Un protocolo multicolor de visualización de alta resolución 3D-STORM para mineralización de colágeno en fibrillas de colágeno tipo I recombinantes autoensambladas

Summary

Aquí presentamos un protocolo para distinguir la mineralización intrafibrilar de extrafibrilar en fibrillas de colágeno recombinante utilizando 3D-STORM multicolor, integrando marcaje optimizado, imagen y análisis cuantitativo de colocalización.

Abstract

Este protocolo describe un método de microscopía de reconstrucción óptica estocástica tridimensional multicolor (3D-STORM) para la visualización a nanoescala de la mineralización del colágeno en un modelo de fibrilla autoensamblada de colágeno tipo I recombinante. El método permite la imagen simultánea de las fases de colágeno, proteínas no colagenosas (por ejemplo, sulfato de condroitina) y minerales de fosfato de calcio. La preparación de la muestra implica la aminosilización y el autoensamblaje del colágeno, seguida de mineralización utilizando un medio de fosfato de calcio que forma fosfato de calcio amorfo (ACP) en una fase temprana (30 minutos) y madura en hidroxiapatita (HAP) en 6 horas. A continuación, se realiza el marcaje multiplexado por inmunofluorescencia y las muestras se evalúan primero mediante microscopía confocal antes de la adquisición de imágenes 3D-STORM utilizando un tampón de imagen absorbente de ojeño. El procesamiento y análisis de datos se realizan utilizando software disponible públicamente. En comparación con la microscopía electrónica o confocal convencional, este protocolo combina especificidad molecular con resolución a nanoescala (precisión lateral típica 20–30 nm, axial 50–60 nm), permitiendo la visualización tridimensional de patrones de mineralización intrafibrilar frente a extrafibrilar. Los resultados representativos muestran una visualización clara de redes de colágeno, proteínas no colágenas asociadas y fases minerales dentro del espacio tridimensional. Métricas cuantitativas, incluyendo el coeficiente de correlación de Pearson (0,89 ± 0,04) y el coeficiente de solapamiento de Mander (0,91 ± 0,03), se proporcionan en la sección de Resultados. Este protocolo ofrece una herramienta poderosa para investigadores en ciencia de biomateriales, biomineralización e ingeniería tisular ósea que requieren conocimientos a escala nanométrica sobre la dinámica de mineralización.

Introduction

La mineralización del colágeno es un proceso biológico fundamental y fundamental en la formación de tejidos duros como huesos y^{dientes 1}. La compleja estructura de las fibras de colágeno, junto con una regulación finamente ajustada de la deposición mineral, otorga a estos tejidos una notable resistencia mecánica e integridad^estructural. El colágeno no sirve solo como andamiaje pasivo, sino como participante activo, orquestando una deposición precisa de minerales a través de complejas interacciones moleculares^{y físicas.} Esclarecer estos mecanismos es crucial para comprender condiciones patológicas como la osteoporosis y la caries dental, y para desarrollar materiales biomiméticos para terapias^{regenerativas 4}.

El diámetro de las fibras de colágeno en tejidos duros varía entre aproximadamente 50 y 100 nm, siendo las partículas de hidroxiapatita (HAP) aún más pequeñas (típicamente de 2–5 nm de grosor y 20–30 nm de longitud) e intercaladas dentro de huecos^{fibrilares 5}. Aunque las zonas de gap pueden actuar como sitios de nucleación, en los tejidos nativos los minerales se forman inicialmente en espacios interfibrilares y posteriormente se expanden hacia compartimentos intrafibrilares. Los métodos tradicionales de caracterización incluyen tinción histológica, microscopía láser^{confocal 6,7} y microscopía electrónica ^8,9. La tinción histológica proporciona una evaluación macroscópica, pero no puede evaluar estados de mineralización a nanoescala. La microscopía confocal permite la observación de componentes específicos pero está limitada por difracción (~200 nm lateralmente), incapaz de resolver la mineralización intrafibrilar frente a^{extrafibrillar 10}. La microscopía electrónica ofrece alta resolución pero carece de especificidad molecular. Aunque el marcado con inmunogold puede proporcionar especificidad molecular para la microscopía electrónica, requiere un procesamiento especializado y es menos susceptible de visualizar multiplexados y tridimensionales múltiples componentes en comparación con STORM, además de implicar largos ciclos experimentales y altos^{costes 11}.

La microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) supera el límite de difracción localizando fluoróforos individuales con alta precisión, alcanzando una resolución lateral de ~20^{nm 12}. En comparación con otras técnicas de superresolución como la microscopía de depleción de emisión estimulada (STED⁾¹³y la microscopía de iluminación estructurada (SIM⁾¹⁴, STORM ofrece una mayor precisión de localización (~20 nm lateralmente y ~50 nm axialmente) y es compatible con una gama más amplia de fluoróforos orgánicos. En particular, STED requiere tintes especializados y altas potencias láser que pueden dañar muestras biológicas, mientras que SIM ofrece solo una resolución de ~100 nm, insuficiente para resolver características a escala de fibrilla (50–100 nm). STORM proporciona un equilibrio práctico entre resolución, capacidad de multiplexación y compatibilidad de muestras. Las directrices publicadas han descrito muestras de prueba estandarizadas para facilitar la optimización de los parámetros de imagen STORM y la evaluación^{de resolución 15}. Cuando se combina con capacidades de imagen tridimensional, 3D-STORM permite la visualización a nanoescala de múltiples componentes^{simultáneamente 16}. Los avances recientes han extendido STORM a imágenes multicolor y multiplexadas, permitiendo la visualización de múltiples objetivos dentro de la misma muestra ^17,18.

Este protocolo utiliza un modelo biomimético in vitro basado en fibrillas de colágeno tipo I recombinantes autoensambladas y está diseñado explícitamente para modelos de fibrillas autoensambladas de colágeno recombinante tipo I in vitro, con el fin de distinguir la mineralización intrafibrilar de extrafibrilar a nanoescala. No es adecuado para la imagen de células vivas, ya que STORM requiere muestras fijas y amortiguadores de oxígeno. Tampoco es adecuado para tejidos nativos altamente mineralizados (por ejemplo, hueso maduro) sin una descalcificación previa o extracción de antígenos. Si solo es necesario evaluar la densidad mineral general o la morfología de grandes áreas, la microscopía confocal convencional o la microscopía electrónica es más eficiente.

