Artículo de método

Hibridación in situ multiplex de ARNm fluorescente en desarrollo de tejidos craneofaciales en muestras de ratón FFPE

DOI:

10.3791/71475

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8 de mayo de 2026

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1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School, 3Shriners Hospital for Children, 4Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

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La hibridación in situ convencional tiene dificultades para visualizar el ARNm en tejidos craneofaciales debido a la arquitectura compleja, alto fondo, especificidad limitada de la sonda y sensibilidad. Este protocolo describe un método multiplex de hibridación in situ con ARN fluorescente para la detección sensible y específica de múltiples dianas de ARNm en tejidos craneofaciales embrionarios de ratón FFPE, superando limitaciones previas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El desarrollo craneofacial depende de la actividad coordinada de diversas poblaciones celulares especializadas que interactúan dentro de arquitecturas tejidulares intrincadas para formar y mantener la estructura y función normal del tejido. Comprender cómo estas células se comunican entre sí y con su microambiente local es esencial para definir los mecanismos moleculares que regulan su formación y homeostasis. La alteración de estos procesos puede provocar afecciones craneofaciales congénitas, incluyendo agenesia dental, paladar hendido y labio leporino, ya sea por sí solas o como parte de trastornos sindrómicos. Aunque las técnicas cuantitativas como la RT-PCR ofrecen alta sensibilidad y rango dinámico, requieren la extracción de ARN de tejido homogenizado, lo que resulta en una pérdida de contexto espacial y celular, una limitación especialmente crítica para tejidos craneofaciales heterogéneos, donde no se puede resolver el origen celular de los transcritos. La hibridación in situ de ARN fluorescente multiplex supera esta limitación al permitir la detección sensible y específica de múltiples transcritos de ARNm, manteniendo la arquitectura tisular. Este enfoque avanzado permite una localización precisa de la expresión génica a nivel celular, proporcionando una valiosa comprensión de la regulación espacial de los procesos del desarrollo y los mecanismos de la enfermedad en la biología craneofacial.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) es el estándar de oro para el análisis de expresión génica debido a su alta sensibilidad y amplio rango dinámico; sin embargo, requiere ARN extraído de tejidos homogeneizados, lo que resulta en la pérdida del contexto espacialy celular 1. Esta limitación es especialmente problemática para tejidos heterogéneos como los tejidos craneofaciales durante el desarrollo embrionario, donde la fuente celular de los transcritos detectados no puede resolverse. La hibridación in situ de ARN (ISH), una técnica pionera en 1968 por Joseph Gall y Mary Lou Pardue, supera esta limitación al permitir la localización de la expresión de ARNm dentro de la arquitectura tisularintacta 2. No obstante, el ARN ISH convencional es técnicamente exigente y depende en gran medida de la fijación óptima del tejido y la preparación de muestras para preservar la integridad delARN 3. Estos desafíos se agravan en tejidos altamente calcificados, que requieren procedimientos de descalcificación que a menudo implican productos químicos agresivos o un procesamiento prolongado, lo que conduce a la degradación del ARN. En consecuencia, el ARN ISH en los tejidos craneofaciales, que comprenden mezclas complejas de tipos celulares, requiere una optimización cuidadosa y conocimientos técnicos, requiere mucho tiempo y conlleva un riesgo considerable de tinción subóptima. El desafío de visualizar la expresión del ARNm es aún más pronunciado en los tejidos dentales, que poseen una estructura y composición altamente complejas. Los dientes están compuestos por componentes mineralizados como esmalte, dentina, cemento y hueso circundante, junto con tejidos más blandos como la pulpa y el ligamento periodontal. Estos tejidos están poblados por una amplia variedad de tipos celulares que desempeñan un papel crucial en el desarrollo dental4. Estas características requieren una estandarización cuidadosa para garantizar una detección fiable de señales. Como resultado, el protocolo descrito es especialmente adecuado para investigar la expresión génica durante las etapas de desarrollo y posnatal de la formación dental.

