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Cuantificación de fluoruro en suero, hueso y dientes en un modelo murino mediante difusión facilitada por hexametildisiloxano y mediciones con electrodo selectivo de iones

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DOI:

10.3791/71488

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28 de agosto de 2026

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1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la preparación de placas de difusión facilitada por hexametildisiloxano (HMDS), seguida de mediciones con electrodo selectivo de iones para cuantificar la masa de iones de fluoruro en el suero, hueso y dientes de ratones. El método proporciona un enfoque sensible, basado en calibración, para evaluar la acumulación de fluoruro en muestras biológicas.

Resumen

La cuantificación de los niveles de fluoruro en tejidos biológicos es esencial para comprender la exposición, el metabolismo y la toxicidad del fluoruro. Este protocolo describe un método sensible y reproducible para medir la masa de iones de fluoruro en suero, hueso y dientes, mediante difusión facilitada por hexametildisiloxano (HMDS) seguida de análisis con electrodo selectivo de iones (ISE). Se recolectan especímenes biológicos, incluyendo suero, hueso fémur y incisivos mandibulares, de ratones expuestos a tratamientos controlados de fluoruro. Los especímenes de hueso y diente se calcinan, muelen e hidratan, mientras que el suero se procesa directamente. Cada espécimen se transfiere a un recipiente de difusión que contiene agua ultrapura y se sella con una tapa revestida de vaselina que lleva gotas de hidróxido de sodio que actúan como trampas para el fluoruro. La inyección de ácido sulfúrico saturado con HMDS inicia la liberación y difusión del fluoruro, permitiendo que los iones de fluoruro liberados sean capturados cuantitativamente en las trampas. Tras una difusión nocturna, las gotas de las trampas de fluoruro se combinan en una sola muestra, se acidifican al rango de pH requerido y se ajustan a un volumen definido para la medición mediante ISE. Los recipientes de difusión de calibración, preparados con masas conocidas de fluoruro, generan una curva patrón para la cuantificación, y las muestras de control de calidad verifican la estabilidad del electrodo. Resultados representativos obtenidos de ratones adolescentes y adultos expuestos a 0 o 125 ppm de fluoruro demuestran la capacidad del método para detectar diferencias dependientes de la edad y de la dosis en los niveles de fluoruro en suero, hueso y dientes. Este protocolo proporciona un enfoque robusto, basado en calibración, para cuantificar el fluoruro en diversas matrices biológicas y es especialmente adecuado para estudios que investigan la exposición al fluoruro, la deposición en tejidos y los efectos toxicológicos en modelos murinos. Una ventaja clave de este método es su capacidad para cuantificar con precisión el fluoruro en especímenes extremadamente pequeños, incluyendo los 3–5 mg de ceniza obtenidos de los incisivos individuales de ratón, ya que el proceso de difusión concentra todo el fluoruro liberado en un volumen de muestra medible inferior a 100 µL.

Introducción

El fluoruro es un anión que se produce de forma natural, y el nivel óptimo de fluoruro es eficaz para prevenir las caries dentales1,2,3,4,5. En Estados Unidos (EE. UU.), la fluoruración del agua potable comunitaria a 0,7 ppm se ha implementado como una estrategia de salud pública para reducir la incidencia de caries y promover la salud bucal6. Sin embargo, la ingestión prolongada de cantidades excesivas de fluoruro puede afectar negativamente a múltiples tejidos. Una exposición elevada a fluoruro interrumpe la formación del esmalte7,8,9, altera la formación ósea10 y compromete la integridad esquelética11.

A nivel celular, la exposición al fluoruro induce varias alteraciones metabólicas, incluyendo estrés oxidativo12, estrés del retículo endoplasmático13, modificaciones epigenéticas que alteran la expresión génica14 y apoptosis en ameloblastos15,16,17,18. A nivel mundial, concentraciones elevadas de fluoruro en aguas subterráneas (>1,5 ppm) representan un problema significativo para la salud. Un estudio reciente de modelado predictivo estimó que aproximadamente 180 millones de personas en todo el mundo podrían verse afectadas por una exposición excesiva al fluoruro, con la mayor carga en Asia y África1. Además del agua potable, la exposición al fluoruro también ocurre a través de alimentos (por ejemplo, mariscos; ~1,9 ppm), bebidas (por ejemplo, té; 0,5–6 ppm19) y productos dentales como la pasta de dientes20 (1.000–1.500 ppm).

Por lo tanto, comprender la exposición al fluoruro, su metabolismo y deposición en los tejidos es esencial para evaluar tanto sus beneficios terapéuticos como sus posibles consecuencias toxicológicas. La cuantificación precisa del fluoruro en especímenes biológicos, incluyendo orina, suero, hueso y dientes, es un componente crítico de este trabajo. Sin embargo, la medición es analíticamente desafiante debido al comportamiento químico del fluoruro y su fuerte afinidad por matrices ricas en calcio. Aproximadamente el 99 % del fluoruro del cuerpo se encuentra en tejidos mineralizados como el hueso y los dientes21. Para abordar estos desafíos, se han desarrollado diversas técnicas analíticas, incluyendo potenciometría con electrodo selectivo de iones (ISE), cromatografía iónica, ensayos colorimétricos, procedimientos titrimétricos y métodos nucleares o basados en activación22. Entre ellas, la técnica de difusión facilitada por hexametildisiloxano (HMDS) combinada con la medición mediante electrodo selectivo de fluoruro ha surgido como uno de los enfoques más confiables y ampliamente utilizados para matrices biológicas, debido a su sensibilidad, reproducibilidad y compatibilidad con diversos tipos de muestras23,24,25,26,27,28,29.

A pesar de la disponibilidad de múltiples métodos analíticos, cada enfoque tiene limitaciones que pueden restringir su uso en investigaciones experimentales o clínicas. La cromatografía iónica ofrece alta sensibilidad y selectividad, pero requiere instrumentación especializada y una preparación extensa de las muestras30,31. Los ensayos colorimétricos, como el método SPADNS (sulfonato de sodio 2-(parasulfofenilazo)-1,8-dihidroxinaftaleno-3,6-disulfónico), son sencillos y económicos, pero son susceptibles a interferencias por turbidez y cromóforos endógenos, lo que limita su fiabilidad en muestras biológicas complejas22,32,33. Los métodos titrimétricos son rentables y directos, pero carecen de la sensibilidad necesaria para la detección de fluoruro a niveles traza en la mayoría de los especímenes biológicos34. Las técnicas nucleares o basadas en activación ofrecen una sensibilidad excepcional, pero requieren acceso a reactores o fuentes de neutrones basadas en aceleradores, lo que las hace poco prácticas para uso rutinario en laboratorio35. En contraste, la difusión facilitada por HMDS seguida de medición mediante ISE proporciona un equilibrio práctico entre sensibilidad, costo y accesibilidad, garantizando al mismo tiempo la liberación completa del fluoruro tanto de tejidos blandos como mineralizados. Esto es particularmente ventajoso en estudios con animales pequeños, en los que la disponibilidad de tejido es limitada y estructuras mineralizadas como los incisivos de ratón producen solo 3–5 mg de ceniza por diente.