El objetivo general de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo estandarizado y escalonado para usar 3D-STORM multicolor y visualizar la distribución nanométrica de minerales y proteínas no colágenas dentro de fibrillas individuales de colágeno, con énfasis específico en distinguir la mineralización intrafibrilar de la extrafibrilar. Este protocolo integra un inmunomarcaje optimizado con un buffer de imagen adaptado para permitir el seguimiento simultáneo de múltiples componentes orgánicos (colágeno, proteínas no colágenas) y fases inorgánicas (ACP, HAP) en tres^{dimensiones 19}. Una innovación clave es la evaluación cuantitativa de los patrones de mineralización intrafibrilar frente a extrafibrilar. La cuantificación se logra mediante dos criterios independientes: (1) calcular el coeficiente de colocalización de Pearson entre los canales del mineral (un colorante indicador de calcio, por ejemplo, calcina) y colágeno (un colorante fluorescente de rojo lejano) utilizando el módulo de colocalización en el software de análisis de imágenes (coeficiente >0,8 indica fuerte asociación); (2) analizar la persistencia de la señal mineral a lo largo de las Z-cortes de fibrillas individuales: si la señal mineral está presente en cortes centrales (Z = 0 a ±120 nm del centro vertical de la fibrilla) a intensidad ≥50% del máximo, se clasifica como intrafibrilar. A diferencia de la microscopía electrónica o confocal convencional, este protocolo combina especificidad molecular con resolución a nanoescala, permitiendo una distribución espacial tridimensional de la mineralización intrafibrilar.

Este protocolo está diseñado para investigadores en ciencia de biomateriales, biomineralización e ingeniería de tejidos óseos que requieren conocimientos a nanoescala sobre la dinámica de mineralización. El procedimiento estandarizado también puede adaptarse para estudiar otros sistemas mineralizados de colágeno, como rodajas de dentina desmineralizadas o hidrogeles a base de colágeno, ajustando en consecuencia los pasos iniciales de preparación de la muestra.

Protocol

Todos los experimentos que involucraron muestras biológicas se realizaron conforme a las directrices y reglamentos de las Instalaciones Centrales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang y fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad (Certificado de Aprobación nº BSL20235710079). El protocolo experimental descrito aquí utiliza reactivos de origen comercial y sistemas biomiméticos in vitro. No involucra participantes humanos, sujetos animales ni muestras de tejido humano, por lo que no requiere la aprobación ética de un comité de revisión institucional.

PRECAUCIÓN: Todos los procedimientos relacionados con productos químicos peligrosos deben realizarse en una campana extractora con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes, gafas de seguridad). Eliminar los residuos químicos según la normativa institucional. Para NaN₃, recoge los residuos en un recipiente dedicado marcado como "residuos azida" y no se mezclan con ácidos (riesgo de gas explosivo). Para el glutaraldehído, inactívale con un 10% de bisulfito de sodio en exceso antes de su eliminación. Para β-mercaptoetanol, oxidar con lejía (1:10 v/v) durante 1 hora antes de la eliminación por el drenaje.

NOTA: El marcaje por inmunofluorescencia DEBE realizarse ANTES de la mineralización para evitar el enmascaramiento de epítopos por depósitos minerales. Para aplicaciones que requieren marcaje post-mineralización, puede ser necesaria la recuperación de antígenos.

1. Preparación del medio mineralizado

1. Preparación de medio mineralizado para fibrillas de colágeno reconstituidas
   1. Preparar la solución de calcio añadiendo 100 μL de ácido poliaspártico de 5 mg/mL (p-Asp, Mw 9-11 kDa) gota a gota a 5 mL de solución de CaCl₂ de 3,44 mM en un tubo cónico de 15 mL.
   2. Mezcla vórtices en el tubo durante 30 segundos hasta que quede homogéneo.
   3. Añade p-Asp lentamente y mezcla bien para estabilizar el fosfato de calcio amorfo (ACP).
   4. Añade 5 mL de solución de fosfato (19 mM Na₂HPO₄ + 300 mM NaCl) a la solución de calcio.
   5. Mezcla de vórtices durante 1 minuto.
      NOTA: Concentraciones finales tras mezclar: 1,67 mM CaCl₂, 9,5 mM Na₂HPO₄, 150 mM NaCl y 50 μg/mL p-Asp.
   6. Prepara el medio mineralizado inmediatamente antes de usarlo. No guardar; usar inmediatamente el precursor ACP inestable para lograr resultados consistentes.
      NOTA: El almacenamiento conduce a una cristalización prematura.
2. Preparación de un medio mineralizado para geles de colágeno/dentina desmineralizada
   1. Preparar una solución que contenga calcio disolviendo 8,77 g de NaCl, 0,01 g de NaN₃, 6,06 g de Tris y 1,11 g de CaCl₂ en 800 mL de agua desionizada.
   2. Reduce el volumen a 1 L con agua desionizada.
   3. Añade 350 μg/mL de ácido poliacrílico (PAA, Mw ~1800) a la solución que contiene calcio.
   4. Vórtice durante 1 minuto.
      NOTA: Usa PAA en lugar de p-asp para una mejor estabilización en concentraciones altas de calcio.
   5. Preparar la solución de fosfato disolviendo 0,85 g de Na₂HPO₄ en 1 L de agua desionizada para obtener 6 mM de Na₂HPO₄.
   6. Esteriliza la solución de fosfato con filtro usando una membrana de 0,22 μm.
   7. Combina volúmenes iguales (por ejemplo, 500 mL cada uno) de soluciones de calcio y fosfato con agitación magnética a 300 rpm.
   8. Ajusta el pH a 7,4 usando 1 M HCl o NaOH mientras monitorizas con un medidor de pH.
      NOTA: Mantener el pH en 7,4 ± 0,1. No permitas desviaciones de pH >0,2, que causen cristalización prematura.

