Artículo de método

Un modelo traslacional de cerdito pretérmino para la sepsis neonatal

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DOI:

10.3791/71456

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10 de julio de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Comparative Pediatrics, Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen, 2BRIDGE Translational Excellence Programme, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los modelos de sepsis bacteriana en neonatos prematuros son esenciales, aunque los modelos existentes en roedores carecen de relevancia clínica. Se desarrolló un modelo altamente traslacional de sepsis neonatal utilizando lechones prematuros infectados con Staphylococcus epidermides vivo.

Resumen

Los bebés prematuros son especialmente vulnerables a infecciones bacterianas que pueden progresar rápidamente hasta una sepsis potencialmente mortal, un estado de inflamación excesiva y disfunción orgánica. Para investigar los mecanismos de la enfermedad y avanzar en el desarrollo terapéutico, se necesitan de forma crítica modelos animales traslacionales robustos que repliquen la compleja fisiopatología y la presentación clínica de la sepsis neonatal. Este protocolo presenta un modelo clínicamente relevante de sepsis neonatal de lechón prematuro, inducido mediante infusión intraarterial de Staphylococcus epidermidis vivo poco después del nacimiento o en el tercer día postnatal. Los lechones nacen al 90% de la gestación por cesárea y son atendidos en cuidados intensivos neonatales. Estos incluyen incubadoras controladas con temperatura y oxígeno y un catéter arterial umbilical permanente, que permite la administración de nutrición parenteral y muestreo sanguíneo en serie. Tras la infección con S. epidermidis, se monitorizan los lechones durante 24–48 horas. La incidencia y gravedad de la sepsis pueden modularse por la dosis de bacterias y el suministro de glucosa parenteral. Una mayor provisión de glucosa parenteral acelera las respuestas inmunitarias proinflamatorias, lo que conduce al deterioro clínico. La sepsis letal y los desenlaces humanos se definen mediante parámetros de gases arteriales (pH ≤ 7,1) combinados con signos clínicos de compromiso hemodinámico como letargo, decoloración cutánea y taquipnea. Este modelo ofrece una plataforma única para explorar cómo el metabolismo energético y las intervenciones inmunomoduladoras afectan a la eliminación bacteriana, la inflamación sistémica y la lesión tisular durante la infección neonatal. Tiene un potencial significativo para informar estrategias clínicas para la prevención y el tratamiento de la sepsis neonatal.

Introducción

La infección neonatal es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad a largo plazo en todo el mundo, especialmente entre los bebés prematuros, pero también en los bebés a término con bajo peso al nacer o complicacionesperinatales 1,2. El diagnóstico precoz sigue siendo complicado debido a signos clínicos inespecíficos, respuestas inmunitarias inmaduras y muy variables, y la falta de biomarcadores sensibles y específicos capaces de distinguir la infección de la inflamación noinfecciosa 3,4. Como resultado, los clínicos inician con frecuencia terapias antibióticas empíricas de amplio espectro, a menudo antes de la confirmación microbiológica, lo que contribuye al uso excesivo de antibióticos, la alteración de la colonización microbiana en la vida temprana y el desarrollo de resistenciaantimicrobiana 5.

La sepsis neonatal es una condición potencialmente mortal causada por una respuesta desregulada del huésped a la infección que conduce a disfunción orgánica4. Aunque infección y sepsis representan entidades biológicas y clínicas distintas, los términos a menudo se usan indistintamente en la literatura de neonatología. Clínicamente, la sepsis neonatal se clasifica comúnmente como sepsis de inicio temprano o tardío (EOS, LOS), que ocurre antes o después de las 72 horas de vida, respectivamente1. La EOS suele ser causada por patógenos transferidos durante el parto, como Escherichia coli o el estreptococo del grupo B. En cambio, la LOS se presenta frecuentemente con síntomas inespecíficos, puede ser negativa para cultivos y está asociada a factores de riesgo como procedimientos invasivos, nutrición parenteral y hospitalización prolongada. Los organismos causantes más comunes incluyen los estafilococos coagulasa negativos, especialmente Staphylococcus epidermidis, así como bacterias Gramnegativas, aunque también ocurren infecciones fúngicas ypolimicrobianas 1,2,6. Independientemente de la etiología, las infecciones neonatales pueden converger en un fenotipo común desepsis 1,2. Es importante destacar que los bebés prematuros presentan inmadurez del desarrollo tanto de la inmunidad innata como adaptativa, junto con reservas metabólicas limitadas, lo que puede afectar la respuesta ala infección 7.

El progreso en el diagnóstico y tratamiento se ha visto obstaculizado por las limitaciones de los sistemas experimentales existentes. Los enfoques in vitro permiten estudios mecanicistas de las vías inmunitarias pero no logran captar la fisiología integrada de las respuestas inmunitarias complejas. Los modelos de roedores, aunque valiosos para estudios genéticos y moleculares sobre respuestas inmunitarias neonatales, difieren sustancialmente de los humanos en ontogenia inmunitaria, metabolismo y tamaño 8,9. El manejo clínico de la sepsis es difícil de estudiar en estos modelos debido a las limitadas oportunidades de monitorización intensiva, muestreos sanguíneos repetidos y pruebas de cuidados de apoyo o terapéuticos clínicamente realistas.

Los modelos animales grandes, especialmente los lechones recién nacidos prematuros, ofrecen un enfoque complementario potente. Los cerdos comparten estrechas similitudes anatómicas, fisiológicas e inmunológicas con los humanos, incluyendo poblaciones celulares inmunitarias comparables, señalización de receptores de reconocimiento de patrones y regulación metabólica 10,11,12,13,14. Es importante destacar que los cerdos se utilizan ampliamente como modelos para la sepsisadulta 13,15. La escala física de los cerdos permite el uso de instrumentación clínicamente relevante, monitorización fisiológica continua, biomuestreo repetido e intervenciones estandarizadas de cuidados intensivos como la nutrición parenteral, la terapia de fluidos, los antibióticos y el soporte respiratorio. La infección experimental también puede estudiarse en el contexto de la inmadurez del desarrollo, lo que permite investigar las trayectorias de la enfermedad, las respuestas del huésped y los efectos del tratamiento bajo condiciones que se asemejan mucho a la práctica clínica.