La capacidad del método de ISE por difusión para concentrar todo el fluoruro liberado en un volumen pequeño y definido permite una cuantificación precisa incluso en muestras extremadamente pequeñas. Esto hace que el método sea especialmente adecuado para estudios toxicocinéticos, experimentos de dosis-respuesta e investigaciones del metabolismo del fluoruro a través de las distintas etapas del desarrollo. Los roedores pequeños, particularmente los ratones C57BL/6J, se han utilizado ampliamente como modelos animales para estudiar los efectos del fluoruro7,9,12,29,36.

En este protocolo, los autores aplican la técnica de difusión facilitada por HMDS seguida de la medición mediante electrodo selectivo de fluoruro para cuantificar el fluoruro en suero, hueso y dientes recolectados de ratones expuestos a una dosis alta de fluoruro (125 ppm) en comparación con controles no tratados. Además, los autores comparan la acumulación de fluoruro en ratones adolescentes (6 semanas al inicio del tratamiento) y maduros (18 semanas al inicio del tratamiento) para evaluar las diferencias dependientes de la edad en el metabolismo del fluoruro y su deposición en los tejidos. Los incisivos mandibulares se seleccionaron como tejido dental representativo porque los incisivos de los roedores erupcionan de forma continua y alcanzan un equilibrio en estado estacionario entre erupción y desgaste oclusal aproximadamente a las 7 semanas de edad. Este patrón de crecimiento continuo proporciona un gradiente constante y accesible de desarrollo del esmalte, lo que convierte a los incisivos de los ratones en un modelo ampliamente utilizado y bien validado para investigar la formación del esmalte y la fluorosis dental.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este protocolo se han realizado de acuerdo con las directrices y regulaciones para el uso de animales vertebrados aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (IACUC) de la Universidad Nova del Sureste (Protocolo N.º 2023.02.MSuz1), que está acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio Internacional (AAALAC). Todo el trabajo con animales cumplió con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y con las Directrices de la Asociación Médica Veterinaria Americana (AVMA) para la eutanasia de animales. Todos los materiales utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Animales y preparación y administración de fluoruro de sodio en un modelo murino

  1. Animales: Asignar ratones macho C57BL/6J a dos categorías de edad: adolescentes, de 6 semanas al inicio del tratamiento, y adultos, de 18 semanas al inicio del tratamiento.
    1. Proporcionar a cada grupo agua desionizada sin flúor (0 ppm F⁻) o agua potable suplementada con fluoruro de sodio (125 ppm F⁻) durante un período de exposición de 6 semanas.
    2. Incluir cinco animales en cada condición de edad y tratamiento (N = 5/grupo).
    3. Al final del período de exposición, recolectar suero, fémures e incisivos mandibulares, y preparar todas las muestras recopiladas para análisis posteriores.
      ​NOTA: Espécimen: material procesado, como hueso calcinado, diente calcinado y suero.
  2. Albergue y dieta de los animales: Mantener a los ratones en condiciones estándar de laboratorio con acceso ad libitum a alimento y agua.
    1. Proporcionar una dieta sin flúor a partir de una semana antes de la recolección de dientes, huesos y suero para minimizar los niveles basales de flúor.
  3. Agua potable con fluoruro de sodio
    1. Para preparar el agua potable suplementada con flúor, disolver fluoruro de sodio (NaF) en agua desionizada para alcanzar la concentración deseada de flúor (por ejemplo, 125 ppm F⁻).
    2. Filtrar la solución a través de un filtro de vacío de 0,2 µm hacia un frasco autoclavado. Preparar una solución fresca cada 2 días.
      ADVERTENCIA: El NaF es tóxico si se ingiere y puede causar irritación cutánea y ocular. Manipular en una campana extractora usando bata de laboratorio, guantes de nitrilo y gafas de seguridad.
  4. Para el agua control sin flúor, filtrar agua desionizada a través de un filtro de vacío de 0,2 µm hacia un frasco autoclavado. Preparar agua fresca cada 2 días.
  5. Proporcionar agua potable con o sin flúor ad libitum durante el tiempo deseado para el tratamiento con flúor. Monitorear los niveles de agua diariamente y reemplazar los frascos cada 2 días.
  6. Al final del período de exposición, sacrificar a los animales mediante inhalación de dióxido de carbono (CO₂) seguida de decapitación. Los procedimientos de eutanasia se realizaron de acuerdo con las Guías de la AVMA para la Eutanasia de Animales y fueron aprobados como parte del protocolo institucional del IACUC.
    ADVERTENCIA: El CO2 es un asfixiante. Realizar los procedimientos en un área bien ventilada y asegurarse de que la cámara funcione correctamente. Evitar la exposición directa por inhalación.

