Un protocolo de separación hemisférica para la observación morfológica y la extracción combinada de ARN y proteínas en regiones cerebrales murinas

Resumen

Este protocolo divide en dos partes el cerebro de ratón. Un hemisferio se utiliza para tinción morfológica, y el otro para la extracción de ARN y proteínas. Esta estrategia reduce el consumo de animales, sigue los principios de las 3R y minimiza la variación entre animales.

Resumen

En la investigación diaria en neurociencia, las tinciones morfológicas y los ensayos moleculares de ácidos nucleicos/proteínas generalmente requieren animales experimentales separados, lo que incrementa el uso de animales y es inconsistente con el principio de bienestar animal de las 3R. Este protocolo establece un flujo de trabajo para la distribución de tejido cerebral murino que permite análisis morfológicos y moleculares emparejados a partir de un solo animal. Tras la perfusión transcardíaca con solución salina al 0,9 %, el cerebro se divide en dos hemisferios. Un hemisferio se fija en paraformaldehído al 4 % para inmunohistoquímica e inmunofluorescencia; los cortes almacenados en una solución de sacarosa-etilenglicol-poli(N-vinil-2-pirrolidona) (PVP) mantienen una calidad de tinción confiable durante hasta siete años. El hemisferio contralateral se criopreserva a -80 °C para la extracción combinada de ARN y proteínas, con rendimientos suficientes para qPCR y Western blot posteriores. Probado en biopsias de 9–10 mg del cortex entorrinal, este método produce rendimientos más bajos de ARN y proteínas que la extracción separada de ARN o proteína individualmente, pero las biomoléculas recuperadas siguen siendo adecuadas para la detección molecular. Este flujo de trabajo reduce el consumo de animales y elimina las diferencias interindividuales entre los análisis morfológicos y moleculares emparejados. Proporciona un método factible de preparación de tejidos para el perfilado multidimensional de subregiones discretas del cerebro murino.

Introducción

La investigación en neurociencia se ha expandido enormemente en las últimas décadas, descubriendo mecanismos clave que rigen la fisiología del cerebro humano, el inicio de enfermedades neurológicas y el desarrollo de terapias. Los modelos animales siguen siendo indispensables para la investigación neurocientífica, ya que proporcionan plataformas controlables y reproducibles para explorar el desarrollo neural, la función fisiológica y los procesos patológicos. La manipulación experimental y la observación histológica en sujetos murinos permiten a los investigadores caracterizar la señalización neuronal, la formación de circuitos neuronales y las asociaciones entre lo neural y el comportamiento. Paralelamente al progreso técnico, la ética en los experimentos con animales se ha convertido en una preocupación central. Los principios de las 3R (Sustitución, Reducción y Refinamiento) son ahora estándares aceptados globalmente para todos los estudios con animales^1,2, y exigen a los investigadores minimizar el uso de animales manteniendo al mismo tiempo resultados experimentales confiables.

Herramientas innovadoras como los sistemas de eliminación condicional permiten una manipulación genética precisa dentro de subregiones discretas del cerebro murino³. Estos avances han impulsado una investigación intensiva en compartimentos cerebrales a microescala, como el CA1, CA3 y DG del hipocampo, que regulan el aprendizaje, la memoria y el estado de ánimo⁴. La decodificación de las funciones de alto nivel de estas pequeñas regiones cerebrales exige mediciones morfológicas, transcripcionales y a nivel de proteínas coordinadas. Desafortunadamente, su escaso volumen de tejido crea importantes obstáculos técnicos para la detección paralela de múltiples índices.

La tinción morfológica, la cuantificación de ARN y la inmunodetección de proteínas son tres lecturas básicas rutinarias en neurociencia. Los diseños de investigación tradicionales requieren tres cohortes separadas de animales murinos para completar estos tres tipos de pruebas. Esta práctica aumenta drásticamente el gasto de animales e introduce una variación biológica considerable entre animales, lo que debilita la comparabilidad entre conjuntos de datos histológicos y moleculares. Un protocolo unificado que obtenga señales morfológicas y moleculares emparejadas a partir de un solo animal abordaría en gran medida estas dos limitaciones críticas y cumpliría mejor con el principio de Reducción de las 3R.

Aquí presentamos un protocolo reproducible de separación hemisférica para tejido cerebral de ratón. Tras la perfusión sistémica con solución salina, se divide todo el cerebro en dos hemisferios: un hemisferio se fija para exámenes morfológicos, y el hemisferio contralateral se criopreserva para la coextracción simultánea de ARN y proteínas. Los tejidos fijados y almacenados en tampón protector de sacarosa-etilenglicol-polivinilpirrolidona (PVP) mantienen señales de tinción estables y de alta calidad para inmunohistoquímica e inmunofluorescencia durante hasta siete años. Validamos este método utilizando biopsias diminutas de 9–10 mg del cortex entorrinal, un tejido más ligero que regiones comúnmente estudiadas como el hipocampo y el cortex prefrontal. La detección exitosa de esta pequeña muestra de tejido indica que subregiones cerebrales aún menores, como el hipotálamo y la amígdala, también son compatibles con este procedimiento. Aunque el protocolo genera concentraciones más bajas de ARN y proteínas que los kits especializados de extracción de propósito único, las biomoléculas aisladas poseen calidad suficiente para realizar análisis estándar de qPCR y Western blot. Este procedimiento reduce el consumo de animales y elimina las diferencias interindividuales entre análisis morfológicos y moleculares emparejados. Proporciona un método factible de preparación de tejidos para el perfilado multidimensional de subregiones cerebrales murinas discretas.