Este artículo describe un modelo estandarizado de sepsis neonatal en lechones prematuros, diseñado como una plataforma traslacional flexible. El modelo permite la inducción controlada de una infección bacteriana sistémica y la evaluación longitudinal de las respuestas clínicas, inmunológicas y metabólicas, lo que puede utilizarse para explorar la fisiopatología de la sepsis neonatal y evaluar la eficacia de intervenciones preventivas y terapéuticas novedosas.

Protocolo

Todos los procedimientos detallados se llevaron a cabo de acuerdo con la directiva de la UE 2010/63/UE para experimentos con animales y fueron aprobados por la Inspección Danesa de Experimentos con Animales (número de licencia: 2020-15-0201-00520).

1. Procedimientos relacionados con el parto

  1. Realizar cesárea electiva para dar a luz a lechones prematuros al 90% de la gestación (días gestacionales 106–107).
    1. Obtén una cerda preñada (Landrace × Large White, tercera o cuarta paridad) de una granja comercial libre de patógenos específicos.
      NOTA: La cerda debe ser impregnada mediante inseminación artificial (× Duroc) para asegurar que se conozca el día exacto de la concepción.
    2. Ayuno a la cerda durante la noche (mínimo 12 horas) con acceso improvisado al agua antes de la cirugía. Inducir sedación mediante inyección intramuscular de un cóctel que contiene atropina (2 mL por cerda), butorfanol (2 mL/100 kg de peso corporal; 10 mg/mL) y Zoletil 50 Vet (3,3 mL/100 kg de peso corporal; tiletamina 25/mL y zolazepam 25 mg/mL).
    3. Una vez sedado, insertar un catéter en la vena del oído e inducir anestesia general con propofol (10 mg/mL), titulado hasta lograr la pérdida del reflejo palpebral y el tono mandibular.
    4. Realizar intubación endotraqueal bajo laringoscopia directa para asegurar las vías respiratorias. Mantener un plano quirúrgico de anestesia durante toda la cesárea utilizando isoflurano vaporizado administrado al 100% de oxígeno (1–2 L/min) mediante un vaporizador calibrado.
    5. Inicia en el 5% y mantén entre el 1,5 y el 2,5%, ajustando la concentración a la dosis efectiva más baja según la frecuencia cardíaca y la saturación periférica de oxígeno.
      NOTA: Si se produce apnea, inicie una ventilación mecánica para asegurar una oxigenación adecuada.
    6. Coloca a la cerda en posición de reclinación lateral derecha. Realiza una preparación aséptica del lugar quirúrgico. Administrar un volumen total de 120 mL de lidocaína (10 mg/mL) mediante infiltración subcutánea e intramuscular a lo largo de la línea de incisión del flanco izquierdo prevista.
    7. Realizar una laparotomía del flanco izquierdo utilizando un bisturí para exponer y exteriorizar los cuernos uterinos. Incisa los cuernos uterinos a lo largo de la curvatura mayor para dar a luz a los lechones individuales.
    8. Antes de seccionar el cordón umbilical, ordeña el cordón 2–3 veces hacia el lechón para aumentar la concentración de hemoglobina y las reservas de hierro. Colocar una pinza en el ombligo etiquetada de la A a la Z alrededor del cordón umbilical junto con gasas para evitar sangrado y transectar el cordón.
    9. Inmediatamente después del parto, coloca cada lechón en una bolsa de polietileno, dejando la cabeza expuesta. La bolsa minimiza la pérdida de calor, reduciendo así el riesgo de hipotermia.
    10. Administrar un volumen fijo de 0,1 mL de doxapram (20 mg/mL) y 0,1 mL de flumazenil (0,1 mg/mL) intramuscularmente en el cuello. Doxapram estimula la respiración espontánea, mientras que el flumazenil, un antagonista de benzodiacepínicos, revierte parcialmente la anestesia transferida por la cerda durante la cesárea.
    11. Transfiere a los lechones a una unidad de cuidados intensivos neonatales.
  2. Reanimación, aleatorización y cateterización
    1. Pesa y determina el sexo de cada lechón tras su traslado a la unidad de cuidados intensivos neonatales.
    2. Para los lechones que no pueden respirar espontáneamente, realiza la reanimación de forma individual. Repite las dosis de doxapram y/o flumazenil, y proporciona ventilación a presión positiva según sea necesario para estabilizar la respiración.
    3. Una vez que los lechones estén fisiológicamente estables y aún anestesiados por la anestesia materna, se utiliza la técnica aséptica para insertar un catéter arterial umbilical (tubo de alimentación PVC 4 Fr) en una de las arterias del cordón umbilical transectado. Avanza la punta del catéter hacia la aorta dorsal. Fija el catéter a la piel con suturas y conéctalo a una línea de infusión para proporcionar nutrición parenteral.
      NOTA: En el cerdo prematuro, la administración intraarterial es el estándar establecido sobre la vena umbilical para evitar la posible necrosis hepática derivada del alto riesgo de que la punta del catéter se desplace dentro del parénquima hepático en lugar del ductovenoso 21.
    4. Estratifica a los lechones por peso al nacer y sexo y asignalos aleatoriamente a grupos de tratamiento.
  3. Condiciones de vivienda
    1. Aloja a cada lechón individualmente en una incubadora acolchada y calefactada con ventilación controlada.
    2. Proporciona oxígeno suplementario (1–2 L/min) hasta 12 horas después del nacimiento para prevenir la hipoxia.
    3. Controla la temperatura rectal durante las primeras 12 horas tras el nacimiento. Ajustar las condiciones de calefacción según sea necesario para mantener una temperatura central de 38–39 °C (objetivo: 38,5 °C).
      NOTA: Se espera un breve periodo de hipotermia inmediatamente después del nacimiento y durante la colocación del catéter.

2. Inmunización pasiva mediante infusión de plasma

NOTA: Dado que los cerdos no transfieren inmunoglobulinas transplacentarias, se debe proporcionar inmunización pasiva parcial para experimentos de más de 24 horas y así prevenir infecciones espontáneas.