2. Preparación de la muestra para la medición de fluoruro

  1. Recolección de sangre
    1. Sacrificar los ratones por inhalación de CO₂ y recolectar inmediatamente la sangre mediante punción cardíaca terminal utilizando una jeringa tuberculínica de 1 mL. Transferir la sangre a tubos microcentrífugos de 1,5 mL. Desechar todas las agujas y jeringas usadas en un contenedor institucional aprobado para residuos punzantes.
      ADVERTENCIA: Las agujas de las jeringas son afiladas y pueden causar lesiones por punción; manejar con cuidado.
    2. Almacenar la sangre durante 30 min a temperatura ambiente, luego centrifugar durante 10 min a 2.000 × g.
    3. Transferir el sobrenadante (suero) a un tubo microcentrífugo y almacenar a −80 °C.
      ADVERTENCIA: Los congeladores ultra bajos representan un riesgo de congelación. Usar guantes aislantes al manipular los tubos y evitar el contacto prolongado de la piel con superficies frías.
  2. Huesos
    1. Extracción de fémures: Tras la eutanasia, disecar las patas traseras en las articulaciones de la cadera.
    2. Eliminar cuidadosamente todos los tejidos blandos de los fémures. Lavar los tejidos tres veces con agua desionizada. Almacenar los huesos a -80 °C hasta su procesamiento posterior. Desechar los tejidos blandos removidos y cualquier material contaminado en el flujo institucional de residuos biológicos.
      NOTA: Los tejidos pueden fijarse en paraformaldehído al 4 % con sacarosa al 2 % durante 12–16 h para almacenamiento prolongado en etanol al 70 %. Este procedimiento de fijación no altera la precisión de la cuantificación subsiguiente de fluoruro.
    3. Lavar los huesos completamente con agua desionizada. Secar el exceso de humedad con una toalla de papel libre de pelusas.
    4. Transferir los huesos a tubos microcentrífugos de 1,5 mL con las tapas abiertas para permitir la evaporación y colocarlos en una estufa de secado a 60 °C durante 12–16 h.
      ADVERTENCIA: La estufa de secado puede causar quemaduras. Utilizar guantes resistentes al calor al manipular las muestras.
    5. Incineración de huesos: Transferir los huesos secos a crisoles de alúmina. Colocar los crisoles en un horno mufla y calentar hasta 600 °C a una velocidad de 150 °C/h, luego mantener durante 6 h. Dejar que el horno se enfríe por debajo de 200 °C antes de retirar los crisoles. Desechar cualquier fragmento residual de hueso o consumibles contaminados en el flujo institucional de residuos biológicos.
      ADVERTENCIA: El horno mufla y los crisoles alcanzan temperaturas extremas, lo que representa un riesgo grave de quemaduras. Permitir siempre que el horno se enfríe antes de manipular los crisoles. Al retirar los crisoles, usar bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes resistentes al calor, y utilizar pinzas largas para evitar el contacto directo con superficies calientes.
      PASO CRÍTICO: Una incineración incompleta comprometerá los análisis posteriores. Verificar que el material óseo haya alcanzado un estado completamente oxidado antes de continuar; cualquier carbono residual interferirá con las mediciones subsiguientes.
      ​NOTA: El hueso correctamente incinerado debe presentar un color gris claro uniforme a blanco. Partículas más oscuras, especialmente residuos negros o similares al carbón, indican una combustión incompleta. Si hay decoloración, prolongar la duración de la incineración para permitir la eliminación completa del material orgánico.
    6. Almacenamiento de huesos incinerados: Inmediatamente después de la incineración, transferir los huesos a tubos microcentrífugos de 1,5 mL. Sellar los tubos con Parafilm y almacenarlos en un desecador al vacío hasta su uso.
  3. Dientes
    1. Extracción de incisivos mandibulares: Realizar un corte horizontal a nivel de la articulación temporomandibular para separar la mandíbula del maxilar.
    2. Realizar cortes medio-sagitales para dividir tanto el maxilar como la mandíbula en mitades izquierda y derecha.
    3. Lavar los tejidos tres veces con agua desionizada y extraer cuidadosamente los incisivos mandibulares. Almacenar los incisivos extraídos a -80 °C hasta su uso posterior. Desechar los tejidos blandos extraídos y cualquier material contaminado en el flujo institucional de residuos biológicos.
      ADVERTENCIA: Utilizar instrumentos de disección afilados con cuidado al realizar cortes en la articulación temporomandibular y en el plano medio-sagital para evitar lesiones personales. Usar EPP adecuado, incluyendo guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad.
      NOTA: Los tejidos pueden fijarse en paraformaldehído al 4 % con sacarosa al 2 % durante 12–16 h para almacenamiento prolongado en etanol al 70 %. Este procedimiento de fijación no altera la precisión de la cuantificación subsiguiente de fluoruro.
    4. Preparación de dientes para incineración: Lavar los dientes completamente con agua desionizada y colocarlos en peróxido de hidrógeno (H₂O₂) al 1 % durante 12–16 h. Desechar las soluciones usadas de peróxido de hidrógeno como residuo químico peligroso.
    5. Lavar nuevamente con agua desionizada, secar brevemente con un tejido libre de pelusas y transferir a tubos microcentrífugos de 1,5 mL con las tapas abiertas. Colocar los tubos en una estufa de secado a 60 °C durante 12–16 h.
      ADVERTENCIA: El peróxido de hidrógeno es un agente oxidante y puede causar irritación en la piel y los ojos. Manipular en una campana extractora usando bata de laboratorio, guantes de nitrilo y gafas de seguridad. Evitar el contacto con materiales combustibles.
    6. Incineración de dientes: Transferir los dientes secos a crisoles de alúmina e incinerar en un horno mufla a una temperatura de permanencia de 600 °C durante 20 h, utilizando una velocidad de rampa de 150 °C/h.
    7. Retirar los crisoles solo después de que el horno haya enfriado por debajo de 200 °C.
      ADVERTENCIA: El horno mufla y los crisoles alcanzan temperaturas extremas, lo que representa un riesgo grave de quemaduras. Permitir que el horno se enfríe por debajo de 200 °C antes de manipular los crisoles. Al retirar los crisoles, usar bata de laboratorio, gafas de seguridad y guantes resistentes al calor, y utilizar pinzas largas para evitar el contacto directo con superficies calientes.
      PASO CRÍTICO: Asegurar la oxidación completa; el carbono residual interferirá con los análisis subsiguientes.
      NOTA: El material dental incinerado debe presentar un color gris claro uniforme a blanco. Volver a incinerar si persisten residuos negros.
    8. Almacenamiento de la muestra de dientes incinerados: Inmediatamente después de la incineración, transferir los dientes a tubos microcentrífugos redondos de 2 mL.
    9. Sellar los tubos con Parafilm y almacenarlos en un desecador al vacío hasta su uso.