2. Preparación de fibras de colágeno recombinante

1. Aminosilanización de platos de fondo de cristal
   NOTA: Este tratamiento utiliza (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) para introducir grupos amino cargados positivamente (-NH₂) en la superficie del vidrio, lo que favorece la adsorción electrostática y la estabilización de monómeros de colágeno cargados negativamente.
   1. Añadir 200 μL de solución APTES (5% v/v en etanol absoluto) a cada plato de cultivo con fondo de vidrio (35 mm, grosor #1,5H, 0,17 mm ± 0,005 mm).
   2. Asegura una cobertura completa de la superficie del plato con la solución APTES.
   3. Incubar en la oscuridad durante 2 horas a temperatura ambiente (20–25 °C).
   4. Enjuaga los platos tres veces con etanol absoluto (2 mL por lavado).
   5. Ultrasonica en agua desionizada durante 10 minutos a 40 kHz. Elimina completamente los APTES residuales para evitar la unión inespecífica.
   6. Los platos silanizados pueden conservarse secos a 4 °C durante hasta una semana.
   7. (Opcional) Hornear para mayor estabilidad: Coloca los platos lavados y secados en el horno a 100–120 °C durante 30–60 minutos.
   8. Déjalo enfriar a temperatura ambiente antes de continuar.
      NOTA: Si usas platos de plástico, reduce la temperatura a menos de 80 °C para evitar deformaciones. Adapta el procedimiento de silanización de Bitter y^{Muir 20}.
2. Autoensamblaje de colágeno y reticulación
   1. Pipetear 100 μL de solución de colágeno-I (50 μg/mL en 0,1 M ácido acético) en cada plato silanizado.
   2. Incubar a 37 °C durante 10 horas en una cámara de humedad (> 90% de humedad relativa). Mantén una humedad estable para evitar la evaporación de la solución.
   3. Verificar la formación de fibrillas con microscopía de contraste de fase o confocal; Una preparación exitosa muestra una fina red de fibrillas, similar a una telaraña.
   4. Para verificar la formación correcta de fibrillas a nivel ultraestructural, preparar una muestra separada sobre una rejilla TEM formal/recubierta de carbono polivinilo siguiendo las mismas condiciones de autoensamblaje (colágeno-I 50 μg/mL, 37 °C, 10 h, humedad > 90%).
   5. Tinte con ácido fosfotongstico al 1% (pH 7,0) durante 10 minutos.
   6. Lava con agua desionizada.
   7. Examina bajo un microscopio electrónico de transmisión. La fibrillogénesis exitosa se indica por el característico patrón de bandas periódicas D de 67 nm (véase la Figura 3).
   8. Aspira cuidadosamente la solución residual de colágeno de los recipientes con fondo de cristal.
   9. Añade 2 mL de solución de sulfato de condroitina (CS) (50 mg/mL en PBS, pH 5,5) a cada plato.
   10. Incubar a 4 °C durante 12 horas para permitir la adsorción electrostática de CS sobre las fibrillas de colágeno.
   11. Preparar la solución de reticulación EDC/^{NHS 21}: disolver 0,2 M EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropilo) carbodiimida) y 0,05 M NHS (N-hidroxisuccinimida) en el tampón MES (0,1 M MES, pH 5,5).
       NOTA: El tampón MES puede prepararse disolviendo ácido libre MES en agua desionizada y ajustando el pH a 5,5 con NaOH.
   12. Quita la solución CS y añade 2 mL de la solución de reticulación EDC/NHS.
   13. Incuba a temperatura ambiente durante 2 horas para inmovilizar covalentemente el CS sobre el colágeno.
   14. Lava los platos tres veces con PBS (5 mL cada uno, 5 min cada uno) para eliminar los reactivos no reaccionados.
   15. Almacenar fibras de colágeno procesadas en PBS a 4 °C durante hasta 24 horas antes de mineralizar.

3. Marcado por inmunofluorescencia (realizado ANTES de la mineralización)

1. Preparación de muestras
   1. Enjuaga las fibrillas de colágeno tres veces con una solución de NaCl de 500 mM (10 mL por lavado, 5 min cada uno).
   2. Lávate tres veces con agua desionizada (10 mL por lavado, 5 min cada uno).
   3. Realiza lavados sobre una plataforma osciladora horizontal que gira a 50 rpm para asegurar un lavado completo minimizando las fuerzas de corte que podrían desprender fibrillas ensambladas.
2. Bloqueo e incubación primaria de anticuerpos
   1. Incubar con tampón bloqueante (albúmina sérica bovina al 5% en PBS) a 37 °C durante 1 hora en una cámara humidificada.
   2. Preparar cóctel de anticuerpos en un tampón bloqueante: anticolágeno-I de conejo (dilución 1:100) y sulfato anticondroitina de ratón (dilución 1:100).
   3. Añade 200 μL de cóctel de anticuerpos por muestra.
   4. Cubre las muestras con película de sellado de laboratorio.
   5. Incubar a 4 °C durante la noche (12–16 h).
   6. Protégelo de la luz con papel de aluminio. Tras la incubación primaria de anticuerpos, las muestras pueden almacenarse en PBS a 4 °C durante hasta 24 horas.
3. Tinción secundaria por anticuerpos
   1. Eliminar los anticuerpos primarios no unidos lavando los platos tres veces con tampón de lavado (0,1% Tween-20 en PBS), 10 minutos por lavado.
   2. Preparar la mezcla secundaria fluorescente de anticuerpos en un tampón bloqueador (200 μL por plato de 35 mm) que contiene: IgG anticonejo de cabra conjugado a un colorante fluorescente de rojo extremo (1:100) y IgM anti-ratón de cabra conjugado a un tinte fluorescente rojo (1:100).
      NOTA: A partir de este paso, protege las muestras de la luz para evitar el fotoblanqueamiento del fluoróforo.
   3. Incubar muestras a temperatura ambiente (20–25 °C) durante 1 hora en la oscuridad.
   4. Lava los platos tres veces con el tampón de lavado (10 min cada uno) para eliminar los anticuerpos secundarios no unidos.
      NOTA: Almacenar las muestras etiquetadas en PBS a 4 °C (protegidas de la luz) hasta 48 horas antes de la imagen. Incluye controles sin anticuerpos primarios para comprobar la autofluorescencia.

4. Mineralización de fibras de colágeno (realizada DESPUÉS del marcado)

1. Proceso de mineralización
   1. Añade 2 mL de medio mineralizado recién preparado por plato.
   2. Incubar a 37 °C durante 30 minutos (a corto plazo) para la formación mineral en fase temprana (ACP).
   3. Alternativamente, incubar a 37 °C durante 6 horas (a largo plazo) para la cristalización de minerales maduros (HAP).
      NOTA: Mantenga la temperatura exacta entre 37 °C ± 0,5 °C utilizando una incubadora calibrada.
   4. Aspira suavemente el medio de mineralización.
   5. Enjuaga tres veces con agua desionizada (5 mL por lavado, intervalos de 1 minuto).
2. Marcado con fosfato de calcio
   1. Añade 4 μM de un colorante indicador de calcio (por ejemplo, calciína) en PBS (200 μL por plato).
   2. Incuba a temperatura ambiente (20–25 °C) durante 30 minutos en la oscuridad.
      NOTA: El colorante indicador de calcio (por ejemplo, calcina) se une a iones de calcio y no discrimina entre fases amorfa y cristalina; la asignación de fases se basa en el tiempo de mineralización (30 min = ACP, 6 h = HAP). Debe protegerse de la luz con tubos ámbar o papel de aluminio.
   3. Enjuaga cinco veces: tres lavados con agua desionizada y dos lavados con etanol al 70% (1 min cada uno), alternando entre ambos.
3. Preparación de la muestra para imagen
   1. Sumergir muestras en un tampón de imagen: 10% (p/v) glicerol en PBS. Opcionalmente, añade un reactivo antifundido según las instrucciones del fabricante.
   2. Aplicar un volumen suficiente (20–50 μL) de tampón de imagen para cubrir la muestra.
   3. Coloca una cubierta sobre la muestra.
   4. Conserva las muestras a 4 °C en la oscuridad durante hasta 72 horas.