  1. Recoger la sangre materna de la cerda tras la cesárea en un recipiente estéril recubierto de heparina. Centrifuga la sangre en tubos estériles de Falcon a 4 °C, 2500 × g, durante 10 minutos y repite una vez. Tras la separación, recoge cuidadosamente el plasma en nuevos tubos estériles de Falcon y guarda a 4 °C hasta su uso.
  2. En un plazo de 12 horas tras el nacimiento, administrar el plasma a una dosis de 8 mL/kg como una infusión intraarterial continua de 30 minutos utilizando una bomba de infusión.

3. Inducción de la infección experimental

NOTA: La infección experimental puede inducirse 3–4 horas después del nacimiento o en el día 3 postnatal.

  1. Preparación de la suspensión bacteriana
    1. Descongelar el vial congelado de stock de S. epidermidis (WT-1457, 15–25% glicerol) a temperatura ambiente. Vórtice brevemente (2–3 s) para obtener una suspensión homogénea.
      NOTA: Según la clasificación de grupos de riesgo para agentes infecciosos, S. epidermidis está clasificado como un microorganismo del Grupo de Riesgo 1 de la OMS. Los microorganismos del Grupo de Riesgo 1 de la OMS tienen pocas probabilidades de causar enfermedades humanas y no requieren consideraciones especiales.
    2. Prepara un cultivo nocturno inoculando 20 mL de caldo de infusión cerebral (BHI) con 5 μL del caldo descongelado de S. epidermidis en un matraz Erlenmeyer estéril de 100 mL. Incubar a 37 °C con agitación orbital a 180 rpm durante ~16 horas, permitiendo que el cultivo alcance la fase estacionaria. Incluir el control de caldo BHI no inoculado bajo condiciones idénticas para verificar la esterilidad del medio.
    3. Prepara un nuevo cultivo inoculando 20 mL de caldo BHI con 200 μL del cultivo nocturno (dilución 1:100) en un matraz Erlenmeyer estéril de 100 mL. Prepara cultivos suficientes para infectar a todos los lechones (véanse los cálculos en los pasos 3.1.4 – 3.1.6). Incubar a 37 °C con agitación orbital a 180 rpm durante 2,5 horas, hasta que las bacterias alcancen la fase de crecimiento logarítmico temprano (Figura suplementaria 1A).
    4. Estima el volumen total de cultivo necesario para infectar a todos los lechones basándose en la dosis objetivo titulada, el peso corporal medio, el número de lechones y la densidad de cultivo.
    5. Supongamos que el cultivo alcanzará una densidad óptica a 600 nm (DO) de ≥1 (Figura suplementaria 1B) tras la incubación de 2,5 horas y utilice una tasa de conversión establecida de OD de 1 = 3 × 108 unidades formadoras de colonias (UFC)/mL.
    6. Incluye un 15% de volumen extra para compensar las pérdidas de manejo. Calcular el volumen estimado de cultivo usando la fórmula:
      Estimación V = [Dosis objetivo (UFC/kg BPC) × BP) × PV × N × 1,15] / 3 × 108 UFC/mL (1)
      donde:
      VEstimación = volumen total estimado de cultivo requerido (mL)
      BW = peso corporal medio del lechón (kg)
      N = número total de lechones
    7. Tras la incubación, determina la OD del cultivo. Diluir la muestra según sea necesario para mantener las lecturas dentro del rango lineal del espectrofotómetro.
    8. Calcula el volumen final de cultivo necesario para alcanzar la concentración objetivo de UFC utilizando la fórmula:
      VFinal = OD1 · VEstimación / OD medida (2)
      donde:
      VFinal = volumen de cultivo final requerido (mL)
    9. Transfiere el VFinal calculado a tubos Falcon de 50 mL y centrifuga a 3.000 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    10. Descarta cuidadosamente el sobrenadante.
    11. Suspende el pellet bacteriano en 3 x Vfinal de suero fisiológico estéril al 0,9% para prepararlo para la administración intraarterial (3 mL/kg de peso corporal en 3 minutos). Asegúrate de que la solución esté libre de agregados.
    12. Prepara jeringuillas de infusión de 50 mL con la suspensión bacteriana.
    13. Prepara una jeringuilla de infusión separada de 50 mL con solución fisiológica estéril al 0,9% para controles no infectados.
  2. Procedimiento de infección
    1. Administra la suspensión bacteriana o solución salina estéril a cada lechón a través del catéter arterial umbilical utilizando una bomba de infusión configurada para administrar la dosis objetivo en 3 minutos. Mantén un intervalo de 5 minutos entre lechones consecutivos.
    2. Inmediatamente después de la infección, comienza la infusión continua de nutrición parenteral para limpiar el catéter y asegurar la administración completa de la dosis.
    3. Confirma la dosis guardando la suspensión bacteriana a 4 °C. Más tarde, esto puede diluirse y colocarse en placas de agar sanguíneo para determinar la densidad bacteriana (véase el paso 8)

4. Nutrición parenteral

  1. Proporcionar nutrición parenteral total (NPT) a los lechones durante toda la duración del experimento. Por ejemplo, utiliza una bolsa de TPN humana de tres cámaras, como Kabiven 1900 kcal, modificada para satisfacer los requisitos de macronutrientes de los lechones recién nacidos.
  2. Prepara la solución nutritiva parenteral en condiciones estériles.
    1. Retira 300 mL de la cámara de glucosa.
    2. Retira 70 mL de la cámara lipídica.
    3. Añade 155 mL de glucosa al 50% a la cámara de glucosa.
    4. Añade 214 mL de Vamin a la cámara de glucosa.
    5. Añade 150 mL de agua estéril a la cámara de glucosa.
    6. Añade 0,1 mL de heparina (5000 IE/mL) a la cámara de glucosa.
    7. Mezcla bien el contenido de las tres cámaras.
      NOTA: Esto da lugar a una solución nutritiva parenteral con la composición de macronutrientes mostrada en la Tabla 1. Utilice esta formulación como dieta de control estándar al evaluar los efectos de regímenes nutricionales alternativos en las respuestas a la infección.
    8. Guarda la nutrición parenteral a 4 °C hasta su uso. Prepara la solución en tandas y no la uses más allá de 48 horas después de la preparación.
      NOTA: El modelo puede modificarse para evaluar los efectos de la alimentación enteral y la estimulación intestinal ajustando a los lechones con tubos de alimentación orogástrica.
  3. Administración de la nutrición parenteral
    1. Llene jeringuillas estériles de infusión de 50 mL con nutrición parenteral e infunda continuamente a través del catéter intraarterial utilizando una bomba de infusión.
    2. Ajusta la velocidad de infusión a 6 mL/kg/h. Pesa los lechones diariamente y ajusta la dosis según el peso corporal actualizado.
      NOTA: Para estudios a largo plazo, si se observa edema periférico (sobrehidratación), reduce la velocidad de infusión a 4 mL/kg/h.
    3. Controla regularmente las bombas de infusión para asegurarte de que las jeringuillas no se queden vacías. Rellena las jeringuillas según sea necesario.