Protocolo

Declaración de ética

Todos los experimentos con animales realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Dalian (Número de aprobación AEE18026 para experimentos con ratas y número AEE24261 para experimentos con ratones), República Popular de China. Todos los protocolos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices éticas para animales de laboratorio y cumplieron plenamente con los principios 3R (Reducción, Sustitución y Refinamiento) para la experimentación animal. A lo largo de todo el proceso experimental, se adoptaron medidas rigurosas para aliviar eficazmente el sufrimiento y el malestar de los animales. Al mismo tiempo, el número de animales experimentales se limitó a la cantidad mínima necesaria para garantizar la fiabilidad y validez de los resultados del análisis estadístico. Véase la Tabla de materiales para obtener una lista completa de los reactivos, consumibles y equipos utilizados en este protocolo.

1. Preparación del animal experimental y cirugía de perfusión transcardial

1. Anestesia y preparación preoperatoria
   1. Utilice ratas Sprague-Dawley o ratones C57BL/6 machos adultos de grado libre de patógenos específicos (SPF) para este protocolo. Mantenga a los animales en un ambiente con temperatura controlada (22 ± 2 °C) y un ciclo de 12 h de luz/oscuridad. Proporcione a los animales acceso ad libitum a alimento y agua estériles.
   2. Administre pentobarbital sódico a los animales mediante inyección intraperitoneal a una dosis de 80 mg/kg para ratas o 50 mg/kg para ratones para inducir la anestesia (véase Figura 1).
2. Procedimiento de perfusión transcardial
   1. Fije los animales anestesiados en posición supina sobre una mesa quirúrgica.
   2. Abra la pared abdominal a lo largo de la línea media desde el apéndice xifoides hasta la sínfisis púbica utilizando tijeras rectas. Corte la pared torácica lateral bilateralmente para exponer completamente el corazón.
   3. Perfunda al animal con solución salina normal al 0,9 % fría con hielo a un flujo constante: 100–150 mL durante 10–15 min para ratas y 20–30 mL durante 5–8 min para ratones.
3. Extracción del cerebro y separación de los hemisferios
   1. Seccione la cabeza de los animales con tijeras quirúrgicas grandes tras finalizar la perfusión. Corte el cuero cabelludo a lo largo de la línea media para exponer el cráneo.
   2. Utilice una espátula estéril para levantar suavemente el cerebro de la cavidad craneal. Transfiera rápidamente el cerebro completo a una placa de Petri estéril colocada sobre hielo.
   3. Utilice una cuchilla de afeitar estéril y libre de RNasas para dividir simétricamente el cerebro en los hemisferios izquierdo y derecho a lo largo de la sutura sagital.
   4. Transfiera inmediatamente el hemisferio izquierdo a un tubo cónico de 15 mL que contenga 10 mL de solución de paraformaldehído al 4 % fría con hielo para su fijación. Transfiera el hemisferio derecho a un tubo de criopreservación estéril y libre de RNasas, congélelo rápidamente en nitrógeno líquido y almacénelo a -80 °C hasta la extracción de ARN y proteínas.

2. Fijación, corte y almacenamiento a largo plazo de tejido cerebral

1. Fijación y deshidratación
   1. Sumergir completamente el hemisferio izquierdo en una solución de paraformaldehído al 4% y fijar el tejido a 4 °C durante 24 h. Al finalizar la fijación, transferir el hemisferio cerebral a un tubo cónico de 15 mL que contenga solución de sacarosa al 30% y deshidratar el tejido a 4 °C.
   2. Reemplazar la solución de sacarosa al 30% cada 24 h hasta que el tejido cerebral se hunda en el fondo del tubo.
2. Preparación de cortes criostáticos
   1. Retirar el hemisferio cerebral deshidratado de la solución de sacarosa y secar suavemente el exceso de líquido con papel de filtro estéril.
   2. Montar el hemisferio cerebral sobre la platina del criostato utilizando medio de inclusión OCT (temperatura óptima para corte).
   3. Realizar cortes coronales seriados del cerebro con un grosor de 30 µm utilizando un criostato. Recoger cortes consecutivos en una placa de 24 pocillos que contenga PBS estéril 0.01 M.
3. Almacenamiento a largo plazo de cortes cerebrales
   1. Preparar con anticipación la solución de preservación crioprotectora para rebanadas cerebrales: Añadir 2 g de PVP400, 60 g de sacarosa y 60 mL de etilenglicol a 100 mL de PBS 0.01 M. Agitar la solución a temperatura ambiente hasta que todos los componentes se disuelvan completamente y almacenarla a 4 °C hasta su uso.

3. Extracción de ARN con TRIzol

1. Homogeneización del tejido y separación de fases
   1. Homogenice el tejido cortical entorrinal en 1 mL de reactivo TRIzol utilizando un homogenizador ultrafino e incube el homogenizado en hielo durante 15 min. Centrifugue a 8,000 × g durante 5 min a 4 °C.
   2. Añada 200 µL de cloroformo y vortexee durante 10 s. Centrifugue a 5,600 × g durante 15 min a 4 °C. Luego transfiera la fase acuosa superior a un tubo libre de RNasas. Añada 500 µL de isopropanol e incube a -20 °C durante la noche para precipitar el ARN. Vuelva a centrifugar.
2. Precipitación del ARN, lavado y evaluación de calidad
   1. Descarte el sobrenadante y lave el botón de ARN con 1 mL de etanol al 75%. Centrifugue a 5,600 × g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante, seque el botón al aire durante 10 min y disuelva el ARN en 20 µL de agua tratada con DEPC durante 10 min.
   2. Mida la concentración y pureza del ARN (A₂₆₀/A₂₈₀) utilizando un espectrofotómetro. Almacene el ARN a -80 °C hasta su análisis posterior.