3. Preparación de placas de difusión facilitada por HMDS

  1. Reactivos y material
    1. Ácido sulfúrico 6 N: Al menos dos días antes de preparar los platos de difusión, prepare un stock de ácido sulfúrico 6 N.
      NOTA: Plato de difusión: Un recipiente sellado diseñado para crear un entorno cerrado controlado en el cual los componentes liberados de un material biológico procesado pueden ser capturados por una trampa química fijada a la tapa. El diseño sellado evita el intercambio con el aire exterior y asegura que los analitos liberados se dirijan hacia la trampa para su posterior medición.
    2. Coloque un vaso de precipitados de 1 L de plástico con una barra magnética sobre un agitador magnético y añada 416 mL de agua ultrapura.
    3. Utilizando una pipeta serológica de 50 mL, añada lentamente 84 mL de H₂SO₄ 36 N al agua mientras agita continuamente. La solución se calentará; déjela enfriar a temperatura ambiente. Deseche cualquier solución de ácido sulfúrico no utilizada o gastada como residuo químico peligroso en el sistema institucional de desechos químicos.
      ADVERTENCIA: El ácido sulfúrico es altamente corrosivo. Manipúlelo en una campana extractora usando guantes resistentes a ácidos, bata de laboratorio y gafas de seguridad. En caso de contacto, enjuague inmediatamente con abundante agua.
    4. Ácido sulfúrico 6 N saturado con HMDS: Transfiera el ácido sulfúrico 6 N a un embudo de separación de 2 L y añada 15 mL de hexametildisiloxano (HMDS).
    5. Asegúrese de que el tapón y la llave estén firmemente cerrados, sostenga el embudo de separación de lado y agite vigorosamente hasta que se observen pequeñas gotas de HMDS.
    6. Abra el tapón para liberar el gas generado y repita el proceso dos veces más.
    7. Deje el tapón ligeramente abierto durante varias horas. Almacene el embudo de separación que contiene el ácido sulfúrico 6 N saturado con HMDS en un soporte dentro de la campana extractora. Deseche el ácido sulfúrico que contiene HMDS y los materiales contaminados como residuo químico peligroso.
      ADVERTENCIA: El HMDS es inflamable y tóxico por inhalación. Manipúlelo en una campana extractora usando bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad. Manténgalo alejado de fuentes de ignición.
    8. Hidróxido de sodio 0,05 N: Disuelva 1 g de pastillas de NaOH en 25 mL de agua ultrapura para preparar una solución stock 1 N.
    9. Mezcle 2 mL de la solución stock de NaOH 1 N con 38 mL de agua ultrapura para obtener una solución de NaOH 0,05 N.
    10. Aliquote el NaOH 0,05 N en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para uso individual, asegure las tapas con Parafilm y almacene los tubos en un desecador al vacío para minimizar la absorción de CO₂. Deseche las soluciones de hidróxido de sodio no utilizadas o gastadas como residuo químico peligroso.
      ADVERTENCIA: El hidróxido de sodio es altamente cáustico y puede causar quemaduras severas. Use bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad. Manipule las soluciones con cuidado para evitar salpicaduras.
    11. Ácido acético 0,2 N: Añada 575 µL de ácido acético glacial a agua ultrapura y ajuste a un volumen final de 50 mL para preparar ácido acético 0,2 N. Deseche las soluciones de ácido acético como residuo químico peligroso.
      ADVERTENCIA: El ácido acético es corrosivo y puede irritar la piel, los ojos y el tracto respiratorio. Manipúlelo en una campana extractora química usando bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad.
    12. Petrolato: Derrita aproximadamente 100 g de petrolato a 60 °C en un horno. Aspire el petrolato líquido a jeringas de 10 mL y déjelo enfriar y solidificar. Las jeringas llenas de petrolato pueden almacenarse a temperatura ambiente durante varias semanas.
    13. Placa de Petri: Use placas de Petri no tratadas de 60 × 15 mm para preparar los platos de difusión.
    14. Haga un pequeño orificio en la tapa de una placa de Petri usando una aguja de jeringa calentada de 18 G.
    15. Recubra el borde interno de la tapa con un sello continuo de petrolato usando una jeringa de 10 mL equipada con una aguja roma de 14 G. Deseche todas las agujas usadas en un contenedor institucional aprobado para residuos punzantes.
      ADVERTENCIA: Las agujas de jeringa son afiladas y pueden causar lesiones por punción. Manipúlelas con cuidado y desecharlas en contenedores para residuos punzantes aprobados. Al calentar agujas, use guantes resistentes al calor y protección ocular para prevenir quemaduras.
    16. Soluciones stock de NaF para platos de difusión de calibración. Disuelva 4,19 g de NaF en 1 L de agua ultrapura para preparar una solución stock de 100 mM. Prepare soluciones stock de 10 mM, 100 µM y 10 µM mediante diluciones sucesivas 1:10 de la solución de 100 mM.
      NOTA: Un mol de NaF proporciona 19 g de F⁻; por lo tanto, 1 µL de NaF 10 µM contiene 0,19 ng de F⁻ y 1 µL de NaF 10 mM contiene 190 ng de F⁻.
      ​NOTA: Platos de difusión de calibración: Platos de difusión utilizados específicamente para calibración con una masa conocida de iones fluoruro (F¯).
  2. Preparaciones específicas de platos de difusión según la muestra
    1. Plato de difusión de suero: Pipetee 3 mL de agua ultrapura en el fondo de la placa de Petri y añada 75 µL de suero. Descarte cualquier material contaminado con suero en el flujo institucional de residuos biológicos. Continúe con el paso 3.4.
    2. Plato de difusión de hueso
      1. Pulverización de cenizas óseas: Use una espátula micro para moler los huesos calcinados dentro de los tubos de microcentrífuga de 1,5 mL hasta obtener un polvo fino. Proceda inmediatamente con el procesamiento de las cenizas óseas pulverizadas. Deseche los consumibles contaminados con cenizas óseas en el flujo institucional de residuos químicos.
      2. Pesado e hidratación de cenizas óseas
        1. Coloque la parte inferior vacía de la placa de Petri sobre el platillo de una balanza analítica con una precisión de al menos 0,1 mg.
        2. Transfiera las cenizas óseas molidas desde el tubo de microcentrífuga de 2 mL a un pequeño recipiente de porcelana para minimizar la carga estática y prevenir la dispersión del polvo.
        3. Usando una espátula micro, añada aproximadamente 5 mg de cenizas óseas al recipiente y cúbralo inmediatamente con 3 mL de agua ultrapura antes de retirar el recipiente de la balanza analítica para evitar la dispersión de las cenizas.
        4. Registre el peso exacto de cada muestra de cenizas óseas. Continúe con el paso 3.4.
    3. Plato de difusión de diente
      1. Molienda de dientes calcinados
        1. Transfiera los incisivos calcinados a tubos de microcentrífuga redondos de 2 mL y añada una bola de acero inoxidable de 5 mm de diámetro a cada tubo. Cierre los tubos y asegure las tapas con Parafilm.
        2. Pulverice los incisivos calcinados en un molinillo de bolas a 2.500 rpm durante 10 s. Proceda inmediatamente con el procesamiento de los dientes molidos.
      2. Pesado e hidratación de dientes calcinados
        1. Vierta todo el contenido del tubo, incluyendo la bola de acero inoxidable, en el fondo del plato de difusión colocado sobre el platillo de una balanza analítica. Deseche los consumibles contaminados que contengan cenizas dentales en el flujo institucional de residuos químicos.
        2. Retire la bola de acero inoxidable del plato y registre el peso exacto de las cenizas dentales (típicamente 3–4 mg por incisivo mandibular).
        3. Añada inmediatamente 3 mL de agua ultrapura para cubrir las cenizas dentales antes de retirar el plato de la balanza, para prevenir la dispersión de cenizas causada por descarga estática. Continúe con el paso 3.4.
  3. Platos de difusión de calibración y control de calidad
    1. En paralelo con los platos de difusión de muestra, prepare dos series de platos de difusión de calibración para una calibración de 5–6 puntos y una serie idéntica de platos de difusión de control de calidad, incluyendo un blanco.
      NOTA: Platos de difusión de control de calidad: Preparados de forma idéntica a los platos de difusión de calibración, pero utilizados periódicamente para verificar la estabilidad del electrodo y asegurar un rendimiento consistente de las mediciones.
    2. Pipetee 3 mL de agua ultrapura en cada uno de 11 o 13 platos de Petri y añada el stock de NaF para cubrir el rango esperado de masa de F¯ en las muestras. Continúe con el paso 3.4. para completar el ensamblaje del plato de difusión37.
  4. Finalización del ensamblaje del plato de difusión
    1. Para construir un depósito de trampa de fluoruro, añada 50 µL de NaOH 0,05 N en tres gotas sobre la superficie interna de la tapa de la placa de Petri, bien alejado del borde de la tapa.
      NOTA: Trampa de fluoruro (F¯ Trampa): Un componente de los platos de difusión que atrapa F¯, específicamente hidróxido de sodio (NaOH).
    2. Invierta la tapa sin perturbar las gotas de NaOH y séllela firmemente al fondo del plato con el petrolato.
    3. Para preparar una solución de ácido sulfúrico 3 N saturado con HMDS, mezcle volúmenes iguales de ácido sulfúrico 6 N saturado con HMDS y agua ultrapura. Prepárelo fresco inmediatamente antes de usar, ya que no puede almacenarse.
    4. Introduzca 3 mL de la solución preparada de ácido sulfúrico 3 N saturado con HMDS a través del orificio en la tapa, dentro del agua en el fondo del plato de difusión, usando una jeringa de 10 mL equipada con una aguja de 20 G. Tenga cuidado de no salpicar ácido sobre la superficie interna de la tapa al insertar o retirar la aguja de la jeringa.
    5. Difusión de fluoruro facilitada por HMDS: Selle inmediatamente el orificio de inyección con una gota de petrolato que cubra completamente la abertura y coloque los platos de difusión sobre un agitador variable ajustado a baja velocidad. Incube durante la noche a temperatura ambiente (Figura 1).