Existen técnicas basadas en hibridación in situ (FISH) por fluorescencia múltiple para la detección espacial de ARN, incluyendo ARN amplificado basado en sondaFISH 5,6,7,8,9, reacción en cadena de hibridación FISH 6, ARN de molécula única FISH10, amplificación de señal por reacción de intercambioFISH 5, y plataformas FISH altamente multiplexadas como MERFISH11 yseqFISH 12.13. Entre estos, el ARN fluorescente multiplexISH 7,8,9 es ampliamente utilizado debido a su alta sensibilidad para detectar una sola molécula de ARN resultante del diseño de doble Z-sonda, en el que dos sondas adyacentes deben hibridarse con la secuencia objetivo para iniciar la amplificación de la señal. Este diseño de doble reconocimiento mejora considerablemente la especificidad y reduce la señal fuera del objetivo. El método soporta la detección multiplex de 2–4 dianas (expandibles hasta 12 o más dianas usando técnicas similares), preserva la morfología tisular y es compatible con tejidos incrustados en parafina fijada en formalina (FFPE)7,8,9, frescos congelados y calcificados seleccionados, lo que lo hace adecuado para muestras complejas como las que se encuentran en el desarrollo craneofacial y dental. El método está estandarizado, es reproducible, apoyado por bibliotecas de sondas bien establecidas y ampliamente validado, garantizando resultados accesibles y fiables en diversos laboratorios.

El ARN fluorescente multiplex ISH emplea múltiples sondas que apuntan a regiones distintas del mismo transcrito, combinadas con una amplificación de señal mejorada, permitiendo una detección altamente sensible y específica incluso para ARNm de baja abundancia o parcialmentedegradados 14,15. Aunque el ARN fluorescente multiplex se ha aplicado con éxito a muestras óseasdescalcificadas 16, y su uso en tejidos craneofaciales complejos ya se hareportado anteriormente 7,8,9; sin embargo, aún no se ha informado de un protocolo detallado paso a paso que describa su aplicación en este contexto.

Las estructuras craneofaciales comprenden arquitecturas tejidos intrincadas con diversos tipos celulares, incluyendo osteoblastos, osteoclastos, osteocitos, ameloblastos, odontoblastos, fibroblastos, células madre, células inmunitarias, vasculaturas y neuronas sensoriales, cuyas interacciones espacialmente coordinadas son esenciales para la formación, función, regeneración y protección inmunológicade los tejidos 4. Por tanto, el estudio de las expresiones génicas localizadas en estos tejidos es fundamental, y el ARN fluorescente multiplex ISH representa un enfoque líder para este tipo de análisis.

En este estudio, describimos cómo el ARN ISH fluorescente multiplexado basado en sondas y tecnología de ARNoscopio podría aplicarse para estudiar tejidos craneofaciales complejos (Figura 1). Además, establecimos un flujo de trabajo optimizado de seccionamiento FFPE que preserva la integridad del ARN y permite un análisis de expresión génica de alta calidad y resuelto espacialmente.

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Protocolo

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Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano, bajo el Protocolo de Estudio Animal #24-031.

1. Apareamiento cronometrado y recogida de tejido embrionario

  1. Organiza apareamientos programados.
    1. Empareja a un Mus musculus macho y fértil sanos a última hora de la tarde. A la mañana siguiente, comprueba la presencia de un plug vaginal. Designa el día en que se observa un tapón como día embrionario (E) 0,5.
  2. Eutanasia a la hembra embarazada.
    1. En la etapa de desarrollo deseada, se eutanasia a la ratona embarazada mediante inhalación de CO₂ seguida de dislocación cervical, de acuerdo con las directrices institucionales de cuidado animal.
    2. Coloca el ratón boca arriba sobre una superficie absorbente y estéril. Desinfecta la zona abdominal con etanol al 70% a lo largo del lugar de la incisión previsto.
  3. Expone y aísla los cuernos uterinos.
    1. Haz una incisión abdominal media con tijeras quirúrgicas estériles y luego abre la pared peritoneal con tijeras microquirúrgicas para exponer los cuernos uterinos.
    2. Usa pinzas romas para exteriorizar suavemente la cadena uterina. Libera el tejido uterino a lo largo del miometrio y corta el oviducto y la unión mediana del cuerno uterino para aislar los embriones.
  4. Transfiere embriones enteros.
    1. Transfiere inmediatamente la cadena uterina que contiene embriones a una placa de Petri de 10 cm que contiene PBS estéril y helado de 1× (pH 7,4).
  5. Disecciona embriones individuales.
    1. Separa cuidadosamente cada embrión de las membranas uterina, amniótica y coriónica circundantes.
    2. Transfiere los embriones limpios a un recipiente fresco de 10 cm que contenga PBS estéril y helado.
  6. Disecciona cabezas embrionarias de ratón.
    1. Utilizando una hoja quirúrgica estéril, disección las cabezas y enjuaga las cabezas diseccionadas una vez en PBS bien frío antes de continuar el procesado.
      NOTA: Recoger y diseccionar los ratones neonatales en la etapa de desarrollo deseada de acuerdo con el protocolo animal.

