuta el programa DN-100. Añade inmediatamente 80 μL de medio mTeSR Plus precalentado. Recuperar las células durante 10 minutos antes de diluirlas en placas de 24 pozos.
    4. Examina las células diariamente tras el uso del blindaje para monitorizar la salud y recuperación celular.

6. Extracción de ADN genómico

NOTA: Asegúrese de que el ADN genómico tenga suficiente calidad y esté libre de inhibidores antes de la amplificación por PCR, ya que la calidad del ADN puede afectar la preparación de la biblioteca de secuenciación y la cuantificación precisa de los resultados de edicióngenómica 9,10,11.

  1. Lava y extrae las células.
    1. Recoge las células 2-3 días después de la electroporación. Lava las células una vez con DPBS y procede inmediatamente a la extracción de ADN genómico.
    2. Preparar el tampón de lisis incompleto combinando 10 mL de 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 5 mL de solución de dodecilo sulfato de sodio (SDS) al 10% (p/vol) y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 1 L. Almacenar el tampón de lisis incompleto a temperatura ambiente durante hasta 6 meses.
    3. Preparar de nuevo un tampón de lisis completo añadiendo la proteinasa K con una dilución 1:1.000 (vol/vol) a una aliteracia de tampón de lisis incompleto. Añade el buffer completo de lisis a las células para iniciar la lisis. Añadir 40 μL de tampón de lisis completo a cada pozo que contiene aproximadamente 80.000 celdas en una placa de 96 pozos. No pipees arriba y abajo, ya que esto podría causar pérdida de muestra.
  2. Digiera las muestras.
    1. Incubar las muestras a 37 °C durante 60 minutos para completar la lisis celular y la digestión de la proteinasa K.
  3. Inactiva la proteinasa K.
    1. Transfiere los lisados a tubos de PCR o a una placa de PCR de 96 pozos. Incubar las muestras a 80 °C durante 30 minutos para inactivar la proteinasa K.
  4. Guarda los lisados.

Punto de pausa: Almacenar los lisados a −20 °C hasta la amplificación por PCR.

7. Secuenciación dirigida de amplicones para editar análisis

NOTA: Agrupar los productos de PCR en cantidades equimolares antes de la secuenciación. Aproximadamente 10.000 lecturas de secuenciación por muestra son generalmente suficientes para cuantificar los resultados de la edición genómica masiva.

  1. Diseña cebadores específicos de locus para generar amplicones de aproximadamente 300 pb que cubran al menos 25 pbb, aguas arriba y 25 pb, aguas abajo del sitio de edición (Tabla 7).
  2. Amplificar el locus genómico objetivo realizando PCR1 según las condiciones proporcionadas en la Tabla 8, Tabla 9.
  3. Añadir índices de muestra únicos por PCR usando el producto PCR1 como plantilla, como con los cebadores mostrados en la pestaña "Ejemplo de cebadores de indexación PCR en la Tabla 7 ". Utiliza las condiciones de PCR como se muestra en la pestaña 2 de la Tabla 8 y la Tabla 9.
  4. Ejecuta los productos PCR1 y PCR2 en un gel de agarosa al 1,5% para confirmar la presencia de bandas simples en los tamaños esperados.
  5. Agrupa los productos PCR2 en cantidades equimolares. Limpia la biblioteca PCR2 agrupada usando la relación perla-muestra de AMPure XP de 0,65:1 según las instrucciones del fabricante. Eluir la biblioteca purificada en 30 μL de agua libre de nucleasas y confirmar la eliminación de dímeros adaptadores mediante electroforesis en gel antes de la secuenciación.
  6. Cuantifica la biblioteca final agrupada usando un ensayo fluorométrico de ADNds. Evalúa la distribución del tamaño de los fragmentos mediante electroforesis capilar.
  7. Secuencia las bibliotecas usando lecturas de 300 ciclos de extremo único en un instrumento Illumina MiSeq. Diluye la biblioteca final agrupada a 4 nM. Combina 5 μL de la biblioteca agrupada de 4 nM con 5 μL de 0,1 M NaOH y un pipete para mezclar. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar, luego añadir 990 μL de tampón HT refrigerado proporcionado con el kit MiSeq para neutralizar la solución y diluir hasta 20 pM. Pico en el control PhiX del 15%. Carga la biblioteca en un cartucho Illumina MiSeq y ejecuta secuenciación de 300 ciclos en un solo extremo usando los ajustes estándar de ejecución del fabricante. Apunta a generar aproximadamente 30.000 lecturas por muestra, aunque 10.000 lecturas por muestra son suficientes para editar análisis12. La secuenciación MiSeq puede realizarse por muestra en algunas empresas como Genewiz o Quintara.