5. Monitorización clínica

  1. Evalúa a los lechones regularmente a lo largo del estudio para determinar si es necesaria la acción. Tras la infusión bacteriana, los animales deben ser monitorizados cada 1–2 horas por personal experimentado hasta la eutanasia planificada.
    NOTA: El deterioro clínico, la progresión de la ausencia de síntomas a los desenlaces humanos, puede ocurrir rápidamente, en un plazo de 30–60 minutos.
    1. Observa síntomas relacionados con la respiración, incluyendo taquipnea, dificultad respiratoria, cianosis y respiración agonal.
      NOTA: En casos de hipoxia (saturación de oxígeno < 80%), el suministro de osígeno debe iniciarse o aumentarse.
    2. Observa síntomas relacionados con la circulación, incluyendo decoloración, extremidades frías, prolongado tiempo de recarga capilar, taquicardia y bradicardia.
    3. Observa síntomas relacionados con la actividad, incluyendo letargo, incapacidad para mantenerse de pie o caminar (relevante desde el tercer día posnatal) y reactividad a estímulos dolorosos.
    4. Observa síntomas relacionados con la coagulación, como equimosis o sangrado petequial en la piel. Aplica una presión suave en las zonas decoloradas; Si el enrojecimiento no se blanquea, clasifica el hallazgo como sangrado cutáneo.
  2. Si se observan síntomas clínicos, realizar mediciones de gases en sangre para evaluar el pH, el lactato, la saturación de oxígeno y la presión parcial de dióxido de carbono en relación con los valores iniciales (véase el paso 6.3).
    NOTA: Se puede utilizar monitorización clínica continua (por ejemplo, de presión arterial, frecuencia cardíaca y frecuencia respiratoria), pero no se emplea rutinariamente en estos experimentos.

6. Análisis de sangre

NOTA: El muestreo longitudinal de sangre puede realizarse en lechones mediante catéter intraarterial o venpuntura yugular. El volumen sanguíneo total muestreado no debe superar el 7,5% del volumen sanguíneo total estimado (~7% del peso corporal). Todos los procedimientos de análisis de sangre deben cumplir con las directrices éticas locales.

  1. Muestreo de sangre intraarterial por catéter
    1. Con manos limpias y enguantadas, accede cuidadosamente al puerto del catéter. Desinfecta el sitio de acceso con etanol antes de abrir. Evita la contaminación de la línea de infusión.
    2. Extrae un mínimo de 2 mL de sangre y déjalo a un lado, ya que este volumen puede estar contaminado con nutrición parenteral de la línea de infusión. Mantener la esterilidad de la muestra retirada.
    3. Recoge el volumen sanguíneo requerido para el análisis. Por ejemplo, la sangre para análisis hematológicos debe recogerse en tubos recubiertos de EDTA, mientras que las muestras para análisis de gases sanguíneos deben obtenerse mediante jeringuillas recubiertas de heparina.
    4. Tras completar la muestra, reinfunda los 2 mL de sangre extraídos inicialmente en el lechón y reconecta cuidadosamente el catéter a la línea de infusión parenteral de nutrición.
  2. Muestreo de sangre por punción yugular
    1. Saca al lechón de su incubadora y colócalo en reclinancia dorsal para exponer la zona del cuello. Sujeta de forma segura al lechón para evitar movimientos y permitir un acceso seguro a la vena yugular.
      NOTA: La venpuntura yugular está asociada a riesgos potenciales, incluyendo hemorragias, formación de hematomas y compromiso de las vías respiratorias. La decisión de realizar este procedimiento debe sopesarse cuidadosamente frente a la importancia científica de los resultados.
    2. Identificar la ubicación anatómica aproximada de la vena yugular y desinfectar el lugar de la punción con etanol.
    3. Realizar la venpuntura yugular utilizando un sistema Vacutainer y recoger el volumen sanguíneo necesario. Por ejemplo, recoge 0,2 mL de sangre y almacena la muestra a 4 °C hasta que se forme la bacteria.
    4. Aplicar presión en el lugar de la venpuntura hasta lograr la hemostasia. Luego devuelven al lechón a su incubadora.
    5. Sigue vigilando al lechón para detectar signos de sangrado renovado. Si ocurre una hemorragia significativa, eutanasia al lechón. También vigila la formación de hematomas subcutáneos o hemorragias internas que puedan comprometer las vías respiratorias.
  3. Mediciones de gases en sangre
    1. Inspecciona la muestra de sangre en la jeringuilla heparinizada para detectar burbujas de aire. Si hay burbujas, expulsalas o deslánzalas suavemente golpeando la jeringuilla para evitar alterar las mediciones de gases.
    2. Transporta la muestra al analizador de gases sanguíneos y sigue las instrucciones del fabricante. Asegúrate de que la muestra se procese con rapidez para mantener la precisión.