2. Fijación y procesamiento de tejido

  1. Arregla el pañuelo.
    1. Sumerge inmediatamente el tejido disecado en formalina tampón neutra al 10% y fijala durante la noche a temperatura ambiente en un agitador.
      NOTA: La adecuada preservación del ARN es crucial para el éxito de los análisis de hibridación in situ. Numerosos estudios han demostrado que el enfoque estándar —fijar muestras de tejido en formalina amortiguada neutra al 10% durante duraciones que van de 6 a 48 horas, dependiendo del tamaño y la edad específicos del tejido— produce resultados fiables para la preservacióndel ARN 16,17,18,19. Para las etapas embrionarias más tempranas (E12.5 y inferiores), la penetración del fijador es rápida y el tiempo de fijación debe reducirse en consecuencia para evitar la sobrefijación. Desde el día embrionario 17,5 (E17,5) en adelante, así como en muestras posnatales, la penetración del fiador puede ser menos eficiente debido a la presencia de piel en la cabeza, que actúa como barrera física. Por ello, la piel debe retirarse de toda la cabeza para permitir una penetración eficiente de la solución de fijación. La descalcificación puede realizarse en 0,5 M EDTA (pH 8,0) que contenga un 0,5% de formaldehído libre de metanol a 4 °C 7. La duración de la descalcificación puede monitorizarse mediante una rápida microTC y puede ajustarse según el grado de mineralización y el tipo de tejido específico; para embriones de E18,5, 24–48 horas suele ser suficiente.
  2. Enjuaga y procesa el tejido.
    1. Retira el fijador y enjuaga las muestras con PBS. Transfiere el tejido al 70% de etanol y almacene a 4 °C hasta el procesamiento posterior (1–4 semanas)20. Realiza deshidratación, limpieza e infiltración de parafina de los tejidos utilizando un procesador de tejidos automatizado según las instrucciones del fabricante.
      NOTA: El protocolo típico de procesamiento de tejidos es el siguiente: 70% de etanol durante 30 minutos, seguido de 95% de etanol durante 30 minutos (2 veces), y 100% de etanol durante 30 minutos (3 veces) para deshidratación; limpieza en xileno durante 1 h (3 veces), y posteriormente infiltración con cera de parafina a 60 °C durante 1 hora (3 veces) antes de incrustarse en bloques de tejido de parafina.
  3. Incrusta el tejido.
    1. Incrustar las cabezas en parafina y orientar las muestras en el plano coronal o sagital, dependiendo de los requisitos experimentales.
    2. Transfiere los bloques incrustados a una placa fría de bloques de parafina para permitir que la cera endurezca durante aproximadamente 30 minutos, ajustando el tiempo según el tamaño del bloque.
  4. Guarda los bloques de FFPE.
    1. Deja que la parafina se solidifique completamente. Saca los bloques de moldes, ponlos en recipientes herméticos o bolsas zip-lock etiquetadas y guárdalos a 4 °C hasta que estén listos para separar.
      NOTA: Los bloques FFPE con ARN bien conservado pueden almacenarse durante varios años antes de la sección sin comprometer la integridad tisular.