4. Extracción de proteína total con el kit Minute

1. Lisis y homogenización de tejidos
   1. Enfríe previamente la columna de centrifugación y el tubo de recolección en hielo. Homogenice el tejido en 100 µL de tampón de lisis celular utilizando un homogenizador ultrafino. Enjuague el homogenizador con 100 µL adicionales de tampón de lisis celular y combine los lisados.
2. Recuperación y cuantificación de proteínas
   1. Transfiera el homogenizado a la columna de centrifugación e incube durante 2 min a temperatura ambiente.
   2. Centrifugue a 11,000–14,300 × g durante 2 min.
   3. Coloque inmediatamente el tubo de recolección en hielo y deseche la columna de centrifugación. Determine la concentración de proteína utilizando un ensayo BCA.

5. Extracción simultánea de ARN y proteína del cortex entorrinal (9–10 mg)

1. Preparación previa al experimento y preparación de reactivos
   1. Utilice el kit de ADN/ARN/proteína para todos los pasos de extracción. Utilice únicamente materiales desechables certificados como libres de RNasa y DNasa (véase Figura 2).
   2. Prepare el tampón de lisis inmediatamente antes de usarlo: añada el cóctel de inhibidores de proteasas al tampón de lisis proporcionado con el kit en una dilución 1:100.
2. Lisis del tejido y separación de fases
   1. Saque la hemiesfera cerebral derecha congelada del almacenamiento a -80 °C y colóquela sobre hielo. Utilice un punzón estéril libre de RNasa para recolectar 9–10 mg de tejido de la región cerebral objetivo.
   2. Homogenice completamente el tejido sobre hielo utilizando un homogeneizador de tejidos eléctrico hasta que no queden fragmentos visibles de tejido. Incube el homogenizado sobre hielo durante 10 min para asegurar una lisis completa.
   3. Añada 200 µL del reactivo de separación proporcionado con el kit al homogenizado. Vortexee el tubo vigorosamente durante 30 s e incúbelo a temperatura ambiente durante 3 min. Centrifugue el tubo a 8.000 × g durante 15 min a 4 °C para lograr una separación completa de fases.
3. Purificación y elución del ARN
   1. Recoja cuidadosamente la fase acuosa superior utilizando una punta de pipeta libre de RNasa. Transfiera la fase acuosa recolectada a un nuevo tubo de 1,5 mL libre de RNasa. Añada un volumen igual de etanol al 100% a la fase acuosa recolectada y mezcle.
   2. Transfiera 700 µL de la mezcla a la columna de purificación de ARN proporcionada con el kit. Centrifugue la columna a 5.600 × g durante 1 min a temperatura ambiente.
   3. Añada 500 µL del tampón de lavado de ARN 1 proporcionado con el kit a la columna. Centrifugue la columna a 5.600 × g durante 1 min a temperatura ambiente.
   4. A continuación, añada 500 µL del tampón de lavado de ARN 2 proporcionado con el kit a la columna y centrifugue nuevamente. Centrifugue la columna vacía a 8.000 × g durante 2 min a temperatura ambiente para eliminar completamente el etanol residual de la membrana de la columna.
   5. Transfiera la columna a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mL libre de RNasa. Añada directamente al centro de la membrana de la columna 30–50 µL de agua libre de RNasa (precalentada a 60 °C). Incube la columna a temperatura ambiente durante 2 min. Centrifugue la columna a 8.000 × g durante 1 min a temperatura ambiente para eluir el ARN.
4. Precipitación y disolución de proteínas
   1. Añada 750 µL de isopropanol a la fase orgánica restante y a la intercara en el tubo original después de retirar la fase acuosa para la extracción de ARN. Incube la mezcla a -20 °C durante 30 min para precipitar las proteínas.
   2. Centrifugue el tubo a 8.000 × g durante 10 min a 4 °C. Descarte el sobrenadante y mantenga el precipitado proteico intacto en el fondo del tubo.
   3. Añada 1 mL de etanol al 95% al precipitado proteico. Vortexee brevemente el tubo para lavar el precipitado. Centrifugue el tubo a 8.000 × g durante 5 min a 4 °C y descarte el sobrenadante. Repita este paso de lavado dos veces más.
   4. Seque el precipitado proteico al aire a temperatura ambiente durante 5–10 min hasta que el precipitado se vuelva translúcido y no se observe etanol residual.
   5. Añada 50–100 µL de solución de SDS al 5–10% al precipitado seco. Vortexee el tubo vigorosamente durante 1 min e incube sobre hielo durante 10 min para disolver completamente la proteína. Centrifugue el tubo a 8.000 × g durante 5 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante como el extracto proteico final.