8. Análisis de los resultados de la edición genómica

Nota: El análisis CRISPResso2 permite cuantificar la eficiencia global de edición, las frecuencias de conversión de nucleótidos y las frecuencias de inserción/deleción (indel), y puede utilizarse para caracterizar los resultados de edición en condicionesexperimentales 15.

  1. Desmultiplexa los datos de secuenciación y organiza los archivos FASTQ según el locus genómico y la condición experimental.
  2. Instala CRISPResso2 siguiendo las instrucciones proporcionadas en el repositorio de Github (https://github.com/pinellolab/crispresso2).
  3. Ejecuta análisis por lotes CRISPResso2 usando archivos batch.txt que especifican los archivos FASTQ de entrada y los parámetros de análisis (ejemplos proporcionados en la Tabla 7). Establece la puntuación mínima de calidad de lectura en 30. Pon el ancho de ventana con "w" en 20. Si se usan editores de bases de citosina, algunos indels pueden centrarse en los nucleótidos editados en base además del sitio de la nick. En ese caso, ajusta el centro de la ventana "wc" a -10 en lugar del centro predeterminado en el sitio del nick para capturar mejor estos indels.
  4. Extraer salidas cuantitativas, como las frecuencias de conversión de nucleótidos, frecuencias de inserción/eliminación (indel) y (si corresponde) frecuencias HDR o de edición primaria, a partir de los archivos de salida resumen correspondientes. Estos suelen encontrarse en archivos llamados "CRISPRessoBatch_quantification_of_editing_frequency.txt" y "Nucleotide_percentage_summary.txt", que pueden abrirse en Microsoft Excel u otro software de edición de hojas de cálculo.
  5. Exporta los valores de edición cuantitativa para la gráfica posterior y la interpretación de datos, como en las Figuras 3-4. Utiliza los archivos "alleles_frequency_table_around_sgRNA.pdf" (como se muestra en la Figura 5) para evaluar los resultados de edición alélica.

Resultados

Utilizar un editor eficiente con un sitio de prueba fácilmente accesible, como el editor base ABE8e con el sitio de control HEK3, puede a menudo resultar en eficiencias de edición superiores al 90% si el sistema de entrega es adecuado para las celdas utilizadas en el experimento. Pueden producirse menores eficiencias de edición si existen problemas con el ARN m, el ARN guía, el sitio objetivo o las condiciones de entrega que hacen que cualquiera sea menos adecuado para la edición. Utilizar variantes de Cas9 que acceden a secuencias PAM más versátiles pero las vinculan menos de forma estrecha, o dirigir editores a nucleótidos que están fuera de su ventana ideal de edición, puede reducir la eficiencia de edición. Los ARNm editores generados por IVT exitosos suelen aparecer como una sola banda predominante con un mínimo difuminamiento o productos de degradación de bajo peso molecular, lo que indica una alta integridad de transcritos adecuada para la electroporación posterior (Figura 2).

Tras la electroporación del ARNm editor y ARN guía sintético, la mayoría de las células se recuperan en 24–48 horas y mantienen su morfología típica con programas de electroporación adecuados (Figuras 3–4). Las condiciones de electroporación deben adaptarse al tipo específico de celda, ya que diferentes tampones pueden dar resultados muy distintos. El Centro de Conocimiento Online de Lonza hace recomendaciones para códigos de tampón y electroporación para tipos celulares comunes, y Lonza ofrece kits de optimización separados para líneas celulares y celdas primarias. La comparación empírica de los buffers puede ayudar a identificar condiciones óptimas para una entrega eficiente. Los programas inadecuados pueden llevar a la falta de entrega o ser altamente tóxicos para las células (perder más del 50% o impedir la continuación del ciclo celular). Los experimentos de optimización representativa demostraron diferencias sustanciales en los resultados de edición a través de las condiciones de electroporación, con algunos programas que ofrecieron altas eficiencias de edición mientras que otros produjeron una edición mínima, lo que subraya la importancia de la optimización empírica para cada tipo de célula (Figura 3–4).