5. Observación bajo un microscopio confocal láser

1. Transferencia de muestras desde almacenamiento a 4 °C a temperatura ambiente (20–25 °C).
2. Deja 10 minutos de equilibrio para evitar condensación.
3. Mantén una protección ligera usando recipientes ámbar o envoltura de papel de aluminio.
4. Verifica que el buffer de imagen cubra toda la muestra.
5. Configura el microscopio confocal con los siguientes ajustes:
   1. Para imagen por colágeno (colorante fluorescente rojo lejano): láser de 647 nm, filtro de emisión de 650-710 nm.
   2. Para imagen con fosfato de calcio (colorante indicador de calcio (por ejemplo, calcina)): láser de 488 nm, filtro de emisión de 500-550 nm.
   3. Objetivo: 100× inmersión en aceite (NA 1,4).
   4. Diámetro del orificio estenopeico: 1 unidad de aireado (UA).
   5. Tiempo de permanencia del píxel: 1-2 μs.
      NOTA: Realizar alineación láser y calibración de orificios estenopeicos antes de la imagen.
6. Realizar escaneo secuencial: primer escaneo con excitación de 647 nm (colágeno).
7. Realizar un segundo escaneo con excitación de 488 nm (mineral).
   NOTA: Recoge canales secuencialmente para evitar que se filtren.
8. Para la reconstrucción 3D, se establece el tamaño del paso de la pila Z a 0,5 μm o menos para asegurar un muestreo adecuado.
9. Guarda archivos con metadatos preservados.
10. Para el análisis de colocalización, utiliza software de análisis de imágenes capaz de calcular el coeficiente de correlación de Pearson (por ejemplo, software disponible públicamente con plugins adecuados).