6. Tinción de inmunohistoquímica (IHC)

1. Pretratamiento de la sección e inactivación de enzimas endógenas
   1. Retire las secciones cerebrales del almacenamiento crioprotector a -20 °C. Utilice una aguja de vidrio para transferir las secciones a una placa de 24 pocillos que contenga PBS 0,01 M (pH 7,4).
   2. Lave las secciones tres veces con PBS 0,01 M, 5 min por lavado, a temperatura ambiente en un agitador.
   3. Incube las secciones con bloqueador de peroxidasa al 3% durante 10 min a temperatura ambiente para inactivar la actividad de peroxidasa endógena. Repita los pasos de lavado tras el bloqueo.
2. Permeabilización y bloqueo no específico
   1. Incube las secciones en Triton X-100 al 0,5% durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador para permeabilizar la membrana celular. Repita los pasos de lavado.
   2. Incube las secciones en albúmina sérica bovina al 4% durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de incubación con un inhibidor de tinción no específica durante 30 min adicionales a temperatura ambiente.
3. Incubación con anticuerpos primarios y secundarios
   1. Diluya los anticuerpos primarios en solución de BSA al 1% a las siguientes diluciones optimizadas: doblecortina (DCX, 1:4000), antígeno nuclear neuronal (NeuN, 1:3000), molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1 (Iba-1, 1:2000) y proteína ácida fibrilar glial (GFAP, 1:2000).
   2. Añada 200 µL de la solución diluida de anticuerpo primario a cada pocillo, asegurando la inmersión completa de las secciones.
   3. Añada 200 µL de anticuerpo secundario marcado con biotina a cada pocillo. Incube las secciones a temperatura ambiente durante 30 min.
   4. Lave las secciones tres veces con PBS 0,01 M, 5 min por lavado. Añada 300 µL de conjugado de estreptavidina-peroxidasa a cada pocillo. Incube las secciones a temperatura ambiente durante 30 min. Repita los pasos de lavado tras la incubación.
4. Desarrollo cromogénico con 3,3′-diaminobencidina (DAB) y montaje con cubreobjetos
   1. Añada 200 µL de solución de trabajo de DAB a cada pocillo. Supervise la reacción cromogénica bajo un microscopio de luz.
   2. Monte las secciones sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con gelatina utilizando una aguja de vidrio. Deje secar completamente al aire a temperatura ambiente.
   3. Deshidrate los portaobjetos mediante una serie de etanol graduado (50%, 70%, 90%, 95%, 100%, 100% etanol, 5 min cada uno), seguido de clarificación en xileno dos veces, 5 min cada vez.

7. Tinción por inmunofluorescencia (IF)

1. Pretratamiento y permeabilización de la sección
   1. Retire las secciones cerebrales del almacenamiento en crioprotector a -20 °C. Transfiera las secciones a una placa de 24 pocillos que contenga PBS 0,01 M (pH 7,4).
   2. Lave las secciones tres veces con PBS 0,01 M, 5 min por lavado, a temperatura ambiente en agitación.
   3. Incube las secciones en Triton X-100 al 0,5 % durante 30 min a temperatura ambiente en agitación.
   4. Lave las secciones tres veces con PBS 0,01 M, 10 min por lavado, tras la permeabilización.
2. Bloqueo e incubación con anticuerpo primario
   1. Incube las secciones en una solución de bloqueo que contenga BSA al 4 % y un inhibidor de tinción no específica durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
   2. Aspire la solución de bloqueo. Diluya los anticuerpos primarios en solución de BSA al 1 % a concentraciones optimizadas y añada 300 µL de la solución de anticuerpo primario diluido a cada pocillo. Incube las secciones durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada y opaca a la luz.
3. Incubación con anticuerpo secundario
   1. Al día siguiente, reanime las secciones a temperatura ambiente durante 1 h a oscuras. Recupere la solución de anticuerpo primario y lave las secciones tres veces con PBS 0,01 M, 10 min por lavado, en agitación y a oscuras.
   2. Diluya los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo en solución de BSA al 1 % según la dilución recomendada por el fabricante. Añada 300 µL de la solución de anticuerpo secundario a cada pocillo. Incube las secciones a temperatura ambiente durante 1–2 h a oscuras.
   3. Lave las secciones cinco veces con PBS 0,01 M, 5 min por lavado, a oscuras.

8. Análisis de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)

1. Eliminación de ADN genómico y transcripción inversa del ARN
   1. Realice la transcripción inversa para sintetizar ADN complementario (cADN) utilizando un kit de transcripción inversa, con 1 µg de ARN total por sistema de reacción de 20 µL. Utilice el programa térmico recomendado por el fabricante: 25 °C durante 5 min, 50 °C durante 15 min, 85 °C durante 5 min, mantenga a 4 °C.
   2. Diluya el cADN sintetizado 1:5 con agua libre de RNasas. Almacene el cADN a -20 °C hasta la amplificación por qPCR.
2. Preparación del sistema de qPCR y amplificación
   1. Prepare el sistema de reacción de qPCR sobre hielo en una campana PCR dedicada y libre de RNasas. El sistema de reacción de 20 µL incluye: 10 µL de Mezcla Maestra de qPCR, 0,4 µL del cebador directo (10 µM), 0,4 µL del cebador inverso (10 µM), 2 µL de la plantilla de cADN diluido, 7,2 µL de agua libre de RNasas.
   2. Realice la amplificación por qPCR utilizando el siguiente programa: desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 s; 40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 30 s; seguido de análisis de la curva de disociación desde 60 °C hasta 95 °C, con incrementos de 0,5 °C cada 5 s.

9. Inmunotransferencia (Western blot)

1. Cuantificación de proteínas y preparación de muestras
   1. Diluya los extractos proteicos a concentraciones iguales utilizando una solución de SDS al 5–10 %, según los resultados del ensayo BCA.
2. Electroforesis SDS-PAGE y transferencia de proteínas
   1. Prepare un gel separador al 10 % de SDS-PAGE y un gel de apilamiento al 5 % según los protocolos estándar de biología molecular.
   2. Cargue 20 µg de proteína total por pocillo en el gel. Para experimentos de carga en gradiente, cargue 15 µg, 30 µg y 45 µg de proteína por pocillo.
   3. Realice la electroforesis a 80 V durante 30 min hasta que el marcador proteico entre en el gel separador, luego aumente el voltaje a 120 V durante 60–90 min hasta que el colorante azul de bromofenol alcance la parte inferior del gel.
   4. Arme el sándwich de transferencia en el siguiente orden (de cátodo a ánodo): esponja, papel filtro, gel, membrana de PVDF, papel filtro y esponja. Asegúrese de que no queden burbujas de aire entre el gel y la membrana.
   5. Realice la transferencia húmeda a 300 mA de corriente constante durante 90 min en un baño de hielo.
3. Bloqueo de la membrana e incubación con anticuerpos
   1. Lave brevemente la membrana de PVDF con tampón TBST tras finalizar la transferencia. Incube la membrana en BSA al 5 % durante 2 h a temperatura ambiente en agitación para bloquear los sitios de unión no específicos.
   2. Diluya los anticuerpos primarios en solución de BSA al 5 % a concentraciones optimizadas. Incube la membrana con la solución de anticuerpo primario durante la noche a 4 °C en agitación.
   3. Lave la membrana tres veces con tampón TBST, 10 min por lavado, en agitación al día siguiente.
   4. Diluya el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en solución de leche descremada al 5 % según la dilución recomendada por el fabricante. Incube la membrana con la solución de anticuerpo secundario durante 2 h a temperatura ambiente en agitación.
   5. Lave la membrana tres veces con tampón TBST, 10 min por lavado, tras la incubación con el anticuerpo secundario. Incube la membrana con la solución de sustrato ECL durante 1–2 min a oscuras.