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Figura 1: Esquema de un recipiente de difusión óseo para la extracción y captura de fluoruro. La figura 1 ilustra el diseño de un recipiente de difusión óseo montado en una placa de Petri de 60 × 15 mm sin tratar. La tapa contiene un pequeño orificio de inyección sellado con una gota de vaselina. En la superficie interna de la tapa, se colocan tres gotas de NaOH como trampas para iones fluoruro (F⁻), suspendidas de la tapa durante la difusión. La tapa se sella herméticamente a la base del recipiente mediante vaselina. El fondo de la placa de Petri contiene agua ultrapura, ácido sulfúrico saturado con hexametildisiloxano (HMDS) y ceniza ósea, que juntos forman el entorno de reacción para la liberación de fluoruro y su posterior captura. Esta figura fue creada por los autores utilizando Biorender y está licenciada bajo la licencia CC BY. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Medición de fluoruro con un ISE

  1. Configuración del ISE
    1. Llene el electrodo selectivo de flúor de doble canal con la solución de relleno adecuada, conéctelo al potenciómetro y sujete el electrodo en un soporte para electrodo.
    2. Coloque una placa de Petri sin tratar sobre un elevador de tijera debajo de la superficie sensora del electrodo, asegurándose de que la superficie sensora esté paralela al fondo de la placa de Petri, y eleve la mesa del elevador de tijera hasta que la placa de Petri esté casi tocando el electrodo (Figura 2).
  2. Preparación de las muestras para la medición
    NOTA: Muestras: En el protocolo, solo los productos finales medidos con un electrodo selectivo de iones (ISE), consistentes en la trampa de F¯ después de la difusión, que posteriormente se combinó con ácido acético y agua, se denominan muestras. 
    1. Para ajustar el pH de la muestra a 5, retire el recipiente de difusión del agitador y levante cuidadosamente la tapa rompiendo el sello de vaselina tras el período de incubación. Invierta la tapa sobre una superficie plana, asegurándose de que las tres gotas de la trampa de F¯ permanezcan inalteradas.
    2. Agregue 15–20 µL de ácido acético 0.2 N a una gota con una pipeta P20, luego combine las tres gotas en una sola gota sin cambiar la punta de la pipeta.
      NOTA: Las muestras con altas concentraciones de F¯ tienden a tener un pH inicial más bajo y, por lo tanto, requieren menos ácido acético 0.2 N para ajustar el pH a 5 en comparación con muestras que contienen menos F¯. Dado que el volumen restante de la muestra después de registrar el potencial del electrodo (paso 5.3) es mínimo, utilice cualquier muestra residual disponible para verificar el pH con papel indicador.
    3. Para ajustar el volumen de la muestra, configure una pipeta P100 a 75 µL, aspire todo el volumen de la trampa de F¯ sin introducir aire y ajuste la muestra exactamente a 75 µL utilizando agua ultra pura.
    4. Realice este paso con cuidado para garantizar un volumen preciso para los cálculos de concentración de fluoruro. Mantenga la muestra en la punta de la pipeta y continúe inmediatamente al paso 4.3.
  3. Medición de las muestras de espécimen, calibración y control de calidad
    1. Para medir el potencial del electrodo de la muestra, dispense esta entre la superficie sensora del electrodo selectivo de flúor y la placa de Petri. Asegúrese de que toda la superficie sensora del electrodo esté completamente sumergida en líquido, sin contacto directo con la placa de Petri. Permita que el potenciómetro se estabilice y registre el potencial (mV) mostrado por el ISE.
    2. Determine la curva estándar de calibración midiendo el primer conjunto de estándares de calibración secuencialmente, comenzando con la concentración más baja de F¯ y avanzando hacia la más alta.
      1. Trace el potencial del electrodo (mV) frente al logaritmo de F¯ (ng) para construir la curva de calibración (Figura 3). Aplique regresión exponencial para obtener la ecuación de la curva estándar y el coeficiente de determinación (R2). Acepte curvas de calibración solo cuando R2 sea ≥ 0.99.
    3. Mida cada muestra de espécimen y registre el potencial del electrodo (mV).
    4. Para monitorear la estabilidad del electrodo y detectar posibles desviaciones del ensayo, mida muestras de control de calidad intermitentemente durante cada corrida analítica.
      1. Compare directamente los valores de las muestras de control de calidad con las muestras de calibración correspondientes y confirme la concordancia dentro de aproximadamente un 5 % para verificar el rendimiento estable del electrodo a lo largo del tiempo.
      2. Mida periódicamente un recipiente de difusión en blanco para confirmar la ausencia de contaminación por fluoruro durante el manejo y la difusión de las muestras.
  4. Para calcular la masa de F¯ (ng) en cada muestra de espécimen, utilice la ecuación de la curva estándar. Luego divida esta masa por el volumen (µL) de suero, o por la masa (mg) de ceniza ósea o dental añadida al recipiente de difusión.
    1. Ejemplo de cálculo de la concentración de F¯ en ceniza ósea (ng/mg)
      1. Masa de ceniza ósea añadida al recipiente de difusión: 5.1 mg; Potencial del electrodo de la muestra de 75 µL: –31.6 mV
      2. Paso 1: Calcular la masa de fluoruro utilizando la ecuación de calibración
        1. Masa de F⁻ (ng) = 3505.4 x e(-0.043x-31.6)
        2. Masa de F⁻ (ng) = 13,641 ng
      3. Paso 2: Calcular la concentración de fluoruro en la ceniza ósea
        1. Concentración de F⁻ =  13,641 ng  /  5.1  mg
        2. Concentración de F⁻ =  2,675 ng / mg (ppm)