6. Imagen mediante microscopía de reconstrucción óptica estocástica tridimensional (3D-STORM)

1. Preparación del buffer de imagen^{STORM 22}
   NOTA: La glucosa oxidasa y la catalasa se añaden al tampón de imagen para extraer oxígeno, reduciendo así el fotoblanqueo y prolongando el parpadeo de los fluoróforos, esencial para la localización de moléculas individuales en STORM.
   1. Preparar una solución de stock de glucosa oxidasa (GOx) a 8 mg/mL en un tampón de acetato de sodio de 50 mM (pH 5,1).
   2. Prepara una solución de catalasa a 160 μg/mL en 1× PBS.
      NOTA: Alicuota las piezas enzimáticas, congelalas de repente usando nitrógeno líquido o un baño de hielo seco/etanol, y guárdalas a -20 °C o -80 °C. Evita ciclos repetidos de congelación y descongelación.
   3. Prepara un nuevo amortiguador de imágenes STORM sobre hielo, protegido de la luz.
   4. Combinar los siguientes componentes en el orden indicado para obtener un volumen final de 1 mL: H₂O estéril libre de nucleasas (hasta 1 mL), 1 M NaCl (10 μL, 10 mM final), 1 M Tris-HCl pH 8,0 (50 μL, 50 mM final), 1 M cisteamina (MEA) recién preparada ajustada a pH ~7,0 (50 μL, 50 mM final), 50% (p/v) de glucosa (200 μL, 10% en carga y volumen final), acción GOx (200 μL, 1,6 mg/mL final), culata de catalasa (200 μL, 32 μg/mL final).
   5. Mezcla suavemente pipeteando o invirtiendo algo. No te pongas en vórtice.
      NOTA: El tampón debe prepararse fresco y mantenerse en hielo protegido de la luz. Úsalo dentro de los 30 minutos posteriores a la preparación. Para optimización detallada de las condiciones de imagen STORM, consulte los protocolos establecidos usando muestras^{de prueba 15}.
   6. Añade 200 μL de buffer de imagen STORM recién preparado para cubrir completamente la muestra.
2. Configuración del sistema 3D-STORM
   1. Asegúrese de que la trayectoria de imagen se dirige a una cámara CCD de multiplicación de electrones (EMCCD).
   2. Activa el módulo de lente cilíndrica para la imagen 3D.
   3. Pon el software en modo adquisición 3D STORM.
   4. Configura los filtros de camino óptico para los tintes utilizados.
   5. Enciende el láser de 647 nm y pon la potencia a un nivel bajo (1-5 mW).
   6. Utilizando un objetivo de inmersión en aceite del 100× (NA ≥1,4), localiza la región de interés en el modo de vista previa en campo amplio o en vivo TIRF.
   7. Adquiere una imagen convencional de fluorescencia de campo amplio para compararla posteriormente.
   8. Cambia al modo de iluminación TIRF.
   9. Calibra el ángulo TIRF para lograr un campo de iluminación fino (~100-200 nm) y así minimizar la fluorescencia de fondo.
   10. Ajusta el tiempo de exposición de la cámara (10-30 ms) en función de la intensidad inicial de la señal.
   11. Ajusta la potencia del láser de imagen en función de la intensidad inicial de la señal.
   12. Realiza una breve prueba de adquisición.
   13. Verifica que los parámetros estén correctamente configurados sin causar un fotoblanqueo rápido.
       NOTA: Asegúrese de alinear con precisión el eje cilíndrico de la lente con el plano de la muestra. La mayoría de los sistemas modernos cuentan con calibración automatizada. Para calibración manual, utiliza perlas fluorescentes de 100 nm para verificar funciones de dispersión simétricas y de punto redondo (PSF).
   14. Comienza con una exposición de 10–30 ms a una potencia láser de 647 nm de 1–2 kW/^cm2.
   15. Verifica que la densidad de parpadeo sea 0,1–1 molécula/^{μm 2}.
   16. Si la densidad es demasiado baja o demasiado alta, ajusta la potencia o el tiempo de exposición del láser en consecuencia.
   17. Repite la verificación y el ajuste hasta alcanzar la densidad ideal.
3. Adquisición de datos 3D-STORM
   1. Pon el software de adquisición en modo "Activación Continua".
   2. Ajusta el láser de imagen (647 nm) a alta potencia (entrada de fibra de 100-500 mW) para hacer pasar la mayoría de los fluoróforos al estado oscuro.
   3. Ajusta el láser de activación (405 nm) a baja potencia (0,1–5 mW).
   4. Optimizar empíricamente la potencia de 405 nm para mantener entre 100 y 200 moléculas localizadas por fotograma en una región de 256×256 píxeles.
   5. Establece el número total de fotogramas entre 10.000 y 20.000.
   6. Utiliza 1 fotograma de luz de activación (405 nm) seguido de 5 fotogramas de luz de imagen (647 nm) por ciclo.
   7. Empieza la adquisición.
   8. Operar el EMCCD con máxima sensibilidad (ganancia EM aplicada)
   9. Usa una exposición de 10–30 ms por fotograma.
   10. Durante la adquisición, monitorizar la densidad de moléculas activas.
   11. Ajusta la potencia láser de 405 nm para mantener un flujo constante de eventos de molécula única.
       NOTA: Los datos de películas en bruto pueden almacenarse en un disco duro estándar para un archivo a largo plazo antes de su reconstrucción.
4. Análisis de datos de mineralización de colágeno (utilizando software de análisis de imágenes con módulo STORM)
   1. En el software de análisis, selecciona el controlador de cámara adecuado (módulo STORM).
   2. Haz clic en [Interfaz de Análisis] en el panel STORM. Se abre la ventana de análisis.
   3. Haz clic en [Archivo abierto]. Selecciona el archivo de imagen de microscopía en bruto para analizar. Haz clic en Abrir.
   4. Determina el valor mínimo de fluorescencia (Altura Mínima) para señales válidas.
   5. Encuentra la mancha más oscura que aún sea reconocible como una señal de una sola molécula.
   6. Mueve el ratón hacia su centro.
   7. Lee el valor de altura de pico.
   8. Anota este valor.
   9. Haz clic en [Configuración de identificación]. En el diálogo, establece los siguientes parámetros: Altura mínima (introduce el valor registrado en el paso 6.4.8), Altura máxima (20000), Línea base CCD (100), y para datos 3D-STORM marca "3D" (desmarca 2D).
   10. Haz clic >> para ampliar más parámetros. Ajustado: Ancho mínimo (nm) a 200, ancho máximo (nm) a 700 (400 para 2D), ancho inicial de ajuste (nm) a 300, relación axial máxima a 2,5 (1,3 para 2D) y desplazamiento máximo (pix) a 1.
   11. Haz clic en OK para cerrar el diálogo.
   12. Realiza un análisis de prueba para validar los parámetros. Desmarca la corrección de deriva.
   13. Ponle los periodos a 1.
   14. Haz clic en [Probar].
   15. Tras el análisis, haz clic en OK en el cuadro de diálogo emergente.
   16. Comprueba que los puntos de señal estén correctamente identificados. No se debe seleccionar mal el ruido de fondo. No se deben perder los lugares verdaderos.
   17. Si no es satisfactorio, repite los pasos 6.4.9–6.4.16 para ajustar los parámetros hasta que sean correctos.
   18. Tras superar el análisis de prueba, realiza el análisis completo. Comprueba la corrección de deriva.
       NOTA: El software de análisis realiza corrección de deriva utilizando un algoritmo redundante de correlación cruzada (RCC) que maximiza la correlación entre segmentos de tiempo de localizaciones moleculares. No se requieren cuentas^{fiduciales 23}.
   19. Mantener los puntos = 1.
   20. Haz clic en [Inicio] (o haz clic en [Prueba] de nuevo, luego en [Iniciar]).
   21. Espera a que el análisis esté completo. Haz clic en OK en el cuadro de diálogo emergente.
   22. Tras el análisis, se generan dos archivos de resultados (.bin y .txt) en la misma carpeta que el archivo .nd2.
   23. Para el análisis de colocalización (canales de 647 nm y 488 nm), mostrar ambos canales simultáneamente en la lista de canales de la ventana de análisis.
   24. Selecciona una región de interés (ROI) adecuada.
   25. Utiliza el módulo de colocalización para calcular el coeficiente de correlación de Pearson. Si no se proporciona automáticamente, exporta manualmente los datos de la nube de puntos a un plugin de colocalización en el software de análisis de imágenes disponible públicamente. Anota el valor.
   26. Realizar análisis en Z-slice para confirmar la mineralización intrafibrilar. En el menú principal, selecciona Ver > paso en Z > Slice.
   27. Extraer planos individuales a intervalos de 60 nm.
   28. Observa la señal mineral (verde, canal de 488 nm). Comprueba si la señal persiste en las secciones centrales (Z = 0 nm ±120 nm). La persistencia confirma la mineralización intrafibrilar.
   29. Opcional: realizar filtrado de densidad para reducir el sobreconteo de emisores densamente empaquetados. Abre la imagen reconstruida de STORM en un software de análisis de imágenes disponible públicamente usando un plugin para análisis de localización de molécula^{única 24}.
   30. Para reducir el sobreconteo de emisores densamente empaquetados, aplica filtrado por densidad (por ejemplo, filtro mediano o umbral local de densidad) basado en la densidad de la señal.
   31. Si la corrección de deriva no estaba habilitada en el paso 6.4.18 o se necesita corrección adicional, realiza corrección por deriva. Correcto según el PSF de los marcadores fiduciales. Alternativamente, utiliza algoritmos de correlación cruzada (por ejemplo, corrección de deriva implementada en el mismo plugin).
   32. Realizar la mezcla espectral para eliminar la diafonía del canal. En la ventana de análisis STORM, haz clic en la herramienta de eliminación de diafonía (normalmente en la esquina inferior derecha).
   33. Configura el radio a 25,0 nm (recomendado). Selecciona el canal de origen. Selecciona el método de eliminación: Se recomienda estadístico.
   34. Para eliminar la activación cruzada causada por el láser de excitación, seleccione Restar además de NSA > Activación cruzada. Haz clic en OK. Se genera automáticamente un nuevo canal, Activación No Específica-Xt.
   35. Validar los niveles de autofluorescencia y las señales de fondo utilizando muestras de control sin teñir. Asegúrate de que todas las señales estén etiquetadas específicamente.
   36. Realiza visualización 3D. Selecciona una región de interés (ROI) en la ventana de análisis.
   37. Haz clic en el botón [3D] (o [Mostrar 3D]). Genera una proyección 3D o renderizado en volumen.
   38. Haz clic derecho para ajustar los parámetros de renderizado. Exporta vídeos en formatos comunes (por ejemplo, .avi o .mp4).
   39. Para clasificar una señal mineral como intrafibrilar, realiza un análisis de corte Z como en 6.4.26–6.4.28. Perfiles de intensidad de exportación.
   40. Define el centro de la fibrilla como el plano Z, donde la señal del colágeno es la más alta.
   41. Una señal mineral se considera intrafibrilar si su intensidad en Z = 0 (centro) y en Z = ±60 nm es el ≥50% de la intensidad máxima mineral en esa fibrilla. Si la señal baja del 30% en Z = 0, clasifique como extrafibrilar.
   42. Registrar la clasificación de al menos 50 fibrillas por condición para calcular el porcentaje de mineralización intrafibrilar.
       NOTA: También existen plugins alternativos disponibles públicamente para filtrado de densidad, corrección de deriva y desmezclado espectral.

Results

La implementación exitosa de este protocolo produce una visualización tridimensional de alta resolución de fibrillas mineralizadas de colágeno utilizando 3D-STORM multicolor. Los siguientes resultados ilustran resultados típicos, controles de calidad y evaluaciones cuantitativas.

La Figura 1 muestra una reconstrucción multicolor 3D-STORM de una red de colágeno mineralizada con fosfato de calcio amorfo (ACP). El colágeno (marcado con un colorante fluorescente de rojo intenso) aparece como una red fibrilar bien definida. El sulfato de condroitina (GAG, marcado con un tinte rojo) está estrechamente asociado con las fibrillas de colágeno, y las regiones de colocalización aparecen cian en la imagen fusionada. Es importante destacar que se observan partículas de ACP (verdes, marcadas con un colorante indicador de calcio) dentro de los límites de las fibrillas de colágeno, demostrando mineralización intrafibrilar en la fase inicial (30 min). Esta figura destaca la capacidad del protocolo para resolver simultáneamente tres componentes distintos (colágeno, GAG, mineral) a nanoescala, una hazaña imposible con la microscopía confocal convencional (véase la Figura 5 para comparar la resolución de imagen). La colocalización nanométrica del ACP dentro de las fibrillas confirma que el precursor amorfo puede infiltrarse en el interior fibrilar antes de la transformación cristalina.