Resultados

Evaluación de la concentración de ARN, electroforesis en gel de agarosa y qPCR

Como se muestra, se extrajeron simultáneamente ARN total y proteína a partir de biopsias del cortex entorrinal (9–10 mg) mediante el kit de ADN/ARN/proteína. Muestras paralelas procesadas con TRIzol (ARN) o con el kit de extracción de proteínas sirvieron como controles. El protocolo permitió obtener 235 ± 12 ng µL⁻¹ de ARN, un 36 % menos que con TRIzol (p < 0,05) (Figura 3A). No obstante, los geles de agarosa revelaron bandas nítidas de ARNr 28S y 18S y señales de 5S, lo que indica ARN intacto (Figura 3B). La qPCR para CD86, IL-1β, TNF-α e IL-6 produjo curvas de disociación únicas y simétricas (Figura 3C), y se observaron valores de Ct más bajos en el grupo (Figura 3D); sin embargo, se requieren estudios adicionales, incluyendo análisis de integridad del ARN, para determinar si estas diferencias reflejan una mejor calidad del ARN o una mayor eficiencia de extracción. Aunque el rendimiento de ARN fue menor que el obtenido con la extracción mediante TRIzol, las bandas definidas de ARNr 28S y 18S y las curvas específicas de amplificación en qPCR indicaron que el ARN extraído era de calidad suficiente para análisis posteriores de qPCR.

Evaluación de la concentración de proteínas, electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS y análisis por inmunotransferencia

De acuerdo con los datos de ARN, el protocolo de extracción dual produjo concentraciones más bajas de proteína total en comparación con el kit de proteína (p < 0,05). Sin embargo, los inmunotransferidos revelaron bandas inmunorreactivas marcadamente más intensas para cada blanco analizado (Figura 4A). En concordancia con los resultados de cuantificación de ARN, el protocolo de coextracción de ARN y proteína recupera menos proteína total que el kit de proteína específico de un solo uso, lo cual puede observarse mediante tinción de proteínas totales con azul de Coomassie (Figura 4B–C). La proteína de control β-Tubulina mostró bandas claras y estables con ambos métodos de extracción, con intensidad de señal comparable. La proteína ULK de baja abundancia también se detectó con éxito en las muestras coextraídas. Notablemente, las señales de las bandas de PSD-95, p-ERK y p-NFκB p65 fueron marcadamente más intensas en el grupo de coextracción en comparación con el kit de extracción de proteína individual. La carga serial de proteína, desde 15 µg hasta 45 µg, generó gradientes de bandas dependientes de la dosis para todos los blancos detectados en ambos grupos. En conjunto, aunque el rendimiento total de proteína del flujo de trabajo de extracción dual es menor, la calidad de la proteína es suficiente para el análisis estándar mediante inmunotransferido, y el rendimiento general de detección no es inferior al de los kits convencionales de extracción individual de proteína.

Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia

La inmunohistoquímica en secciones cerebrales almacenadas durante 0,5–7 años reveló una marcación robusta de neuronas recién nacidas DCX⁺, células secretoras AVP⁺ y neuronas MAP2/NeuN⁺ con morfología y fibras intactas (Figura 5A). La inmunofluorescencia de secciones de 5–7 años de antigüedad mostró astrocitos GFAP⁺, microglía Iba-1⁺ y neuronas activadas FosB⁺ claramente visibles (Figura 5B). Secciones representativas almacenadas durante 0,5–siete años conservaron señales inmunohistoquímicas e inmunofluorescentes detectables bajo las condiciones evaluadas. Por lo tanto, la solución de preservación mantiene la integridad del tejido y la antigenicidad, permitiendo un almacenamiento a largo plazo confiable.