figure-protocol-2
Figura 2: Esquema del montaje para la medición con electrodos selectivos de iones. La figura 2 ilustra la configuración utilizada para las mediciones de iones fluoruro con un electrodo selectivo de iones (ISE) de doble canal. Un recipiente de Petri se coloca sobre un soporte ajustable para permitir un ajuste preciso de su altura con respecto al electrodo. El ISE está conectado a un potenciómetro y orientado de manera que su superficie sensora sea paralela al plano del recipiente de Petri, manteniendo una distancia de aproximadamente 1–2 mm. Una vez establecido el espaciado, se pipetea un pequeño volumen de muestra (75 µL) en el espacio entre la superficie sensora y el recipiente de Petri, asegurando que la muestra cubra completamente el área sensora del electrodo durante la medición. Esta figura fue creada por los autores utilizando Biorender y está licenciada bajo la licencia CC BY. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-3
Figura 3: Curva de calibración y tabla de calibración correspondiente para la cuantificación de la masa de ion fluoruro en muestras de especímenes dentales. Panel superior: Ejemplo de curva de calibración utilizada para determinar la masa de ion fluoruro en muestras de especímenes dentales. El eje x muestra el potencial del electrodo (mV, escala lineal), y el eje y muestra la masa correspondiente de ion fluoruro (ng F⁻, escala logarítmica). Los puntos de calibración medidos se representan mediante una línea continua, y la regresión exponencial ajustada se muestra como una línea punteada. Un recuadro insertado muestra la ecuación de la curva patrón y el coeficiente de determinación (R2 = 0,99). Panel inferior: Tabla que contiene los valores numéricos utilizados para generar la curva de calibración. La primera fila enumera los cinco potenciales del electrodo (mV) registrados para las muestras de calibración. La segunda fila proporciona las masas correspondientes de ion fluoruro (ng F⁻) para cada muestra de calibración. La tercera fila enumera los volúmenes (µL) de la solución stock de NaF 10 mM añadidos a los recipientes de difusión de calibración; esta masa de ion fluoruro añadida equivale a la masa atrapada en cada muestra de calibración tras la difusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Para demostrar la aplicación de este protocolo para medir las concentraciones de fluoruro (F-) en materiales biológicos, se generaron muestras de especímenes a partir de suero, hueso y incisivos mandibulares obtenidos de ratones expuestos a tratamientos controlados de fluoruro. Se asignó a ratones macho C57BL/6J a dos categorías de edad, adolescentes (6 semanas) y adultos (18 semanas), y se les proporcionó agua desionizada sin fluoruro (0 ppm F⁻) o agua de bebida suplementada con fluoruro de sodio (125 ppm F⁻) durante un período de exposición de 6 semanas. Cada grupo de edad y condición de tratamiento incluyó cinco animales. Al final del período de exposición, se recolectaron suero, fémures e incisivos mandibulares, y las muestras de los especímenes se prepararon y analizaron según el protocolo. A continuación se resumen las concentraciones representativas de fluoruro medidas en suero, hueso y dientes.

figure-results-1
Figura 4: Concentraciones de fluoruro medidas en suero, hueso femoral y incisivos mandibulares. Se asignaron ratones macho C57BL/6J a dos categorías de edad, adolescentes (6 semanas, barra abierta) y adultos (18 semanas, barra rellena), y se les proporcionó agua desionizada sin fluoruro (0 ppm F⁻) o agua de bebida suplementada con fluoruro de sodio (125 ppm F⁻) durante un período de exposición de 6 semanas. Al final del período de exposición, se midieron los niveles de fluoruro en (A) suero, (B) hueso femoral y (C) incisivos mandibulares de los mismos grupos de tratamiento. Los valores en suero por debajo del límite de detección (<0,02 ppm) se representaron para visualización, pero se excluyeron del análisis estadístico. Los datos se expresan como medias ± DE. Las comparaciones entre los grupos adolescentes y adultos se realizaron mediante una prueba U de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni-Dunn para comparaciones múltiples. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/grupo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Concentraciones de flúor en suero
En ambos grupos, el de adolescentes y el de adultos tratados con 0 ppm de flúor, las concentraciones séricas de flúor estuvieron por debajo del límite de detección del electrodo selectivo de iones (<0,02 ppm). En los grupos tratados con 125 ppm, el flúor sérico aumentó a 0,3 ± 0,2 ppm en el grupo de adolescentes y a 0,7 ± 0,2 ppm en el grupo de adultos (p = 0,06). La comparación entre los grupos de adolescentes y adultos tratados con 125 ppm se realizó mediante una prueba U de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni-Dunn para comparaciones múltiples. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/grupo). Los grupos tratados con 0 ppm fueron excluidos del análisis estadístico. (Figura 4A, Tabla 1).

Concentraciones de flúor en el hueso femoral
En los grupos tratados con 0 ppm, las concentraciones de flúor en el fémur fueron significativamente más bajas en los adolescentes (292 ± 39 ppm) en comparación con los animales maduros (896 ± 55 ppm) (p < 0,01). En contraste, en los grupos tratados con 125 ppm, las concentraciones de flúor en los adolescentes (4.108 ± 482 ppm) fueron significativamente más altas que en los animales maduros (2.966 ± 612 ppm) (p = 0,04). Las comparaciones entre los grupos adolescentes y maduros se realizaron mediante una prueba U de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni-Dunn para comparaciones múltiples. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/grupo). (Figura 4B, Tabla 1). Figura 5A muestra el cambio en el número de veces (fold-change) de la concentración de flúor en el fémur entre los tratamientos de 0 ppm y 125 ppm para cada grupo de edad. Los adolescentes presentaron un aumento de 14 veces en los niveles de flúor a 125 ppm, mientras que los ratones maduros mostraron un aumento de 3 veces.

Concentraciones de flúor en incisivos mandibulares
En los grupos con 0 ppm, las concentraciones de flúor en los incisivos mandibulares fueron significativamente más bajas en los adolescentes (35 ± 4 ppm) en comparación con los animales adultos (123 ± 23 ppm) (p = 0,03). En los grupos tratados con 125 ppm, las concentraciones de flúor en los incisivos aumentaron hasta 5641 ± 955 ppm en los adolescentes y 4392 ± 1694 ppm en los animales adultos. Las comparaciones entre los grupos adolescentes y adultos se realizaron mediante una prueba U de Mann-Whitney con corrección de Bonferroni-Dunn para comparaciones múltiples. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/grupo). (Figura 4C, Tabla 1). Aunque las concentraciones absolutas de flúor a 125 ppm no difirieron significativamente entre los grupos de edad, el cambio relativo desde 0 ppm hasta 125 ppm fue significativamente mayor en los ratones adolescentes (incremento de 161 veces) que en los adultos (incremento de 36 veces) (Figura 5B).

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Figura 5: Los adolescentes presentan un mayor incremento en el acumulo de flúor en el hueso y los incisivos en comparación con los ratones adultos. Cambio en el incremento de las concentraciones de flúor desde 0 ppm hasta 125 ppm en el tratamiento con flúor en ratones adolescentes (barra abierta) y adultos (barra rellena). (A) Hueso femoral y (B) Incisivo mandibular de los mismos grupos de tratamiento. Los datos se expresan como medias ± DE. Las comparaciones entre los grupos adolescentes y adultos se realizaron mediante una prueba t no apareada. * p < 0,05, (N = 5/grupo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

MuestraSueroFémurIncisivo Mandibular
Grupo de EdadAdolescenteMaduroAdolescenteMaduroAdolescenteMaduro
Grupo de Tratamiento0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192N/A72711114909
Promedio< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
DENA0.2NA0.239482556123955231694

Tabla 1: Mediciones individuales de fluoruro en suero, hueso femoral y incisivos mandibulares. La Tabla 1 muestra las concentraciones individuales de fluoruro (ppm F⁻) medidas en muestras de suero, hueso femoral e incisivos mandibulares de ratones adolescentes y adultos expuestos a 0 ppm o 125 ppm de fluoruro. Para cada tipo de tejido, los datos se presentan en columnas correspondientes a los cuatro grupos de tratamiento: adolescentes con 0 ppm, adolescentes con 125 ppm, adultos con 0 ppm y adultos con 125 ppm. Cada columna incluye los cinco valores individuales registrados (N = 5), seguidos por la media calculada y la desviación estándar (DE). En el grupo de suero de adolescentes con 0 ppm, todos los valores registrados estuvieron por debajo del límite de detección del electrodo selectivo de iones (<0.02 ppm). La tabla proporciona los datos numéricos brutos que sustentan los valores resumidos y las comparaciones estadísticas mostradas en Figura 4.