La Figura 2 proporciona evidencia cuantitativa de la penetración intrafibrilar de hidroxiapatita madura (HAP) tras 6 horas de mineralización. La Figura 2A presenta imágenes 2D STORM que muestran una extensa colocalización de colágeno (rojo) y HAP (verde), con canales fusionados que aparecen en amarillo. La Figura 2B es una reconstrucción de volumen 3D que ilustra la arquitectura integrada. La Figura 2C muestra el análisis de cortes en el eje Z a intervalos de 60 nm desde la parte superior (Z = −120 nm) hasta el centro (Z = 0) y hasta las secciones más profundas (Z = +120 nm). La señal HAP persiste en las secciones centrales (Z = 0 a ±120 nm) a una intensidad ≥50% del máximo, lo que cumple con los criterios de clasificación para mineralización intrafibrilar definidos en los pasos 6.4.39–6.4.4.41 del Protocolo. El análisis cuantitativo de colocalización de tres experimentos independientes (n = 3 replicaciones, cada una con 5 regiones de interés) arrojó un coeficiente de correlación de Pearson de 0,89 ± 0,04 y un coeficiente de solapamiento de Manders de 0,91 ± 0,03 (media ± de la DS). Estos valores indican una asociación fuerte y específica entre el colágeno y el HAP dentro de las fibrillas, confirmando que la fase cristalina madura también reside intrafibrilarmente.

La Figura 3 valida la integridad estructural del andamiaje de colágeno autoensamblado utilizando microscopía electrónica de transmisión. Las fibrillas de colágeno teñidas con ácido fosfotungstico al 1% (pH 7,0) muestran el característico patrón de bandas cruzadas periódicas D de 67 nm, que es diagnóstico de la fibrillogénesis nativa. Este paso de control de calidad es esencial antes de proceder con experimentos de mineralización, ya que confirma que el andamio está estructuralmente intacto y es capaz de soportar la deposición intrafibrilar de minerales. Sin este patrón de bandas, el colágeno puede desnaturalizarse o ensamblarse de forma incorrecta, lo que puede dar lugar a patrones de mineralización artefactual.

La Figura 4 ilustra un resultado negativo representativo obtenido cuando las condiciones de mineralización no se controlan adecuadamente (por ejemplo, ausencia de ácido poliaspártico o pH > 7,6). Bajo estas condiciones subóptimas, se observan depósitos de HAP (verde) exclusivamente sobre el sustrato de vidrio fuera de las fibrillas de colágeno (rojo), sin invasión intrafibrilar. Este resultado sirve como un control importante: demuestra que la mineralización intrafibrilar observada en las Figuras 1 y 2 no se debe a precipitación inespecífica o lavado incompleto, sino que requiere un control preciso del entorno químico (pH 7,4 ± 0,1, presencia de ácido poliaspártico y uso inmediato de medio mineralizado fresco). Los investigadores deberían incluir estos controles negativos para validar su propio sistema.

La Figura 5 muestra imágenes representativas de microscopía confocal adquiridas antes de la adquisición STORM para el cribado preliminar de muestras. El canal de colágeno (Figura 5A) revela una red fibrilar clara, y el canal HAP (Figura 5B) muestra minerales asociados a las fibrillas. La imagen fusionada (Figura 5C) confirma la colocalización en el nivel limitado por difracción (~200 nm). Estas imágenes cumplen dos propósitos: (1) verifican la calidad de la muestra (etiquetado adecuado, agregación mínima y asociación mineral específica) antes de pasar a la lenta imagen STORM; y (2) guían la selección de regiones de interés para la adquisición de 3D-STORM. Es importante destacar que las imágenes confocales carecen de la resolución necesaria para distinguir la mineralización intrafibrilar de la extrafibrilar. Ten en cuenta que la señal mineral aparece continua a lo largo de las fibrillas sin revelar si está dentro o fuera. Esta limitación subraya la necesidad del enfoque de superresolución descrito aquí.

La Figura 6 presenta dos experimentos de control. La Figura 6A (control sin anticuerpos primarios) no muestra señal específica cuando solo se aplica el anticuerpo secundario, confirmando que las señales observadas en muestras marcadas no se deben a la unión de anticuerpos secundarios no específicos. La Figura 6B (control sin teñir) no muestra señal de fluorescencia (completamente negra), descartando una autofluorescencia significativa de la muestra o sustrato. Estos controles son esenciales para validar la especificidad del marcaje de inmunofluorescencia. Cualquier señal detectable en estos controles indicaría la necesidad de ajustar los pasos de bloqueo o lavado.

Bajo nuestras condiciones de imagen optimizadas, el sistema 3D-STORM alcanzó una precisión típica de localización de 20–30 nm lateralmente y 50–60 nm axialmente, consistente con la literatura original 3D-STORM²⁵. La corrección de deriva se realizó durante el postprocesamiento utilizando el algoritmo de correlación redundante cruzada (RCC) incorporado, que elimina la necesidad de marcadores fiduciales^{exógenos 23}. Para la asignación de fases, el ACP se asignó a 30 minutos de mineralización y el HAP a 6 horas, basándose en la cinética de maduración establecida. La capacidad de distinguir temporalmente estas dos fases, combinada con la localización a escala nanométrica, permite a los investigadores estudiar la dinámica de la transformación mineral intrafibrilar.

En resumen, los resultados representativos demuestran que este protocolo permite la distinción a nanoescala entre mineralización intrafibrilar y extrafibrilar en un modelo de colágeno recombinante, con métricas cuantitativas de colocalización y controles negativos apropiados. El método es especialmente valioso para investigadores que estudian mecanismos de biomineralización, materiales biomiméticos y ingeniería de tejidos óseos.