7. Criterios de sepsis y objetivos humanos

  1. Eutanasiar a los lechones al alcanzar los límites humanos predefinidos indicativos de sepsis.
    NOTA: Para otras patologías o lesiones iatrogénicas, consulte las directrices éticas locales para los criterios de protección humanitaria.
    1. Utiliza el pH sanguíneo como principal indicador de sepsis y como principal punto crítico humano. Eutanasia inmediatamente a los lechones con pH sanguíneo ≤ 7,1. Para lechones con pH sanguíneo ≤ 7,2, repita las mediciones de gasometría cada 15–30 minutos y monitorea los puntos secundarios de habilidad.
    2. Como extremos secundarios para humanos, se eutanasian los lechones independientemente del pH sanguíneo ante la manifestación de coagulación intravascular diseminada, incluyendo equimosis o hemorragia petequial, paro respiratorio, letargo profundo y/o falta de respuesta a estímulos dolorosos (confirmado por la ausencia de reflejo de retirada tras un suave pellizco del espacio interdigital con pinzas anatómicas).
  2. Anestesiar al lechón mediante inyección intramuscular de una mezcla a base de Zoletilo (0,1 mL/kg).
    NOTA: Reconstituir un vial de Zoletil 50 Vet (tiletamina 125 mg, zolazepam 125 mg) a 10 mL usando 6,25 mL de xilazina (20 mg/mL), 1,25 mL de ketamina (100 mg/mL) y 2,5 mL de butorfanol (10 mg/mL). Las concentraciones finales son 12,5 mg/mL de tiletamina, zolazepam, xilazina, ketamina y 2,5 mg/mL de butorfanol.
  3. Confirmar la profundidad adecuada de anestesia por la ausencia de reflejo de abstinencia en respuesta a un estímulo doloroso (véase el paso 7.1.2).
  4. Realizar la eutanasia mediante inyección intracardíaca de una sobredosis de pentobarbital sódico (3 mL/kg; 400 mg/mL).
    NOTA: Se puede realizar una extracción de sangre intracardíaca antes de la eutanasia utilizando un sistema Vacutainer.

8. Placado bacteriano y cuantificación

  1. Cuantifique la densidad bacteriana en sangre utilizando muestras de venopunctura yugular recogidas durante el experimento y muestras de punción cardíaca recogidas en la eutanasia.
    NOTA: No utilice sangre extraída del catéter arterial, ya que podría contener bacterias residuales de la infección experimental inicial, lo que podría confundir las cuantificaciones.
    1. Prepara una placa de agar de sangre de oveja para cada muestra, marca los cuadrantes 0, -1, -2 y -3 en la parte inferior, y etiqueta la placa con la identificación del animal y el punto temporal.
    2. Utilizando 50 μL de sangre de cada muestra, preparar diluciones de 10 veces 10-1, 10-2 y 10-3 en 450 μL de PBS estéril en tubos microcentrífugas de 1,5 mL.
    3. Manchar cada placa con tres gotas de 20 μL de la dilución correspondiente en el cuadrante asignado, espaciando las gotas para evitar el contacto o la transferencia y evitando la aerosolización.
    4. Incuba los platos durante la noche a 37 °C y luego guarda los platos a 4 °C hasta el contar.
    5. Cuenta todas las colonias bacterianas en la dilución que contienen aproximadamente 10 colonias por mancha. Incluye solo colonias de S. epidermidis, que suelen ser blancas, circulares y de bordes lisos. Inspecciona y registra cuidadosamente cualquier colonia con morfología alterada, ya que esto puede indicar contaminación, por ejemplo, por muestreo. Calcula la CFU/mL usando la siguiente ecuación:
      (CFU/mL) = [(conteo de colonias · factor de dilución)/(3 · 20 μL)] · [1000μL/mL] (3)

Resultados

Se realizó un experimento dosis-respuesta en lechones prematuros criados hasta el día 5 posnatales (Figura 1). En el tercer día posnatal, los lechones recibieron una infusión de una dosis baja de S. epidermidis (109 UFC/kg, n = 9), una dosis alta de S. epidermidis (5 × 109 UFC/kg, n = 9), o solución salina como control (n = 3), y fueron monitorizados durante 44 horas.

Tras la infusión de S. epidermidis , la carga bacteriana en sangre se mantuvo más alta durante el periodo de seguimiento de 44 horas en los lechones que recibieron la dosis alta en comparación con el grupo de dosis baja (Figura 2A, P < 0,05). Solo los lechones del grupo de dosis alta (3/9) desarrollaron sepsis, con inicio aproximadamente entre 12 y 15 horas después de la infección (Figura 2B). De acuerdo con esto, los lechones que recibieron la dosis alta de S. epidermidis mostraron un pH sanguíneo más bajo a las 12 horas (Figura 2C, P < 0,001), acompañado de un marcado aumento de la presión parcial de dióxido de carbono (pCO₂) (Figura 2D, P < 0,01), en comparación con el grupo de dosis baja.

Durante la fase aguda de infección (6 h), ambos grupos infectados mostraron un exceso de base más bajo y niveles más altos de lactato en comparación con los controles con solución salina, con cambios más pronunciados que persistieron hasta las 12 horas en el grupo de dosis altas de S. epidermidis (Figura 2E, F, P < 0,01 – 0,05). Los niveles de glucosa en sangre no difirieron entre grupos (Figura 2G).

A las 6 horas, ambos grupos infectados también mostraron una depleción robusta de neutrófilos en sangre en comparación con los controles no infectados (Figura 3A, ambos P< 0,001). Más adelante en el curso de la infección, se observó reposición de neutrófilos en ambos grupos infectados, pero fue mayor en el grupo de dosis bajas de S. epidermidis (Figura 3A, P < 0,05). Ambos grupos infectados desarrollaron trombocitopenia durante el experimento; sin embargo, los recuentos de trombocitos disminuyeron antes y de forma más marcada en el grupo de dosis altas de S. epidermidis en comparación con el grupo de dosis baja y los controles no infectados (Figura 3B, P < 0,01–0,05). Los niveles plasmáticos de TNF-α, IL-6 e IL-10 estaban elevados en ambos grupos infectados a las 6 y 12 horas después de la infección en comparación con los controles (Figura 3C, P < 0,001–0,05). A las 24 horas, los niveles plasmáticos de TNF-α e IL-10 seguían elevados solo en el grupo de dosis altas de S. epidermidis en comparación con los controles no infectados (P < 0,05), mientras que a las 44 horas solo los niveles de TNF-α seguían elevados (P < 0,05).

En la eutanasia, cuando los lechones alcanzaron los límites humanos o fueron eutanasiados en el momento programado de 44 horas después de la infección, se midieron los niveles plasmáticos de reactivos negativos en fase aguda y marcadores de lesión orgánica (Figuras 4A–G). Entre estos, solo el colesterol (un reactivo de fase aguda negativo) fue significativamente menor en los lechones infectados con la dosis alta de S. epidermidis en comparación con el grupo de dosis baja (Figura 4B, P < 0,05). Los niveles medios de marcadores de lesión hepática, incluyendo alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa, así como marcadores de lesión renal como creatinina y nitrógeno urea en sangre, fueron numéricamente más altos en el grupo de dosis altas de S. epidermidis que en controles no infectados (Figura 4D–G).