3. Procesamiento de tejido FFPE para ARN fluorescente multiplex ISH

  1. Prepara un espacio de trabajo libre de RNasa.
    1. Desinfecta todas las superficies de trabajo e instrumentos con un 70% de etanol. Trata superficies, herramientas y guantes con una solución descontaminante de RNasa para minimizar la degradación del ARN.
    2. Monta el microtomo y pon una hoja nueva. Ajusta el ángulo de espacio libre a 10°. Trata pinzas y cepillos con solución desinfectante de RNasa antes de usarlas.
      NOTA: Utiliza siempre una hoja nueva para seccionar y así obtener cortes de tejido precisos. El ángulo de la hoja afecta significativamente a la calidad de la sección, la integridad del tejido, la uniformidad del grosor y la preservación de las características morfológicas.
  2. Prepara el baño marea.
    1. Llena un baño marea de flotación con agua ultrapura de grado laboratorio.
    2. Ajusta la temperatura entre 40 y 43 °C según sea necesario, dependiendo de la etapa embrionaria y las características del tejido.
  3. Recorta y monta el bloque de FFPE.
    1. Recorta el exceso de parafina alrededor del tejido incrustado. Enfría el bloque de FFPE sobre hielo y móntalo en la etapa de microtomo frío.
  4. Recorta según la región de interés.
    1. Alinear la cara del bloque de parafina con la hoja del microtomo y recortar en pasos de 12 μm hasta que la región de interés (por ejemplo, la adyacente al molar o al diente incisivo) aparezca en las secciones coronales.
    2. Reposiciona el bloque y la hoja según sea necesario para secciones coronal o sagital simétricas y correctamente orientadas de toda la cabeza.
  5. Seccionar el pañuelo.
    1. Una vez alcanzada la región de interés, cortar secciones de 5–7 μm. Haz flotar las secciones en el baño maria para permitir una relajación suave y aplanamiento antes de transferirlas a los toboganes.
  6. Monta y seca las secciones.
    1. Monta las secciones sobre correderos de vidrio cargados positivamente. Examina las láminas bajo un microscopio óptico para confirmar la orientación correcta y la integridad del tejido.
    2. Seque las láminas en un calentador de portaobjetos a 40 °C durante la noche antes de realizar el ensayo multiplex de ARN fluorescente ISH.

4. Día 1: Deparafinización y rehidratación

  1. Hornea las láminas.
    1. Hornea las láminas con secciones de FFPE durante 1 hora a 60 °C.
      NOTA: Si no se usa el portaobjetos inmediatamente, guárdalo sin cocer a temperatura ambiente (RT) con desecantes durante 1–4 semanas. El almacenamiento prolongado puede provocar la degradación del ARN.
  2. Equilibra las corredoras.
    1. Deja que el portaobjetos de tejido FFPE se equilibre a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos.
  3. Deparafiniza y rehidrata las secciones.
    1. Sumerge las láminas en xileno o un sustituto de xileno con una agitación suave durante 5–10 minutos en RT. Repite este paso una vez para asegurar la eliminación completa de la parafina.
      NOTA: El trabajo con xileno debe realizarse en una campana extractora química. Si se utiliza un sustituto de xileno de baja toxicidad, puede emplearse fuera de la campana extractora química.
    2. Transfiere las láminas a etanol al 100% e incubar durante 2 minutos en RT. Repita una vez para eliminar el xileno residual. Rehidrata las secciones con etanol al 70% durante 2 minutos.
    3. Enjuaga las secciones 3 veces con PBS. Luego añade una gota de PBS suficiente para cubrir completamente las secciones y pasa inmediatamente al siguiente paso.

5. Multiplexar ARN fluorescente ISH en secciones de tejido FFPE

NOTA: Este estudio siguió las instrucciones del fabricante para realizar el ISH de ARN fluorescente multiplex en secciones de tejido FFPE utilizando la tecnologíaRNAscope 21.