La Tabla Suplementaria 1 resume los problemas comunes encontrados durante los procedimientos de mineralización e imagen STORM, junto con sus posibles causas y soluciones recomendadas. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura 1: Reconstrucción multicolor 3D-STORM de fibrillas mineralizadas de colágeno. El colágeno (colorante fluorescente rojo rojo extremo) y el sulfato de condroitina (GAG, colorante fluorescente azul y rojo) se imagan simultáneamente. La colocalización del colágeno y GAG aparece como magenta en el canal fusionado, y las regiones donde los tres solapamientos aparecen blancas. También se muestra fosfato de calcio amorfo (ACP, verde, colorante indicador de calcio). La ACP se observa dentro de los límites de las fibrillas de colágeno, lo que indica localización intrafibrilar. Barra de escala: 1 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Imágenes 3D-STORM de mineralización intrafibrilar de hidroxiapatita (HAP). (A) Imágenes STORM 2D de colágeno (colorante fluorescente rojo rojo lejos), HAP (verde, colorante indicador de calcio) y canal fusionado. (B) Reconstrucción de volumen 3D. (C) Análisis de cortes en el eje Z a intervalos de 60 nm (Z = −120, −60, 0, +60, +120 nm). La señal persistente de HAP en las secciones centrales (Z = 0 a ±120 nm) cumple con los criterios de clasificación para la mineralización intrafibrilar (intensidad ≥50% del máximo). Colocalización cuantitativa calculada a partir de esta figura: r de Pearson = 0,89 ± 0,04, solapamiento de Mander = 0,91 ± 0,03. Barras de escala: 0,1 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Validación por microscopía electrónica de transmisión (MET) de fibrillas de colágeno autoensambladas. Las fibrillas de colágeno se tiñieron con ácido fosfotongstico al 1% (pH 7,0). El patrón diagnóstico de banda cruzada periódica D de 67 nm confirma una fibrillogénesis exitosa e integridad estructural. Barra de escala: 200 nm. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Resultado negativo representativo: mineralización extrafibrilar. Colágeno (colorante fluorescente rojo rojo lejano) y HAP (colorante indicador de calcio verde). El HAP se deposita exclusivamente sobre el sustrato de vidrio fuera de las fibrillas de colágeno, sin invasión intrafibrilar. Este resultado subóptimo se incluye como control negativo para ilustrar el rango de posibles resultados. Barra de escala: 0,1 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Imágenes confocales representativas utilizadas para el cribado preliminar. (A) El canal de colágeno (tinte fluorescente rojo lejano) muestra una red fibrilar clara. (B) El canal HAP (verde, tinte indicador de calcio) muestra asociación mineral. (C) La imagen combinada muestra la colocalización del colágeno y el HAP. Barra de escala = 2 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Experimentos de control. (A) Control sin anticuerpos primarios: solo anticuerpo secundario aplicado; No hay señal específica. (B) Control sin tinción: no se aplica fluoróforo ni anticuerpo; Sin señal de fluorescencia (completamente negra). Barra de escala = 1 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla suplementaria 1: Guía de solución de problemas. Problemas comunes encontrados durante la mineralización y la adquisición/análisis 3D-STORM, junto con sus posibles causas y soluciones recomendadas. Consulta el texto para los números detallados de pasos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo integral para la visualización a nanoescala de la mineralización del colágeno utilizando 3D-STORM multicolor. Varios pasos críticos requieren especial atención para garantizar resultados exitosos.

En primer lugar, la preparación de la muestra es fundamental para la imagen de alta calidad de STORM. La aminosilización de platos de fondo de cristal debe ser exhaustiva para asegurar la fijación estable de las fibrillas de colágeno durante los siguientes pasos de lavado y etiquetado. El APTES residual puede causar unión inespecífica y alto fondo de fondo, mientras que la silanización incompleta puede provocar desprendimiento de fibrillas. El paso recomendado de ultrasonicación (10 min a 40 kHz) elimina eficazmente el silano no ligado mientras preserva la funcionalización superficial. Para fibras de colágeno entrecruzadas, se recomienda EDC/^{NHS 21} para alta especificidad. Alternativamente, se puede usar glutaraldehído al 0,1% (incubar 30 minutos a temperatura ambiente y luego lavar bien), pero es menos específico. Lo fundamental es que recomendamos verificar la formación correcta de fibrillas mediante TEM antes de proceder a la mineralización. Como se muestra en la Figura 3, la presencia del característico patrón de bandas periódicas D de 67 nm confirma que el proceso de autoensamblaje ha producido fibrillas de colágeno²⁶ estructuralmente intactas, similares a las nativas. Este paso de control de calidad evita interpretaciones erróneas de los resultados derivados de andamios de colágeno mal formados o desnaturalizados.

En segundo lugar, el medio de mineralización debe prepararse con un control preciso del pH (7,4 ± 0,1) y utilizarse de inmediato. El precursor amorfo del fosfato de calcio (ACP) es altamente sensible al pH y a la fuerza iónica; pequeñas desviaciones pueden causar cristalización prematura. Por lo tanto, el medio mineralizado debe utilizarse inmediatamente después de la preparación. Para estudios que requieran comparaciones entre múltiples puntos temporales, preparar un medio fresco para cada experimento en lugar de usar soluciones almacenadas. Cuando las condiciones de mineralización no están debidamente controladas (por ejemplo, ácido poliaspártico insuficiente o pH incorrecto), predomina la mineralización extrafibrilar, como se muestra en la Figura 4. En este control negativo, el HAP se deposita exclusivamente sobre el sustrato de vidrio fuera de las fibrillas de colágeno, sin invasión intrafibrilar. La inclusión de estos resultados negativos es esencial para validar que la señal intrafibrilar observada en las Figuras 1 y 2 se debe efectivamente a mineralización intrafibrilar controlada y no a precipitación inespecífica o lavado incompleto. Además, estudios previos han enfatizado que distinguir la mineralización intrafibrilar de la extrafibrilar requiere un control cuidadoso del entorno químico local y la presencia de aditivos estabilizadores como el ácido poliaspártico²⁷.

En tercer lugar, el marcado por inmunofluorescencia requiere una optimización cuidadosa. La concentración de anticuerpos (1:100) proporcionada funciona bien para el sistema de colágeno y sulfato de condroitina descrito, pero puede necesitar titulación para diferentes anticuerpos o tipos de muestras. Incluye siempre controles sin anticuerpos primarios para evaluar la autofluorescencia y la unión inespecífica. Desde el paso secundario de anticuerpos en adelante, es esencial una protección estricta de la luz para evitar el fotoblanqueamiento por fluoróforos.

En cuarto lugar, el buffer de imagen STORM debe prepararse fresco y utilizarse en un plazo de 30 minutos. El sistema absorbente de oxígeno (glucosa oxidasa/catalasa) pierde actividad con el tiempo, y la cisteamina es tanto fotosensible como sensible al oxígeno. Pre-alicotizar las acciones enzimáticas y almacenarlas a -80 °C garantiza un rendimiento consistente entre experimentos. La densidad de parpadeo debe monitorizarse en tiempo real y ajustarse modulando la potencia láser de 405 nm; demasiadas moléculas prolongan el tiempo de adquisición, mientras que demasiadas provocan solapamientos de PSF y una menor precisión de localización. Para una optimización detallada de los parámetros de imagen de STORM, remitimos a los lectores a los protocolos de muestra de prueba^{establecidos 15}.

Quinto, el procesamiento de datos requiere parámetros estandarizados para comparaciones significativas entre muestras. El umbral mínimo de recuento de fotones (típicamente 500-1000 fotones) excluye localizaciones de baja confianza. Si las señales de la muestra son débiles, puede reducirse adecuadamente a 300 fotones, pero no se recomienda bajar de 200 fotones. La corrección de deriva usando marcadores fiduciales o algoritmos de correlación cruzada es esencial para mantener la resolución, especialmente para reconstrucciones^{3D 28}. La desmezcla espectral ayuda a eliminar diafonía entre canales, lo cual es fundamental para un análisis de colocalización preciso. La resolución de problemas comunes se describe en la Tabla Suplementaria 1.