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Figura 1: Diseño experimental. Los lechones prematuros nacieron por cesárea al 90% de la gestación. En el tercer día postnatal, los lechones recibieron una infusión intraarterial de S. epidermidis viva a10-9 o 5 × 10,9 UFC/kg, o solución salina como control. Tras la infección, se monitorizaron los lechones durante 44 horas, realizándose una toma de muestras longitudinales de sangre en momentos de tiempo definidos. Figura creada con Biorender.com. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Carga bacteriana en sangre, supervivencia y parámetros de gases en sangre en lechones prematuros tras la infusión arterial con solución salina (CON) o la infección con S. epidermidis vivo. (A) Densidad de S. epidermidis en muestras de sangre recogidas a las 6, 24 y 44 horas posteriores a la infección. (B) Curvas de supervivencia que muestran el tiempo hasta el final humano o la eutanasia programada a las 44 horas tras la infección. (C–G) Parámetros de gasometría arterial a 0, 6, 12, 24 y 44 horas después de la infección. Los datos se presentan en media ± SD. (A), curvas de supervivencia (B) o diagramas de puntos de violín, incluyendo mediana (línea sólida) e IQR (líneas punteadas) (C–G). n = 9 para cada grupo infectado; n = 3 para el control no infectado. Los datos se analizaron utilizando un modelo lineal de efectos mixtos que incluía interacciones de tiempo × grupo (A, C–G) o un modelo de riesgo proporcional de Cox (B). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Abreviaturas; CON = control; pCO2 = presión parcial de CO2; SE = S. epidermidis. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Marcadores inflamatorios circulantes en lechones prematuros tras la infusión arterial con solución salina (CON) o infección con S. epidermidis. (A, B) Recuento circulante de neutrófilos y plaquetas a las 6, 12, 24 y 44 horas después de la infección. (C) Niveles plasmáticos de TNF-α, IL-6 e IL-10 a las 6, 12, 24 y 44 horas después de la infección. Los datos se presentan en gráficos de puntos de violín, incluyendo mediana (línea sólida) e IQR (líneas punteadas) (A–C). n = 9 para cada grupo infectado; n = 3 para el control no infectado. Los datos se analizaron utilizando un modelo lineal de efectos mixtos que incluía interacciones de tiempo × grupo (A–C). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Abreviaturas; CON = control; IL = interleucina; SE = S. epidermidis; TNF = factor de necrosis tumoral. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Parámetros bioquímicos plasmáticos en lechones prematuros tras la infusión arterial con solución salina (CON) o la infección con S. epidermidis viva (109 o 5 × 109 UFC/kg). (A–G) Niveles plasmáticos de albúmina, colesterol, ALP, ALAT, ASAT, creatinina y BUN en el extremo humano o en la eutanasia programada 44 horas después de la infección. Los datos se presentan como gráficos de bigotes que muestran el rango completo (de mínimo a máximo) (A–G). Los datos individuales en púrpura oscuro indican lechones que desarrollaron sepsis. n = 9 para cada grupo infectado; n = 3 para el control no infectado. Los datos se analizaron utilizando un modelo de regresión lineal múltiple (A–G). *P < 0,05. Abreviaturas; ALAT = alanina aminotransferasa; ALP = fosfatasa alcalina; ASAT = aspartato aminotransferasa; BUN = nitrógeno ureico en sangre; CON = control; SE = S. epidermidis. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Cantidad totalConcentración
Energía7762kJ3525kJ/L
Macronutrientes
Aminoácidos92g42g/L
Gordo66g30g/L
Glucosa221g100g/L
Micronutrientes
No64MMOL29mmol/L
K48MMOL22mmol/L
Mg8MMOL4mmol/L
Ca4MMOL2mmol/L
PO418MMOL8mmol/L
SO 48MMOL4mmol/L
Cl93MMOL42mmol/L
Acetato78MMOL35mmol/L

Tabla 1: Composición de la nutrición parenteral total modificada. Las cantidades y concentraciones totales de energía, macronutrientes (aminoácidos, grasa y glucosa) y micronutrientes en la solución nutritiva parenteral.

Figura suplementaria 1: Cinética de crecimiento de S. epidermmidis WT-1457. Las bacterias se cultivaron en caldo de infusión cerebral y corazón a 37 °C con vibración orbital a 180 rpm. La densidad óptica se midió en 600 nm a lo largo del tiempo. Los datos se muestran en una escala logarítmica (A) y lineal (B) (n = 3 experimentos independientes). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Se diseñó un modelo estandarizado de sepsis neonatal en lechones prematuros para estudiar una infección bacteriana sistémica bajo condiciones clínicamente relevantes de inmadurez neonatal. El modelo combina el control de la edad gestacional, la reanimación y el apoyo en cuidados intensivos, el momento de la infección y la toma de muestras longitudinales de sangre. Este enfoque busca cerrar la brecha entre los sistemas experimentales de roedores e in vitro y la compleja fisiología que se encuentra en recién nacidos infectados. Es importante destacar que este modelo se ha utilizado para confirmar la asociación conocida entre sexo, bajo peso al nacer y edad gestacional con la sensibilidad a la sepsis observada en bebés prematuros humanos 16,17,18.

Los cerdos son un modelo de gran tamaño animal muy relevante para la investigación de infecciones debido a las importantes similitudes con los humanos en función inmunitaria y fisiología. Componentes clave del sistema inmunitario innato, incluidos los subconjuntos leucocitos, la señalización de receptores de reconocimiento de patrones y las respuestas de citocinas, muestran una estrecha correspondencia entre cerdos y humanos. Las principales diferencias inmunológicas entre los lechones recién nacidos y los humanos se encuentran en las respuestas inmunitarias adaptativas. Dado que no hay transferencia transplacentaria de inmunoglobulina G (IgG) durante la gestación porcina, los lechones recién nacidos nacen ingenuos en esteaspecto 19. Del mismo modo, mientras que las células B de los bebés no experimentan un desplazamiento isoforme de IgM a IgG antes de los 3–6 meses de edad, las células B porcinas son capaces de desarrollar respuestas IgG poco después delnacimiento de 20 meses.