Figura 1: Flujo de trabajo integrado para la separación de hemisferios destinado a la detección morfológica y molecular del cerebro. Este esquema ilustra toda la secuencia experimental, incluyendo la perfusión transcardial con solución salina en roedores, la bisectomía media del cerebro completo aislado, la fijación y preparación de cortes por criomicrotomía del hemisferio izquierdo para tinción mediante IHC/IF, y la criopreservación del hemisferio contralateral para la posterior extracción simultánea de ARN y proteínas, análisis de qPCR y de inmunotransferencia (Western blot). Todas las ilustraciones de ratones fueron generadas originalmente por Jimeng AI. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Flujo de trabajo para la coextracción simultánea de ARN y proteínas a partir de tejido cerebral de roedor congelado. El diagrama muestra los pasos secuenciales que incluyen la perforación del tejido diana a partir de hemisferios congelados, la lisis tisular y la separación en tres fases, la purificación y elución del ARN para qPCR, así como la precipitación, lavado y disolución de proteínas para preparar muestras destinadas a la detección mediante inmunotransferencia (Western blot). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Evaluación del rendimiento de ARN, integridad del ARN y compatibilidad con qPCR utilizando muestras microescalares de corteza entorrinal de rata. (A) Concentraciones cuantificadas de ARN obtenidas mediante el kit de coextracción frente al método TRIzol (media ± EE). (B) Electroforesis en gel de agarosa que muestra bandas intactas de ARNr 28S y 18S de ambos grupos de extracción. (C) Curvas de fusión únicas que confirman la amplificación específica de los genes inflamatorios diana y de GAPDH como gen de referencia. (D) Valores de Ct de los genes inflamatorios detectados con la misma cantidad de ARN de entrada en ambos métodos de extracción. *p < 0,05, **p < 0,01 frente al grupo TRIzol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Evaluación mediante inmunotransferencia de las proteínas recuperadas por el protocolo de coextracción de ARN/proteína. (A) Carga escalonada de proteína (15/30/45 µg) que muestra señales de bandas dependientes de la dosis para proteínas sinápticas y de señalización. (B) Detección de la proteína ULK1 de alto peso molecular con tinción total de proteínas con CBB como referencia de carga. (C) Comparación mediante inmunotransferencia con carga equitativa de proteínas diana entre dos flujos de extracción. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Tinción inmunohistoquímica e inmunofluorescente de secciones cerebrales libres conservadas durante 0,5–7 años. (A) Micrografías de tinción inmunohistoquímica en campo claro capturadas con aumentos de 200× y 400×. Las tinciones de DCX y AVP se realizaron en muestras de tejido de ratón, mientras que las tinciones de MAP2 y NeuN se realizaron en muestras de tejido de rata. (B) Imágenes representativas de inmunofluorescencia obtenidas de muestras de tejido de rata. GFAP marca astrocitos, IBA-1 marca microglía, y FOSB indica actividad neuronal. Todos los experimentos de tinción de inmunofluorescencia mostrados en este panel se realizaron utilizando muestras de rata para evaluar la expresión de marcadores neuronales y la localización celular, micrografías con aumento de 200×.  Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

En la investigación con roedores, los análisis morfológicos y los ensayos de ácidos nucleicos/proteínas a menudo requieren muestras animales separadas debido a sus procedimientos de preparación distintos. Esto incrementa el uso de animales e introduce variación biológica entre animales, lo que puede reducir la comparabilidad entre conjuntos de datos histológicos y moleculares. Para abordar estas limitaciones, desarrollamos un protocolo que permite obtener datos histológicos y moleculares a partir del mismo animal.

El diseño central de este protocolo es la distribución hemisférica del tejido cerebral tras la perfusión transcardíaca con solución salina al 0,9 %^5,6. Un hemisferio se fija en paraformaldehído al 4 % para inmunohistoquímica e inmunofluorescencia, mientras que el hemisferio contralateral se almacena a −80 °C para la posterior coextracción de ARN y proteínas, qPCR y inmunotransferencia (Western blot). Sin embargo, las lecturas seleccionadas podrían no ser completamente comparables entre ambos hemisferios cerebrales. Se ha documentado la lateralización estructural y funcional en cerebros de roedores, y estas diferencias hemisféricas podrían introducir variabilidad cuando los análisis se realizan en lados opuestos^7,8. Por lo tanto, los investigadores deben seleccionar sistemáticamente tejido del mismo hemisferio cerebral de acuerdo con sus objetivos de investigación.

Una ventaja destacada de este método es la conservación a largo plazo de secciones cerebrales fijadas y flotantes. Tras la deshidratación con sacarosa al 30%, secciones coronales de 30 µm se almacenan en una solución de preservación de sacarosa-etilenglicol-PVP. Estudios previos han demostrado que las soluciones crioprotectoras de sacarosa-etilenglicol-PVP ayudan a preservar la morfología tisular y la antigenicidad durante el almacenamiento prolongado^9,10. Sin embargo, pocos estudios han evaluado duraciones de almacenamiento que se extienden durante varios años. Los datos de nuestro laboratorio amplían estos hallazgos: secciones representativas almacenadas hasta siete años conservaron señales inmunohistoquímicas e inmunofluorescentes detectables bajo las condiciones evaluadas. Estas observaciones respaldan la viabilidad de almacenar secciones cerebrales flotantes durante varios años para análisis retrospectivos y experimentos de seguimiento.

Cabe destacar que este protocolo ofrece otra ventaja clave mediante la coextracción dual de ARN y proteínas a partir de un único hemisferio cerebral congelado. Aunque este protocolo de coextracción produce cantidades ligeramente menores de ARN y proteínas que los métodos convencionales de extracción individual, los biomateriales obtenidos siguen siendo suficientes para una detección robusta mediante qPCR e inmunotransferencia (Western blot). Es fundamental que la coextracción permita cuantificar la abundancia de transcritos y proteínas a partir de muestras de tejido idénticas, eliminando la variación biológica derivada del procesamiento separado de especímenes y posibilitando un perfilado molecular integrado altamente consistente^11,12. Además, este enfoque requiere únicamente una pequeña masa de tejido de aproximadamente 9–10 mg, lo que lo hace especialmente adecuado para análisis de subpoblaciones cerebrales discretas y específicas de región con disponibilidad limitada de muestras.