Discusión

Las mediciones de fluoruro se realizaron utilizando un electrodo selectivo de iones (ISE) específico para fluoruro, que incorpora fluoruro de lantano (LaF₃) como material sensible al ion.₃membrana cristalina38,39. Esta membrana forma enlaces La–F altamente estables, lo que resulta en una fuerte preferencia por iones fluoruro frente a otros haluros. De acuerdo con la literatura electroquímica establecida y las especificaciones del fabricante, el LaF₃ la membrana presenta coeficientes de selectividad muy bajos para el cloruro, lo que indica que los iones cloruro no producen una interferencia medible bajo las condiciones utilizadas en este protocolo. Aunque el cloruro está naturalmente presente en los dientes y los huesos, su actividad no influye en el potencial del electrodo, y la señal registrada refleja específicamente la actividad del fluoruro. El límite inferior de detección de 0,02 ppm corresponde a la concentración mínima cuantificable validada por el fabricante para el electrodo selectivo de fluoruro Orion. Este límite refleja la concentración más baja de fluoruro a la cual el electrodo mantiene una respuesta estable de tipo nernstiana y una relación lineal con la curva de calibración. Dado que el límite de detección está definido por las características de la membrana del electrodo y ha sido validado por el fabricante, no se requirió ninguna determinación experimental adicional para este protocolo; sin embargo, en cuanto al rango superior de detección, los autores observaron que masas de fluoruro superiores a aproximadamente 38.000 ng en un 50 µL La trampa de NaOH provocó una respuesta no lineal del electrodo, lo que indica que la curva de calibración ya no es confiable a cargas muy altas de fluoruro. Esta no linealidad probablemente se deba a que se ha superado el rango óptimo de fuerza iónica y actividad para el electrodo bajo las condiciones experimentales dadas, y no a un límite superior inherente al ISE en sí. Para muestras que se espera contengan masas de fluoruro por encima de este umbral, es recomendable aumentar el volumen de la trampa de NaOH para mantener las mediciones dentro del rango dinámico lineal del electrodo.

Esta consideración debe tenerse en cuenta al aplicar el protocolo a muestras con un contenido inusualmente alto de fluoruro. Dado que el paso de difusión consume todo el volumen de la muestra, no fue posible realizar mediciones por duplicado ni experimentos de recuperación con adición de analito en las muestras biológicas. Para garantizar la exactitud y precisión analítica, se incluyeron en cada serie de mediciones estándares de control de calidad (QC) con concentraciones conocidas de fluoruro. Estos estándares QC se procesaron y midieron de manera idéntica a las muestras experimentales. En todos los ensayos, las concentraciones medidas de fluoruro en los estándares QC estuvieron constantemente dentro del 5 % de sus valores esperados. Para cada serie de 10 a 20 muestras de especímenes, se prepararon paralelamente dos conjuntos independientes de 5 a 6 muestras de calibración, y se registró una curva de calibración antes de cada sesión de medición. El rango de calibración se ajustó en cada ensayo para aproximar las masas esperadas de fluoruro en las muestras de especímenes, lo cual dependía del tipo de espécimen, la masa de material añadido al recipiente de difusión y del grupo de tratamiento y la edad del animal. Para las mediciones de suero, los estándares de calibración correspondieron a concentraciones de fluoruro de aproximadamente 0,06 a 1,20 ppm en la muestra. Para las mediciones de hueso y diente, los estándares de calibración correspondieron a concentraciones de fluoruro de aproximadamente 19 a 7 600 ppm en la muestra.

Este protocolo proporciona un enfoque sensible y reproducible para cuantificar la masa de iones de fluoruro en suero, hueso y dientes mediante difusión facilitada por hexametildisiloxano seguida de análisis por electrodo selectivo de iones. El método captura de manera confiable el fluoruro liberado a partir de diversas matrices biológicas y permite la evaluación cuantitativa de la acumulación de fluoruro tras exposiciones controladas. Resultados representativos obtenidos en ratones adolescentes y adultos muestran diferencias claras dependientes de la edad y de la dosis en la deposición de fluoruro en los tejidos, destacando la utilidad de este enfoque para estudiar el metabolismo y la toxicocinética del fluoruro in vivo.

Una ventaja clave de este protocolo es el uso de placas de difusión que separan físicamente la reacción de liberación de fluoruro del entorno de captura de fluoruro. El diseño sellado con petrolato minimiza el intercambio con la atmósfera y garantiza una captura eficiente de los iones de fluoruro liberados mediante gotas de hidróxido de sodio en la tapa. El ácido sulfúrico saturado con HMDS proporciona una fuerza impulsora fuerte y constante para la liberación de fluoruro a partir de tejidos mineralizados, incluyendo estructuras altamente calcificadas como huesos y dientes. La medición posterior mediante ISE, calibrada con estándares emparejados por difusión, permite una cuantificación precisa en un amplio rango dinámico. Otra ventaja de este enfoque es su capacidad para cuantificar fluoruro en muestras biológicas extremadamente pequeñas. Los tejidos mineralizados de ratones, particularmente los incisivos mandibulares, producen solo de 3 a 5 mg de ceniza por diente. Los métodos analíticos convencionales a menudo requieren masas de muestra más grandes o un contenido más alto de fluoruro para lograr una detección confiable. En contraste, el diseño basado en difusión concentra todo el fluoruro liberado a partir del espécimen completo en un volumen pequeño y definido, lo que permite una cuantificación precisa incluso en muestras diminutas con baja masa absoluta de fluoruro. Esta característica es particularmente valiosa para estudios que involucran animales pequeños, disponibilidad limitada de tejido o estructuras mineralizadas microdisectadas.

Una limitación principal de este método es el límite de detección del electrodo selectivo de iones (ISE) utilizado en este estudio (0,02 ppm). Las muestras de suero de animales control sin flúor frecuentemente estuvieron por debajo de este umbral, lo que impidió la cuantificación de concentraciones extremadamente bajas de flúor. Puede ser necesario utilizar una masa o volumen mayor de muestra agregada al recipiente de difusión, si está disponible, o emplear técnicas analíticas alternativas al medir concentraciones traza cercanas o por debajo del límite de detección. Además, el método requiere difusión durante la noche y un manejo cuidadoso de reactivos corrosivos, lo que podría limitar el rendimiento en estudios de alto volumen. Aunque el ISE permite una cuantificación sensible del flúor total, no puede evaluar la distribución espacial dentro de los tejidos. Se pueden incorporar enfoques complementarios, como microscopía electrónica de barrido acoplada a espectroscopía de rayos X por dispersión de energía (SEM-EDX) o emisión de rayos gamma inducida por partículas (PIGE), para visualizar y mapear la distribución de flúor a escala microscópica y macroscópica. Estas modalidades basadas en imágenes permiten evaluar la acumulación localizada de flúor en tejidos mineralizados o blandos, complementando así las mediciones mediante ISE y proporcionando una evaluación más completa del contenido de flúor en los tejidos.