En este sistema modelo, estas diferencias se mitigan induciendo la infección poco después del nacimiento, antes de que puedan producirse respuestas inmunitarias adaptativas y suministrando inmunoglobulinas maternas mediante transfusión plasmática. Este enfoque da lugar a niveles circulantes de IgG similares a los de recién nacidos muy prematuros, sujetos a una transferencia transplacentaria interrumpida de IgG debido al nacimientoprematuro 17. Además, el tamaño corporal comparativamente grande al nacer (~800 g) fortalece aún más el modelo en comparación con los ratones recién nacidos (~3 g). Como resultado, las influencias ambientales como la temperatura, la humedad y la tensión de oxígeno se parecen más a las que experimentan los recién nacidos humanos. Esta escala también permite el uso de equipos de grado clínico, monitorización invasiva y modalidades de cuidados de apoyo, como el acceso vascular, el soporte respiratorio y la monitorización fisiológica continua, que no son viables en modelos de roedores neonatales. Específicamente, el acceso vascular para infusiones, como la nutrición parenteral, en el modelo de cerdo prematuro se logra mediante un catéter arterial umbilical. Aunque esto contrasta con la vía intravenosa estándar utilizada en neonatología clínica, es necesario por las limitaciones anatómicas de los lechones prematuros, donde los catéteres de la vena umbilical, rara vez atraviesan espontáneamente el ducto venoso y en su lugar se malposicionan dentro del parénquimahepático 21. El parto intraarterial proporciona una vía fiable y reproducible para la infusión continua sin el alto riesgo de necrosis hepática asociada a la mallocación de la vena umbilical. Asimismo, esto permite tomar muestras de sangre arterial para análisis de gasometría.

La infección sistémica en este modelo se induce por la infusión intraarterial de S. epidermides vivo, una de las principales causas de sepsis de inicio tardío en las unidades de cuidados intensivosneonatales 1,2. Sin embargo, un conjunto diverso de patógenos causa sepsis neonatal, y los estafilococos coagulasa negativos, como S. epidermidis, también se sabe que causan infecciones menos graves y un menor riesgo de sepsis que otros patógenos más virulentos, como E. coli 1,2. Aunque el modelo utiliza un patógeno de baja virulencia, el deterioro clínico observado, la activación inflamatoria y la inestabilidad fisiológica reflejan características clave de la sepsis neonatal. El grupo control no infectado (n = 3) de este estudio sirve como referencia base para demostrar el estado fisiológico de lechones prematuros "sanos" bajo condiciones idénticas de cuidados intensivos. Aunque esto provoca un desequilibrio de diseño, estas comparaciones pretenden representar la respuesta del huésped a la infección. Como se muestra en la Figura 2, se observó una clara relación dosis-respuesta con el aumento de las dosis de S. epidermid, coherente con hallazgos previos en lechones infectados en el día 1 de lavida 22. Solo los lechones que recibieron la dosis más alta de S. epidermidis se deterioraron hasta los extremos humanos que requirieron la eutanasia. Sin embargo, ambos grupos infectados desarrollaron acidosis metabólica, mientras que un componente respiratorio sustancial (pCO₂ elevado) solo se observó en el grupo de dosis altas de S. epidermidis. De manera similar, ambos grupos mostraron una marcada neutropenia a las 6 horas de la infección, seguida de reposición de neutrófilos a las 24 horas, que fue mayor en el grupo de dosis bajas. También estuvo presente trombocitopenia en ambos grupos, acompañada de aumentos en las citocinas plasmáticas y marcadores de lesión orgánica, con respuestas más pronunciadas en lechones que recibieron la dosis más alta de S. epidermidis.

En lechones prematuros, la infección por S. epidermidis en el primer día postnatal induce los mismos signos paraclínicos de sepsis neonatal (acidosis metabólica, leucopenia, trombocitopenia, inflamación), así como letargo, coagulopatía y consumo decomplemento 17,22,23. La infección también provoca alteraciones sistémicas en el metabolismo energético, destacando especialmente la reducción de la fosforilación oxidativa mitocondrial, junto con alteraciones en el proteoma y metaboloma plasmáticos similares a las reportadas en pacientes con sepsisneonatal 24,25,26. Además, los lechones prematuros (90% de gestación) tienen muchas más probabilidades de desarrollar sepsis que los lechones nacidos atérmino 17. La composición nutricional afecta además las respuestas clínicas e inmunológicas. La NPT basada en glucosa impulsa el metabolismo glicolítico, que amplifica las respuestas inmunitarias proinflamatorias, mientras que afecta la tolerancia a la enfermedad en los tejidosperiféricos 24,26. La combinación de estas respuestas se asocia con lesión orgánica y progresión hacia el fenotipo de sepsis27. La modulación de la composición de la NPT, ya sea reduciendo el contenido de glucosa o sustituyendo la glucosa por macronutrientes alternativos como la galactosa, aminoácidos glucogénicos o β-hidroxibutirato28,29, atenúa la respuesta inflamatoria y preserva la tolerancia tisular a la enfermedad. La suplementación con glucosa alta mediante NPT también provoca hiperglucemia (≈10–20 mM). Sin embargo, sigue sin estar claro hasta qué punto las respuestas inflamatorias observadas vinculadas a la glucólisis están directamente mediadas por niveles elevados de glucosa en sangre.