En iPSCs, fibroblastos y LCLs, se utiliza secuenciación dirigida de amplicones seguida de análisis CRISPResso2 para cuantificar la eficiencia de edición y los subproductos (Figura 4). Aquí se muestra la edición de bases de adenina del locus de prueba HEK3 (Figura 4), que resultó en las conversiones de nucleótidos previstas con bajas frecuencias indel en las muestras analizadas. El análisis CRISPResso2 permite la visualización de alelos editados y no editados en el locus objetivo y facilita la cuantificación de conversiones nucleótidicas previstas, frecuencias indel y otros subproductos de edición, proporcionando una evaluación exhaustiva de los resultados de la edición (Figura 5). La eficiencia de edición se cuantifica midiendo la frecuencia de esta sustitución precisa de un solo nucleótido en el sitio objetivo. El locus HEK3 se utiliza como locus de modelo debido a su perfil de edición bien caracterizado y su reproducibilidad en sistemas experimentales, lo que permite una evaluación robusta del rendimiento de edición base bajo diferentes condiciones. Recomendamos probar esta guía como control positivo en células humanas al optimizar nuevos procedimientos de edición. La edición de bases suele enriquecerse para conversiones de nucleótidos previstas con bajas frecuencias index, mientras que la edición prime produce una mezcla de ediciones precisas y subproductos de bajafrecuencia 3,12. Las eficiencias de edición variaron según las condiciones, observándose diferencias claras entre tipos celulares y programas de electroporación (Figuras 3-4). Estas variaciones probablemente reflejan diferencias en la absorción celular, viabilidad y actividad de reparación del ADN, así como la influencia de los parámetros de electroporación en la eficiencia de la entrega. En conjunto, estos hallazgos destacan la importancia de optimizar los ajustes de electroporación específicos por tipo celular para lograr resultados de edición consistentes y máximos.