  1. Día 1: Pretratamiento e hibridación con sonda
    1. Dibuja una barrera hidrofóbica.
      1. Usando un corral barrera, dibuja una barrera hidrofóbica alrededor de cada sección de tejido. Deja que las láminas se sequen al aire durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente (RT).
      2. Asegúrate de que las secciones de tejido permanezcan cubiertas con PBS en todo momento para evitar el sequeo.
        NOTA: Utiliza una toallita sin pelusa (toallita de lente) para secar la lámina alrededor del pañuelo mientras mantienes el tejido hidratado. Asegúrate de que la tinta barrera del bolígrafo no entre en contacto con la sección de tejido.
    2. Realiza el pretratamiento.
      1. Aplica el reactivo de pretratamiento personalizado para cubrir completamente cada sección. Incuba las láminas durante 30 minutos a 40 °C en una cámara humidificada situada dentro de un horno de hibridación.
        NOTA: Para todos los reactivos suministrados en botellas cuentagotas, añade suficientes gotas para cubrir completamente la sección dentro de la barrera. Asegúrate de que todos los reactivos se lleven a RT antes de usarlos.
    3. Enjuaga las secciones.
      1. Enjuaga las secciones varias veces con PBS y luego incuba en PBS fresco durante 2 minutos en tiempo de descanso.
        NOTA: Usa una pipeta de transferencia de 5 mL para lavar cada lámina individualmente con PBS. Durante los 2 minutos de lavado, asegúrate de que las secciones permanezcan completamente cubiertas con PBS.
    4. Extinguir la actividad endógena de la peroxidasa.
      1. Aplicar peróxido de hidrógeno al 3% en cada sección e incubar en RT durante 10 minutos para bloquear la actividad endógena de la peroxidasa.
    5. Repite el lavado.
      1. Lava las láminas en PBS durante 2 minutos en tiempo de descanso. Repite dos veces.
    6. Prepara las sondas.
      1. Precalienta las sondas a 40 °C durante 10 minutos. Deja que las sondas se enfríen a RT antes de usarlas.
    7. Prepara la mezcla de la sonda.
      1. La sonda C1 se suministra como solución de trabajo 1×; Úsalo directamente.
      2. En contraste, las sondas C2, C3 y C4 se proporcionan como concentrados del 50×; diluir estas sondas con la solución de sonda C1. Si no se utiliza la sonda C1, diluir las sondas C2, C3 y/o C4 con el diluyente suministrado por el fabricante.
    8. Hibrida las sondas.
      1. Aplica 30–40 μL de mezcla de sonda en cada sección de tejido, asegurando una cobertura completa. Incubar las láminas durante 2 horas a 40 °C en una cámara humidificada en el horno de hibridación.
        NOTA: Al aprender la técnica de RNAscopio, se recomienda incluir tanto sondas de control negativas como positivas durante las pruebas. Este enfoque ayuda a validar el ensayo y confirmar la calidad del procedimiento. Una posible limitación a tener en cuenta es que algunas sondas de control positivas proporcionadas por el fabricante pueden no expresarse en el tejido de interés. Para abordar esto, se pueden utilizar sondas específicas por tipo celular. Por ejemplo, Col1a1 es un control positivo fiable para los tejidos conectivos. La tinción para Col1a1 (u otro gen con alta expresión conocida) puede realizarse como primer paso para evaluar la preservación del ARN y la morfología tisular en las muestras. Una vez alcanzada la competencia con la técnica, los controles negativos suelen realizarse procesando portaobjetos sin sondas, tratándolas con todas las demás soluciones. Este método proporciona información crítica sobre la señal de fondo en todos los canales de detección. El kit estándar Multiplex V2 permite teñir e imaginar simultáneamente hasta cuatro sondas diferentes. Cuando los niveles de expresión génica se establecen mediante estudios transcriptómicos previos, es recomendable asignar genes con baja expresión a los canales Cy5 y Cy7. Los genes con alta expresión deben colocarse en los canales GFP y RFP para una detección óptima. En los casos en que ninguna de las sondas se dirija a genes con alta expresión, el canal GFP debe permanecer sin usar. Esto permite que el canal GFP sirva como referencia para la resta de fondo del canal RFP, mejorando la precisión de la detección de señales para objetivos de baja expresión.
    9. Enjuaga con buffer de lavado.
      NOTA: El tampón de lavado disponible comercialmente al 20× se diluyó a 1× con agua libre de RNasa antes de su uso.
      1. Lava las correderas durante 2 minutos en RT en el buffer de lavado 1× que viene con el kit. Repite dos veces.
    10. Incubar en 5x tampón de suero salino-citrato de sodio (SSC).
      NOTA: El tampón SSC de 20× disponible comercialmente (3 M NaCl, 0,3 M citrato de sodio, pH 7,0) se diluyó a 5× con agua libre de RNasa antes de su uso.