Varios factores técnicos recurrentes pueden influir en la precisión y confiabilidad de la difusión y medición de fluoruro en este protocolo, y nuestras observaciones destacan cómo la preparación de la calibración, el sellado de los recipientes de difusión, el control de pH, el rendimiento del electrodo y el manejo de las muestras moldean colectivamente la calidad de los datos. Las causas posibles de una curva de calibración no lineal (R2 < 0,99) o lecturas de muestras tisulares fuera del rango esperado incluyen errores en el cálculo del volumen de la solución stock de NaF añadido al recipiente de difusión o errores de pipeteo durante la preparación de los patrones de calibración. Acción recomendada: preparar al menos dos conjuntos independientes de muestras de calibración para cada ensayo, de modo que haya un conjunto de respaldo disponible si una curva de calibración cae fuera del rango esperado. Un sellado incompleto del recipiente de difusión también puede provocar pérdida de fluoruro durante la difusión, lo que resulta en lecturas artificialmente bajas. Esto ocurre típicamente cuando se aplica una cantidad insuficiente de petrolato al borde de la tapa del recipiente de difusión. Acción recomendada: aplicar una cantidad generosa de gel de petrolato alrededor del borde de la tapa del recipiente de difusión y presionar firmemente para asegurar un sellado completo. Los errores de pipeteo al añadir la solución de ácido acético al trampa de NaOH pueden desplazar el pH de la muestra fuera del rango óptimo de pH 5,0, lo que conduce a una recuperación inexacta de fluoruro. Acción recomendada: verificar el pH de cada muestra con papel indicador de pH y descartar cualquier muestra cuyo valor esté fuera del rango de pH 5. Las muestras de calibración también pueden caer fuera de los límites válidos de registro del electrodo selectivo de fluoruro. Las concentraciones inferiores a 0,02 ppm están por debajo del límite de detección del electrodo. Acción recomendada: no utilizar muestras de calibración que contengan menos de 0,02 ppm de fluoruro. Por el contrario, las muestras de calibración con concentraciones excesivamente altas de fluoruro pueden alterar la fuerza iónica de la solución y producir respuestas no lineales del electrodo. Acción recomendada: al comienzo del proyecto, preparar soluciones de calibración que abarquen un amplio rango de concentración de fluoruro para determinar el rango lineal de trabajo del electrodo específico que se está utilizando. Si las muestras tisulares exceden este rango lineal, reducir la masa del tejido o aumentar el volumen de la trampa de NaOH y ajustar el volumen de ácido acético en consecuencia para mantener el pH 5. Dificultad para obtener curvas de calibración lineales en el rango de 0,02–1 ppm: una causa común es el envejecimiento del electrodo. Los electrodos selectivos de fluoruro más antiguos pierden sensibilidad a concentraciones muy bajas de fluoruro. Acción recomendada: reemplazar el electrodo selectivo de fluoruro. Lecturas inestables del potenciómetro (señal fluctuante o errática) ocurren típicamente cuando la superficie sensora del electrodo no está completamente sumergida en la solución de la muestra. Acción recomendada: bajar el electrodo de modo que la superficie sensora quede completamente cubierta por la muestra líquida.

En general, este protocolo proporciona un enfoque sólido, basado en calibración, para cuantificar el fluoruro en diversas matrices biológicas y es muy adecuado para estudios que investigan la exposición al fluoruro, la deposición en tejidos y los efectos toxicológicos en modelos murinos.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

La investigación informada en esta publicación fue apoyada por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia; Becas de Investigación en el Extranjero JSPS 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.) y el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial de los Institutos Nacionales de Salud; R01DE027648 (M.S.) y K02DE029531 (M.S.).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido acético, glacialSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
Crisoles de alúminaAdvalue Technology12 mm de diámetro exterior × 25 mm de altura, AL-6212AL-6212
Balanza analíticaVWRVWR 124B2, d = 0,1 mg—
Homogeneizador de bolasBenchmarkBeadBug 6—
Aguja roma para jeringaAmazonAguja industrial con punta roma, 14 G × 0,5 pulgadasX001TT8KX1
Dióxido de carbonoAirGas——
Campana extractora químicaMott ManufacturingModelo 7421040—
Sacarosa D(+)Thermo Scientific99,7 % para bioquímica177142500
Solución de relleno para electrodoThermo ScientificSolución de relleno Orion IonPlus900061
Solución de alcohol etílicoKoptec140 pruebas2401
Congelador, −80 °CThermo ScientificRevco Serie RDE—
Guantes resistentes al calorFisher ScientificGuantes Bel-Art Clavies para autoclave y riesgo biológicoH13201
Hexametildisiloxano (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98 %H0091
Peróxido de hidrógenoVWRJ.T. Baker, 30 %2204-01
Electrodo selectivo de ionesThermo ScientificElectrodo selectivo de iones de flúor Orion, doble canal9609BNWP
Mezclador magnéticoVWRAgitador 360—
MicroespátulaAmazonMicroespátula para cera n.º 7A, acero inoxidable—
MicrocentrífugaEppendorf5427R5404000131
Horno muflaThermo ScientificHorno mufla pequeño de banco Thermolyne, 1,3 L, FB1315MFB1315M
HornoBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
Solución de paraformaldehído en PBSThermo ScientificParaformaldehído al 4 % en PBSJ19943-K2
Placa de PetriVWR60 × 15 mm, sin tratar25384-092
PetrolatoThermo ScientificPetrolato blanco puro417090010
Papel indicador de pHFisher ScientificpH-Fix 4,5–10,092120.3
Plato de porcelanaFisher ScientificCrisol Fisherbrand, 5 mL, 20 mm de altura, forma altaFB-965-B
PotenciómetroThermo ScientificMedidor de pH/ISE Orion Dual Star2115102
Soporte universal con pinzaVWRPinza de anillo, 15 cm470104-526
Dieta para roedoresBio-ServF1515, AIN-76A, ½ pelletsF1515
Gato de tijeraAmazonGato de tijera de laboratorio—
Embudo de separaciónFisher ScientificEisco, vidrio de borosilicato, 2 LS89285
Cloruro de sodioFisher ScientificACS certificado, cristalinoS271-1
Fluoruro de sodioFisher ScientificACS certificado, en polvoS299-100
Hidróxido de sodioFisher ScientificGránulos blancosBP359-500
Bolas de acero inoxidableFisher ScientificScientific Industries, 5 mm, 100 unidadesSI-CS05
Ácido sulfúricoFisher ScientificGrado ACSA300-500
TISAB IIThermo ScientificSolución de aplicación Orion IonPlus940909
Desecador al vacíoFisher ScientificDesecador al vacío Bel-Art Space Saver, 10 pulgadasF42010-0000
Filtro al vacíoFisher ScientificFiltro de botella con flujo superior, PES, 90 mm, 0,2 µm597-4520
Agitador rotatorio variableMidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

Referencias

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