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Figura 1. Preparación del ARNm editor mediante transcripción in vitro.
Resumen esquemático de la generación de mRNA del editor. (Paso 1) Preparación de la plantilla de plásmido que contiene la secuencia codificadora del editor y el promotor T7. (Paso 2) Amplificación por PCR para generar una plantilla lineal de ADN. (Paso 3) Transcripción in vitro utilizando ARN polimerasa T7 para sintetizar ARNm capturado. (Paso 4) Purificación de ARNm para eliminar ADN molde, enzimas y nucleótidos libres. El ARNm cubierto resultante es adecuado para su entrega posterior a células de mamíferos mediante electroporación o nanopartícula lipídica. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2. Imagen de ejemplo de electroforesis en gel de ARNm 
Imagen electroforesis de tres ARNm editores genómicos que se ejecutan sobre un gel de agarosa al 1% usando tinción de oro SYBR. La escalera de ARNSSss de NEB se muestra a la izquierda con marcadores de tamaño indicados por su longitud. La ausencia de manchas sustanciales o bandas pequeñas indica que estos ARNm son de calidad adecuada. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3. Optimización de las condiciones de electroporación para la edición genómica en células madre pluripotentes inducidas (iPSC). 
Se muestran las eficiencias de edición obtenidas bajo diferentes condiciones de electroporación en iPSC. Las celdas se electroporaban utilizando múltiples buffers y combinaciones de programas, incluyendo el buffer CB-150 P4, buffer CD-118 P3, buffer DN-100 P3, buffer DC-100 P3, todos en el dispositivo de nucleofección Lonza 4D. La edición se evaluó utilizando el dispositivo de electroporación Neón con parámetros (1600 V, 20 ms, 1 pulso). La eficiencia de edición se cuantificó mediante un análisis de secuenciación dirigido del lugar editado. N=1 por muestra. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4. Optimización de las condiciones de electroporación para la edición genómica en fibroblastos.
Eficiencia de edición tras electroporación utilizando diferentes programas de nucleofección. Los fibroblastos fueron electroporados utilizando múltiples programas de Lonza Nucleofector (CA-137, CM-138, DS-150, EH-100, EN-150, EO-114 y FF-113), y los resultados de edición se cuantificaron mediante secuenciación dirigida. Se muestran resultados para dos réplicas (P2, P3). Se incluye un control negativo sin entrega por parte del editor. La comparación de códigos de electroporación destaca diferencias en la eficiencia de edición entre los entornos de electroporación, permitiendo identificar parámetros óptimos para la edición del genoma de fibroblastos. N=1 por muestra. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 5. Caracterización de los resultados de la edición genómica en el locus objetivo. 
Salida de la tabla de frecuencias aleladas de CRISPResso2, que muestra la abundancia relativa de alelos editados y no editados que rodean la región objetivo del ARNsg, determinada por análisis de secuenciación de alto rendimiento tras la edición. Las anotaciones rojas indican la ventana de edición de la base y el polimorfismo heterocigoto preexistente presente en la línea celular utilizada. La secuencia del espaciador de ARN guía está subrayada en gris. La "posición de corte predicha" mostrada por una línea de puntos se desplaza respecto a la posición típica de "PAM menos 3" para SpCas9 debido a la modificación del "wc" del centro de la ventana en nuestro archivo de análisis (ejemplo en la Tabla 8). Esto no desplaza realmente la ubicación de la cindidura predicha, pero la salida se muestra de esta manera para indicar que se evaluarán los indels que rodean la línea punteada dentro de una ventana de 20 nucleótidos, capturando tanto los indels centrados en el verdadero sitio de la muela como los centrados en los nucleótidos desaminados. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1. Editores y secuencias utilizadas en este estudio 
Columna 1: Editores genómicos disponibles en AddGene para transcripción in vitro. Nombres e identificadores de Addgenes para plásmidos disponibles que sean susceptibles de transcripción in vitro según lo descrito en este protocolo. Columna 2: Secuencias de espaciadores de ARN guía utilizados en este estudio. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2. Reactivos de PCR para la amplificación de la plantilla de plásmidos de ARNm.
La lista de reactivos y componentes de reacción utilizados para la amplificación por PCR de la plantilla de plásmidos para generar ADN lineal para aplicaciones posteriores, así como la secuencia de los cebadores de transcripción directa y inversa. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3. Condiciones de ciclo de PCR para la amplificación de la plantilla de ARNm. 
Esta tabla muestra las condiciones de termociclo utilizadas para la amplificación por PCR de la plantilla de ARNm a partir del ADN plasmídico antes de las aplicaciones posteriores. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4. Reactivos utilizados para reacciones in vitro . Transcripción (TVI). 
Esta tabla enumera los reactivos y componentes de reacción utilizados para la transcripción in vitro para sintetizar ARNm del editor a partir de la plantilla lineal de ADN. Una secuencia de plantilla de ejemplo (ABE8e) se muestra con elementos codificados por colores. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 5. Guía de resolución de problemas para los pasos clave en el flujo de trabajo de edición del genoma. 
Esta tabla resume cuestiones técnicas comunes que pueden surgir durante la preparación del ARNm del editor mediante transcripción in vitro (IVT) y análisis de secuenciación MiSeq. Para cada paso del flujo de trabajo, se proporcionan posibles problemas, posibles causas y soluciones recomendadas para ayudar a optimizar la eficiencia de la edición y asegurar la detección precisa de los resultados de edición. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 6. Programas óptimos de electroporación para diferentes tipos celulares de mamíferos. 
Esta tabla enumera los códigos de programa de electroporación y las condiciones del tampón utilizadas para la entrega eficiente de ARNm editor y para guiar ARN hacia diferentes tipos celulares de mamíferos. Se probaron los parámetros de electroporación listados para identificar condiciones que maximizan la eficiencia de la edición genómica manteniendo la viabilidad celular. El mismo programa puede no funcionar para cada línea celular o fuente de células primarias, por lo que se recomienda probar alternativas de esta lista si la edición inicialmente no tiene éxito. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 7. Parámetros de análisis CRISPResso2 para la cuantificación de resultados de edición genómica. 
La primera pestaña muestra un ejemplo del diseño de cebador HTS1 utilizado para amplificar el locus objetivo. La segunda pestaña ofrece un ejemplo de los manuales de indexación utilizados durante la preparación de la biblioteca. La tercera pestaña ilustra un ejemplo de la disposición de indexación utilizada para asignar índices únicos a cada muestra durante la secuenciación. La cuarta pestaña contiene un archivo batch de entrada de ejemplo para análisis CRISPResso2, y la quinta pestaña proporciona un ejemplo adicional de archivo Batch de entrada para análisis CRISPResso2. Cabe señalar que el centro de la ventana "wc" se ajusta para los editores de bases para facilitar la detección de indels centrados en las bases desaminadas, además de los centrados en el corte o sitio de corte o corte de nucleasa. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Mesa 8. Reactivos PCR1 (Tab 1) y PCR2 (Tab 2) para la preparación de la biblioteca MiSeq.
Esta tabla enumera los reactivos y componentes de reacción utilizados en la Pestaña 1 (PCR1) para amplificar los loci genómicos objetivo y en la Pestaña 2 (PCR2) para incorporar secuencias índice específicas de muestra y adaptadores de secuenciación Illumina, generando bibliotecas listas para secuenciación para el análisis MiSeq. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 9. PCR1 (Tab 1) y PCR2 (Tab 2) para la preparación de la biblioteca MiSeq.