Las observaciones experimentales indican diferencias claras en las respuestas clínicas dependiendo del día posnatal de la infección. Tanto el riesgo de desarrollar sepsis como la gravedad de los síntomas clínicos son mayores cuando la infección se induce poco después del nacimiento. La inducción de la infección en el tercer día postnatal conduce a un fenotipo de sepsis más leve con comportamientos de enfermedad, acidosis respiratoria y metabólica durante las primeras 24 horas tras la inducción, seguida de recuperación clínica a pesar de los marcadores elevados de lesiones en órganos. Los mecanismos subyacentes a estas diferencias entre inducción temprana y tardía son actualmente desconocidos y representan un área de investigación en curso. Sin embargo, la homeostasis de la glucosa tras el inicio de la nutrición parenteral mejora durante los tres primeros días postnatales en los lechones prematuros, lo que resulta en una reducción de la hiperglucemia a pesar de una ingesta similar de glucosa. En conjunto, variar el día postnatal de la infección y la provisión de glucosa permite al modelo capturar características tanto de sepsis aguda grave como potencialmente mortal, o un fenotipo más leve. En conjunto, estos ajustes permiten realizar pruebas de intervenciones dirigidas adaptadas a fenotipos específicos de la enfermedad. La aplicabilidad clínica de este modelo podría reforzarse aún más alineándolo con sistemas de puntuación neonatal relacionados con la sepis ya establecidos, como la Evaluación Secuencial de Insuficiencia Orgánica neonatal (nSOFA). En el estudio actual no se implementó un sistema de puntuación basado en nSOFA en tiempo real debido a la inviabilidad de monitorizar la presión arterial arterial continua y de contar plaquetas inmediatas para la puntuación cardiovascular y hematológica. Futuras mejoras del protocolo podrían incorporar un marco nSOFA adaptado para categorizar mejor la gravedad de la enfermedad.

A pesar de sus fortalezas traslacionales, este modelo presenta varias limitaciones importantes. Estos experimentos requieren muchos recursos, requiriendo instalaciones especializadas y personal altamente cualificado para realizar cesáreas, reanimación neonatal, alojamiento postnatal y cuidado de lechones prematuros. Los experimentos de infección requieren además una monitorización continua y práctica por parte de dos o tres miembros experimentados del personal para garantizar el bienestar animal y la recogida fiable de datos, y el seguimiento a largo plazo incrementa los costes. En comparación con los modelos de roedores, la disponibilidad de reactivos específicos de cada especie es más limitada, especialmente para inmunohistoquímica y citometría de flujo, aunque muchos anticuerpos humanos pueden usarse con éxito tras una validación adecuada. Además, la naturaleza de sobreproducción de los cerdos provoca una considerable variación biológica dentro y entre camadaches, lo que requiere grupos más grandes para detectar diferencias modestas en las respuestas a la infección. Aunque esta variabilidad aumenta la complejidad experimental, también refleja más estrechamente la heterogeneidad observada en poblaciones neonatales clínicas, aumentando así la relevancia traslacional del modelo. En conclusión, este protocolo validado para la sepsis neonatal será una herramienta útil para futuras investigaciones en neonatología y para probar intervenciones preventivas y terapéuticas novedosas.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el personal del grupo de Pediatría Comparada de la Universidad de Copenhague y financiado por la Fundación Novo Nordisk (NNF23OC0085457 y NNF22OC0078747).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
 0.1–10 μL pipette tips “Optifit”Sartorius790010
1 mL disposable syringes (sterile)e-power150001S
1 mL syringe with 25 G X 16 mm needle (sterile)B. Braun Melsungen AG9161465V
1.5 mL tubesEppendorf30125215
10 mL disposible syringe (sterile)e-power150010S
100 mL Erlenmeyer flasksDuran Wheaton Kimble212162403
1000 μL pipetteSartorius 46880171
12 G “Intraflon 2” needles (sterile)Vygon122.27
16 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300637
18 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson303262
19 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG466 5112
2 mL disposible syringe (sterile)e-power150002S
2-0 70 cm suture “ Vicryl plus” (sterile)Johnson & Johnson  VCP453
20 G X 25 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson304827
20 mL disposable syringe (sterile)e-power150020S
20 μL pipetteSartorius46886095
200 μL pipetteSartorius39486615
20G Venflon "Pro" 1.1 x 32 mmBeckton Dickinson393255
21 G x 25 mm Vacutainer blood collection needles (sterile)Becton Dickinson301746
21 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG4665643
22 G X 50 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300094
23 G X 25 mm “Medoject” needles (sterile)Chirana T. InjectaCH23100
25 G X 16 mm “Microlance 3” needles (sterile)Beckton Dickinson300600
25 G X 25 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG9186158
25 mL plastic pipettes (sterile)LP Italian Spa162510
30 mL disposible syringes (sterile)e-power150030S
4L plastic freezer bagsCater.LineABN-105004
5–350 μL pipette tips “Optifit”Sartorius790350
5 mL disposible syringe (sterile)e-power150005S
5 mL syringe (sterile) B. Braun Melsungen AG4617053V
50–1200 μL pipette tips “Optifit”Sartorius791200
50 mL Luer Lock Original Perfusor Syringe B. Braun Melsungen AG8728844F-06
50 mL tubes (sterile)Sarstedt AG and Co. KG62.547.254
82% ethanol + 0.5% chlorhexidine disinfection wipesMediq527497
Atropine "ATROpin" 1 mg/mLAmgros741124
Bandage scissors, stainless steel, 180 mmB. Braun Melsungen AGBC849R
Blood gas machine ABL90Radiometer994-667 (service manual)
Brain Heart Infusion broth (BHI/B)Produced in-houseN.A. Commercially available equivalent product: Brain Heart Infusion Broth (Merck, Cat. No. 53286)
Butorphanol "Butomidor vet" 10 mg/mLVetViva Richter53 19 43
Cell incubator “HeraCell 150i”Thermo Fisher Scientific51032719
Centrifuge, Rotina 380 RHettich 1701
Clinical chemistry system “Advia 2120i”Siemens Healthcare GmbH10488923
Closing cones “Combi-Stopper” (sterile)B. Braun Melsungen AG4495101
Columbia agar + 5% sheep blood platesBioRad63784
Disposable soft underpads, Abri-Soft classicAbena4115
Doxapram-V 20 mg/mLDechra34144/G
EDTA 3 mL collection tubes (sterile)Becton Dickinson368856
Endotracheal tube (12 mm x 55 cm, 150 cc), Silicone, cuffedMilaGVPmL-METC955
Enteral feeding tube 04Fr-L.40cm - PVC (sterile)Vygon310.04Used as umbilical arterial catheter
Ethanol 70% VWR83801.36
Extension line “Q-Style” (sterile)Becton Dickinson385151
Flowmeter for oxygenDamecaP/N 32018-00
Flumaznil 0.1 mg/mLHamelm pharmacy gmbh33659
Gloves, “Gentle Skin” (sterile)Meditrade9021

Referencias

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