A pesar de estas ventajas significativas, este método también tiene ciertas limitaciones que merecen reconocerse. En primer lugar, los rendimientos relativamente bajos de ARN y proteínas pueden restringir su aplicabilidad en experimentos que requieren grandes cantidades de ácidos nucleicos o proteínas, como la purificación a gran escala de proteínas o la secuenciación profunda de ARN. En segundo lugar, aunque el almacenamiento a largo plazo de secciones es efectivo durante hasta siete años, aún puede ocurrir una degradación gradual de ciertos antígenos lábiles o ácidos nucleicos durante períodos prolongados, lo que podría comprometer la intensidad de tinción o la sensibilidad de detección molecular. En tercer lugar, el método actualmente está optimizado para tejido cerebral de ratón y podría requerir modificaciones para su aplicación en otros tejidos o modelos animales alternativos, ya que la composición tisular y las características estructurales varían entre especies y órganos. Por último, el SDS al 5–10 % podría interferir con la espectrometría de masas, los ensayos de actividad enzimática, los estudios de interacciones proteína-proteína^13,14 y otras aplicaciones sensibles al SDS. Por lo tanto, podrían requerirse procedimientos adicionales de eliminación del detergente o intercambio de tampón.

En conclusión, este protocolo de asignación hemisférica permite análisis morfológicos y moleculares emparejados a partir del mismo animal, reduciendo el uso de animales y la variabilidad interindividual. Este protocolo sería útil en estudios que requieran análisis histológicos y moleculares emparejados, particularmente cuando la disponibilidad de tejido sea limitada. Su capacidad de almacenamiento a largo plazo de secciones también podría facilitar análisis retrospectivos y el archivo estandarizado de muestras, mientras que el uso de muestras pequeñas de regiones cerebrales apoya investigaciones específicas de región. Sus principales limitaciones son los menores rendimientos de ARN y proteínas, la posible asimetría hemisférica, la restricción al tejido cerebral murino y la compatibilidad limitada con aplicaciones sensibles al SDS. Estudios futuros deberían optimizar la recuperación de biomoléculas, validar el protocolo en otros tejidos y especies, y evaluar la estabilidad a largo plazo de otros blancos moleculares.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos microcentrífugos de 1,5 mL libres de RNasa	Axygen	MCT-150-C-S	Recopilación de biopsias de tejido y fracciones de extracción de ARN/proteína.
Tubos cónicos centrífugos de 15 mL	Biofil	CFT010150	Fijación, deshidratación con sacarosa y almacenamiento de soluciones.
Placas de cultivo celular de 24 pocillos	NEST	702001	Recopilación, tinción y almacenamiento a largo plazo de secciones cerebrales flotantes.
Solución de sacarosa al 30%	Preparado en el laboratorio	N/A	Crioprotección de hemisferios cerebrales fijados antes de la criosección.
Solución de paraformaldehído al 4%	Biosharp	BL539A	Fijación por inmersión del hemisferio cerebral designado para morfología.
Tampón de carga de proteínas 5×	Beyotime Biotechnology	DL101	Preparación de muestras de proteína para SDS-PAGE.
Agarosa	Solarbio	Cat: A8201	Evaluación de la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa.
Anticuerpo anti-doblecortina	Abcam	ab18723	Anticuerpo primario para inmunohistoquímica de doblecortina.
Anticuerpo anti-ERK	Beyotime	AB2014	Anticuerpo primario para inmunotransferencia de ERK total.
Anticuerpo anti-GFAP	Abcam	ab10062	Anticuerpo primario para inmunofluorescencia de proteína ácida fibrilar glial.
Anticuerpo anti-Iba1	Wako	NCNP24	Anticuerpo primario para inmunofluorescencia de la molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1.
Anticuerpo anti-NeuN	Millipore	A60	Anticuerpo primario para tinción del antígeno nuclear neuronal.
Anticuerpo anti-NF-κB p65	HUABIO	ET1603-12	Anticuerpo primario para inmunotransferencia de NF-κB p65.
Anticuerpo anti-ERK fosforilado	Beyotime	ET1610-13	Anticuerpo primario para inmunotransferencia de ERK fosforilado.
Anticuerpo anti-PSD95	HUABIO	ET1602-20	Anticuerpo primario para inmunotransferencia de PSD95.
Anticuerpo anti-ULK1	HUABIO	ET1704-63	Anticuerpo primario para inmunotransferencia de ULK1.
Anticuerpo anti-β-tubulina	ABclonal	AC021	Anticuerpo primario de control de carga para inmunotransferencia.
Medio de montaje antifade para fluorescencia	Beyotime	P0126-5	Medio de montaje para secciones teñidas por inmunofluorescencia.
Kit de detección de biotina-estreptavidina peroxidasa	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Sistema de detección secundario para inmunohistoquímica con DAB.
Albúmina sérica bovina	Qiansheng Biotech Co., Ltd.	QO3000	Tampón de bloqueo para inmunotinción e inmunotransferencia.
Ratones C57BL/6	Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	Ratones C57BL/6 de 4 semanas de edad	Animales experimentales para la recopilación de tejido cerebral de ratón, si se incluyen.
Sistema de imagen quimioluminiscente	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Detección de señales quimioluminiscentes en inmunotransferencia.
Microscopio confocal de barrido láser	Leica Microsystems CMS GmbH	SN: 591974	Adquisición de imágenes de secciones con inmunofluorescencia.
Solución de preservación crioprotectora	Preparado en el laboratorio	N/A	Almacenamiento a largo plazo de secciones cerebrales flotantes a −20 °C.
Criostato	Leica	CM1950	Preparación de secciones coronales cerebrales de 30 μm.
Kit de sustrato cromogénico DAB	Sigma	SLBP7387V	Desarrollo cromogénico para inmunohistoquímica.
Solución de tinción nuclear con DAPI	Coolaber	SL7100	Contratinción nuclear para inmunofluorescencia.