Esta tabla enumera las condiciones de termociclo utilizadas en la Pestaña 1 (PCR1) para amplificar las regiones genómicas objetivo y en la Pestaña 2 (PCR2) para incorporar secuencias índice específicas de muestra y adaptadores de secuenciación Illumina, generando bibliotecas listas para secuenciación para el análisis MiSeq. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo para la edición genómica en células primarias de mamíferos utilizando la electroporación de ARNm editor y ARN guía sintéticos. La entrega como ARNm tiende a ofrecer una edición más eficiente en relación con la entrega de plásmidos, y el ARNm tiende a ser más sencillo y consistente entre lotes en comparación con la proteína editor o la ribonucleoproteína. Cuando las formas de ARNm y ribonucleoproteínas de editores de bases se han comparado directamente en algunos trabajos previos, el ARNm ha proporcionado una mejor eficiencia deedición 3. En comparación con los métodos de administración de plásmidos o vírus, la administración basada en ARNm permite la expresión transitoria y reduce el riesgo de integración genómica, aunque puede requerir optimización para diferentes tipos celulares. Además de una menor eficiencia de edición, el uso de ADN plasmídico para la edición genómica conlleva un riesgo de integración aleatoria en el genoma de las células objetivo y puede aumentar el riesgo de edición fuera del objetivo debido a la prolongada expresión del editor. La combinación de secuenciación dirigida con amplicones y CRISPResso2 permite la cuantificación estandarizada de la eficiencia de edición y la caracterización de cualquier resultadoalélico 3.

Varios factores son vitales para el éxito. Los pasos críticos de este protocolo incluyen mantener la integridad del ARN mediante un manejo estricto sin RNasa, seleccionar ARN guía óptimos y optimizar cuidadosamente las condiciones de electroporación para cada tipo celular. La integridad del ARN y el control cuidadoso de la RNasa influyen fuertemente en los resultados, y la selección del ARN guía sigue siendo un determinante principal de la eficiencia y los perfiles de subproductos. Los ajustes de electroporación requieren optimización empírica por tipo celular y algunos programas que ofrecen alta edición también pueden causar toxicidad. Si se observa baja eficiencia de edición, se debe considerar la optimización de los parámetros de electroporación, la calidad del ARN o el diseño de ARN guía. Si se produce una toxicidad excesiva, reducir la fuerza de electroporación o la entrada de ARN puede mejorar la viabilidad celular. Las estrategias adicionales de optimización incluyen la prueba de buffers de electroporación alternativos y programas adaptados al tipo de célula objetivo o modificadores de concentraciones de ARN que lo editan o guía. Este flujo de trabajo proporciona una plataforma práctica para comparar los estándares de los editores y producir células modificadas antes de la clonación de células individuales, fenotipado, estudios in vivo o desarrollo traslacional. Este flujo de trabajo es ampliamente aplicable para evaluar estrategias de edición genómica en células primarias, permitiendo la comparación sistemática de modalidades de edición entre contextos genómicos y tipos celulares. Apoya la modelización de enfermedades mediante la introducción o corrección de variantes clínicamente relevantes, así como la interrogación funcional de elementos regulatorios codificantes y no codificantes. Además, proporciona una plataforma para optimizar enfoques terapéuticos de edición, incluyendo la evaluación de la eficiencia en el objetivo, la actividad fuera del objetivo y la durabilidad de la edición. El flujo de trabajo también puede utilizarse para filtrar y priorizar ARN y sistemas de edición, evaluar estrategias de administración y probar variantes específicas de cada paciente en un marco de medicina de precisión. En conjunto, sirve como un puente versátil entre la biología genómica básica, la investigación traslacional y el desarrollo preclínico. Una limitación de este método es que la eficiencia de electroporación y la viabilidad celular pueden variar sustancialmente entre tipos celulares, lo que requiere optimización empírica. Además, los resultados de edición pueden depender del diseño y la pureza del ARN guía, y de la accesibilidad del locus objetivo, lo que puede limitar la reproducibilidad entre diferentes sistemas experimentales. A pesar de estas limitaciones, una optimización cuidadosa de los parámetros experimentales y el diseño de guías puede mitigar la variabilidad, permitiendo una aplicación fiable y reproducible de este enfoque en diversos sistemas celulares.