      1. Después de lavar, incuba las secciones durante la noche en un buffer de 5× SSC en RT.
  2. Día 2: Amplificación de la señal, marcado fluorescente y montaje
    1. Lava los tobogáns.
      1. Lava las láminas en 1× Wash Buffer durante 2 minutos a temperatura ambiente (RT). Repite dos veces.
    2. Realiza los pasos de amplificación.
      1. Aplica un reactivo de Amplificación 1 en cada sección e incuba durante 30 minutos a 40 °C en una cámara humidificada.
      2. Enjuaga dos veces en 1× Wash Buffer durante 2 minutos en RT.
      3. Aplica el reactivo de amplificación 2 e incuba durante 30 minutos a 40 °C.
      4. Enjuaga dos veces en 1× Wash Buffer durante 2 minutos en RT.
      5. Aplica el reactivo de amplificación 3 e incuba durante 15 minutos a 40 °C.
        NOTA: Se requieren los tres pasos de amplificación independientemente de qué canales (sondas) se estén desarrollando.
      6. Enjuaga dos veces en 1× Wash Buffer durante 2 minutos en RT.
    3. Desarrollar peroxidasa de rábano de pico (HRP) y fluoróforo.
      1. Calcular el volumen de fluoróforo necesario (generalmente 100–200 μL por lámina) y diluir las reservas de fluoróforo de ópalo.
        NOTA: El rango de dilución recomendado para fluoróforo es de 1:300 a 1:1500. En estos experimentos, Opal Polaris 780 (reactivo fluoróforo) se diluyó 1:500 en diluyente de anticuerpos, y todos los demás colorantes se diluyeron 1:1000 en buffer TSA. Minimiza la exposición a la luz de las diapositivas siempre que sea posible.
      2. Aplica el reactivo HRP-C1 e incuba durante 15 minutos a 40 °C.
      3. Enjuaga dos veces en 1× Wash Buffer durante 2 minutos en RT.
      4. Aplica 30–40 μL de tinte Opal (por ejemplo, Opal 570 o Opal 690) en cada sección. Incuba durante 30 minutos a 40 °C.
      5. Enjuaga dos veces en 1× Wash Buffer durante 2 minutos en RT.
      6. Aplica un bloqueador de HRP y incuba durante 15 minutos a 40 °C.
      7. Enjuaga dos veces en 1× Wash Buffer durante 2 minutos en RT.
      8. Aplica el reactivo HRP-C2 o HRP-C3 e incuba a 40 °C durante 15 minutos.
      9. Enjuaga dos veces en 1× Wash Buffer durante 2 minutos en RT.
      10. Aplica 30–40 μL del segundo tinte de ópalo e incuba durante 30 minutos a 40 °C.
      11. Enjuaga dos veces en 1× Wash Buffer durante 2 minutos en RT.
      12. Aplica un bloqueador de HRP y incuba durante 15 minutos a 40 °C.
      13. Enjuaga dos veces en 1× Wash Buffer durante 2 minutos en RT.
      14. Aplica reactivo HRP-C3 o HRP-C4 e incuba durante 15 minutos a 40 °C.
      15. Enjuaga dos veces en 1× Wash Buffer durante 2 minutos en RT.
    4. Realizar amplificación de señales de tiramidas con digoxigenina (TSA-DIG) y marcaje con fluoróforos (si procede).
      1. Aplicar 30–40 μL de reactivo TSA-DIG diluido por sección e incubar durante 30 minutos en RT.
      2. Enjuaga dos veces en 1× Wash Buffer durante 2 minutos en RT.
      3. Aplica el reactivo bloqueador y incuba durante 15 minutos a 40 °C.
      4. Enjuaga dos veces en 1× Wash Buffer durante 2 minutos en RT.
      5. Aplicar 30–40 μL de reactivo fluoróforo diluido e incubar durante 30 minutos a 40 °C.
      6. Enjuaga dos veces en 1× Wash Buffer durante 2 minutos en RT.
    5. Realiza el contratinte y el montaje.
      1. Aplica 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e incuba durante 5 minutos en RT en la oscuridad.
      2. Enjuaga el DAPI y monta rápidamente las secciones usando un anti-desvanecimiento, aplica el protector con cuidado y evita que queden atrapadas burbujas de aire. Elige una talla de funda que se ajuste adecuadamente a la cobertura de pañuelo.
      3. Seca las láminas durante 2 horas en RT en la oscuridad, y luego mantén las láminas a 4 °C para su almacenamiento a largo plazo.
        NOTA: La fluorescencia puede preservarse hasta un año si se almacena a 4 °C en la oscuridad con un montaje adecuado anti-descolorido.
    6. Realiza imágenes.
      1. Realizar imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia multicanal con iluminación LED y filtros para la separación espectral (Figura 2A). Utiliza las longitudes de onda de excitación y emisión de la siguiente manera: DAPI (353/465 nm), FITC (495/519 nm), Cy3 (548/561 nm), Cy5 (650/673 nm) y Cy7 (747/773 nm). Filtros específicos minimizan las superposiciones espectrales y distinguen señales azules, verdes, naranjas, rojas y del infrarrojo cercano.
      2. Adquirir todas las imágenes utilizando los mismos ajustes de exposición e iluminación entre muestras, asegurando la consistencia y permitiendo un análisis comparativo fiable.