Microscopio óptico digital	Ningbo Yongxin Optics Co., Ltd.	Modelo NE910+FL-900	Supervisión del desarrollo con DAB e imagen de secciones teñidas en campo claro.
DNasa I	Vazyme	R223-01	Eliminación de ADN genómico residual antes de la transcripción inversa.
Anticuerpo secundario de burro anti-IgG de conejo conjugado con 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	Anticuerpo secundario fluorescente para inmunofluorescencia.
Anticuerpo secundario de burro anti-IgG de conejo conjugado con 594	Abcam	ab150076	Anticuerpo secundario fluorescente para inmunofluorescencia.
Kit E.Z.N.A. de ADN/ARN/proteína	Omega Bio-Tek	D3892-01
Fuente de alimentación para electroforesis	Bio-Rad	1645050	Fuente de alimentación para electroforesis en gel de agarosa y SDS-PAGE.
Etilenglicol	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10009828	Componente de la solución de preservación crioprotectora.
Sistema de imagen de geles	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Imagen de geles de agarosa para evaluación de la calidad del ARN.
Portaobjetos de vidrio recubiertos con gelatina	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO.,LTD	REF: 10127105P P/N: 80312-2101	Montaje de secciones cerebrales flotantes teñidas con DAB.
Software de análisis de imágenes	National Institutes of Health	ImageJ/Fiji	Análisis densitométrico de bandas de inmunotransferencia y procesamiento de imágenes.
Isopropanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	80109218	Precipitación de proteínas a partir de la fracción orgánica/interfase.
Microcentrífuga refrigerada	Yancheng Kaite Laboratory Instrument Co., Ltd.	TGL16M	Centrifugación durante la extracción de ARN/proteína y pasos de lavado.
Kit Minute de extracción de proteínas	Invent	MS-026
Medio de montaje con bálsamo neutro	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, China	Catalog No. S30509, CAS 96949-21-2	Aplicación de cubreobjetos sobre secciones teñidas con DAB y deshidratadas.
Medio de inclusión OCT	Sakura	4583	Medio de inclusión para criosección de hemisferios cerebrales fijados.
Placas o tubos ópticos para qPCR	Axygen	PCR-0208-C	Recipientes para amplificación por qPCR.
Parafilm	amcor	PM996	Sellado de placas multipozo para almacenamiento a largo plazo de secciones.
Pentobarbital sódico	Hualan Bio	57-33-0	Agente anestésico antes de la perfusión transcardíaca.
Placas de Petri	Biosharp	BS-90-D	Manipulación del cerebro sobre hielo y separación de hemisferios.
Reactivo de extracción de ARN con fenol/guanidinio	Sparklade	AC0101-B	Reactivo comparador para experimentos de control de extracción de ARN.
Cóctel de inhibidores de fosfatasas	APExBIO	K1015-100	Preservación de la fosforilación durante la extracción de proteínas.
Solución salina tamponada con fosfato	Biosharp	BL601A	Tampón de lavado, disolvente de solución de sacarosa y disolvente de crioprotector.
Membrana de fluoruro de polivinilideno	Millipore	IPVH08100	Membrana para transferencia en inmunotransferencia.
Polivinilpirrolidona K40	Sigma	9003-39-8	Componente de la solución de preservación crioprotectora.
Cóctel de inhibidores de proteasas	Beyotime	P1045	Prevención de la degradación de proteínas durante la lisis del tejido.
Kit de extracción de proteínas	Invent	MS-026	Kit comparador para experimentos de control de extracción de proteínas totales.
Sistema de PCR en tiempo real	Amolarray	MA6000	Amplificación por PCR cuantitativa y análisis de curvas de fusión.
Dodecilsulfato de sodio	BioFroxx	3250GR500	Disolución del precipitado proteico y preparación de muestras para SDS-PAGE.
Cuchillas de afeitar estériles	Biosharp	BS-RB-11	Separación de hemisferios y recorte de tejido sobre hielo.
Conjugado estreptavidina-peroxidasa	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Reactivo de amplificación/detección de señal para inmunohistoquímica con DAB.
Sacarosa	Hushi	57-50-1	Solución de crioprotección y solución de preservación crioprotectora.
Mezcla maestra SYBR para qPCR	Vazyme	Q711-02	Amplificación por PCR cuantitativa.
Aparato de transferencia	Bio-Rad	1703930	Transferencia húmeda de proteínas desde gel de SDS-PAGE a membrana.
Solución salina tamponada con Tris y Tween 20	Preparado en el laboratorio	N/A	Tampón de lavado de membranas para inmunotransferencia.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Permeabilización de secciones cerebrales para inmunotinción.
Trizol	Sparklade	AC0101-B
Kit de detección inmunohistoquímica UltraSensitive SP (para anticuerpos primarios de ratón/conejo)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Anticuerpo secundario/reactivo de detección para inmunohistoquímica con DAB.
Rata Wistar	Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	280-320 g, macho	Animales experimentales para la recopilación de tejido cerebral de rata, si se incluyen.
Xileno	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	Clarificación de portaobjetos teñidos con DAB antes de la aplicación de cubreobjetos.
Medio de montaje con bálsamo neutro	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, China	Catalog No. S30509, CAS 96949-21-2	Aplicación de cubreobjetos sobre secciones teñidas con DAB y deshidratadas.
Conjugado estreptavidina-peroxidasa	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Reactivo de amplificación/detección de señal para inmunohistoquímica con DAB.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Permeabilización de secciones cerebrales para inmunotinción.
Kit de detección inmunohistoquímica UltraSensitive SP (para anticuerpos primarios de ratón/conejo)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Anticuerpo secundario/reactivo de detección para inmunohistoquímica con DAB.
Xileno	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	Clarificación de portaobjetos teñidos con DAB antes de la aplicación de cubreobjetos.