Divulgaciones

N.W. y E.V.B. han presentado solicitudes de patente sobre tecnologías de edición genómica a través de la Universidad Johns Hopkins. G.A.N. ha presentado solicitudes de patente relacionadas con tecnologías de edición genómica a través del Broad Institute y la Universidad Johns Hopkins.

Contribución de los autores:
M.V., J.N.W., E.V.B, D.M.E., J.D. y G.A.N. redactaron cada uno secciones separadas del texto. M.V. recopiló y editó el texto final seguido de ediciones por parte de todos los autores.

Agradecimientos

Agradecemos a Beatriz Olalla Sastre por las valiosas discusiones relacionadas con este protocolo. Este trabajo fue apoyado por el premio Big Beat Challenge de la British Heart Foundation otorgado a CureHeart (referencia del premio nº BBC/F/21/220106), la Fundación de Fibrosis Quística (premio NEWBY23XX0) y los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (R00HL163805 y DP2OD038783 a G.A.N.). J.N.W. reconoce el apoyo de la Subvención NIH Nº T32 GM148383.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1M Tris-HCl, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15568025
Agarose Thermo Fisher Scientific R0491 Agarose UltraPure 16500500 ThermoFisher 500g
AMPure XP SPRI Beads Beckman Coulter B23317 A63880, AMPure XP Beads for DNA Cleanup, 5 mL, Beckman Coulter
ATP (100 mM) New England Biolabs N0450 
CEPT Cocktail Bio-Techne / Tocris 7200 
CleanCap AG Reagent TriLink Biotechnologies N-7113 CleanCap AG 3′ OMe CleanScript IVT Kit, 125 x 20 µL rxns, 
CTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Custom DNA Primers Integrated DNA Technologies Custom 
DNA Loading Dye New England Biolabs B7024 
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific 14190-144 D8537-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965-092 DMEM High Glucose [4,500 mg/L] with [4.0 mM] L-Glutamine and [110 mg/L] Sodium Pyruvate, 500 mL
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 
GTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Illumina Indexing Primers Illumina FC-131-2001 10uM stocks
Illumina MiSeq Sequencer Illumina SY-410-1003 
Lithium Chloride RNA Precipitation Solution Thermo Fisher Scientific AM9480 
Lonza 4D Nucleofector System Lonza AAF-1002X 
ssRNA Ladder NEBNEBN0362S5ul/ reaction
MiSeq Reagent Kit v3 (300 cycles) Illumina MS-102-3002 
N1-Methyl-Pseudouridine-5′-Triphosphate TriLink Biotechnologies N-1081 
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544 
Nuclease-Free Water Thermo Fisher Scientific AM9937 
NucleoCounter NC Slide A8 ChemoMetec 941-0008 
NucleoCounter NC-3000 ChemoMetec NC-3000 10ul of cell solution and 0.4167 μL of DAPI solution 
Solution 15, Hoechst 33342, 1 mL 910-3015 ChemometecChemometec910-3013 500 μg/ml ~ 0.9 mM ~ 0.05%
Nucleocuvette Strips Lonza V4XP-3032 
P3 Primary Cell Nucleofector Solution Lonza V4XP-3032 1 x 0.675 mL P3 Primary Cell Nucleofector® Solution
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530L 
Proteinase K Thermo Fisher Scientific EO0491 Quantity: 1mL, >600 U/mL (~20 mg/mL)
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491 2,000 units/ml 100 units 
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q33230 
Qubit RNA Broad Range Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q10211 
Qubit™ Assay TubesThermo Fisher ScientificQ32856
RNA Gel Loading Dye (2x)Thermo Fisher ScientificR06415ul/ reaction
RNA Purification Kit Zymo Research R1017 
RNase Away Thermo Fisher Scientific 1236B62 
SDS, 10% solutionThermo Fisher Scientific 15553027
SYBR Gold Nucleic Acid Gel StainThermo Fisher ScientificS11494
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102 
Synthetic sgRNA / pegRNA Synthego / IDT Custom 2ug 
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, 250 reactionsNew England Biolabs E2040L
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 100 mL
TE buffer (Tris-EDTA)Thermo Fisher Scientific AM9849TE, pH 8.0, RNase-free Thermo
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056 1X 
Fetal Bovine Serum (FBS), Premium, 500 mLThermo Fisher ScientificA5670701
mTSER PLUS STEM cell Technologies# 100-0276
Penicillin/Streptomycin Mixture 10,000 ug/mL, 100 mL, 4-packQuality Biological120-095-721 

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