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Resultados

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Utilizando el protocolo descrito (Figura 1), demostramos la detección de transcritos ISH de ARNm fluorescentes multiplexados en una cabeza completa de ratón fotografiada en una plataforma de microscopio Zeiss (Figura 2B). Se pueden seleccionar vistas de imagen específicas usando la pestaña lateral (caja amarilla), mientras que varios canales pueden visualizarse simultáneamente usando la pestaña de canales (caja roja). El brillo,...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La hibridación in situ ha sido una herramienta fundamental para estudiar la expresión génica durante más de cuatro décadas y ha experimentado un perfeccionamiento continuo. Sin embargo, los enfoques convencionales de ISH suelen estar limitados por baja sensibilidad, alta señal de fondo y procedimientos largos e intensivos en mano de obra. Estas limitaciones han restringido su aplicación más amplia, especialmente en tejidos craneofaciales complejos, donde la resolución espacial p...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al personal de las instalaciones animales de NICHD por su ayuda en la cría y la ganadería. Agradecemos al Dr. Vincent Schram del Microscopy and Imaging Core (NIH/NICHD) por su ayuda con la imagen de fluorescencia. El manuscrito actual cuenta con fondos del NIH/NIDCR RO1DE033520 a M.B., el Programa de Investigación Intramuros, el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (NICHD) a E.M., y el Identificador de Subvenciones de Investigación ZIA del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (HD009015NICHD). El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 y veces; PBSThermo Fischer10010023Uso  realizar lavados durante el flujo de trabajo
20 y más veces; SSCThermo FischerJ60839. K2Úsalo para hacer el 1&agudo; Buffer de lavado
Tubos cónicos de 50 mL (Ambión) libres de ARNASAThermo FischerAM12502Uso para almacenar muestras en diferentes soluciones
Agitador orbital avanzadoVWR6683-470Se usa para agitar tejidos en la solución de fijación durante la incubación
Alcohol, 70%, Fisherbrand, HistoPrepFisher ScientificHC-1000-1GLÚsalo para limpiar y desinfectar todo el espacio de trabajo
Diluiente de anticuerpos y subs:Akoya BiosciencesARD1001EADiluyente para TSA-DIG
Procesador automático de tejidos al vacíoLeica BiosystemsASP300SUso para limpiar, deshidratación, rehidratación e infiltración de cera de muestras
Espesor de vidrio de cubierta 1,5, 25 mm x 25 mm  Corning2850-25Uso para el montaje de corredera en el flujo de trabajo Visium HD
Reactivo de Pretratamiento personalizadoACD, Bio-Techne300040Optimizar la permeabilización tisular y la accesibilidad a los objetivos
EDTAMillipore Sigma03690Uso para descalcificar tejidos mineralizados
Etanol al 100%Grupo AeroBase6505001050000Úsalo para eliminar la xilina y rehidratar muestras durante el procesamiento
Baño María HistoCore Leica BiosystemsHIS2326Úsalo para flotar las secciones a 40-43 grados; C para eliminar arrugas de las secciones FFPE 
Papel humidificador HybEZACD, Bio-Techne310015Úsalo dentro del horno HybEZ para mantener la humedad y evitar que las secciones de tejido se sequen durante la hibridación