El protocolo tiene varias limitaciones. Está optimizado para modelos biomiméticos in vitro; La aplicación en tejidos nativos y altamente mineralizados (por ejemplo, hueso maduro) puede requerir pasos adicionales como la descalcificación o una recuperación de antígenos más agresiva, lo que podría afectar a la ultraestructura. La dependencia de anticuerpos específicos puede provocar problemas de densidad de marcado o impedimentos estéricos, especialmente en estructuras densamente agrupadas. La técnica requiere mucho equipo, requiriendo acceso a un microscopio STORM de alta gama con líneas láser adecuadas y una cámara EMCCD. Además, el tiempo total requerido (~53 h desde la preparación de la muestra hasta el análisis de datos) puede limitar el rendimiento para algunas aplicaciones.

A pesar de estas limitaciones, este protocolo ofrece ventajas significativas frente a métodos alternativos. En comparación con la microscopía electrónica, proporciona especificidad molecular mediante marcaje por inmunofluorescencia, permitiendo la visualización simultánea de múltiples componentes orgánicos e inorgánicos. En comparación con la microscopía confocal, alcanza una resolución espacial ~10 veces mayor, lo que permite distinguir entre patrones de mineralización intrafibrilar y extrafibrilar. La capacidad 3D proporciona información volumétrica esencial para comprender la distribución mineral dentro de la matriz de colágeno.

El método tiene una amplia aplicabilidad en la investigación en biomineralización. Las aplicaciones potenciales incluyen el estudio del papel de las proteínas no colágenas en la nucleación mineral, la evaluación de materiales biomiméticos para la regeneración ósea, la investigación de mineralización patológica en enfermedades como la osteoporosis y la caries dental, y la evaluación de los efectos de intervenciones terapéuticas en la distribución de minerales. Con las modificaciones adecuadas, el protocolo puede adaptarse para estudiar otras interfaces orgánico-inorgánicas en tejidos o biomateriales.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido poliaspártico (p-Asp)	Sigma-Aldrich	P9903	Estabilizador para fosfato de calcio amorfo
Cloruro de calcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Fuente de calcio
Dibásico fosfato de sodio (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S0876	Fuente de fosfato
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	Ajustador de resistencia iónica
Ácido poliacrílico (PAA)	Sigma-Aldrich	323667	Estabilizador para calcio de alta concentración
Base de Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Componente búfer
Azida de sodio (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002	Agente antimicrobiano
(3-Aminopropil)trietoxisilano (APTES)	Sigma-Aldrich	440140	Agente de funcionalización de superficies de vidrio
Etanol absoluto	Sigma-Aldrich	459836	Disolvente
Solución de colágeno tipo I (50 y mu; g/mL en 0,1 M de ácido acético)	Corning	354249	Andamiaje de autoensamblaje
Sulfato de condroitina (CS)	Sigma-Aldrich	C9819	Imitador de proteínas no colágenas
EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida)	Sigma-Aldrich	E7750	Reticulador
NHS (N-hidroxisuccinimida)	Sigma-Aldrich	130672	Activador de reticulador
Ácido libre de MES	Sigma-Aldrich	M5287	Búfer para reticulación
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	10010023	Lavado y amortiguador de dilución
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Agente bloqueador
Anticuerpo anticolágeno-I de conejo	Abcam	AB34710	Anticuerpo primario para el colágeno
Anticuerpo anti-chondroitina sulfato de ratón	Sigma-Aldrich	C8035	Anticuerpo primario para la SC
IgG anticonejo de cabra conjugado a un tinte fluorescente de rojo extremo (Alexa Fluor 647)	Thermo Fisher Scientific	A-21244	Anticuerpo secundario para el colágeno
IgM anti-ratón de cabra conjugado con tinte fluorescente rojo (Alexa Fluor 568)	Thermo Fisher Scientific	A-11031	Anticuerpo secundario para la SC
Calceína (colorante indicador de calcio)	Sigma-Aldrich	C0875	Etiqueta de fosfato de calcio
Preadolescente-20	Sigma-Aldrich	P1379	Detergente para el tampón de lavado
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516	Componente del búfer de imagen
Glucosa oxidasa (GOx)	Sigma-Aldrich	G7141	Carroñero de oxígeno
Catalase	Sigma-Aldrich	C1345	Carroñero de oxígeno
Cisteamina (MEA)	Sigma-Aldrich	M6500	Tiol para el parpadeo con fluoróforo
D-glucosa	Sigma-Aldrich	G6152	Sustrato para glucosa oxidasa
Acetato de sodio	Sigma-Aldrich	S2889	Buffer para la acción de GOx
Ácido clorhídrico (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Ajuste del pH
Hidróxido de sodio (NaOH)	Sigma-Aldrich	71690	Ajuste del pH
Ácido fosfotongstico	Sigma-Aldrich	P4006	Tinción negativa para TEM
Platos de cultivo con fondo de vidrio (35 mm, #1,5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	Muestrear el sustrato; espesor: 0,17 mm
Limpiador ultrasónico (40 kHz)	Branson	B200	Dispositivo de limpieza
Cámara de humedad	Thermo Fisher Scientific	11-432-10	Para el autoensamblaje del colágeno
Microscopio electrónico de transmisión	Hitachi	HT7800	Imagen TEM
Formvar/rejillas TEM recubiertas de carbono (malla 200)	Sigma-Aldrich	FCF200-Cu	Soporte para muestras TEM
Plataforma de vibración horizontal	Labnet	S2030-RC	Lavado suave
Microscopio láser de barrido confocal	Nikon	A1	Cribado preliminar
Sistema de microscopio 3D-STORM (con láseres de 405/488/647 nm, lente cilíndrica, EMCCD)	Nikon	N-STORM	Imagen de superresolución
100 y más veces; Objetivo de inmersión en aceite (NA 1.49)	Nikon	MRD01991	Imagen de alta resolución
Medidor de pH	Mettler Toledo	FiveGo F2	Control del pH
Software de adquisición y análisis de STORM	Nikon	NIS-Elementos (módulo STORM)	Adquisición y procesamiento de datos STORM
.nd2 (archivo de imagen de microscopía en bruto)	Nikon	N/A	Formato de archivo de imagen en bruto generado por microscopios Nikon.
Software de análisis de imágenes disponible públicamente	Código abierto	N/A	por ejemplo, ImageJ con el plugin ThunderSTORM para análisis de localización de moléculas individuales (colocalización, corrección de deriva)
Parafilm	Bemis	PM996	Recubrimiento de muestra durante la incubación
Papel de aluminio	Cualquier proveedor de laboratorio	N/A	Para protección ligera (por ejemplo, envolviendo muestras)
Tubos microcentrífugas ámbar	Fisher Scientific	05-669-21	Para la protección de la luz de los fluoróforos
Cubiertas (N.º 1.5)	Corning	2855-18	Montaje de muestra