Horno, bandeja y rejilla HybEZACD, Bio-Techne310011, 310012, 310014Se usa para proporcionar temperatura, humedad controladas y una correcta posición del portaobjetos durante los pasos de hibridación e incubación  
Pluma barrera hidrofóbica ImmEdgeLaboratorio de VectoresH-4000Úsalo para dibujar límites hidrofóbicos en las láminas para confinar los reactivos a la sección del tejido durante los procedimientos de tinción.
Cuchillas desechables de perfil bajo DB80LXLeica Biosystems14035843496Úsalo para seccionar bloques FFPE  
Formalina amortiguada en neutro 10%Azer ScientificNBF-4-GÚsalos para arreglar los pañuelos
PAQUETE DE REACTIVOS OPAL 520Akoya Biosciences, Inc.FP1487001KTAmplificar y detectar señales de ARN objetivo mediante marcaje fluorescente.
PAQUETE DE REACTIVOS OPAL 570Akoya Biosciences, Inc.FP1488001KTAmplificar y detectar señales de ARN objetivo mediante marcaje fluorescente.
PAQUETE DE REACTIVOS OPAL 620Akoya Biosciences, Inc.FP1495001KTAmplificar y detectar señales de ARN objetivo mediante marcaje fluorescente.
PAQUETE DE REACTIVOS OPAL 690Akoya Biosciences, Inc.FP1497001KTAmplificar y detectar señales de ARN objetivo mediante marcaje fluorescente.
Paquete de reactivos Opal Polaris 780Akoya Biosciences, Inc.FP1501001KTAmplificar y detectar señales de ARN objetivo mediante marcaje fluorescente.
Prolong DiamondThermo FischerP36970Un medio de montaje antifade para preservar las señales fluorescentes y proteger la señal de ARNscope durante la imagen
RNAscope 4-Plex Kit auxiliar UI específicaACD, Bio-Techne323120Materiales adicionales utilizados con el ensayo Multiplex Fluorescent v2 de RNAscope
RNAscope DAPIACD, Bio-Techne320858Una tinción nuclear fluorescente utilizada en ensayos de ARNscopio para visualizar núcleos celulares
Kit de reactivos fluorescentes multiplex de RNAscope v2ACD, Bio-Techne323100Realizar la hibridación multiplex fluorescente in situ
Búfer TSA multiplex de RNAscopeACD, Bio-Techne322810Un tampón utilizado en ARNscopio para diluir tintes ópalo
Reactivos tampón de lavado de RNAscopoACD, Bio-Techne310091Úsalo para lavar las secciones de tejido en las láminas durante el ensayo
Solución de descontaminación RNasa RNaseZapThermo FischerAM9782Úsalo para limpiar y eliminar RNasa
Microtomo rotatorio semiautomatizadoLeica BiosystemsRM2245Úsalo para seccionar los bloques FFPE según lo indicado en las directrices.
Slide BriteCiencia de la Microscopía Electrónica23401-01Para el paso de deparafinización antes del procesamiento de ARNscopio.
Calentador de corredero con cubiertaEstreno y Estreno;XH2004Uso para incubación de portaobjetos a diferentes temperaturas
Superfrost Plus Slides Fisher Scientific12-550-15 Úsalo para conectar secciones en Vsium HD
Paraplasto SurgipathLeica Biosystems39601006Se utiliza para realizar infiltración tisular e incrustación de tejidos
Cultivo de tejidos DISH 100 X 20 MM 500/CSFisher Scientific877222Uso para recoger y diseccionar muestras en 1&agudo; PBS
XilenoFisher Scientific6.81001E+12Se usa como agente despejador para eliminar el alcohol y hacer los tejidos transparentes

Referencias

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